CN101597576B - 一种石油污染土壤修复固体菌剂及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于修复石油污染土壤的固体菌剂，属于土壤污染物的生物修复技术领域。固体菌剂是由抗辐射不动杆菌和红平红球菌的一级种子液经液态和固态两步发酵培养后等量混合制成，其中抗辐射不动杆菌和红平红球菌的有效活菌数为10⁹～10¹¹CFU/g。本发明的固体微生物菌剂具有成本低、活菌数目高、促进土壤的微生态环境改良和对环境不造成二次污染的优点，用于石油及石油产品污染土壤的生物修复。

Description

一种石油污染土壤修复固体菌剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种能够修复石油污染土壤的固态菌剂及其制备方法，属于石油及石油产品污染土壤的微生物修复技术领域。

背景技术

全世界每年的石油开采量超过了22亿吨，在石油的开采、运输、储存以及事故性泄露中每年约有1000万吨石油进入环境，在我国每年有近60万吨石油进入环境，这些进入环境的石油造成了土壤、地下水和地表水的严重污染。

土壤中石油污染的处理方法按其性质可分为3种：物理方法，化学方法和生物方法。其中物理和化学方法存在明显的缺陷：消极处理、费用昂贵和二次污染严重。生物方法修复石油污染土壤是指利用特定的生物将土壤中的石油及石油产品转化成为无害的无机化合物(通常为水和二氧化碳)的过程。由于其费用低、效果好、无二次污染等优点，迅速成为土壤石油污染处理研究的热点。

已知能够降解石油的微生物有70属200余种。土壤中最主要的降解细菌有：假单胞菌属、无色杆菌属、不动杆菌属、产碱杆菌属、节杆菌属、芽孢杆菌属、黄杆菌属、棒杆菌属、微杆菌属、微球菌属、放线菌属、诺卡氏菌属、分枝杆菌属等。真菌有：曲霉属、毛霉属、镰刀霉属和青霉属。酵母菌有假丝酵母属、红酵母属、球拟酵母属和酵母属。

随着修复技术的研究深入，各种污染土壤的修复装置和微生物菌剂的制作技术被相继报道。2004年李培军等人公开了一种污染土壤生物修复设施(公告号CN 2623365Y，申请号03214009.6)，2008年高冬梅等人公开了一种高浓度石油污染土壤的生物修复装置和方法(公开号CN 101234392A，申请号200810014714.2)，这些修复方法都属于异位修复方法，适用于污染严重的土壤，投资成本高，对于污染程度轻微、面积大的土壤不适合。2006年刘铮等人公开了一种石油污染土壤的原位生物修复方法(公开号CN 1785539A，申请号200510130674.4)，该方法是添加真菌-细菌液态混合微生物制剂，添加土壤结构改良剂、有机肥和无机营养盐，采用灌溉、翻耕、覆盖多孔地膜和保水保温的工程设施完成石油污染土壤的原位修复过程。2007年郭书海等人公开了一种处理稠油污水的微生物菌剂及制备方法(公开号CN 1990854A，申请号200510130900.9)，该菌剂包含了铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、弗氏丙酸杆菌、液化金杆菌、环状芽孢杆菌、短小杆菌、球形节杆菌、木棍杆菌、热土厌氧棒菌，由不同菌株的协同作用，可以加快稠油污水的生物处理。这些微生物菌剂的生产大多是通过微生物液态发酵培养后直接使用或是与固态微生物载体吸附后使用，菌剂中的石油降解菌仅仅来自液态发酵液，活菌数目有限，生产成本较高。

发明内容

针对现存的微生物菌剂在对石油污染土壤的原位修复中存在的问题，本发明提供一种用于石油污染土壤修复的固体微生物菌剂，该菌剂中石油降解菌数量多，能够直接分解石油污染物作为营养进行生长繁殖，石油污染物降解效果明显，菌剂中的其他物质能够改善土壤的微生态环境，加快土壤的修复进程。

本发明还提供该石油污染土壤修复固体菌剂的制备方法，包括制备该微生物菌剂所使用的菌种，以及制作过程。

制备该石油污染土壤修复固体菌剂的菌种：

抗辐射不动杆菌(Acinetobacter radioresistens)，保藏号：CGMCC No.3094，红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)，保藏号：CGMCC No.3095，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期：2009年6月9日。

一种用于石油污染土壤生物修复的固体微生物菌剂，是由抗辐射不动杆菌和红平红球菌经液态和固态两步发酵培养后混合而成，菌剂中抗辐射不动杆菌的有效活菌数为10⁹～10¹¹CFU/g，红平红球菌的有效活菌数为10⁹～10¹¹CFU/g。

本发明固体微生物菌剂的制备方法，是将抗辐射不动杆菌和红平红球菌经种子液制备、液态发酵培养、固态发酵培养、自然风干后混合而成。

所述石油污染土壤修复固体菌剂的制备步骤如下：

(1)一级种子液：

将抗辐射不动杆菌和红平红球菌分别在牛肉膏蛋白胨斜面培养基上活化16～32h后，转接到液体LB培养基或牛肉膏蛋白胨培养基内摇瓶活化16～32h，作为一级种子液。

(2)液态发酵培养：

将上述一级种子液分别转接到液态发酵培养基中摇床培养16～32h，转速为150～250rpm，培养温度为20～30℃，一级种子液的接种量为液态发酵培养基体积的2％～10％。在该步骤中控制抗辐射不动杆菌和红平红球菌的有效活菌数为10⁷～10⁹CFU/mL。

上述液态发酵培养基所选用的碳源、氮源为：葡萄糖、豆粕粉、酵母粉。

优选的，上述液态发酵培养基如下：葡萄糖1～3g，豆粕粉为0.5～2g，酵母粉为0.1～1g，K₂HPO₄0.11g，CaCl₂0.01g，MgSO₄·7H₂O 0.15g，MnSO₄0.01g，蒸馏水100mL。

(3)固态发酵培养：

将两种细菌培养液按固态发酵培养基重量的5％～10％单独接种在固态发酵培养基中，于20～30℃温度下培养2～4天，室温风干保存，即得单一菌种固态培养物，将两种固态培养物等量混合均匀即制得成品。

固态培养基为高温灭菌后的麸皮与草炭重量比为0.5～2∶1的混合物，将分别在摇瓶中培养的两种发酵液按5％～10％的接种量单独接种在上述固态培养基中，混合均匀，调整水分为30％～60％，通入无菌空气，于20～30℃温度下培养2～4天，室温风干，即得单一菌种固态培养物。将两种固态培养物等量均匀混合即制得成品。所得成品中，所述抗辐射不动杆菌和红平红球菌的有效活菌数均在10⁹～10¹¹CFU/g之间。

本发明的固体微生物菌剂的应用，在用于石油污染土壤修复时，还需要添加肥料，保持土壤松散和一定的水分。添加的肥料一般为离子型的氮磷农用复合肥，水分含量保持在占土壤总质量的20～50％。

上述应用时，固体菌剂的添加量及复合肥的添加量可根据土壤污染的程度或石油产品泄漏的程度进行调整。

本发明的技术特点是从石油污染现场筛选石油高效降解菌，经斜面培养、制备种子液、液态发酵、固态发酵，制成有效活菌数目高的石油降解菌剂。采用本发明所述菌剂，同时施加一定量的氮磷农用复合肥，与污染土壤混合均匀，提供微生物生长的条件，能够取得显著的石油降解效果。

本发明所述的石油污染土壤修复固体菌剂及其制作方法与现有的微生物菌剂相比，具有如下优点：所用菌种为石油污染场地的土著菌，解除了外来菌株的不适应性；采用液态、固态两步发酵培养的方法活菌数目能提高10倍以上，降低液态发酵的压力和能耗；所选用的固态发酵原料麸皮和草炭能显著增加土壤的有机质含量，激活土壤中的多种微生物活性，改善土壤的微生态环境；添加的复合肥料能够刺激微生物生长，加快对石油污染物的降解，也能刺激土壤中的其他微生物、植物的生长，加速土壤修复的进程。本发明所述固体菌剂制备过程简单易操作，成本低廉，在石油污染土壤的生物修复领域具有广阔的应用前景。

具体实施方式

本发明所述的两株细菌分别是抗辐射不动杆菌(Acinetobacter radioresistens)和红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)，两株细菌均分离自我国胜利油田的石油污染土壤，抗辐射不动杆菌的菌种保藏号为CGMCC No.3094，红平红球菌的菌种保藏号为CGMCCNo.3095。抗辐射不动杆菌，微生物株名为R1，不动杆菌属，革兰氏阴性菌，球状菌，呈多形性，成对排列或呈短链，无芽胞及鞭毛，无动力，有荚膜，专性需氧，硝酸盐反应及氧化酶试验阴性。红平红球菌，微生物株名R5，红球菌属，革兰氏阳性菌，严格好氧，不运动，杆状，细胞壁属于IV型，不产生水溶性色素，无气生菌丝体，可氧化葡萄糖产酸，不发酵，不产气，不能水解淀粉，过氧化氢酶阳性，硝酸盐还原反应阴性。

实施例1：石油污染土壤修复菌剂的制备

采用的细菌是前述的抗辐射不动杆菌和红平红球菌，分别将其经过斜面培养、制备种子液、液态发酵培养、固态发酵培养得到修复菌剂，具体操作步骤为：

(1)斜面培养：采用常规方法制备牛肉膏蛋白胨斜面培养基，具体步骤为：牛肉膏3g，蛋白胨5g，NaCl 5g，蒸馏水1000mL，pH7.2～7.4，琼脂1.5％～2％，121℃灭菌20～30min。灭菌后做成斜面，将保藏的菌株转接到试管斜面上，25～30℃条件下培养16h后备用；

(2)制备一级种子液：液体培养基仍为牛肉膏蛋白胨培养基，将配制好的液体培养基分装入150或250mL三角瓶内，装液量为50mL，于121℃灭菌30min。从斜面转接菌种至三角瓶中，然后置于摇床上培养，调节摇床转速为150～250rpm，20～30℃条件下培养16h，待培养基混浊后接入发酵培养基中培养。

(3)液态发酵培养：将活化好的细菌的一级种子液，分别接种量接入发酵培养基内，发酵培养基配方如下：葡萄糖1～3g，豆粕粉为0.5～2g，酵母粉为0.1～1g，K₂HPO₄0.11g，CaCl₂0.01g，MgSO₄·7H₂O 0.15g，MnSO₄0.01g，蒸馏水100mL。一级种子液的接种量为液态发酵培养基体积的2％，接种后置于摇床上培养16h，温度为20℃，摇床转速为150rpm。此条件下得到高密度的细菌发酵液，抗辐射不动杆菌和红平红球菌的有效活菌数分别约为3.0×10⁸CFU/mL和1.0×10⁸CFU/mL。

(4)固态发酵培养：固态培养基为高温灭菌后的麸皮与草炭重量比为0.5∶1的混合物，将分别在摇瓶中培养的两种发酵液按固态培养基重量的5％单独接种在上述固态培养基中，混合均匀，调整水分占固体发酵培养基重量的30％，通入无菌空气，于20℃下培养2天，室温风干，即得单一菌种固态培养物。干燥完毕将两种固态培养物等量混合均匀即制得成品。

在该石油污染土壤修复固体菌剂成品中，所述抗辐射不动杆菌和红平红球菌的有效活菌数分别约为8.0×10⁹CFU/g和3.0×10⁹CFU/g。

实施例2：石油污染土壤修复菌剂的制备

与实施例1所用材料和参数基本相同，所不同的是，液态发酵培养中：一级种子液的接种量为液态发酵培养基体积的10％，接种后置于摇床上培养32h，温度为30℃，摇床转速为250rpm，抗辐射不动杆菌和红平红球菌的有效活菌数分别约为5.0×10⁸CFU/mL和2.5×10⁸CFU/mL；固态发酵培养中：培养基为高温灭菌后的麸皮与草炭重量比为2∶1的混合物，调节培养基水分为60％，发酵液接种量为10％，培养时间为4天，所得石油污染土壤修复固体菌剂成品中，所述抗辐射不动杆菌和红平红球菌的有效活菌数分别约为1.5×10¹⁰CFU/g和8.0×10⁹CFU/g。

实施例3：石油污染土壤修复菌剂的制备

与实施例1或2所用材料和参数基本相同，所不同的是，液态发酵培养中：一级种子液的接种量为液态发酵培养基体积的7％，接种后置于摇床上培养30h，温度为28℃，摇床转速为200rpm，抗辐射不动杆菌和红平红球菌的有效活菌数分别约为4.5×10⁸CFU/mL和2.0×10⁸CFU/mL；固态发酵培养中：培养基为高温灭菌后的麸皮与草炭重量比为1∶1的混合物，调节培养基水分为45％，发酵液接种量为8％，培养时间为3天，所得石油污染土壤修复固体菌剂成品中，所述抗辐射不动杆菌和红平红球菌的有效活菌数分别约为1.0×10¹⁰CFU/g和6.0×10⁹CFU/g。

实验例4：细菌对原油的降解能力试验

利用实施例1(2)中制备的两种细菌的种子液进行实验，其中1#为抗辐射不动杆菌，2#为红平红球菌，3#为抗辐射不动杆菌和红平红球菌的等量混合液，按照5％的接种量分别接种到到原油培养基(NH₄NO₃2.0g，K₂HPO₄1.5g，KH₂PO₄3.0g，MgSO₄·7H₂O0.1g，无水CaCl₂0.01g，Na₂EDTA₂·H₂O0.01g，原油0.5～1.0g/L，pH7.5，H₂O1000mL)中，置于20～30℃摇床上培养7d，转速为150～250rpm。以不接菌的培养基为空白对照。培养结束时，向培养液中加入三氯甲烷，进行萃取，将萃取液加热至75℃，使三氯甲烷挥发干净，采用重量法测定培养液中残油含量。采用下面公式计算石油烃的生物降解率(η％)：

η(％)＝(ω₀-ω_x)/ω₀×100

式中：ω₀为对照培养液中残油含量；ω_x为测试菌培养液中残油含量。

在液体摇瓶中两种细菌对原油均有降解能力，其中1#降解率为40％，2#降解率为35.3％，3#降解率为45.9％，可见两种细菌组合对原油的降解率较高，随着时间延长，降解率也会逐渐升高。

摇瓶中细菌对原油的降解结果

实验例5：固体菌剂应用效果试验

采用本发明制备的固体菌剂进行盆土试验。具体方法为：从农田中采集土样，按5％加入新鲜石油，自然风干，粉碎，混匀。做三组实验：(1)称取土样1.0kg，加入菌剂10g，硝基磷酸铵10g；(2)称取土样1.0kg，加入菌剂10g；(3)只称取土样1.0kg做空白对照。混合均匀，装入花盆，保持水分含量为20～50％左右，保持土壤松散，室温放置，修复一个月，采用常规的重量法测定石油含量。计算公式为石油总烃(g/kg)＝蒸发瓶中残留物重/鲜土重*(1-含水率％)*1000。经过一个月的修复，(1)的石油降解率为42.4％，(2)的石油降解率为22.5％，由此可以看出，硝基磷酸铵能较大的提高菌剂的石油降解能力。

实验例6：固体菌剂应用效果试验

采用本发明制备的固体菌剂修复胜利油田含盐2.0％、含油2.0～2.5％的盐碱地土壤。具体方法为：对现场进行模拟原位修复，挖2个边长为2m深0.5m的土坑(编号为1^#、2^#)，取含油土壤4m³，充分搅拌均匀，分成2份，1^#区域为空白对照，2^#区域为加入大约50kg的固体菌剂和1％的肥料硝基磷酸铵。将拌匀的这些土壤加入挖好的坑内，保持土壤水分20～50％，每隔一周翻动土壤一次，并进行通风强化，定期取样测定总石油烃含量，修复一个月，采用常规的重量法测定石油含量。计算公式为：石油量(g/kg)＝蒸发瓶中残留物重/鲜土重*(1-含水率％)*1000。经过一个月的修复后，1^#的石油降解率5.7％，2^#的石油降解率达到31.8％，即添加固体微生物菌剂的修复效果良好。

Claims (8)

1.抗辐射不动杆菌(Acinetobacter radioresistens)，保藏号：CGMCC No.3094。

2.一种石油污染土壤修复固体菌剂，是由保藏号是CGMCC No.3095的红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)和权利要求1的抗辐射不动杆菌的一级种子液经液态和固态两步发酵培养后等量混合制成，所述抗辐射不动杆菌和红平红球菌的有效活菌数均在10⁹～10¹¹CFU/g之间。

3.如权利要求2所述的石油污染土壤修复固体菌剂的制备方法，其步骤如下：

(1)一级种子液：

将抗辐射不动杆菌和红平红球菌分别在牛肉膏蛋白胨斜面培养基上活化16～32h后，转接到液体LB培养基或牛肉膏蛋白胨培养基内摇瓶活化16～32h，作为一级种子液；

(2)液态发酵培养：

将上述一级种子液分别转接到液态发酵培养基中摇床培养16～32h，转速为150～250rpm，培养温度为20～30℃，一级种子液的接种量为液态发酵培养基体积的2％～10％，抗辐射不动杆菌和红平红球菌的有效活菌数为10⁷～10⁹CFU/mL；

(3)固态发酵培养：

将两种细菌的发酵培养液按固态发酵培养基重量5％～10％单独接种在固态发酵培养基中，混匀，于20～30℃下培养2～4天，室温风干，即得单一菌种固态培养物，将两种固态培养物等量混合均匀即制得成品。

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征是，步骤(2)中所述液态发酵培养基为：葡萄糖1～3g，豆粕粉为0.5～2g，酵母粉为0.1～1g，K₂HPO₄ 0.11g，CaCl₂ 0.01g，MgSO₄·7H₂O0.15g，MnSO₄ 0.01g，蒸馏水100mL。

5.如权利要求3所述的制备方法，其特征是，步骤(3)中所述固态发酵培养基为高温灭菌后的麸皮与草炭重量比例为0.5～2∶1的混合物，含水量为30％～60％。

6.如权利要求2所述的石油污染土壤修复固体菌剂的应用，其特征是，用于石油或石油产品污染场地的修复处理。

7.如权利要求6所述的应用，其特征是，在进行石油或石油产品污染场地的修复处理时还添加肥料硝基磷酸铵和水。

8.如权利要求7所述的应用，其特征是，所述水的用量为土壤质量的20～50％。