CN111961640B

CN111961640B - 一种尿源性肾干细胞三维分化模型的构建方法及培养体系

Info

Publication number: CN111961640B
Application number: CN202010347932.9A
Authority: CN
Inventors: 左为; 张婷
Original assignee: Tongji University; Regend Therapeutics Co Ltd
Current assignee: Tongji University; Regend Therapeutics Co Ltd
Priority date: 2020-04-27
Filing date: 2020-04-27
Publication date: 2023-05-12
Anticipated expiration: 2040-04-27
Also published as: CN111961640A

Abstract

本发明提供了一种尿源性肾干细胞三维分化模型的构建方法及培养体系，所述的构建方法包括如下步骤：提取和二维细胞培养步骤，从尿液中提取干细胞，然后在滋养层细胞上，用尿源性肾干细胞培养液传代培养，得尿源性肾干细胞；三维细胞分化步骤，取尿源性肾干细胞加入尿源性肾干细胞培养液，重新混悬，得尿源性肾干细胞悬液，取支架材料，加入所述尿源性肾干细胞悬液培养，得三维分化模型；所述滋养层细胞为成纤维细胞，通过与其共培养，可以有效获得大量有活性、纯度较高的肾干细胞，同时也能很好地维持肾干细胞的特性，即自我更新能力和分化潜能，肾干细胞能在短期内在三维分化中形成再生组织和微器官以供移植治疗和药物筛选。

Description

一种尿源性肾干细胞三维分化模型的构建方法及培养体系

技术领域

本发明涉及细胞生物领域，具体涉及一种尿源性肾干细胞三维分化模型的构建方法及培养体系。

背景技术

由各种肾脏相关疾病或毒性物质引发的终末期肾衰竭是困扰医学界的一大难题。目前治疗肾衰竭的唯一有效的根治手段是原位肾移植。而由于受到供体器官短缺和手术繁复、耗费大、并发症繁复等因素制约，肾移植并不适用于所有终末期肾衰竭患者。近年来，作为器官移植的替代治疗手段，细胞移植在血液***疾病、自身免疫病以及心、肝、肾等重要器官的功能性障碍等医学的领域的作用日渐得到重视，其潜在的应用价值使得细胞移植研究领域取得了巨大的进展。其优点包括细胞来源广泛、治疗过程低创以及避免了异体器官移植带来的免疫排斥和伦理问题等。

在使用细胞移植手段治疗急性或慢性肾损伤的应用中，种子细胞的选择至关重要。目前再生医学领域认为具有潜在应用价值的种子细胞包括异体全能干细胞、诱导性多能干细胞、成体多能干细胞和成体组织特异性干细胞等。其中，成体组织特异性干细胞能够从自体组织中获取，且具有定向分化成特异的组织器官的特点。此外，与异体全能干细胞和诱导性多能干细胞等种子细胞相比，成体组织特异性干细胞获取相对容易、成瘤性低，不存在组织相容性问题和伦理争议，作为种子细胞具有极大优势。肾脏干细胞是存在于成体肾脏上皮组织中的一种具有分化成成熟肾脏功能细胞的干细胞。多项研究表明，在一定程度的肾损伤后，存在于肾单位特定位点中的少数肾脏干细胞能够迅速增殖并分化，代替受损的成熟肾小球或肾小管细胞发挥功能，从而达到修复局部损伤的目的。因此，从尿液中提取得到这类肾脏干细胞可能为细胞治疗技术提供理想的种子细胞。这类细胞能够从患者本人的尿液中提取，作为自体细胞具有分离过程安全低创、制备过程简便和操作成本低等特点。并且经过分离纯化的肾脏干细胞具有较高的自我更新能力，经过短时间培养即能够获得足够数量的细胞，并且其分化表型稳定，能够满足科研研究和临床应用的需求，具有巨大的应用潜力。

目前，从尿液中获得肾干细胞多采用二维细胞培养方式，细胞处于平面结构，很难形成相应的具有立体结构的组织或者器官，而肾干细胞移植后发挥修复作用往往通过分化形成肾小管或肾小球的组织细胞来实现的，因此，肾干细胞的诱导分化非常重要。本发明利用三维培养的体系，高效诱导干细胞分化，形成具有三维结构的“微器官”，可用于后续移植或药物筛选等检测。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术因无法从尿液中分离培养制得具有肾脏损伤结构修复能力的肾干细胞而导致移植治疗的肾脏损伤组织难以修复以及采用二维培养方式诱导尿源性肾干细胞分化效率低下的缺陷，从而提供一种尿源性肾干细胞三维分化模型的构建方法及培养体系，可以获得尿源肾干细胞并有效诱导其向肾上皮细胞的分化，在短期内形成再生组织和微器官以供移植治疗和药物筛选等。

本发明提供了一种尿源性肾干细胞三维分化模型的构建方法，包括如下步骤：

分离和二维细胞培养步骤，从尿液中提取干细胞，然后在滋养层细胞上，用尿源性肾干细胞培养液传代培养，得尿源性肾干细胞；

三维细胞分化步骤，取尿源性肾干细胞加入尿源性肾干细胞培养液，重新混悬，得尿源性肾干细胞，取支架材料，加入所述尿源性肾干细胞，再用尿源性肾干细胞分化培养液培养，得三维分化模型；

所述滋养层细胞为成纤维细胞，所述尿源性肾干细胞培养液为含有DMEM/F12培养基200～300ml、胎牛血清20-70ml、L-谷氨酰胺0.2-2mM、胰岛素1-14ng/ml、表皮生长因子0.1-1ng/ml、腺嘌呤5-30μg/ml、氢化可的松2-20μg/ml，所述尿源性干细胞分化培养液含有DMEM培养基200～300ml、F12培养基200～300ml、L-谷氨酰胺0.2-2mM、50-300ug/ml FGF9和10-70ug/ml HGF。

进一步地，所述滋养层细胞来源于胚胎成纤维细胞；

所述胚胎成纤维细胞包括已建系的成纤维细胞和原代培养获得的成纤维细胞。

优选地，所述滋养层细胞包括胚胎细胞为小鼠胚胎成纤维细胞3T3-J2。

进一步地，所述支架材料选自胶原蛋白、海藻酸钠、明胶、琼脂糖、基质胶、透明质酸、壳聚糖、葡聚糖、肾脏脱细胞支架、层连接蛋白、纤连接蛋白和纤维蛋白中的至少一种；和/或，所述支架材料为3D打印支架材料。

进一步地，所述的构建方法，包括如下步骤：

分离和二维细胞培养步骤，收集尿液，离心，弃上清后，得残留液，加入洗涤缓冲液进行洗涤，然后离心，得细胞沉淀，加入尿源性肾干细胞培养液，重悬细胞，得干细胞悬浮液，将滋养层细胞铺于培养器皿底部，建立滋养层细胞培养体系，将上述干细胞悬浮液铺到滋养层细胞上进行培养，得尿源性肾干细胞；

三维细胞分化步骤，取上述尿源性肾干细胞，去除滋养层细胞后消化尿源性干细胞，离心，弃上清得细胞沉淀，加入肾干细胞培养液，重悬，得到尿源性肾干细胞悬液，滴入含基质胶滴的玻片上，进行三维细胞培养，将培养基更换为含有100μg/ml FGF9和30μg/mlHGF的分化培养基，得尿源性肾干细胞三维分化模型。

进一步地，含基质胶滴的玻片，构建方法为取30-100μl 100％基质胶于玻片上形成基质胶滴，放入37℃中30min后可加入肾干细胞悬液进行三维培养。

优选地，在所述提取和二维细胞培养步骤中，取滋养层细胞加入滋养层细胞培养基进行传代培养，待细胞数量扩增至1×10⁸～2×10⁸个细胞后，消化细胞，离心，弃上清，收集细胞沉淀，重悬，得到浓度为1×10⁶～1×10⁷个/mL的重悬细胞液，用γ射线放射处理使其失去生长活性，然后将5％-30％基质胶加入培养器皿中，孵育，吸弃基质胶并按照5×10³～2×10⁵个/cm²的密度加入滋养层细胞，滋养层细胞贴壁，得到滋养层细胞培养体系。

进一步地，在所述提取和二维细胞培养步骤，在滋养层细胞贴壁后，将干细胞悬浮液按照0.1×10⁵～5×10⁵个/cm²的密度铺在滋养层细胞上，培养3-5天进行第一次细胞换液，然后以每2-3天1次的频率进行细胞换液，传代培养，得尿源性肾干细胞。

优选地，由滋养层细胞和尿源性肾干细胞培养液组成，所述滋养层细胞为生长灭活的成纤维细胞。

进一步地，所述滋养层细胞来源于胚胎成纤维细胞；

本发明还提供了上述任一所述的构建方法制备得到的尿源性肾干细胞三维分化模型或上述任一所述的培养体系在药物筛选、生理病理学研究、细胞治疗和肾脏组织工程中的应用。

本发明提供的尿源性肾干细胞三维分化模型的培养方法，包括分离和二维细胞培养步骤，从尿液中提取干细胞，然后在滋养层细胞上，用尿源性肾干细胞培养液传代培养，得尿源性肾干细胞；三维细胞分化步骤，取尿源性肾干细胞加入尿源性肾干细胞培养液，重新混悬，得尿源性肾干细胞，取支架材料，加入所述尿源性肾干细胞，再用尿源性肾干细胞分化培养液培养，得三维分化模型。首先，本发明采用特定的尿源性肾干细胞培养液具有成分较少、组成简单、稳定性好的优势，有利于后续进行临床级培养基和产品的开发，在细胞二维培养过程中通过使用成纤维细胞构建的滋养层细胞培养体系与特定的尿源性肾干细胞培养液相结合，能够对肾干细胞进行逐步筛选，获得纯度较高的肾干细胞，促进肾干细胞的稳定增殖，同时也能很好地维持肾干细胞的特性，即自我更新能力和分化潜能。在该***中，肾干细胞能够在体外长期传代培养10代以上，同时保持其干细胞特性，成克隆状生长，保持增殖活性，表达典型的肾干细胞标记特征，也是尿源肾干细胞高效诱导分化的前提条件；其次，对获得的尿源性肾干细胞进行三维细胞分化步骤，高效诱导其分化，获得三维分化模型，利用三维培养***，联合尿源性肾干细胞分化培养液，高效诱导尿源性肾干细胞分化，在短期内形成再生组织和微器官以供移植治疗。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例1制得的尿源性肾干细胞的细胞形态图。

图2是本发明实施例1制得的尿源性肾干细胞三维分化模型的形态图。

图3是本发明实施例1制得的尿源性肾干细胞的染色图，其中A为PAX2染色图；B为SOX9染色图；C为DAPI染色图。

图4是本发明中制得的尿源性肾干细胞三维分化模型的染色图，A为AQP1染色图；B为DAPI染色图。

图5是本发明中移植肾干细胞在体内三维分化后顺铂处理组和对照组小鼠肾脏图；其中A和B为顺铂处理组；C和D为对照组。

图6是本发明中移植肾干细胞在体内三维分化后顺铂处理组和对照组小鼠肾脏切片Kim1染色图；其中A-C为顺铂处理组，A为Kim1染色图，B为GFP染色图；C为DAPI染色图；D-F为对照组，D为Kim1染色图，E为GFP染色图；F为DAPI染色图。

图7是本发明中移植肾干细胞在体内三维分化后顺铂处理组和对照组小鼠肾脏切片Caspase3染色图；其中A-C为顺铂处理组，A为Caspase3染色图，B为GFP染色图；C为DAPI染色图；D-F为对照组，D为Caspase3染色图，E为GFP染色图；F为DAPI染色图。

图8是本发明对比例1制得的尿源性干细胞的细胞形态。

具体实施方式

提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。

实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。

实施例1

本实施例提供了一种尿源性肾干细胞三维分化模型的构建方法，包括如下步骤：

(1)分离和二维细胞培养步骤：取3支离心管，各加入青霉素/链霉素双抗溶液(100X)500μl和2.5mg/ml的两性霉素溶液50μl，取慢性肾病患者的尿液150ml，将尿液平均加入上述3支离心管中，以420g的速度离心10分钟，弃上清，保留离心管底部约2ml尿液，将所有离心管中的尿液合并入1个离心管中，加入洗涤缓冲液至50ml，吹打重悬底部细胞沉淀，再次以380g的速度离心15分钟，弃上清并加入洗涤缓冲液，重复此过程3次，最后一次离心后，彻底弃去上清，仅留底部细胞沉淀，加入1ml肾干细胞培养基吹打重悬细胞，得细胞悬浮液。

其中，所述洗涤缓冲液应在使用前配置，其配方包括基础培养基和添加成分两部分，基础培养基为F12培养基，添加成分为胎牛血清6％(体积比)、100X左旋谷氨酰胺溶液1％(体积比)、100X青霉素/链霉素双抗溶液1％(体积比)；所述肾干细胞培养基含有DMEM培养基225ml、F12培养基225ml、胎牛血清50ml、L-谷氨酰胺1.2mM、胰岛素5ng/ml、表皮生长因子0.5ng/ml、腺嘌呤30μg/ml、氢化可的松10μg/ml。

小鼠胚胎成纤维细胞3T3-J2细胞为滋养层细胞，加入滋养层细胞培养基进行传代培养，待3T3-J2细胞扩增至1×10⁸个细胞后，消化培养的细胞，以350g的速度离心10分钟，弃上清，收集细胞沉淀，按照1×10⁶个细胞/30ml的浓度用30ml的滋养层细胞培养基重悬细胞沉淀，吹打混匀后进行γ射线放射处理，照射量为60Gy/次，得生长灭活的滋养层细胞。然后将20％(体积比)基质胶400μl加入12孔板中，置于37℃环境下孵育30分钟后，吸弃基质胶并按照5×10³个细胞/cm²的细胞量加入滋养层细胞，使其铺满培养容器的底部，培养6小时，待其贴壁后使用。其中滋养层细胞培养基为加入10wt％FBS、1wt％青霉素/链霉素双抗溶液和1wt％左旋谷氨酰胺溶液的DMEM基础培养基。

将制得的干细胞悬浮液铺在滋养层细胞上，置于37℃，5％CO₂条件下培养，培养3天后进行第一次细胞换液，之后按照每2天1次的频率换液。14天发现有细胞克隆的形成，说明分离成功，继续在滋养层细胞培养体系中培养，得尿源性肾干细胞。

采用倒置相差显微镜观察尿源性肾干细胞的形态并记录，结果如图1所示，尿源性肾干细胞呈克隆状生长，克隆边界清晰，克隆内细胞均一。

(2)三维细胞分化步骤：取P3代尿源性肾干细胞，干细胞克隆生长密度达到70％，使用胰酶消化细胞，并用去滋养层细胞的磁珠分选柱去除培养体系中的滋养层细胞。以350g速度离心10分钟，弃上清，收集细胞沉淀。按照1.33×10⁵个细胞/ml的密度用尿源性肾干细胞培养液重悬细胞，得到肾干细胞悬液。将300μl肾干细胞悬液滴入预先准备好的含有基质胶滴的8孔玻片上，培养24小时，将培养基换为肾干细胞分化培养基。分化7天后细胞聚集成团，呈空泡状细胞球生长，显示出典型上皮细胞分化的特征。得到尿源性肾干细胞三维分化结构。

所述含有基质胶滴的8孔玻片应在使用前30分钟制备，其方法是：准备载有8个隔离小室的玻片，取50μl 100％基质胶迅速滴于小室中央，于37℃条件下静置30分钟待其凝固。

采用倒置相差显微镜观察尿源性肾干细胞的形态并记录，结果如图2所示，细胞聚集成球，中心为空泡，边缘细胞呈现出长梭形，为典型上皮细胞分化特征。

实施例2

(1)分离和二维细胞培养步骤：取3支离心管，加入青霉素/链霉素双抗溶液(100X)500μl作为提取溶液，取慢性肾病患者的尿液150ml，将尿液平均加入上述3支离心管中，以380g的速度离心15分钟，弃上清，保留离心管底部约1ml尿液，将所有离心管中的尿液合并入1个离心管中，加入洗涤缓冲液至50ml，吹打重悬底部细胞沉淀，再次以420g的速度离心10分钟，弃上清并加入洗涤缓冲液，重复此过程2-3次，最后一次离心后，彻底弃去上清，仅留底部细胞沉淀，加入1ml肾脏干细胞培养基吹打重悬细胞，得细胞悬浮液。其中，所述洗涤缓冲液应在使用前配置，其配方包括基础培养基和添加成分两部分，基础培养基为F12培养基，添加成分为胎牛血清4％(体积比)、100X左旋谷氨酰胺溶液1％(体积比)、100X青霉素/链霉素双抗溶液1％(体积比)；所述肾干细胞培养基含有DMEM/F12培养基225ml、胎牛血清50ml、L-谷氨酰胺1.2mM、胰岛素7ng/ml、表皮生长因子0.5ng/ml、腺嘌呤10μg/ml、氢化可的松10μg/ml。

滋养层细胞培养体系的制备步骤：取小鼠胚胎成纤维细胞3T3-J2细胞为滋养层细胞，加入滋养层细胞培养基进行传代培养，待3T3-J2细胞扩增至2×10⁸个细胞后，消化培养的细胞，以350g的速度离心5分钟，弃上清，收集细胞沉淀，按照1×10⁷个细胞/30ml的浓度用30ml的滋养层细胞培养基重悬细胞沉淀，吹打混匀后进行γ射线放射处理，照射量为60Gy/次，得生长灭活的滋养层细胞。然后将20％(体积比)基质胶600μl加入12孔板中，置于37℃环境下孵育15分钟后，吸弃基质胶并按照2×10⁵个细胞/cm²的细胞量加入滋养层细胞，使其铺满培养容器的底部，培养至少6小时，待其贴壁后使用。其中滋养层细胞培养基为含有10wt％FBS、1wt％青霉素/链霉素双抗溶液和1wt％左旋谷氨酰胺溶液的DMEM基础培养基。

将制得的干细胞悬浮液铺在滋养层细胞上，置于37℃，5％CO₂条件下培养，培养4天后进行第一次细胞换液，之后按照每2天1次的频率换液。15天发现有细胞克隆的形成，说明分离成功，继续在滋养层细胞培养体系中培养，得尿源性肾干细胞。

(2)三维细胞分化步骤：取P3代尿源性肾干细胞，干细胞克隆生长密度达到70％，使用胰酶消化细胞，并用去滋养层细胞的磁珠分选柱去除培养体系中的滋养层细胞。以350g速度离心10分钟，弃上清，收集细胞沉淀。按照1.33×10⁵个细胞/ml的密度用尿源性肾干细胞培养液重悬细胞，得到肾脏干细胞悬浮液。将300μl肾干细胞悬液滴入预先准备好的含有基质胶滴的8孔玻片上，培养24小时，将培养基换为分化培养基。分化7天后细胞聚集成团，呈空泡状细胞球生长，显示出典型上皮细胞分化的特征。得到尿源性肾干细胞三维分化结构。

实验例1尿源性肾干细胞的鉴定

本实验例提供了一种人尿源性肾干细胞的鉴定，包括如下步骤：

取实施例1中步骤(1)制得的P3代尿源性肾干细胞进行细胞免疫荧光染色鉴定肾干细胞标志物SOX9和PAX2。待干细胞克隆生长到20-30个细胞大小时，使用4％多聚甲醛固定细胞10分钟。固定结束后，使用PBS洗涤3次，每次5分钟以去除残留的多聚甲醛。加入2.5％Triton X-100对细胞进行通透处理5-8分钟。使用PBS洗涤3次，每次5分钟。加入含有5％-10％驴血清的PBS溶液，对细胞进行封闭处理30-60分钟。去除驴血清PBS溶液，加入含有一抗(SOX9和PAX2)的PBS溶液，4℃孵育过夜。去除含有一抗的PBS溶液，使用PBS洗涤3次，每次10分钟。加入含有能够识别一抗的二抗PBS溶液，室温孵育2小时。去除二抗PBS溶液，加入0.1％DAPI溶液对细胞核染色，孵育10分钟。使用PBS洗涤3次，每次20分钟。封片后置于显微镜下观察细胞。结果如图3所示，SOX9、PAX2和DAPI都显现出阳性的荧光信号，DAPI为细胞核染料，说明克隆中肾干细胞均特异表达肾干细胞标志物SOX9和PAX2。

实验例2尿源性肾干细胞三维分化模型的鉴定

取实施例1步骤(2)制得的尿源性肾干细胞三维分化模型转移到填充满OCT包埋剂的包埋盒中，室温放置30分钟，待基质胶变透明之后将包埋盒放入-80℃冰箱12小时使其凝固。再用冰冻切片机进行切片，切片厚度为5-10μm。切片在提前预冷的100％甲醇中固定10分钟，用PBS清洗，再用10％驴血清封闭30-60分钟；将含有AQP1一抗的液体滴加在切片组织上，室温孵育2小时后，4℃过夜孵育；PBS清洗,将ALEX Flora标记的二抗(同时加入DAPI染液)滴加在切片组织上，室温孵育2小时。PBS洗4次，每次5分钟。之后用封片剂滴加到组织上，然后用盖玻片进行封片处理。最后用荧光显微镜观察拍照。

结果如图4所示，切片中可见AQP1的阳性信号，AQP1是肾小管上皮细胞的标记物，说明在三维分化体系中，铺板进行三维培养诱导的尿源性肾干细胞分化形成肾小管组织细胞。

实验例3尿源性肾干细胞体内三维分化模型在药物筛选中的应用

取实施例1中步骤(1)制得的P3代尿源性肾干细胞，加入表达GFP的慢病毒孵育过夜后，去上清洗去病毒进行培养，得表达GFP的尿源性肾干细胞。

取8-10周的NOD/SCID小鼠8只，在左侧背部切开小口，暴露出左侧肾脏，用微动脉夹夹住肾动脉。然后用手术刀片在肾背部切开，擦去血液后，挖去部分髓质和肾盂组织，然后用医用胶水封住肾脏切口。

将上述表达GFP的尿源性肾干细胞重悬于分化培养基中，加入10μL瑞蓝材料混合后，移植于上述每只小鼠肾脏中，在小鼠肾脏中模拟形成尿源性肾干细胞的三维分化模型。移植后把肾脏放回原位并且缝合伤口。移植后11天，将小鼠平均分成2组，每组4只，一组通过腹腔注射20mg/kg的顺铂(cisplatin)，另一组腹腔注射相同体积的PBS作为对照组。顺铂为一种常见的抗肿瘤药物，具有较强的肾脏毒性，可使肾组织发生损伤。

细胞移植后14天分别取顺铂处理组和对照组小鼠的肾脏组织，观察绿色荧光信号，结果如图5所示，顺铂处理组和对照组小鼠中均可明确观察到GFP信号，说明移植的尿源肾干细胞在小鼠肾脏中整合并形成表达GFP的三维分化结构。

3.7％甲醛固定后，用OCT包埋，放入-80℃过夜后，按照8μm/片的厚度进行切片，分别加入相应的一抗(Kim1和GFP)或(Caspase3和GFP)，然后将切片进行荧光信号的检查。结果如图6和图7所示，顺铂处理组和对照组的小鼠肾脏切片中GFP阳性的肾干细胞形成的结构中都能够观察到标志着肾损伤的Kim1信号，而顺铂处理组小鼠肾脏切片中GFP阳性的肾干细胞形成的结构中也可观察到标志细胞凋亡的caspase3信号，对照组小鼠肾脏切片中则无标志细胞凋亡的caspase3信号。

已知顺铂对肾小管的细胞有损伤作用，以上结果说明当尿源性肾干细胞在体内三维分化模型中分化成肾上皮结构时，能够感应顺铂的信号，受到顺铂的影响，表现出凋亡的反应。因此，尿源性肾干细胞三维分化模型具有用来进行药物筛选的用途。

对比例1常规的尿源性干细胞的培养方法

本实施例提供了一种尿源性干细胞的培养方法，包括如下步骤：

(1)干细胞的提取步骤：取3支离心管，各加入青霉素/链霉素双抗溶液(100×)500μl和2.5mg/ml的两性霉素溶液50μl作为提取溶液，取慢性肾病患者的尿液150ml，将尿液平均加入上述3支离心管中，以420g的速度离心10分钟，弃上清，保留离心管底部约2ml尿液，将所有离心管中的尿液合并入1个离心管中，加入洗涤缓冲液至50ml，吹打重悬底部细胞沉淀，再次以380g的速度离心15分钟，弃上清并加入洗涤缓冲液，重复此过程3次，最后一次离心后，彻底弃去上清，仅留底部细胞沉淀，加入1ml肾干细胞培养基吹打重悬细胞，得尿源性干细胞悬浮液，直接铺被于无滋养层细胞的培养板中培养。

其中，所述洗涤缓冲液应在使用前配置，其配方包括基础培养基和添加成分两部分，基础培养基为F12培养基，添加成分为胎牛血清6％(体积比)、100×左旋谷氨酰胺溶液1％(体积比)、100×青霉素/链霉素双抗溶液1％(体积比)、两性霉素2.5μg/ml(质量体积比)和庆大霉素100μg/ml(质量体积比)；所述肾干细胞培养基含有DMEM培养基225ml、F12培养基225ml、胎牛血清50ml、L-谷氨酰胺1.2mM、胰岛素5ng/ml、表皮生长因子0.5ng/ml、腺嘌呤30μg/ml、氢化可的松10μg/ml。

培养11天后，采用倒置相差显微镜观察所得细胞的形态并记录，结果如图8所示，视野中可见部分细胞的形态与实施例1中所获得的尿源性肾干细胞的形态差异较大，未呈克隆状生长，细胞较大，均一性差，增殖速度慢。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims

1.一种尿源性肾干细胞三维分化模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

三维细胞分化步骤，取尿源性肾干细胞加入尿源性肾干细胞培养液，重新混悬，得尿源性肾干细胞悬液，取支架材料，加入所述尿源性肾干细胞悬液，再用尿源性肾干细胞分化培养液培养，得三维分化模型；

所述滋养层细胞为成纤维细胞，所述尿源性肾干细胞培养液含有DMEM培养基200-300ml、F12培养基200-300ml、胎牛血清20-70ml、L-谷氨酰胺0.2-2mM、胰岛素1-14ng/ml、表皮生长因子0.1-1ng/ml、腺嘌呤5-30μg/ml、氢化可的松2-20μg/ml；

所述尿源性肾干细胞分化培养液含有DMEM培养基200-300ml、F12培养基200-300ml、L-谷氨酰胺0.2-2mM、50-300ug/ml FGF9和10-70ug/ml HGF。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述滋养层细胞来源于胚胎成纤维细胞；

3.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，滋养层细胞为小鼠胚胎成纤维细胞3T3-J2。

4.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，所述支架材料选自胶原蛋白、玻尿酸、海藻酸钠、明胶、琼脂糖、基质胶、透明质酸、壳聚糖、葡聚糖、肾脏脱细胞支架、层连接蛋白、纤连接蛋白和纤维蛋白中的至少一种；和/或，所述支架材料为3D打印支架材料。

5.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

分离和二维细胞培养步骤，收集尿液，离心，弃上清后，得残留液，加入洗涤缓冲液进行洗涤，然后离心，得细胞沉淀，加入尿源性肾干细胞培养液，重悬细胞，得干细胞悬浮液，将已经用辐照灭活的滋养层细胞铺于培养器皿底部，放入细胞培养箱中过夜或隔天后待使用，建立滋养层细胞培养体系，将上述干细胞悬浮液铺到滋养层细胞上进行培养，得尿源性肾干细胞；

三维细胞分化步骤，取上述尿源性肾干细胞，去除滋养层细胞后消化尿源性肾干细胞，离心，弃上清得细胞沉淀，加入肾干细胞培养液，重悬，得到尿源性肾干细胞悬液，滴入含基质胶的玻片上，进行三维细胞培养，得尿源性肾干细胞三维分化模型。

6.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，在所述提取和二维细胞培养步骤中，取滋养层细胞加入滋养层细胞培养基进行传代培养，待细胞数量扩增至1×10⁸～2×10⁸个细胞后，消化细胞，离心，弃上清，收集细胞沉淀，重悬，得到浓度为1×10⁶～1×10⁷个/mL的重悬细胞液，用γ射线放射处理使其失去生长活性，然后将基质胶加入培养器皿中，孵育，吸弃基质胶并按照5×10³～2×10⁵个/cm²的密度加入滋养层细胞，滋养层细胞贴壁，得到铺被滋养层细胞的培养器皿。

7.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，在所述提取和二维细胞培养步骤，在滋养层细胞贴壁后，将干细胞悬浮液按照0.1×10⁵～5×10⁵个/cm²的密度铺在滋养层细胞上，培养3-5天进行第一次细胞换液，然后以每2-3天1次的频率进行细胞换液，传代培养，得尿源性肾干细胞。

8.权利要求1～7中任一所述的构建方法制备得到的尿源性肾干细胞三维分化模型在药物筛选或者生理病理学研究中应用。