CN102732429B - 多环芳烃降解菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于有机污染物生物修复技术领域，具体的说一种多环芳烃降解菌及其应用。所述降解菌为毛霉(Mucor sp.)的菌株FMM，其已于2011年3月23日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为：CCTCC M 2011092。所述菌株毛霉(Mucor sp.)FMM作为多环芳烃的降解菌剂。本发明所述FMM菌株降解性能稳定，降解底物范围较广，适用于酸性PAHs污染土壤及水的生物修复(pH5-6.5)。
Description
技术领域
本发明属于有机污染物生物修复技术领域，具体的说一种多环芳烃降解菌及其应用。
背景技术
多环芳烃(PAHs)是一类广泛分布于环境中的有机污染物，是石油、煤炭等化石燃料燃烧过程及能源转化过程的副产物，对人体具有潜在的三致危害性。由于PAHs的潜在致癌性、致畸性、致突变性，已引起各国的高度重视。
目前对于PAHs污染土壤生物修复技术已有很多研究，其优点是①费用省，其费用约为焚烧处理费用的1/4-1/3。②环境影响小，生物修复只是一个自然过程的强化，其最终产物是二氧化碳、水和脂肪酸等，不形成二次污染或导致污染物转移。③可以最大限度地降低污染物浓度等。且能改良土壤，提高地力，因此具有广泛的应用和发展前景。
沈阳抚顺灌区已有多年的污灌历史，土壤中积累了大量的PAHs，由于低环组分易于挥发、降解，而中高环部分的自然降解能力相对较低，因此土壤中更多地积累了PAHs高环组分，其中PAHs含量按环数排列4环＞5环＞3环＞6环＞2环，属于老化的石油源污染土壤。针对这种情况本研究以3环的菲、4环的芘、5环的苯并(a)芘)为主，以优势降解菌活性与修复效率为目标，研究了多种菌株的活性和降解能力，其中毛霉(Mucor sp.)的菌株FMM的降解效果最好。实验结果为大规模的原位修复PAHs污染土壤工程提供科学依据。
发明内容
本发明的目的是提供一种多环芳烃降解菌及其应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种多环芳烃降解菌：所述降解菌为毛霉(Mucor sp.)的菌株FMM，其以于2011年3月23日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为：CCTCC M 2011092。
多环芳烃降解菌的应用：所述菌株毛霉(Mucor sp.)FMM作为多环芳烃的降解菌剂。该菌剂作为菲(3环)、芘(4环)和/或苯并(a)芘(5环)的降解菌剂。将所述菌剂按5-10(质量)％的接种量投加到污染土壤或水体中。
本发明所具有的优点：
本发明所得菌株筛选自老污灌区PAHs污染土壤，经过含PAHs污染物的富集培养基的富集培养，再以PAHs污染物为唯一碳源的无机盐培养基驯化培养、筛选、分离、纯化获得。能以菲、芘和苯并(a)芘为唯一碳源和能源生长，在无机盐培养基中，当菲、芘和苯并(a)芘的浓度为72.84mg/l、67.49mg/l和40.34mg/l时，9天内菲、芘和苯并(a)芘的降解率分别为95.33％、95.16％和90.36％。本发明所述FMM菌株降解性能稳定，降解底物范围较广，适用于酸性PAHs污染土壤及水的生物修复(pH5-6.5)。
附图说明
图1为本发明提供的毛霉(Mucor sp.)的菌株FMM菌落形态图。
图2为本发明提供的毛霉(Mucor sp.)的菌株FMM孢囊梗及孢子囊图。
图3为本发明提供的毛霉(Mucor sp.)的菌株FMM对3种污染物的降解率图。
图4为本发明提供的毛霉(Mucor sp.)的菌株FMM对3种污染物的去除效果图。
具体实施方式
实施例1
毛霉(Mucor sp.)菌株FMM的筛选和菌落形态。
高效降解菌毛霉(Mucor sp.)菌株FMM的筛选：
菌液的制备：在90ml含有PAHs污染物的富集培养基中，加入10g污灌区(抚顺市三宝屯北后屯耕层土壤)老化的PAHs污染土壤，于120rpm/min恒温(25℃)摇床中振荡培养7d，待用。
所述含有PAHs污染物的富集培养基为：将2.5ml PAHs溶液加入到无菌的500ml三角瓶中，使富集培养基中多环芳烃总量浓度为200mg/L；待溶剂挥发完后，再将分装好的90ml无菌富集培养基倒入三角瓶中。所述富集培养基按重量百分比计为：葡萄糖0.1％，蛋白胨0.05％，酵母膏0.05％，NaCl 0.5％，NH4NO3 1.0％，K2HPO4 0.5％，KH2PO4 0.5％，MgSO4.7H2O 0.02％，余量为自来水，pH 6.0。灭菌条件为：0.1Mpa湿热灭菌30min。
而后按10％(质量)接种量将上述种液转接到装有30ml无机盐培养基的150ml三角瓶中，使培养基中PAHs总量浓度约为200mg/L。于25℃，120rpm/min条件下进行驯化培养7d。以此重复三次上述富集培养和驯化培养即为降解PAHs的菌液。
所述无机盐培养基按照重量百分比计(％)：NaCl 0.01；NH4NO3 0.1；CaCl2 0.01；MgSO4.7H2O 0.02；FeCl3 0.002；KH2PO4 0.1；K2HPO4 0.1，水100ml，pH为6.0。
在上述菌液中通过平板分离、纯化获得毛霉(Mucor sp.)的菌株FMM。(参见图1、图2)。
上述菌株已于2011年3月23日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为：CCTCC M 2011092。
毛霉(Mucor sp.)的菌株FMM菌体形态为无假根和匍匐枝，孢囊梗直接由菌丝体生出，单生，不分枝顶端有膨大的孢子囊，孢子囊球形，囊轴与孢囊梗相连处无囊托。菌落形态见图1。孢囊梗及孢子囊形态见图2。
菌株FMM最适生长及最佳降解温度为23℃-28℃，在低于10℃或高于40℃时生长缓慢，最适生长pH值为5-6。
实施例2
将上述分离、纯化后的毛霉(Mucor sp.)的菌株FMM进行活化，所述活化即把一支固体斜面保存的FMM菌株的试管，全部转移到150ml三角瓶中，每瓶装有30ml已灭菌的PDA培养基。130转/min，25℃振荡培养7d。即为FMM菌液。所述PDA培养基：马铃薯200g、蔗糖20g，水1000ml，pH6.0。
降解效果实验采用摇瓶液体培养法进行。每个处理设3个重复。在无菌条件下，吸取0.60mlPAHs溶液置于已灭菌的150ml空三角瓶中，盖上通气的高温塑料膜，通风至近干，再加入0.5ml丙酮，通过振摇将污染物溶解，再通风至近干，加入30ml已灭菌的无机盐培养基，接种已活化的1.5ml(接种量5％)FMM菌液，振荡培养，130转/min，25℃震荡培养9天。
将上述培养9天后的培养液进行处理，采用二氯甲烷萃取，在三角瓶中加入二氯甲烷10ml，盖上密封塑料膜，180转/min振荡5min，静止分层后，下层(二氯甲烷层)放入装有无水Na2SO4漏斗中，过滤到25ml比色管中。上层再萃取两次，步骤同上，最后定容至25.0ml，取2ml过0.22um有机膜。准确吸取过膜后的液体40ul置于样品瓶中，自然挥发近干后，用过膜的色谱纯甲醇定容至1ml，用高效液相色谱仪测定。
分析培养液中污染物的残留浓度，根据初始投加量的减少，计算去除率(参见表1及图3)。由表1和图3可知9天后的残留浓度测定结果，及菌株毛霉-FMM对3种污染物的降解率。结果表明，当菲、芘和苯并[a]芘初始浓度为72.84mg/l、67.49mg/l和40.34mg/l时，9天内菲、芘和苯并(a)芘的降解率分别为96.86％、95.38％和90.70％。
相同条件下不接种FMM菌液的对照菲、芘和苯并(a)芘的降解率仅为14.02％、3.08％和4.64％。
所述PAHs溶液为菲、芘和苯并(a)芘混合液，菲、芘浓度为4mg/ml，苯并[a]芘为2mg/ml，3种污染物浓度总量约为10mg/ml，溶剂为二氯甲烷。
所述无机盐培养基按照重量百分比计(％)：NaCl 0.01；NH4NO3 0.1；CaCl2 0.01；MgSO4.7H2O 0.02；FeCl3 0.002；KH2PO4 0.1；K2HPO4 0.1，水100ml，pH为6.0。
表1菌株毛霉-FMM降解PAHs 9d后的残留浓度(mg·L-1)
实施例3
将上述FMM菌液，从冰箱中取出放置至室温，进行活化。所述活化即在无菌条件下，按10％(质量)接种至已灭菌的PDA培养基中。用150ml三角瓶，每瓶装有30ml已灭菌的PDA培养基。130转/min，25℃振荡培养7d。即为FMM菌液。
实验采用摇瓶液体培养法进行。每个处理设3个重复。在无菌条件下，吸取0.60mlPAHs溶液置于已灭菌的150ml空三角瓶中，盖上通气的高温塑料膜，通风至近干，再加入0.5ml丙酮，通过振摇将污染物溶解，再通风至近干，加入已灭菌的30ml无机盐培养基中。30ml培养基接种3ml菌剂(接种量10％)，振荡培养，130转/min，28℃震荡培养10天。
将上述培养9天后的培养液进行处理，采用二氯甲烷萃取，在三角瓶中加入二氯甲烷10ml，盖上密封塑料膜，180转/min振荡5min，静止分层后，下层(二氯甲烷层)放入装有无水Na2SO4漏斗中，过滤到25ml比色管中。上层再萃取两次，步骤同上，最后定容至25.0ml，取2ml左右过0.22um有机膜。准确吸取过膜后的液体40ul置于样品瓶中，自然挥发近干后，用过膜的色谱纯甲醇定容至1ml，用高效液相色谱仪测定。
分析培养液中污染物的残留浓度，根据初始投加量的减少，计算去除率(参见表2及图4)。结果表明，当菲、芘和苯并[a]芘初始浓度为93.94mg/ml、95.26mg/ml和44.44mg/ml时，10天后去除率为90.80％、89.83％和85.70％。不投加菌剂的对照去除率分别31.15％、26.97％和17.03％。实验结果表明FMM菌剂有非常明显的去除效果。
所述PAHs溶液为菲、芘和苯并(a)芘混合液，菲、芘浓度为4mg/ml，苯并[a]芘为2mg/ml，3种污染物浓度总量约为10mg/ml，溶剂为二氯甲烷。
表2菌株毛霉-FMM降解PAHs 10天后的残留浓度(mg·L-1)
| 处理 | 菲 | 芘 | Bap | 总量 |
| 初始 | 93.94 | 95.26 | 44.44 | 233.64 |
| 对照 | 64.68 | 69.57 | 36.87 | 171.12 |
| FMM | 8.64 | 9.69 | 6.35 | 24.68 |
Claims (3)
1.一种多环芳烃降解菌，其特征在于：所述降解菌为毛霉(Mucor sp.)的菌株FMM，其于2011年3月23日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为：CCTCC M2011092。
2.一种按权利要求1所述的多环芳烃降解菌的应用，其特征在于：所述菌株毛霉(Mucor sp.)FMM用来制备多环芳烃的降解菌剂；
所述多环芳烃为菲、芘和/或苯并(a)芘。
3.按权利要求2所述多环芳烃降解菌的应用，其特征在于：将所述菌剂按质量百分比5-10％的接种量投加到污染土壤或水体中。
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