CN101724582A - 一种修复PAHs污染土壤的固定化菌剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及多环芳烃(PAHs)污染土壤的修复技术，具体地说是一种修复PAHs污染土壤的固定化菌剂及其制备方法。具体为：将制备好的微生物混合菌种液接种到固体培养基中，即经过处理的菌剂载体上，在培养箱28-30℃条件下、恒温培养3-4天，进行吸附固定和增殖，制备固定混合微生物制剂。本发明具体采用农作物副产品为载体，对混合菌吸附速度快、增殖效果好，操作简单，不产生二次污染。而且农作物副产品来源丰富，价格便宜。将其制备的固定化细胞颗粒按照2-4％投放到PAHs污染土壤中，可使土壤中PAHs污染物得到有效去除，当污染土壤中PAHs浓度为84mg/kg时，经过70d的处理PAHs的降解率可达74％。
Description
技术领域
本发明涉及多环芳烃(PAHs)污染土壤的修复技术，具体地说是一种修复PAHs污染土壤的固定化菌剂及其制备方法。
背景技术
常规环境修复技术主要指：化学修复法、物理修复法、生态修复法和生物修复法，后两者常被归为统一的技术，工程上一般采取原位方式。生物修复技术作为低能耗、无二次污染的新兴技术，适于大面积轻度或中度污染的土壤治理，具有费用低、易操作、对环境无污染等优点，且能改良土壤，提高地力，因此具有广泛的应用和发展前景。
我国自20世纪90年代开始，针对石油污染土壤生物修复技术开展了大量研究，从理论和应用均取得了显著的研究成果。但目前仍有大量污染农田土壤需要修复，急需进行农田污染土壤的生物修复研究。
沈抚灌渠始建于1960年，全长70公里，始自抚顺石油二厂，沿途接纳抚顺市数十家企业排放的工业废水和生活污水，这些排放水于东陵区深井子镇进入沈阳，斜穿东陵区，在白塔堡镇大羊安村进入***区，最后汇入太子河。由于长期使用灌渠污水进行灌溉，在深井子镇的灌渠上游地区，造成了水稻秧苗生长速度缓慢、烂根、粒瘪等现象，产出的大米有浓重的石油味和芳香族化合物气味。在长期的污灌给土壤和农作物造成严重污染的同时，该地域的地下水和地表水水质也受到了严重的影响。该地区有很多水井受到不同程度的污染，浅层地下水有浓重的异味及油污。根据辽宁省防疫站有关部门的调查显示，该地区人群中的慢性病和恶性疾病的发病率明显增加，而且，污灌区的农作物(水稻、蔬菜等)基本上销往沈阳市和抚顺市内，对城市居民的身体健康存在潜在的威胁。自80年代起，随着人们对污水灌溉危害认识和政府重视的加强，污灌区逐步开始了清水灌溉改造和清污分流工程建设，整个污灌区于2000年基本实现了区内农田的清水灌溉。但由于辽沈地区水资源短缺，特别是干旱年份尤为严重，个别地区污灌现象仍然存在。为了治理和修复多年污灌造成的PAHs污染土壤，我们研发了微生物固定化修复技术IMR(Immobilized MicrobeRemediation)。
固定化技术，是指利用化学或物理的方法，将游离的细胞(微生物)或酶，定位于限定的空间区域内，并使其长时间保持活性的一种技术。微生物固定化技术的关键是筛选适宜的载体材料和确定优化的固定化工艺。利用IMR技术修复污染水体已有一些成功的例子，但修复污染土壤还未见报道。PAHs污染土壤修复技术的核心是高效降解菌对PAHs的降解作用，但能否将高效的降解菌的降解能力淋漓尽致的发挥出来是关键。将固定化技术应用到PAHs污染土壤修复中，可以使微生物长期保持活性，并使其在复杂环境中也可稳定地发挥高效能。
发明内容
本发明的目的是提供一种修复效果好、应用广泛的农作物副产品为载体的修复PAHs污染土壤的固定化菌剂制备方法。
为了实现上述目的，本发明的技术方案是：
修复PAHs污染土壤的固定化菌剂：由按重量份数计0.5-1.5∶0.5-1.5∶0.5-1.5∶0.5-1.5∶1-3∶2-4∶1-3，戈登氏菌、节细菌、产碱杆菌、苍白杆菌、假单胞菌、芽胞杆菌和分枝杆菌的菌种，余量为固体培养基。
固体培养基按重量百分比计，55-65％的稻糠、11-16％的玉米芯、1.0-2.0％的豆饼粉、0.06-0.1％的K2HPO4、20-25％的麦麸、0.025-0.05％的MgSO4.7H2O、0.8-1.2％的蔗糖，余量为水分；pH7.0-7.5。所述菌种需在含多环芳烃的富集培养集中培养其为：将戈登氏菌、节细菌、产碱杆菌、苍白杆菌、假单胞菌、芽胞杆菌和分枝杆菌按重量份数计为0.5-1.5∶0.5-1.5∶0.5-1.5∶0.5-1.5∶1-3∶2-4∶1-3的菌种接种在30-100ml的含有PAHs污染物的富集培养基中，而后投放富集培养基重量百分比10-15％的PAHs污染土壤，在温度28～30℃，120～130rpm/min恒温摇床中培养一周，待用；将上述培养的菌液按重量比为10-15％的接种量接种到无机盐培养基中，在温度28～30℃，120～130rpm/min恒温摇床中培养5-7d，得到的微生物混合菌液，即为一级种子液。
修复PAHs污染土壤的固定化菌剂的制备方法，富集、培养和驯化：首先将戈登氏菌、节细菌、产碱杆菌、苍白杆菌、假单胞菌、芽胞杆菌和分枝杆菌按重量份数计为0.5-1.5∶0.5-1.5∶0.5-1.5∶0.5-1.5∶1-3∶2-4∶1-3的菌种在含多环芳烃的富集培养基中培养至对数生长期，将对数生长期的菌种于用农作物副产品作为的固体增值培养基在温度28～30℃，下进行吸附、固定和增殖3-4d，增殖2-3次，即得为固定化菌剂。
所述菌种需在含多环芳烃的富集培养集中培养其为：将戈登氏菌、节细菌、产碱杆菌、苍白杆菌、假单胞菌、芽胞杆菌和分枝杆菌按重量份数计为0.5-1.5∶0.5-1.5∶0.5-1.5∶0.5-1.5∶1-3∶2-4∶1-3的菌种接种在30-100ml的含有PAHs污染物的富集培养基中，而后投放富集培养基重量百分比10-15％的PAHs污染土壤，在温度28～30℃，120～130rpm/min恒温摇床中培养一周，待用；将上述培养的菌液按重量比为10-15％的接种量接种到无机盐培养基中，在温度28～30℃，120～130rpm/min恒温摇床中培养5-7d，得到的微生物混合菌液，即为一级种子液对数生长期菌液。
所述富集培养基按重量份数计，0.1-0.2％葡萄糖、0.01-0.5％NaCl、0.05-0.1％蛋白胨、0.1-1.0％NH4NO3、0.05-0.1％酵母膏、0.1-0.5％K2HPO4、0.01-0.05％MgSO4.7H2O，余量为无菌水；pH7.0-7.5；同时在富集培养基中加入PAHs，使其总量浓度为100-200mg/L。所述无机盐培养基按重量份数计为：0.01-0.5％NaCl、0.1-1.0％NH4NO3、0.5-0.1％K2HPO4、0.01-0.05％MgSO4.7H2O、余量为无菌水；pH7.0-7.5。
所述将对数生长期的菌种培养时，将对数生长期的菌种按照重量百分比为10-15％的接种量投加到固体培养基中进行吸附固定3-4d，保持含水量55％-65％，为增殖一次；而后以增殖一次的产品为固体菌种，以同样的方式，再增殖2-3次，即得到固定化菌剂。
所述固体培养基按重量百分比计，55-65％的稻糠、11-16％的玉米芯、1.0-2.0％的豆饼粉、0.06-0.1％的K2HPO4、20-25％的麦麸、0.025-0.05％的MgSO4.7H2O、0.8-1.2％的蔗糖，余量为水分；pH7.0-7.5。所述固体增值培养基由多种农作物副产品混合而成，将各种材料粉碎至粒度直径在0.1-0.5cm，并在使用前先用1.2-2％的Ca(OH)2水浸泡杀菌24h。
原理：用于修复PAHs污染土壤以多种农作物副产品混合物作为载体材料，采用吸附固定方法；对培养驯化的高效降解PAHs的混合微生物进行固定化，制备混合菌剂；将制备的固定化菌剂对PAHs污染土壤进行原位修复。
本发明具有如下优点：
1.本发明选择多种农作物副产品混合物作为载体材料，载体材料粉碎到直径0.1-0.5cm范围较合适，其农作物副产品孔隙度适合微生物的吸附，可对完整的微生物细胞进行固定，避免人为破坏生物酶的活性和生化反应的稳定性；增殖速度快、效果好。
2.本发明选择在多年老化的PAHs污染土壤中培养、驯化优势微生物混合菌，固定化后能长期保持活性；固定化细胞颗粒的微环境有利于强化这些菌种的降解能力，使其在复杂环境条件下稳定地发挥高效能。
3.农作物副产品混合物为载体的固定化菌剂，可根据污染程度直接投加，操作简单，不产生二次污染。该类材料来源丰富，价格便宜。节省投资，简化流程，实践上安全可靠，经济上费用低廉。这类材料投加到土壤中可增加土壤的通透性，经过长时间的腐败，还可增加土壤的肥力。
4.本发明采用微生物修复，具体为农作物副产品载体吸附固定微生物，对混合菌吸附速度快、增殖效果好。将其制备的固定化菌剂按照2％-4％投放到PAHs污染土壤中，可使污染土壤中难降解的PAHs得到有效去除，当污染土壤中高分子量的、难降解的PAHs总量浓度为84mg/kg时，经过70d的处理，PAHs总量的降解率可达74％。
附图说明
图1为本发明固定化微生物菌剂修复PAHs污染土壤效果图。
图2为本发明固定化微生物菌剂修复PAHs污染土壤效果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1
农作物副产品为载体固定微生物的方法，具体步骤为：先制备种子液，同时处理载体；然后混合菌株在固体培养基中进行吸附固定和增殖。具体步骤如下：
1)菌液的制备：
将菌种戈登氏菌(Gordona sp.)、节细菌(Arthrobaccer sp.)、产碱杆菌(Alealigenes sp.)、苍白杆菌(Ochrobactrum)、假单胞菌(Psedomonassp.)、芽胞杆菌(Bacillus sp.)、分枝杆菌(Mycobacterium sp.)，(均购于中国科学院沈阳应用生态研究所微生物菌种库，其是对外开放任何人均可购买；同时所采用的菌种在市面上均可购买)将上述菌种按重量份数计，1∶1∶1∶1∶2∶3∶2的比例接种在90ml的含有PAHs污染物的富集培养基中，而后投放10g污灌区(抚顺市三宝屯北后屯耕层土壤)老化的PAHs污染土壤，于30℃，120rpm/min恒温摇床中振荡培养7d，待用。
所述含有PAHs污染物的富集培养基为：将2.5ml PAHs溶液加入到无菌的500ml三角瓶中，使富集培养基中多环芳烃总量浓度为200mg/L；待溶剂挥发完后，再将分装好的90ml无菌富集培养基倒入三角瓶中。所述培养基按重量百分比计为：葡萄糖0.1％、蛋白胨0.1％、酵母膏0.1％、NaCl0.5％、NH4NO3 0.1％，K2HPO4 0.5％、MgSO4·7H2O 0.05％、pH7.2。灭菌条件为：0.1Mpa湿热灭菌30min。
而后按10％接种量将上述种液转接到30ml无机盐培养基的150ml三角瓶中，使培养基中PAHs总量浓度为200mg/L。于28℃，120rpm/min条件下进行第二次驯化、培养，培养7d。以此重复三次即作为微生物混合菌液，使种液为对数生长期，即一级种子液。
所述无机盐培养基按重量百分比计为：NaCl 0.01％、NH4NO3 0.5％，K2HPO40.5％、MgSO4·7H2O 0.05％、pH7.2。灭菌条件为：0.1Mpa湿热灭菌30min。
2)混合菌株的固定化
将上述一级种子液按10％的接种量加入到经过预处理的固体培养基中，并充分混合，即80ml一级种子液接入800g固体培养基中，保持含水量60％，于28℃条件下吸附、固定增殖培养3d，即增殖一次为二级种子，按上述增殖方式，再增殖二次，即为固定化菌剂。
载体材料(来自中国科学院沈阳应用生态研究所十里河生态站)，即固体培养基配方：稻糠55％，玉米芯16％，蔗糖1.0％，麦麸25％，豆饼粉1.0％，KH2PO4 0.06％，MgSO4.7H2O 0.026％，(NH4)2HPO4 0.2％，1.8％CaO。混匀后加水，水分含量55％，放置过夜。次日调节pH7.5。分装于耐高温塑料袋中，每袋800g。0.1mpa灭菌1h，放置过夜，再在同样条件下进行第二次灭菌。
将上述固定化菌剂作用于人工配制的多环芳烃污染土壤中效果为：在人工配制的多环芳烃污染土壤中(PAHs总量为83.72mg/kg)，加入2％的上述固定化菌剂，保持土壤含水量为30％，28℃条件下静止放置。以同样的方法做对照(CK)试验，即污染土壤中只加入无菌的载体。定期取样测定土壤中PAHs的残留量，实验结果见图1。
当土壤中PAHs总量浓度为83.72mg/kg时，经过70d的处理，浓度降低为21.35mg/kg，降解率达到74.50％，比CK高出6.98个百分点。实验结果说明调控微生物适宜生存的环境条件，投加本发明的固体培养基土著微生物也可以发挥较好的作用。实验结果说明微生物固定化菌剂对于修复PAHs污染土壤效果是令人满意的。
实施例2与实施例1不同之处在于：
1)菌液的制备：
菌种为戈登氏菌(Gordona sp.)、节细菌(Arthrobaccer sp.)、产碱杆菌(Alealigenes sp.)、苍白杆菌(Ochrobactrum)、假单胞菌(Psedomonassp.)、芽胞杆菌(Bacillus sp.)、分枝杆菌(Mycobacterium sp.)将上述菌种按重量份数计，0.5∶1.5∶0.5∶1.5∶3∶4∶3的比例接种在100ml的含有PAHs污染物的富集培养基中，而后投放15g污灌区老化的PAHs污染土壤，于28℃，130rpm/min恒温摇床中振荡培养5d，待用。
所述含有PAHs污染物的富集培养基为：将1.25ml PAHs溶液加入到无菌的500ml三角瓶中，使富集培养基中多环芳烃总量浓度为100mg/L；待溶剂挥发完后，再将分装好的100ml无菌富集培养基倒入三角瓶中。所述富集培养基按重量百分比计为：葡萄糖0.2％、蛋白胨0.06％、酵母膏0.06％、NaCl 0.01％、NH4NO3 1.0％，K2HPO4 0.1％、MgSO4·7H2O 0.01％、pH7.5。灭菌条件为：0.1Mpa湿热灭菌30min。
而后按15％接种量将上述种液转接到30ml无机盐培养基的150ml三角瓶中，使培养基中PAHs总量浓度为100mg/L。于30℃，130rpm/min条件下进行第二次驯化、培养，培养5d。以此重复三次即作为微生物混合菌液，使种液为对数生长期，即一级种子液。
所述无机盐培养基按重量百分比计为：NaCl 0.5％、NH4NO3 0.1％，K2HPO40.1％、MgSO4·7H2O 0.01％、pH7.5。灭菌条件为：0.1Mpa湿热灭菌30min。
2)混合菌株的固定化
将上述一级种子液按15％的接种量加入到经过预处理的固体培养基中，并充分混合，即80ml一级种子液接入800g固体培养基中，保持含水量65％，于30℃条件下吸附、固定增殖培养4d，即增殖一次为二级种子，按上述增殖方式，再增殖二次，即为固定化菌剂。
载体材料(来自中科院生态所十里河生态站)，固体培养基配方：稻糠65％，玉米芯11％，蔗糖0.8％，麦麸20％，豆饼粉1.2％，KH2PO4 0.06％，MgSO4.7H2O 0.026％，(NH4)2HPO4 0.2％，1.4％CaO。混匀后加水，水分含量60％，放置过夜。次日调节pH7.5。分装于耐高温塑料袋中，每袋800g。0.1mpa灭菌1h，放置过夜，再在同样条件下进行第二次灭菌。
将上述固定化菌剂作用于人工配制的多环芳烃污染土壤中效果为：在人工配制的多环芳烃污染土壤中(PAHs总量为83.72mg/kg)，加入2％的固定化混合菌剂，保持土壤含水量为30％，28℃条件下静止放置。以同样的方法做对照(CK)试验，即污染土壤中只加入无菌的载体。定期取样测定土壤中PAHs的残留量，实验结果见图2。
当土壤中PAHs总量浓度为84.23mg/kg时，经过70d的处理，浓度降低为22.01mg/kg，降解率达到73.87％。在同样的时间内，CK降解率达到67.52％。实验结果说明本发明的固体培养基对土著微生物也有较好作用。本发明制备的微生物固定化菌剂对于修复PAHs污染土壤效果是令人满意的。
实施例3与实施例1不同之处在于：
修复PAHs污染土壤的固定化菌剂的制备方法，富集、培养和驯化：首先将戈登氏菌、节细菌、产碱杆菌、苍白杆菌、假单胞菌、芽胞杆菌和分枝杆菌按重量份数计为0.5∶0.5∶0.5∶0.5∶2∶3∶2的菌种接种在50ml的含有PAHs污染物的富集培养基中，而后投放富集培养基重量百分比12％的PAHs污染土壤，于29℃，125rpm/min恒温摇床中振荡培养6d，待用。
所述含有PAHs污染物的富集培养基为：将PAHs溶液加入富集培养基中，使其多环芳烃总量浓度为150mg/L。所述富集培养基按重量百分比计为：葡萄糖0.15％、蛋白胨0.08％、酵母膏0.08％、NaCl 0.1％、NH4NO3 0.8％，K2HPO4 0.3％、MgSO4·7H2O 0.03％、pH7.2。
而后按15％接种量将上述种液转接到30ml无机盐培养基的150ml三角瓶中，使培养基中PAHs总量浓度为150mg/L。于29℃，125rpm/min条件下进行第二次驯化、培养，培养6d。以此重复三次即作为微生物混合菌液，使种液为对数生长期，即一级种子液。
所述无机盐培养基按重量百分比计为：NaCl 0.1％、NH4NO3 0.5％，K2HPO40.3％、MgSO4·7H2O 0.04％、pH7.2。
2)混合菌株的固定化
将上述一级种子液按13％的接种量加入到经过预处理的固体培养基中，并充分混合，即80ml一级种子液接入800g固体培养基中，保持含水量55％，于29℃条件下吸附、固定增殖培养4d，即增殖一次为二级种子，按上述增殖方式，再增殖二次，即为固定化菌剂。
载体材料(来自中科院生态所十里河生态站)，固体培养基配方：稻糠60％，玉米芯13％，蔗糖1％，麦麸23％，豆饼粉1.5％，KH2PO4 0.08％，MgSO4.7H2O0.04％。
上述详细说明针对本发明的实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围。
Claims (10)
1.一种修复PAHs污染土壤的固定化菌剂，其特征在于：由按重量份数计0.5-1.5∶0.5-1.5∶0.5-1.5∶0.5-1.5∶1-3∶2-4∶1-3，戈登氏菌、节细菌、产碱杆菌、苍白杆菌、假单胞菌、芽胞杆菌和分枝杆菌的菌种，余量为固体培养基。
2.按权利要求1所述的修复PAHs污染土壤的固定化菌剂，其特征在于：所述固体培养基按重量百分比计，55-65％的稻糠、11-16％的玉米芯、1.0-2.0％的豆饼粉、0.06-0.1％的K2HPO4、20-25％的麦麸、0.025-0.05％的MgSO4.7H2O、0.8-1.2％的蔗糖，余量为水分；pH7.0-7.5。
3.按权利要求1所述的修复PAHs污染土壤的固定化菌剂，其特征在于：所述菌种需在含多环芳烃的富集培养集中培养其为：将戈登氏菌、节细菌、产碱杆菌、苍白杆菌、假单胞菌、芽胞杆菌和分枝杆菌按重量份数计为0.5-1.5∶0.5-1.5∶0.5-1.5∶0.5-1.5∶1-3∶2-4∶1-3的菌种接种在30-100ml的含有PAHs污染物的富集培养基中，而后投放富集培养基重量百分比10-15％的PAHs污染土壤，在温度28～30℃，120～130rpm/min恒温摇床中培养一周，待用；
将上述培养的菌液按重量比为10-15％的接种量接种到无机盐培养基中，在温度28～30℃，120～130rpm/min恒温摇床中培养5-7d，得到的微生物混合菌液，即为一级种子液。
4.一种按权利要求1所述的修复PAHs污染土壤的固定化菌剂的制备方法，富集、培养和驯化，其特征在于：首先将戈登氏菌、节细菌、产碱杆菌、苍白杆菌、假单胞菌、芽胞杆菌和分枝杆菌按重量份数计为0.5-1.5∶0.5-1.5∶0.5-1.5∶0.5-1.5∶1-3∶2-4∶1-3的菌种在含多环芳烃的富集培养基中培养至对数生长期，将对数生长期的菌种于用农作物副产品作为的固体增值培养基在温度28～30℃，下进行吸附、固定和增殖3-4d，增殖2-3次，即得为固定化菌剂。
5.按权利要求4所述的修复PAHs污染土壤的固定化菌剂的制备方法，其特征在于：所述菌种需在含多环芳烃的富集培养集中培养其为：将戈登氏菌、节细菌、产碱杆菌、苍白杆菌、假单胞菌、芽胞杆菌和分枝杆菌按重量份数计为0.5-1.5∶0.5-1.5∶0.5-1.5∶0.5-1.5∶1-3∶2-4∶1-3的菌种接种在30-100ml的含有PAHs污染物的富集培养基中，而后投放富集培养基重量百分比10-15％的PAHs污染土壤，在温度28～30℃，120～130rpm/min恒温摇床中培养一周，待用；
将上述培养的菌液按重量比为10-15％的接种量接种到无机盐培养基中，在温度28～30℃，120～130rpm/min恒温摇床中培养5-7d，得到的微生物混合菌液，即为一级种子液对数生长期菌液。
6.按权利要求4所述的修复PAHs污染土壤的固定化菌剂的制备方法，其特征在于：所述富集培养基按重量份数计，0.1-0.2％葡萄糖、0.01-0.5％NaCl、0.05-0.1％蛋白胨、0.1-1.0％NH4NO3、0.05-0.1％酵母膏、0.1-0.5％K2HPO4、0.01-0.05％MgSO4.7H2O，余量为无菌水；pH7.0-7.5；同时在富集培养基中加入PAHs，使其总量浓度为100-200mg/L。
7.按权利要求4所述的修复PAHs污染土壤的固定化菌剂的制备方法，其特征在于：所述无机盐培养基按重量份数计为：0.01-0.5％NaCl、0.1-1.0％NH4NO3、0.5-0.1％K2HPO4、0.01-0.05％MgSO4.7H2O、余量为无菌水；pH7.0-7.5。
8.按权利要求4所述的修复PAHs污染土壤的固定化菌剂的制备方法，其特征在于：所述将对数生长期的菌种培养时，将对数生长期的菌种按照重量百分比为10-15％的接种量投加到固体培养基中进行吸附固定3-4d，保持含水量55％-65％，为增殖一次；而后以增殖一次的产品为固体菌种，以同样的方式，再增殖2-3次，即得到固定化菌剂。
9.按权利要求8所述的修复PAHs污染土壤的固定化菌剂的制备方法，其特征在于：所述固体培养基按重量百分比计，55-65％的稻糠、11-16％的玉米芯、1.0-2.0％的豆饼粉、0.06-0.1％的K2HPO4、20-25％的麦麸、0.025-0.05％的MgSO4.7H2O、0.8-1.2％的蔗糖，余量为水分；pH7.0-7.5。
10.按权利要求9所述的修复PAHs污染土壤的固定化菌剂的制备方法，其特征在于：所述固体增值培养基由多种农作物副产品混合而成，将各种材料粉碎至粒度直径在0.1-0.5cm，并在使用前先用1.2-2％的Ca(OH)2水浸泡杀菌24h。
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| CN 200810228376 CN101724582A (zh) | 2008-10-29 | 2008-10-29 | 一种修复PAHs污染土壤的固定化菌剂及其制备方法 |
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2008
- 2008-10-29 CN CN 200810228376 patent/CN101724582A/zh active Pending
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