CN102875658B - 一种产油微生物能源微藻的高值化利用分离方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种产油微生物能源微藻的高值化利用分离方法，包括以下步骤：步骤1：将收集的微藻湿菌体依次经过热水和离心处理，得到上清液A和沉淀A；步骤2：沉淀A依次经过加酶和离心处理，得到上清液B和沉淀B；步骤3：将上清液A和上清液B混合后进行浓缩，并加4℃冷乙醇静置12小时以上，将混合液进行过滤得到粗多糖沉淀；步骤4：步骤3中所得粗多糖沉淀加水溶解，脱蛋白处理，分离成蛋白沉淀和脱蛋白的多糖溶液，蛋白沉淀通过冷冻干燥或烘干得到粗蛋白产品，脱蛋白后的多糖溶液进行脱色得到精制多糖，沉淀B再经过多次处理后可以得到黄色素、叶绿素盐、高蛋白成分饲料以及油脂。

Description

一种产油微生物能源微藻的高值化利用分离方法

技术领域

本发明涉及微生物工程领域，尤其涉及一种产油微生物微藻的高值化利用分离方法。

背景技术

随着石化资源日益枯竭、人类环保意识不断增强，清洁可再生的生物柴油的发展显得尤为紧迫。能源微藻以种类繁多、分布广、繁殖快、成本低的特点成为重要来源之一。另外，其脂肪酸组成与植物来源的食用油脂相似，可以代替动、植物油脂作为食用油脂，甚至是作为保健类功能性油脂。微藻除含有大量的脂质之外，还含有丰富的多糖、色素、蛋白质和必需氨基酸等活性成分。具有增强免疫力，抗癌，防辐射损伤，抗衰老，降血糖等功效。

叶绿素是较早开发的一种绿色色素，无毒，可食用，是一种很好的天然食用色素，但由于叶绿素稳定性极差，且不溶于水，给应用带来一定的困难。为方便使用，常将其制成叶绿素铜钠应用。叶绿素铜钠盐不但溶于水而且稳定性比叶绿素强很多，是我国食品工业唯一允许使用的绿色色素，是***粮农组织、世界卫生组织批准使用的天然绿色素。

从产油微生物能源微藻进行分离可以得到多糖、色素、油脂以及蛋白产品四种成分。

现阶段对四种成分的提取，常规方法是酸法、碱法、酶法、热水法、超声波、微波提取法对某一种成分进行提取，但仍没有一种方法同时对四种成分进行有效提取。且超声、微波法处理量小，工业上较难扩大再生产；若直接采用酸法、碱法用量大、且浓度高，对环境污染严重，对色素、多糖结构破坏严重、损失较大，蛋白含量较高，增加了多糖纯化的难度，且碱处理使水相清液中呈墨绿色，得到的粗多糖颜色也为绿色，油脂提取过程中，色素杂质也较多，后期分离成本加大；酶法破碎条件温和、能耗低、处理量大，多糖得率高，油脂浸出率高，但是酶的造价较高，而在使用时又需要大量的酶才可达到较好的破碎效果，且酶的大量使用对色素降解作用较明显，所以可以先对酶进行预处理，减少酶的用量和作用时间；热水处理，可增大细胞通透性，有利于胞内物质的浸出，可控时间内热水处理对色素影响较小，但脱单独热水处理，多糖和油脂的提取效率低，可作为一种预处理手段与酶法结合。常规对色素提取采用有机溶剂浸提，此时目标产物必须为干菌体，湿菌体有机溶剂提取效果甚微。

发明内容

本发明设计了一种产油微生物能源微藻的高值化利用分离方法，其解决的技术问题是现有产油微生物能源微藻分离方法无法对其含有的多糖、油脂、色素以及蛋白得到充分利用，并且分离效果不佳，成本高。

为了解决上述存在的技术问题，本发明采用了以下方案： 

一种产油微生物能源微藻的高值化利用分离方法，包括以下步骤：

步骤1：将收集的微藻湿菌体依次经过热水和离心处理，得到上清液A和沉淀A；其中，热水与湿菌体的质量比为20—30：1；

步骤2：沉淀A依次经过加酶和离心处理，得到上清液B和沉淀B；其中，沉淀A和酶的质量比为40-100：1；

步骤3：将上清液A和上清液B混合后进行浓缩，并加4℃冷乙醇混合12小时以上，将混合液进行过滤得到粗多糖沉淀；其中，上清液A和上清液B的总体积浓缩到原体积的1/5—1/4，加冷乙醇的体积是浓缩后上清液A和上清液B总体积的3-5倍；

步骤4：步骤3中所得粗多糖沉淀加水溶解，脱蛋白处理，分离成蛋白沉淀和脱蛋白的多糖溶液，蛋白沉淀通过冷冻干燥或烘干得到粗蛋白产品。

进一步，步骤4中所得脱蛋白后的多糖溶液进行脱色得到精制多糖。

进一步，将步骤2中所得沉淀B的菌悬液调节pH值为10-12后，70-80℃保温1-2h，然后加入0.8%的氯化钠溶液以及正己烷与乙醇的混合液，使最终正己烷：乙醇：水的体积比为2：4：1.5，震荡10min，静置分成三层：正己烷相A、中间菌体相以及醇水相A，最上层正己烷相A得到黄色素。添加乙醇是为了使黄色素更好的进入正己烷相中。

进一步，中间菌体相经过干燥处理后当作动物膳食的高蛋白成分饲料。

进一步，醇水相A加酸调节溶液pH至酸性后，加入体积比为2：1的正己烷与乙醇混合溶液以及0.8%的氯化钠溶液，醇水相A、正己烷：乙醇混合液以及氯化钠溶液体积比为4：6：1，震荡10min，静置再次分层为正己烷相B和醇水相B，正己烷相B制得油脂，醇水相B制得叶绿素铜钠盐。

进一步，所述酶选自中性蛋白酶、碱性蛋白酶以及纤维素酶中的一种或多种组合；所述纤维素酶酶活为1200-1500U/g，所述中性蛋白酶酶活为59000-60000U/g，所述碱性蛋白酶酶活为2×105-2.02×105U/g。

进一步，步骤1中的热水处理温度和时间分别为90-100℃和0.5-2h。

进一步，所述产油微生物能源微藻为小球藻、螺旋藻或栅藻。藻类微生物的细胞壁成分主要是纤维素极其结合蛋白。以适当的比例组成具有水解多糖、蛋白等物质能力的复合酶，使细胞壁通透性大幅增加，产品能够顺利溶出。所述纤维素酶与蛋白酶的质量比优选为1:0.2-5；所述酶与产油微生物菌体的质量比为1:40-100。

本发明使用的微藻湿菌体由藻类微生物菌体发酵液通过离心处理获得，藻类微生物菌体发酵液的制备方法为取种子液对数期进行接种，接种量为20%，初始pH值为7.5，温度27℃，光照4000lx，通无菌空气培养8天则达到稳定期。

本发明在提取油脂时优选采用六号溶剂萃取，六号溶剂是各种低级烷烃的混合物，具有工业己烷类似的性质且不与水互溶，形成的双水相可以分离脂溶性的油脂和水溶性的叶绿素酸。浸提后离心得到油相层，利用旋转蒸发仪脱溶得到油脂。

该产油微生物能源微藻的高值化利用分离方法与现有方法相比，具有以下有益效果：

（1）本发明产油微生物能源微藻的利用分离方法，在确保能够不影响油脂提取，以及得到较高的产物得率的情况下，对提取顺序进行了优化，可以依次得到蛋白、多糖、色素以及油脂产品四种成分。

（2）本发明设计用热水处理作为预处理手段，增大细胞通透性，适当破坏细胞壁结构，减少酶法酶法作用时间和酶的使用量，通过热水抽提和酶解作用，得到产品多糖和少量的粗蛋白。

（3）本发明通过油脂和叶绿素在碱性条件下可以变成水溶性的物质，得到胡萝卜素等黄色素产品。

（4）本发明油脂在酸性条件下仍能变成脂溶性的游离脂肪酸，叶绿素仍是水溶性的叶绿素酸，从而分离成油脂和叶绿素，得到的油脂产品色素杂质极少，油脂品质较好。

（5）本发明中叶绿素可以直接转化成叶绿素铜钠盐，且叶绿素转化充分。

具体实施方式

结合下列实施例，对本发明做进一步说明：

实施例1：选用小球藻

将小球藻发酵液以4000rpm/min离心10min，去除上清液获得小球藻湿菌体，称取小球藻湿菌体1.0g于100ml三角烧瓶中，加入25ml去离子水，90℃加热1.5h，冷却，离心得上清液A和沉淀A。称取0.065g纤维素酶，0.035g中性蛋白酶，纤维素酶酶活为1200U/g，中性蛋白酶酶活为60000U/g，加入pH=5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液，pH=5是实验中选定的最优酶作用的pH反应体系。定容至100ml，取25ml酶溶液加入到小球藻湿菌体沉淀A中，水解温度为42℃，搅拌4h，90℃灭酶10min。将水解后的悬浊液进行4000r/min下离心10min，得到上清液B和沉淀B，合并两次上清液A和上清液B，浓缩该上清混合液至原体积的1/5，加入3倍体积的冷乙醇4℃震荡混合均匀，静置12h，过滤得粗多糖沉淀。

取10ml水溶解粗多糖沉淀，用三氯乙酸调节pH到3，混匀，静置2h，加入15倍三氯乙酸体积的正丁醇，搅拌，静置1h，离心，水溶液回收多糖，重复2次。多糖提取率82.3%。用水溶解多糖，以2BV/h的流速对2.5mg/ml的粗多糖溶液进行吸附脱色，测得色素脱除率92.4%，多糖保留率为88.97%。pH=3时蛋白质溶解度较低且多糖损失较小，是实验中最优反应体系。正丁醇的使用也是为了降低蛋白质的水溶性，从而和多糖分离。此处单独使用TCA方法也可以，增加重复提取的次数。

沉淀B的菌悬液用2mol/L的氢氧化钠调节pH为11，70℃反应60min，冷却，加入适量0.8%的氯化钠溶液和正己烷与乙醇的混合液正己烷与乙醇的体积比为2：4，使最终正己烷：乙醇：水的体积比为2：4：1.5，震荡10min，收集正己烷相，再加入初始1/3体积的正己烷重复两次，正己烷相A加无水硫酸钠去除微量水，回收溶剂并得到胡萝卜素等黄色素。中间层悬浮的菌体经干燥后粗蛋白含量为38.7%，十八水解氨基酸含量充分，完全可以作为富含蛋白、氨基酸的成分当作蛋白饲料成为动物膳食饲料的部分替代品。醇水相A中加1mol/L的硫酸调节pH到3，85℃反应90min，冷却，加入体积比为2：1的正己烷:乙醇溶液和0.8%的氯化钠溶液，醇水相A、正己烷：乙醇混合液以及氯化钠溶液体积比：4：6：1，震荡10min，静置再次分层为正己烷相B和醇水相B，重复两次，正己烷相B加无水硫酸钠去除微量水，回收溶剂并得到油脂产品，油脂提取率为79.4%。醇水相B浓缩到原体积的1/3，加入10%的硫酸铜溶液，醇水相B：硫酸铜体积比为2：3，搅拌均匀，60℃搅拌90min。趁热过滤，滤液加入2倍纯水，析出叶绿素铜，静置90min过滤。析出的叶绿素铜的滤饼用乙醇溶解，缓慢加入5%氢氧化钠-乙醇溶液，调节pH为11，搅拌成盐，过滤，滤液于60℃加热蒸发得到墨绿色结晶物，60℃烘箱烘干得到叶绿素铜钠盐成品，叶绿素铜钠盐得率75.6%。

实施例2：选用栅藻

将栅藻发酵液以4000rpm/min离心10min，去除上清获得栅藻菌体，称取栅藻湿菌体1.0g于100ml三角烧瓶中，加入25ml去离子水，90℃加热1.5h，冷却，离心得上清液A和沉淀A。称取0.075g纤维素酶，0.025g碱性蛋白酶，纤维素酶酶活为1200U/g，碱性蛋白酶酶活为2×105U/g，加入pH=4的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液定容至100ml，取25ml酶溶液加入到栅藻湿菌体沉淀A中，水解温度为40℃，搅拌4h，90℃灭酶10min，将水解后的悬浊液进行4000r/min下离心10min，得到上清液B和沉淀B。之后步骤同实施例1。

最终产物，多糖提取率78.14%。测得色素脱除率90.92%，多糖保留率为89.23%。粗蛋白含量为36.7%，油脂提取率为78.88%，叶绿素铜钠盐得率77.26%。

实施例3：选用螺旋藻

将螺旋藻发酵液以4000rpm/min离心10min，去除上清获得螺旋菌体，称取螺旋湿菌体0.8g于100ml三角烧瓶中，加入25ml去离子水，90℃加热1.5h，冷却，离心得上清液A和沉淀A。称取0.067g中性蛋白酶，碱性蛋白酶酶活为60000U/g，加入pH=7的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液定容至100ml，取20ml酶溶液加入到栅藻湿菌体中，水解温度为42℃，搅拌6h，90℃灭酶10min。将水解后的悬浊液进行4000r/min下离心10min，得到上清液B和沉淀B。之后步骤同实施例1。

最终产物，多糖提取率75.74%。测得色素脱除率91.22%，多糖保留率为89.75%。粗蛋白含量为38.97%，油脂提取率为78.28%，叶绿素铜钠盐得率72.86%。

上面结合实施例对本发明进行了示例性的描述，显然本发明的实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明的方法构思和技术方案进行的各种改进，或未经改进将本发明的构思和技术方案直接应用于其它场合的，均在本发明的保护范围内。

Claims (4)

1.一种产油微生物能源微藻的高值化利用分离方法，包括以下步骤：

步骤1：将收集的微藻湿菌体依次经过热水和离心处理，得到上清液A和沉淀A；其中，热水与湿菌体的质量比为20—30：1；步骤1中的热水处理温度和时间分别为90-100℃和0.5-2h；

步骤2：沉淀A依次经过加酶和离心处理，得到上清液B和沉淀B；其中，沉淀A和酶的质量比为40-100：1；所述酶选自中性蛋白酶、碱性蛋白酶以及纤维素酶中的一种或多种组合；所述纤维素酶酶活为1200-1500U/g，所述中性蛋白酶酶活为59000-60000U/g，所述碱性蛋白酶酶活为2×10⁵-2.02×10⁵U/g；

将步骤2中所得沉淀B的菌悬液调节pH值为10-12后，70-80℃保温1-2h，然后加入0.8%的氯化钠溶液以及正己烷与乙醇的混合液，使最终正己烷：乙醇：水的体积比为2：4：1.5，震荡10min，静置分成三层：正己烷相A、中间菌体相以及醇水相A，最上层正己烷相A得到黄色素；醇水相A加酸调节溶液pH至酸性后，加入体积比为2：1的正己烷与乙醇混合溶液以及0.8%的氯化钠溶液，醇水相A、正己烷：乙醇混合液以及氯化钠溶液体积比为4：6：1，震荡10min，静置再次分层为正己烷相B和醇水相B，正己烷相B制得油脂，醇水相B制得叶绿素铜钠盐；

步骤3：将上清液A和上清液B混合后进行浓缩，并加4℃冷乙醇混合12小时以上，将混合液进行过滤得到粗多糖沉淀；其中，上清液A和上清液B的总体积浓缩到原体积的1/5—1/4，加冷乙醇的体积是浓缩后上清液A和上清液B总体积的3-5倍；

步骤4：步骤3中所得粗多糖沉淀加水溶解，脱蛋白处理，分离成蛋白沉淀和脱蛋白的多糖溶液，蛋白沉淀通过冷冻干燥或烘干得到粗蛋白产品。

2.根据权利要求1所述产油微生物能源微藻的高值化利用分离方法，其特征在于：步骤4中所得脱蛋白后的多糖溶液进行脱色得到精制多糖。

3.根据权利要求1所述产油微生物能源微藻的高值化利用分离方法，其特征在于：中间菌体相经过干燥处理后当作动物膳食的高蛋白成分饲料。

4.根据权利要求1所述产油微生物能源微藻的高值化利用分离方法，其特征在于：所述产油微生物能源微藻为小球藻、螺旋藻或栅藻。