CN101679934A - 具有经修饰的岩藻糖基化的糖蛋白的生产 - Google Patents

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Abstract

公开了使缺乏岩藻糖基化糖蛋白N－聚糖的内源性途径的基因工程宿主细胞能够生产具有岩藻糖基化N－聚糖的糖蛋白方法。

Description

具有经修饰的岩藻糖基化的糖蛋白的生产
发明背景
(1)发明领域
本发明涉及糖生物学领域，并且具体而言涉及使缺乏岩藻糖基化糖蛋白N-聚糖的内源途径的基因工程宿主细胞能够生产具有岩藻糖基化N-聚糖的糖蛋白的方法。
(2)相关技术描述
用于人体的糖基化治疗性蛋白质应具有复杂型、人N-糖基化类型。一般而言，使用细菌或真核微生物生产治疗性蛋白质是有利的，因为(a)可快速生产高浓度的蛋白质；(b)可使用无菌的控制良好的生产条件(例如GMP条件)；(c)可使用简单的化学成分确定的生长培养基；(d)易于基因操作；(e)不存在污染性的人或动物病原体；(f)可表达多种蛋白质，包括由于毒性等原因在细胞培养中表达低的那些，以及(g)易于蛋白质回收(例如通过分泌进入培养基中)。但是，原核生物和低等真核生物通常不产生具有复杂型N-糖基化类型的蛋白质。因此，通常使用动物细胞生产治疗性蛋白质，其中需要该蛋白质具有复杂型、类似于人N-糖基化类型。但是，使用动物细胞生产治疗性蛋白质具有许多显著的缺点。
只有某些治疗性蛋白适于在动物细胞(例如，缺乏任何细胞毒性作用或对生长不利的其他作用的那些)中表达。动物细胞培养体系通常非常缓慢，时常需要在仔细控制的条件下生长多于一个星期以生产任何可用量的所关注蛋白质。虽然如此蛋白质产量仍比不过微生物发酵法。此外，细胞培养体系通常需要复杂和昂贵的营养和辅因子，例如胎牛血清。而且，程序性细胞死亡(凋亡)可限制生长。
而且，动物细胞(尤其是哺乳动物细胞)极易被病毒感染或污染。在一些情况下，病毒或其他传染物可危害培养物的生长，而在其他情况下该传染物可为人病原体，使得治疗性蛋白质产品不适于其预期用途。此外，许多细胞培养过程需要使用复杂的、温度敏感的、衍生自动物的生长培养基组分，其可能携带病原体例如牛海绵样脑病(BSE)朊病毒。该类病原体难以检测和/或难以去除或杀灭而同时不破坏生长培养基。在任何情况下，使用动物细胞生产治疗性蛋白质必需进行费用高昂的质量控制以确保产品的安全性。
最近，已显示低等真核生物尤其是酵母可经基因修饰从而表达具有类似于人或人源化的复杂型N-糖基化类型的蛋白质。可通过去除参与生产高甘露糖N-聚糖的所选内源糖基化酶并引入参与生产复杂型N-聚糖的外源酶的多种组合获得该类经基因修饰的低等真核生物。基因工程酵母生产复杂型N-聚糖的方法已描述于美国专利号7029872和美国已公布专利申请号2004/0018590、2005/0170452、2006/0286637、2004/0230042、2005/0208617、2004/0171826、2005/0208617和2006/0160179。举例而言，可筛选或工程化宿主细胞以去除1，6-甘露糖基转移酶活性，否则其会将甘露糖残基添加至糖蛋白的N-聚糖；接着进一步工程化以包括参与生产复杂型、类似于人N-聚糖的各种酶。
动物和人类细胞具有岩藻糖基转移酶途径，其可将岩藻糖残基添加至蛋白质N-聚糖还原末端的GlcNAc残基。人类的岩藻糖基化途径由以下组成：GDP-甘露糖脱水酶和GDP-酮-脱氧-甘露糖-差向异构酶/GDP-酮-脱氧-半乳糖-还原酶(FX蛋白)，二者均位于细胞质，一起将GDP-甘露糖转化至GDP-岩藻糖；位于高尔基体膜上的GDP-岩藻糖转运体，其可将GDP-岩藻糖运输至高尔基体；以及岩藻糖基转移酶(Fut8)，其可通过1，6-键的方式将岩藻糖残基转移至N-聚糖还原末端GlcNAc残基的6位。与高等真核生物相反，许多低等真核生物例如酵母缺乏参与岩藻糖基转移酶途径的酶，产生不包含岩藻糖的糖蛋白(参见，例如，Bretthauer/Catellino，Biotechnol.Appl.Biochem.30：193-200(1999)；Rabina等，Anal.Biochem.286：173-178(2000))。然而，糖蛋白上缺乏岩藻糖已显示在某些情况下具有优势。举例而言，在单克隆抗体、免疫球蛋白分子和相关分子的生产中，已显示从免疫球蛋白的N-聚糖去除岩藻糖可增加或改变其与所选Ig受体的结合，这会引起抗体-依赖性细胞毒性即ADCC等性质的改变(参见，例如，美国已公布专利申请号2005/0276805和US2003/0157108)。
然而，虽然从免疫球蛋白的N-聚糖去除岩藻糖似乎可增强免疫球蛋白的ADCC活性，但是岩藻糖基化N-聚糖看来对其他糖蛋白而言是重要的。例如，小鼠中岩藻糖基转移酶基因的缺失可诱导严重的生长迟缓、出生后发育中的早期死亡以及肺部的气肿样改变。可通过给予外源TGF-β1挽救这些Fut8-/-缺陷型小鼠的气肿样表型。此外，通过重新引入Fut8基因可挽救受损的受体-介导的信号转导，表明核心岩藻糖基化对于生长因子受体例如TGF-β1和EGF的正常功能是必需的(Wang等，Meth.Enzymol.417：11-22(2006)。在获自Fut8-/-小鼠的肺组织中，核心岩藻糖基化的丢失损害低密度脂蛋白(LDL)受体-相关蛋白质-1(LRP-1)的功能，引起***(IGF)-结合蛋白-3(IGFBP-3)的胞吞作用降低(Lee等，J.Biochem.(Tokyo)139：391-8(2006)。在Fut8-/-小鼠的胚成纤维细胞中，α3β1整合素-介导的细胞迁移停止并且细胞信号转导降低，从而鉴定核心岩藻糖对蛋白质功能是必需的(Zhao等，J.Biol.Chem.，281：38343-38350(2006)。此外，有的情况下需要生产抗体组合物，其中组合物中的至少一部分抗体被岩藻糖基化以降低ADCC活性。因此，在具体情况下提供可生产岩藻糖基化糖肽的低等真核生物和细胞是有利的。因此，用于制备低等真核宿主细胞(例如真菌和酵母，尤其是酵母例如巴斯德毕赤酵母、乳酸克鲁维斯酵母和其他)的方法和材料的发展将有助于用于重组生产岩藻糖基化糖蛋白的基因强化酵母株的发展。
发明概述
因此，本发明提供制备可用于生产重组、岩藻糖基化糖蛋白的低等真核表达***的方法和材料。具体而言，提供载体(包含编码一个或多个参与哺乳动物岩藻糖基化途径的酶的基因)和已用这些载体转化以制备可生产岩藻糖基化糖蛋白的宿主细胞的低等真核宿主细胞。这些载体、宿主细胞和方法尤其适用于基于酵母和真菌宿主细胞例如巴斯德毕赤酵母的表达***。
在一个实施方案中，本发明提供用一个或多个编码将GDP-甘露糖转化至GDP-岩藻糖并将岩藻糖与宿主细胞生产的N-聚糖结合的酶活性的载体转化低等真核宿主细胞的方法和材料。在另一实施方案中，本发明包括编码融合蛋白的杂交载体，该融合蛋白包含与非天然前导序列融合的岩藻糖基化途径酶的催化结构域，所述前导序列编码将融合肽靶向内质网、早期高尔基体或晚期高尔基体的适当位点的靶向序列。举例而言，岩藻糖基转移酶的催化结构域与将该催化结构域靶向内质网、早期高尔基体或晚期高尔基体中的位点的前导肽融合。在另一实施方案中，用编码GDP-岩藻糖转移酶(将GDP-岩藻糖从细胞质转移至高尔基体内部)的载体转化低等真核生物宿主细胞。
本发明提供包含岩藻糖基化途径的重组低等真核生物宿主细胞。在具体方面，所述宿主细胞为酵母或丝状真菌，例如毕赤酵母属的酵母，例如巴斯德毕赤酵母。
在另一发面，该宿主细胞就糖蛋白上的N-聚糖而言进一步不显示1，6-甘露糖基转移酶活性并包括与细胞靶向信号肽融合的α1，2-甘露糖苷酶催化结构域，该信号肽通常与该催化结构域无关并选用来将α1，2-甘露糖苷酶活性靶向宿主细胞的ER或高尔基体，藉此当重组糖蛋白通过宿主细胞的ER或高尔基体时产生了包含岩藻糖基化Man5GlcNAc2糖形的重组糖蛋白。
在另一方面，上述宿主细胞进一步包括与细胞靶向信号肽融合的GlcNAc转移酶I催化结构域，该信号肽通常与该催化结构域无关并选用来将GlcNAc转移酶I活性靶向宿主细胞的ER或高尔基体，藉此当重组糖蛋白通过宿主细胞的ER或高尔基体时产生了包含岩藻糖基化GlcNAcMan5GlcNAc2糖形的重组糖蛋白。
在另一方面，上述宿主细胞进一步包括与细胞靶向信号肽融合的甘露糖苷酶II催化结构域，该信号肽通常与该催化结构域无关并选用来将甘露糖苷酶II活性靶向宿主细胞的ER或高尔基体，藉此当重组糖蛋白通过宿主细胞的ER或高尔基体时产生了包含岩藻糖基化GlcNAcMan3GlcNAc2糖形的重组糖蛋白。
在另一方面，上述宿主细胞进一步包括与细胞靶向信号肽融合的GlcNAc转移酶II催化结构域，该信号肽通常与该催化结构域无关并选用来将GlcNAc转移酶II活性靶向宿主细胞的ER或高尔基体，藉此当重组糖蛋白通过宿主细胞的ER或高尔基体时产生了包含岩藻糖基化GlcNAc2Man3GlcNAc2糖形的重组糖蛋白。
在另一方面，上述宿主细胞进一步包括与细胞靶向信号肽融合的半乳糖转移酶II催化结构域，该信号肽通常与该催化结构域无关并选用来将半乳糖转移酶II活性靶向宿主细胞的ER或高尔基体，藉此当重组糖蛋白通过宿主细胞的ER或高尔基体时产生了包含岩藻糖基化Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2糖形的重组糖蛋白。
在另一方面，上述宿主细胞进一步包括与细胞靶向信号肽融合的唾液酸转移酶催化结构域，该信号肽通常与该催化结构域无关并选用来将唾液酸转移酶活性靶向宿主细胞的ER或高尔基体，藉此当重组糖蛋白通过宿主细胞的ER或高尔基体时产生了包含岩藻糖基化NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2糖形的重组糖蛋白。
用编码具体糖蛋白的核酸转化上述宿主细胞，可产生包含多种糖形的糖蛋白组合物，各糖形包含至少一种与之结合的N-聚糖，其中该糖蛋白组合物因此包含多种N-聚糖，其中优势糖形包含期望的岩藻糖基化N-聚糖。基于所期望的具体糖蛋白，本发明方法可用于获得其中优势N-糖形以大于第二优势N-糖形5至80摩尔百分比的量存在的糖蛋白组合物；在另一实施方案中，优势N-糖形以大于第二优势N-糖形10至40摩尔百分比；20至50摩尔百分比；30至60摩尔百分比；40至70摩尔百分比；50至80摩尔百分比的量存在。在另一实施方案中，所述优势N-糖形为期望的岩藻糖基化N-糖形并以占N-聚糖总量大于25摩尔百分比；大于35摩尔百分比；大于50摩尔百分比；大于60摩尔百分比或大于75摩尔百分比的量存在。
因此，提供了用于生产包含多种糖形的糖蛋白组合物的宿主细胞，各糖形包含至少一种与之结合的N-聚糖，其中所述糖蛋白组合物因此包含多种岩藻糖基化N-聚糖，其中优势N-聚糖选自Man5GlcNAc2、GlcNAcMan5GlcNAc2、Man3GlcNAc2、GlcNAcMan3GlcNAc2、GlcNAc2Man3GlcNAc2、GalGlcNAc2Man3GlcNAc2、Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2、NANAGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2和NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2。
在另一方面，大于25摩尔百分比的多种岩藻糖基化N-聚糖基本由其中的糖形选自以下的岩藻糖基化糖形组成：Man5GlcNAc2、GlcNAcMan5GlcNAc2、Man3GlcNAc2、GlcNAcMan3GlcNAc2、GlcNAc2Man3GlcNAc2、GalGlcNAc2Man3GlcNAc2、Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2、NANAGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2和NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2。
在又另一方面，大于25摩尔百分比；大于35摩尔百分比；大于50摩尔百分比；大于60摩尔百分比；大于75摩尔百分比或大于90摩尔百分比的多种N-聚糖基本由其中的糖形选自以下的岩藻糖基化糖形组成：Man5GlcNAc2、GlcNAcMan5GlcNAc2、Man3GlcNAc2、GlcNAcMan3GlcNAc2、GlcNAc2Man3GlcNAc2、GalGlcNAc2Man3GlcNAc2、Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2、NANAGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2和NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2。
在上述糖蛋白组合物中，岩藻糖与N-聚糖还原末端的GlcNAc以α1，3-键连接，与N-聚糖还原末端的GlcNAc以α1，6-键连接、与N-聚糖非还原末端的Gal以1，2-键连接、与N-聚糖非还原末端的GlcNac以α1，3-键连接或与N-聚糖非还原末端的GlcNAc以α1，4-键连接。
因此，在上述糖蛋白组合物的具体方面，所述糖形为α1，3-键或α1，6-键岩藻糖形式，以生成选自下列的糖形：Man5GlcNAc2(Fuc)、GlcNAcMan5GlcNAc2(Fuc)、Man3GlcNAc2(Fuc)、GlcNAcMan3GlcNAc2(Fuc)、GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)、GalGlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)，Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)，NANAGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)和NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)；为α1，3-键或α1，4-键岩藻糖形式，以生成选自下列的糖形：GlcNAc(Fuc)Man5GlcNAc2、GlcNAc(Fuc)Man3GlcNAc2、GlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2、GalGlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2、Gal2GlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2、NANAGal2GlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2和NANA2Gal2GlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2；或为α1，2-键岩藻糖形式，以生成选自下列的糖形：Gal(Fuc)GlcNAc2Man3GlcNAc2、Gal2(Fuc1-2)GlcNAc2Man3GlcNAc2、NANAGal2(Fuc1-2)GlcNAc2Man3GlcNAc2和NANA2Gal2(Fuc1-2)GlcNAc2Man3GlcNAc2。
在其他方面，本发明所述糖蛋白组合物包括其中上述N-糖形以大于第二优势N-糖形约5至80摩尔百分比、10至40摩尔百分比、30至60摩尔百分比、40至70摩尔百分比或50至80摩尔百分比的水平存在的组合物。
定义
如本文所使用，术语“N-聚糖”和“糖形”可互换使用并指N-连接寡糖，例如通过天冬酰胺-N-乙酰葡萄糖胺键与多肽的天冬酰胺残基结合的寡糖。N-连接糖蛋白包含与蛋白质天冬酰胺残基的酰胺氮连接的N-乙酰葡糖胺残基。糖蛋白中存在的优势糖类为葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、甘露糖(Man)、岩藻糖(Fuc)、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)和唾液酸(例如，N-乙酰-神经氨酸(NANA))。对于N-连接糖蛋白，糖基团的加工与翻译一起发生在内质网的内腔并在高尔基体中继续。
N-聚糖具有普通的戊糖核心Man3GlcNAc2。N-聚糖的差异在于分支(天线)的数量，其包含添加至也被称作“三甘露糖核心”、“戊糖核心”或“寡甘露糖核心”的Man3GlcNAc2核心的外周糖(例如，GlcNAc、半乳糖、岩藻糖和唾液酸)。N-聚糖根据它们的分支组分进行分类(例如高甘露糖型、复杂型或杂合型)。“高甘露糖”型N-聚糖具有五个或更多个甘露糖残基。“复杂”型N-聚糖通常具有至少一个与1，3甘露糖臂结合的GlcNAc和至少一个与“三甘露糖”核心的1，6甘露糖臂结合的GlcNAc。复杂型N-聚糖也可能具有半乳糖或N-乙酰半乳糖胺残基，其任选经唾液酸或衍生物(例如，“NANA”或“NeuAc”，其中“Neu”指神经氨酸，“Ac”指乙酰基)修饰。复杂型N-聚糖也可能具有包括“平分型”GlcNAc和核心岩藻糖(“Fuc”)”的链内替换。举例而言，当N-聚糖在三甘露糖核心上包括平分型GlcNAc时，其结构可表示为Man3GlcNAc2(GlcNAc)或Man3GlcNAc3。当N-聚糖包含与三甘露糖核心结合的核心岩藻糖时，其结构可表示为Man3GlcNAc2(Fuc)。复杂型N-聚糖也可在“三甘露糖核心”上具有多个天线，通常称作“多天线聚糖”。“杂合”N-聚糖在三甘露糖核心的1，3甘露糖臂的末端具有至少一个GlcNAc并且在三甘露糖核心的1，6甘露糖臂上具有零个或多个甘露糖。各种N-聚糖也称作“糖形”。
本文使用的缩写为本领域的普通用法，参见，例如上文中糖的缩写。其他常用缩写包括“PNGase”或“聚糖酶(glycanase)”或“葡糖苷酶(glucosidase)”，均指肽N-糖苷酶F(EC 3.2.2.18)。
如本文所使用的术语“表达控制序列”指影响与它们可操作地连接的编码序列的表达必需的多聚核苷酸序列。表达控制序列为控制转录、转录后事件以及核酸序列翻译的序列。表达控制序列包括适当的转录起始、终止、启动子和增强子序列；有效的RNA加工信号例如剪接和多腺苷酸化信号；稳定细胞质mRNA的序列；增强翻译效率的序列(例如核糖体结合位点)；增强蛋白质稳定的序列；和需要时增强蛋白质分泌的序列。这些控制序列的性质随宿主生物体而不同；在原核生物中，这些控制序列一般包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列。术语“控制序列”意在包括至少其存在是表达所必需的所有组分并且也包括其存在是有利的其他组分，例如前导序列和融合伴侣序列。
如本文所使用的术语“重组宿主细胞”(“表达宿主细胞”、“表达宿主***”、“表达***”或简单的“宿主细胞”)意在指引入了重组载体的细胞。应理解的是该类术语不仅意在指具体主题细胞而且也指这一细胞的后代。由于突变或环境影响在后续世代中可能出现一些修饰，这些后代事实上可与亲本细胞不相同但是仍包括在本文所使用术语“宿主细胞”的范围内。重组宿主细胞可为分离的细胞或生长在培养物中的细胞系或位于活体组织或生物体内的细胞。
术语“真核的”指有核的细胞或生物体，并且包括昆虫细胞、植物细胞、哺乳动物细胞、动物细胞和低等真核细胞。
术语“低等真核细胞”包括酵母、真菌、collar-flagellates、微孢子目、alveolates(例如甲藻)、茸鞭生物界(例如褐藻门、原生动物门)、红藻门(例如红藻)、植物(例如绿藻、植物细胞、苔藓)和其他原生生物。酵母和真菌包括但不限于：巴斯德毕赤酵母、芬兰毕赤酵母、Pichia trehalophila、Pichia koclamae、膜醭毕赤酵母、微小毕赤酵母(Ogataea minuta，Pichia lindneri)、Pichia opuntiae、耐热毕赤酵母、Pichia salictaria、Pichia guercuum、Pichia pijperi、Pichia stiptis、甲醇毕赤酵母、毕赤酵母属酵母、酿酒酵母、酵母菌属酵母菌、多形汉森酵母、克鲁维酵母属酵母、乳酸克鲁维酵母、白色念珠菌、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、里氏木霉、Chrysosporium lucknowense、镰刀菌属镰刀菌、禾谷镰刀菌、Fusarium venenatum、小立碗藓和粗糙链孢霉、毕赤酵母属酵母、任何酵母菌属酵母菌、多形汉森酵母、任何克鲁维酵母属酵母、白色念珠菌、任何曲霉属曲霉、里氏木霉、Chrysosporium lucknowense、任何镰刀菌属镰刀菌和粗糙链孢霉。
如本文所使用术语“肽”指短多肽，例如通常少于约50个氨基酸长度并更通常少于约30个氨基酸长度的多肽。如本文所使用该术语涵盖模拟结构以及生物学功能的类似物和模拟体。
如本文所使用，术语“占优势地”或变体例如“优势的”或“其为优势的”应理解为意指在用PNGase处理糖蛋白并用质谱例如MALDI-TOF MS分析所释放的聚糖后占总N-聚糖的摩尔百分比(％)最高的聚糖种类。换言之，短语“占优势地”定义为以大于任何其他单个实体的摩尔百分比存在的单个实体，例如具体的糖形。举例而言，如果一种组合物由40摩尔百分比的种类A、35摩尔百分比的种类B和25摩尔百分比的种类C组成，那么该组合物包括占优势的种类A。
除非另外定义，所有如本文所使用的技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员之一通常理解的相同含义。下文中描述了示例性方法和材料，尽管可使用与本文所述相似或等同的方法和材料实施本发明并对本领域技术人员是显而易见的。所有的出版物和本文描述的其他参考文献以其完整内容并于本文作为参考。如有冲突，以本说明书包括定义为准。这些材料、方法和实施例仅用于说明并不具有限制性。
附图简述
图1图解说明了存在于许多高等真核细胞中的岩藻糖基化途径。
图2显示了制备可生产岩藻糖基化糖蛋白的重组酵母所需的糖基化工程步骤。存在于酵母细胞质中的内源GDP-甘露糖被GDP-甘露糖-脱水酶(GMD)和双功能酶FX转化为GDP-岩藻糖。接着该产物被GDP-岩藻糖转运体(GFTr)转入高尔基体中，并将α-1，6-岩藻糖基转移酶(FUT8)转移至受体聚糖上。蓝色文字表示酶，黑色文字表示代谢中间体。GDP-kdMan(GDP-4-酮-6-脱氧-甘露糖)和GDP-kdGal(GDP-4-酮-6-脱氧-半乳糖)为GDP-甘露糖转化至GDP-岩藻糖的中间体。
图3A显示了用于工程化酵母株中生产岩藻糖基化糖蛋白的载体。显示了向其中引入岩藻糖生物合成和转移基因的表达载体pSH995。将岩藻糖生物合成和转移所需的基因引入pSH995生成了载体pSH1022。
图3B显示了载体pSH1022。(B)中显示了用于整合该基因至毕赤酵母基因组的TRP2基因座的侧接区；优势选择标记NATr；GAPDH-CYC表达盒；以及pUC 19质粒主链。
图4A显示了从大鼠EPO释放的N-聚糖的MALDI-TOF扫描，显示了巴斯德毕赤酵母株YSH661(用包含岩藻糖基化途径基因的载体pSH1022转化株RDP974)产生包含Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)和Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2N-聚糖的rEPO。Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)N-聚糖在方框中。
图4B显示了从大鼠EPO释放的N-聚糖的MALDI-TOF扫描，对照株YSH660(用对照载体pSH995转化的株RDP974)仅产生无岩藻糖基化或不含岩藻糖的Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2N-聚糖。
发明详述
本发明提供使基因工程化宿主细胞可生产具有岩藻糖基化N-聚糖的糖蛋白蛋白质的方法和材料。虽然在酵母巴斯德毕赤酵母(不具有内源性岩藻糖基化途径)中举例说明了这些方法和材料，但是这些方法和材料也可用于基因工程化其他低等真核生物例如真菌、原核生物和其他不具有内源性岩藻糖基化途径的高等真核生物例如昆虫细胞。在其他实施方案中，所述方法和材料可用于基因工程化具有内源性岩藻糖基化途径但是需要增加这些宿主细胞产生的糖蛋白中存在的岩藻糖基化量的高等真核细胞。
一般而言，本发明涉及制备可生产岩藻糖基化糖蛋白的宿主细胞的方法，其方式为向宿主细胞中引入编码参与岩藻糖基化途径的那些酶或酶活性的核酸，这样当引入宿主细胞时使该细胞可生产岩藻糖基化糖蛋白。这些核酸包括例如编码下列的核酸：GDP-甘露糖-4，6-脱水酶活性、GDP-酮-脱氧-甘露糖-差向异构酶活性/GDP-酮-脱氧-半乳糖-还原酶活性、GDP-岩藻糖转运体蛋白和岩藻糖基转移酶活性。高等真核生物中的岩藻糖基化途径的概况显示于图1。
已在许多种中鉴定出GDP-甘露糖-4，6-脱水酶(GMD)(EC4.2.1.47)在NAD存在下将GDP-甘露糖转化成GDP-4-酮-6-脱氧-甘露糖。人GMP(hGMD)由显示于SEQ ID NO：1的核苷酸序列编码并具有SEQ ID No：2中显示的氨基酸序列。具有GDP-甘露糖-脱水酶活性的同源基因包括猪GMD(Broschat等，Eur.J.Biochem.，153(2)：397-401(1985))、秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)GMD和黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)GMD(参见，例如，Rhomberg等，FEBS J.；273：2244-56(2006))；拟南芥(Arabidopsis thaliana)(参见，例如，Nakayama等，Glycobiology；13：673-80(2003))和大肠杆菌(E.coli)(Somoza等，Structure，8：123-35(2000))。
GDP-酮-脱氧-甘露糖-差向异构酶/GDP-酮-脱氧-半乳糖-还原酶(GDP-L-岩藻糖合酶，EC 1.1.1.271)为双功能酶，其存在于真核生物和原核生物中。人GDP-酮-脱氧-甘露糖-差向异构酶/GDP-酮-脱氧-半乳糖-还原酶被称作FX蛋白(也称作hFX或GER)。编码hFX的核苷酸序列显示于SEQ ID NO：3中。hFX蛋白具有SEQ ID NO：4显示的氨基酸序列。
已在若干种中鉴定出GDP-岩藻糖转运体。人GDP-岩藻糖转运体(hGFTr)经鉴定与糖基化-II先天性疾病(CDG-II)相关(Lubke等，Nat.Genet.28：73-6(2001))。也称作白细胞粘附缺陷症II(LADII)，似乎该疾病由选择蛋白配体的岩藻糖基化紊乱引起。Roos和Law，BloodCells Mol.Dis.27：1000-4(2001)。编码hGFTr的核苷酸序列显示于SEQ ID NO：5并且hGFTr的氨基酸序列显示于SEQ ID NO：6。已在其他种中鉴定出具有GDP-岩藻糖转运体活性的同源基因，例如黑腹果蝇(Ishikawa等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.102：18532-7(2005))、小鼠肝脏(Puglielli和Hirschberg；J.Biol.Chem.274：35596-60(1999))和推定CHO同源物(Chen等，Glycobiology；15：259-69(2005))。
已鉴定出许多岩藻糖基转移酶(参见Breton等，Glycobiol.8：87-94(1997)；Becker，Lowe，Glycobiol.13：41R-53R(2003)；Ma等，Glycobiol.16：158R-184R(2006))，例如α1，2-岩藻糖基转移酶(EC 2.4.1.69；由FUT1和FUT2编码)、α1，3-岩藻糖基转移酶(糖蛋白3-α-L-岩藻糖基转移酶，EC 2.4.1.214；由FUT3-FUT7和FUT9编码)、α1，4-岩藻糖基转移酶(EC 2.4.1.65；由FUT3编码)以及α1，6-岩藻糖基转移酶(糖蛋白6-α-L-岩藻糖基转移酶，EC 2.4.1.68；由FUT8编码)。一般而言，α1，2-岩藻糖基转移酶以α1，2-键的方式将岩藻糖转移至N-聚糖的末端半乳糖残基上。一般而言，α1，3-岩藻糖基转移酶和α1，4-岩藻糖基转移酶将岩藻糖转移至N-聚糖非还原末端的GlcNAc残基上。
一般而言，α1，6-岩藻糖基转移酶以α1，6-键的方式将岩藻糖转移至N-聚糖还原末端的GlcNAc残基(天冬酰胺-连接GlcNAc)。通常，α1，6-岩藻糖基转移酶需要三甘露糖核心的至少一个分支的非还原末端的末端GlcNAc残基以使岩藻糖得以添加至还原末端的GlcNAc。但是，已鉴定出需要非还原末端的末端半乳糖残基以使岩藻糖得以添加至还原末端GlcNAc的α1，6-岩藻糖基转移酶(Wilson等，Biochm.Biophys.Res.Comm.72：909-916(1976))并且Lin等(Glycobiol.4：895-901(1994))已证明在缺乏GlcNAc转移酶I的中国仓鼠卵巢细胞中，α1，6-岩藻糖基转移酶可岩藻糖基化Man4GlcNAc2和Man5GlcNAc2N-聚糖。相似的，α1，3-岩藻糖基转移酶(将岩藻糖)转移至N-聚糖还原末端的GlcNAc残基，但是以α1，3-键的方式，通常对具有一个未取代的非还原末端GlcNAc残基的N-聚糖具有特异性。这一酶的N-聚糖产物存在于植物、昆虫和一些其他的无脊椎动物(例如裂体吸虫属(Schistosoma)、血矛线虫属(Haemonchus)、椎实螺属(Lymnaea))中。然而，美国专利号7094530描述了分离自人单核细胞系THP-1的α1，3-岩藻糖基转移酶。
Yamaguchi等(Cytogenet.Cell.Genet.84：58-6(1999))已鉴定出人α1，6-岩藻糖基转移酶(hFUT8)。编码人FUT8的核苷酸序列显示于SEQ ID NO：7。hFUT8的氨基酸序列显示于SEQ ID NO：8。已在其他种中鉴定出具有FUT8活性的同源基因，例如大鼠FUT8(rFUT8)，其具有SEQ ID NO：10显示的氨基酸序列并由SEQ ID NO：9显示的核苷酸序列编码；小鼠Fut8(mFUT8)，其具有SEQ ID NO：12显示的氨基酸序列并由SEQ ID NO：11显示的核苷酸序列编码，以及猪FUT8(pFUT8)，其具有SEQ ID NO：14显示的氨基酸序列并由SEQ IDNO：13显示的核苷酸序列编码。也在CHO细胞(Yamane-Ohnuki等，Biotechnol.Bioeng.87：614-622(2004))、猴肾COS细胞(Clarke和Watkins，Glycobiol.9：191-202(1999))和鸡细胞(Coullin等，Cytogenet.Genome Res.7：234-238(2002))中鉴定出FUT8。Paschinger等，Glycobiol.15：463-474(2005)描述了从秀丽隐杆线虫和黑腹果蝇中克隆和鉴定岩藻糖基转移酶。已鉴定玻璃海鞘(Ciona intestinalis)、拟暗果蝇(Drosophila pseudoobscura)、非洲爪蟾(Xenopus laevis)和斑马鱼(Danio rerio)中的推定α1，6-岩藻糖基转移酶(GenBank登录号分别为AJ515151、AJ830720、AJ514872和AJ781407)。
之前描述的岩藻糖基化途径酶或活性由核酸编码。这些核酸可为DNA或RNA，但是通常这些核酸为DNA因为优选这些编码岩藻糖基化途径酶或活性的核酸可稳定整合入宿主细胞的基因组中。编码岩藻糖基化途径酶或活性的核酸各自与允许该岩藻糖基化途径酶或活性表达的调控序列可操作地连接。该类调控序列包括启动子和任选在编码岩藻糖基化途径酶或活性的核酸上游的增强子以及岩藻糖基化途径酶或活性下游的转录终止位点。所述核酸也通常进一步包括具有核糖结合位点的5′非翻译区和具有多腺苷酸化位点的3′非翻译区。所述核酸常常为载体(例如质粒)的组分，其可在表达岩藻糖基化途径酶或活性的细胞中复制。该载体也可包含允许筛选用该载体转化的细胞的标记。但是，一些细胞类型尤其是酵母可用缺乏载体序列的核酸成功转化。
一般而言，用编码一个或多个岩藻糖基化途径酶或活性的核酸转化的宿主细胞进一步包括一个或多个编码期望糖蛋白的核酸。例如对于岩藻糖基化途径酶而言，编码该糖蛋白的核酸与允许该糖蛋白表达的调控序列可操作地连接。编码所述糖蛋白的核酸可使用该糖蛋白保守区的引物从已知表达该糖蛋白的细胞系扩增(参见，例如，Marks等，J.Mol.Biol.：581-596(1991))。也可基于科学文献中的序列从头合成核酸。也可通过延伸跨越期望序列的重叠寡聚核苷酸合成核酸(参见，例如，Caldas等，Protein Engineering，13：353-360(2000))。
宿主细胞生成的岩藻糖基化N-聚糖结构的类型取决于宿主细胞中的岩藻糖基化途径和具体的岩藻糖基转移酶。举例而言，α1，2-岩藻糖基转移酶一般将岩藻糖添加至N-聚糖的末端半乳糖。这样利用α1，2-岩藻糖基转移酶的途径将优选被引入可产生具有Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2糖形的N-聚糖的宿主细胞。所产生的N-聚糖具有与末端半乳糖残基以α1，2-键连接的岩藻糖。α1，3-岩藻糖基转移酶和α1，4-岩藻糖基转移酶分别以α1，3或α1，4-键的方式将岩藻糖添加至一个或多个非还原末端处或其附近的GlcNAc残基，或者对于一些α1，3-岩藻糖基转移酶而言，以α1，3-键的方式添加至与糖蛋白天冬酰胺残基连接的核心GlcNAc。这样，利用α1，3/4-岩藻糖基转移酶的途径将优选被引入可生成具有至少一种GlcNAcMan5GlcNAc2糖形的N-聚糖的宿主细胞。最后，α1，6-岩藻糖基转移酶一般以α1，6-键的方式将岩藻糖转移至与糖蛋白天冬酰胺残基连接的核心GlcNAc。一般而言，利用α1，6-岩藻糖转移酶的途径优选被引入可生成具有至少一种GlcNAcMan5GlcNAc2、Man5GlcNAc2或Man4GlcNAc2糖形的宿主细胞中。
可根据本文所公开的方法生产的糖蛋白包括用于治疗和诊断目的的任何所需蛋白质，与生产糖蛋白的核酸序列的来源无关。举例而言，N-聚糖未被岩藻糖基化的单克隆抗体具有增强的ADCC活性；然而ADCC活性增强对于意在结合受体配体作为疾病治疗但是不引起ADCC活性的单克隆抗体而言是不希望有的。本文公开的包含岩藻糖基化途径的宿主细胞中生成的单克隆抗体将具有岩藻糖基化N-聚糖并将预期具有降低的ADCC活性。作为另一个实例，附着性免疫蛋白(immunoadhesion)(参见，美国专利号5428130、5116964、5514582和5455165；Capon等，Nature 337：525(1989)；Chamow和Ashkenazi，Trends Biotechnol.14：52-60(1996)；Ashkenazi和Chamow，Curr.Opin.Immunol.9：195-200(1997))，其包含与本发明公开的包含岩藻糖基化途径的宿主细胞生成的抗体的Fc部分融合的膜结合受体的胞外部分，将具有岩藻糖基化N-聚糖并预期具有降低的ADCC活性。可根据本文方法生产的具有岩藻糖基化N-聚糖的糖蛋白的实例包括但不限于***(EPO)；细胞因子例如干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、干扰素-ω和粒细胞-CSF；凝血因子例如凝血因子VIII、凝血因子IX和人类蛋白C；单克隆抗体、可溶性IgE受体α-链、IgG、IgM、IgG，尿激酶、糜蛋白酶和脲胰蛋白酶抑制剂、IGF-结合蛋白、表皮生长因子、生长激素-释放因子、膜联蛋白V融合蛋白、血管他丁、血管内皮生长因子-2、骨髓祖细胞抑制因子-1、骨保护素、组织纤溶酶原激活剂、G-CSF、GM-CSF和TNF-受体。
在具体的实施方案中，一个或多个核酸编码包含与靶向肽融合的岩藻糖基化途径蛋白催化结构域的融合蛋白，所述靶向肽将融合蛋白靶向至细胞的特定区域。通常，该靶向肽将融合蛋白靶向至分泌途径内的位点。因此术语“分泌途径”指细胞内的细胞器和组分，在那里糖蛋白经修饰以备分泌。分泌途径包括内质网(ER)、高尔基体、高尔基体外侧网络和分泌小泡。例如，适当的细胞靶向肽将催化结构域靶向ER、高尔基体、高尔基体外侧网络或分泌小泡。可用于本发明的靶向肽包括美国专利号7029872中描述的那些。在一个实施方案中，岩藻糖转移酶的催化结构域与将该融合蛋白引导至高尔基体的靶向肽融合。与岩藻糖转移酶催化结构域融合的具体靶向肽取决于宿主细胞、具体的岩藻糖基转移酶和所生产的糖蛋白。可用于靶向岩藻糖基转移酶的靶向肽的实例公开于例如美国专利号7029872和美国已公布专利申请号2004/0018590、2004/0230042、2005/0208617、2004/0171826、2006/0286637和2007/0037248。
将编码参与岩藻糖基化途径的酶或活性的核酸连入载体，其可用于转染宿主细胞。通常，这些载体将包括调控元件，其分离自与期望宿主细胞同种的细胞或分离自其他种，但是已知其在***期望宿主细胞时具有功能。通常，这些调控元件包括5’调控序列，例如启动子，以及3’调控序列，例如转录终止子序列。载体通常也包括至少一个选择性标记元件，其允许筛选用载体成功转染的宿主细胞。载体被转移至预期的宿主细胞中，筛选所得细胞中是否存在选择性标记，以鉴定用载体成功转染的那些宿主细胞，其因此也携带编码所述融合蛋白的载体。
优选低等真核生物例如酵母用于表达糖蛋白，因为它们可低成本培养、获得高产量蛋白并且当适当修饰时可生产具有特定优势N-聚糖结构的糖蛋白。具体而言，酵母可提供确定的遗传学允许快速转化、经验证的蛋白质定位策略和温和的基因敲除技术。各种酵母例如乳酸克鲁维酵母、巴斯德毕赤酵母、甲醇毕赤酵母和多形汉森酵母通常用于细胞培养和蛋白质生产因为它们可生长至高细胞浓度并分泌工业规模的大量重组蛋白。相似的，丝状真菌例如黑曲霉、镰刀菌属镰刀菌、粗糙链孢霉和其他可用于工业规模生产糖蛋白。
低等真核生物，尤其是酵母可经基因修饰从而它们可表达其中的糖基化类型为复杂型或类似于人或人源化的糖蛋白。可通过去除参与生成高甘露糖N-聚糖的所选内源性糖基化酶并引入参与生产复杂型N-聚糖的外源性酶的各种组合获得这些经基因修饰的低等真核生物。使基因工程化酵母生产复杂型N-聚糖的方法已描述于美国专利号7029872和美国已公布专利申请号2004/0018590、2005/0170452、2006/0286637、2004/0230042、2005/0208617、2004/0171826、2005/0208617和2006/0160179。举例而言，选择或工程化宿主细胞使其缺失1，6-甘露糖基转移酶活性，否则其将甘露糖残基添加至糖蛋白的N-聚糖上。例如在酵母中OCH1基因编码1，6-甘露糖基转移酶活性。接着将宿主细胞进一步工程化以包括一个或多个参与生成复杂型、类似于人N-聚糖的酶。
在一个实施方案中，该宿主细胞进一步包括与细胞靶向信号肽融合的α1，2-甘露糖苷酶催化结构域，该信号肽通常与该催化结构域无关并选用来将α1，2-甘露糖苷酶活性靶向宿主细胞的ER或高尔基体。当重组糖蛋白通过宿主细胞的ER或高尔基体时产生了包含岩藻糖基化Man5GlcNAc2糖形例如Man5GlcNAc2(Fuc)糖形的重组糖蛋白。美国专利号7029872和美国已公布专利申请号2004/0018590和2005/0170452公开了可生成包含Man5GlcNAc2糖形的糖蛋白的低等真核生物宿主细胞。
在另一个实施方案中，前述宿主细胞进一步包括与细胞靶向信号肽融合的GlcNAc转移酶I(GnTI)催化结构域，该信号肽通常与该催化结构域无关并选用来将GlcNAc转移酶I活性靶向宿主细胞的ER或高尔基体。当重组糖蛋白通过宿主细胞的ER或高尔基体时产生了包含岩藻糖基化GlcNAcMan5GlcNAc2糖形例如GlcNAcMan5GlcNAc2(Fuc)糖形的重组糖蛋白。美国专利号7029872和美国已公布专利申请号2004/0018590和2005/0170452公开了可生成包含GlcNAcMan5GlcNAc2糖形的糖蛋白的低等真核生物宿主细胞。上述细胞生产的糖蛋白可经氨基己糖苷酶体外处理生成包含Man5GlcNAc2(Fuc)糖形的重组糖蛋白。
在另一个实施方案中，前述宿主细胞进一步包括与细胞靶向信号肽融合的甘露糖苷酶II催化结构域，该信号肽通常与该催化结构域无关并选用来将甘露糖苷酶II活性靶向宿主细胞的ER或高尔基体。当重组糖蛋白通过宿主细胞的ER或高尔基体时产生了包含岩藻糖基化GlcNAcMan3GlcNAc2糖形例如GlcNAcMan3GlcNAc2(Fuc)糖形的重组糖蛋白。美国已公布专利申请号2004/0230042公开了可表达甘露糖苷酶II酶并可生成具有优势GlcNAc2Man3GlcNAc2糖形的糖蛋白的低等真核生物宿主细胞。上述细胞生产的糖蛋白可经氨基己糖苷酶体外处理生成包含Man3GlcNAc2(Fuc)糖形的重组糖蛋白。
在另一个实施方案中，前述宿主细胞进一步包括与细胞靶向信号肽融合的GlcNAc转移酶II(GnTII)催化结构域，该信号肽通常与该催化结构域无关并选用来将GlcNAc转移酶II活性靶向宿主细胞的ER或高尔基体。当重组糖蛋白通过宿主细胞的ER或高尔基体时产生了包含岩藻糖基化GlcNAc2Man3GlcNAc2糖形例如GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)糖形的重组糖蛋白。美国专利号7029872和美国已公布专利申请号2004/0018590和2005/0170452公开了可生成包含GlcNAc2Man3GlcNAc2糖形的糖蛋白的低等真核生物宿主细胞。上述细胞生产的糖蛋白可经氨基己糖苷酶体外处理生成包含Man3GlcNAc2(Fuc)糖形的重组糖蛋白。
在另一个实施方案中，前述宿主细胞进一步包括与细胞靶向信号肽融合的半乳糖转移酶II催化结构域，该信号肽通常与该催化结构域无关并选用来将半乳糖转移酶II活性靶向宿主细胞的ER或高尔基体。当重组糖蛋白通过宿主细胞的ER或高尔基体时产生了包含岩藻糖基化Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2糖形例如Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)糖形的重组糖蛋白。美国已公布专利申请号2006/0040353公开了可生成包括Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2糖形的糖蛋白的低等真核生物宿主细胞。上述细胞生产的糖蛋白可经半乳糖苷酶体外处理以生成包括GlcNAc2Man3GlcNAc2糖形的重组糖蛋白，例如GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)糖形。
在又另一个实施方案中，前述宿主细胞进一步包括与细胞靶向信号肽融合的唾液酸转移酶催化结构域，该信号肽通常与该催化结构域无关并选用来将唾液酸转移酶活性靶向宿主细胞的ER或高尔基体。当重组糖蛋白通过宿主细胞的ER或高尔基体时产生了包含岩藻糖基化NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2糖形例如NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)糖形的重组糖蛋白。对于低等真核生物宿主细胞例如酵母和丝状真菌而言，优选该宿主细胞进一步包括提供CMP-唾液酸以转移至N-聚糖的工具。美国已公布专利申请号2005/0260729公开了基因工程化低等真核生物以具有CMP-唾液酸合成途径的方法并且美国已公布专利申请号2006/0286637公开了基因工程化低等真核生物以生成唾液酸化糖蛋白的方法。上述细胞生产的糖蛋白可经神经氨酸酶体外处理生成包含岩藻糖基化Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2糖形例如Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)糖形的重组糖蛋白。
任一前述宿主细胞可进一步包括一个或多个选自GnTIII、GnTIV、GnTV、GnTVI和GnTIX的GlcNAc转移酶以生成具有例如美国已公布专利申请号2004/074458和2007/0037248中公开的平分型和/或多天线N-聚糖结构的糖蛋白。各种前述宿主细胞可进一步包括一个或多个糖转运体例如UDP-GlcNAc转运体(例如，乳酸克鲁维酵母和小鼠(Mus musculus)UDP-GlcNAc转运体)、UDP-半乳糖转运体(例如，黑腹果蝇UDP-半乳糖转运体)和CMP-唾液酸转运体(例如，人唾液酸转运体)。由于低等真核生物宿主细胞例如酵母和丝状真菌缺乏上述转运体，优选低等真核生物宿主细胞例如酵母和丝状真菌经基因工程化以包括上述转运体。
在上述宿主细胞的另一个实施方案中，该宿主细胞进一步经基因工程化通过缺失或破坏β-甘露糖基转移酶基因(BMT2)去除具有α-甘露糖苷酶-抗性N-聚糖的糖蛋白(参见美国已公布专利申请号2006/0211085)并通过缺失或破坏磷酸甘露糖基转移酶基因PNO1和MNN4B之一或二者去除具有磷酸甘露糖残基的糖蛋白(参见，例如美国已公布专利申请号2006/0160179和2004/0014170)。在上述宿主细胞的又一实施方案中，所述宿主细胞经进一步基因工程化通过缺失或破坏一个或多个Dol-P-Man：蛋白(Ser/Thr)甘露糖基转移酶基因(PMTs)去除糖蛋白的O-糖基化(参见美国专利号5714377)。
已显示编码具体多肽的基因或转录单元的密码子优化可引起所编码多肽的表达增加，即编码该多肽的mRNA的翻译增加。因此，在本文公开的宿主细胞中，被编码酶的表达增加将产生更多的被编码酶，其可引起岩藻糖基化N-聚糖的产量增加。在密码子优化背景下，术语“表达”及其变体指编码多肽的mRNA的翻译而不是编码多肽的多聚核苷酸的转录。如本文所使用术语“基因”指编码多肽的基因组DNA或RNA二者以及编码该多肽的cDNA。
密码子优化指以下过程：当基因被移入显示与该基因的天然遗传环境不同的核苷酸密码子使用的外源遗传环境中时寻找提高该基因的异源表达或当该基因天然包括编码高度表达基因的遗传环境中天然存在的基因不经常使用的一个或多个核苷酸密码子时提高该基因在其天然遗传环境中的异位表达。换言之，密码子优化涉及使用在遗传环境或生物体中高频率表达的基因使用的核苷酸密码子替换在具体的遗传环境或生物体中以相对低频率表达的基因的那些核苷酸密码子。这样可增加该基因产物(多肽)的表达(翻译)。推定在高度表达基因中高频出现的核苷酸密码子比低频出现的核苷酸密码子更有效地翻译。
一般而言，优化具体基因核苷酸密码子的方法依赖于鉴定在生物体中高度表达的基因所使用的各氨基酸的核苷酸密码子的频率，接着用经鉴定用于高度表达基因中的核苷酸密码子替换在高度表达基因中低频使用的所关注基因中的那些核苷酸密码子(参见，例如Lathe，Synthetic Oligonucleotide Probes Deduced from Amino Acid SequenceData：Theoretical and Practical Considerations，J.Molec.Biol.：183：1-12(1985)；Nakamura等，Nuc.Acid Res.28：292(2000)；Fuglsang，ProteinExpression & Purification 31：247-249(2003))。许多计算机程序可自动分析编码基因的生物体的核酸的核苷酸密码子并给出核苷酸密码子用在生物体中高度表达的基因中存在的核苷酸密码子替换在生物体中低频出现的核苷酸密码子。
以下实施例意在促进对本发明的进一步理解。
实施例1
该实施例显示了可生成在糖蛋白的N-聚糖结构中包括岩藻糖的糖蛋白的巴斯德毕赤酵母株的构建。
将大肠杆菌株TOP10或XL10-Gold用于重组DNA工作。PNGase-F、限制性和修饰酶获自New England BioLabs(Beverly，MA)并根据生产商的指示使用。α-1，6-岩藻糖苷酶获自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)并根据生产商的指示使用。寡聚核苷酸获自IntegratedDNA Technologies(Coralville，IA)。金属螯合“HisBind”树脂获自Novagen(Madison，WI)。96-孔裂解物清除板购自Promega(Madison，WI)。蛋白质结合96-孔板购自Millipore(Bedford，MA)。盐和缓冲剂购自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)。
扩增岩藻糖基化途径基因
岩藻糖基化途径的概况显示于图1。使用Advantage 2聚合酶根据生产商推荐的操作从人肝脏cDNA(BD Biosciences，Palo Alto，CA)扩增hGMD的开放阅读框(ORF)。简略而言，使用引物SH415和SH413(分别为5’-GGCGG CCGCC ACCAT GGCAC ACGCA CCGGCACGCT GC-3’(SEQ ID NO：15)和5’-TTAAT TAATC AGGCATTGGG GTTTG TCCTC ATG-3’(SEQ ID NO：16))从人肝脏cDNA扩增1139bp产物，使用下列条件：97℃ 3分钟；97℃ 30秒，50℃ 30秒，72℃ 2分钟，进行35个循环；和72℃ 10分钟。接着将该产物克隆至pCR2.1(Invitrogen，Carlsbad，CA)，测序并将所得构建体命名为pSH985。
使用上文列出的条件用引物SH414和SH411(分别为5’-GGCGGCCGCC ACCAT GGGTG AACCC CAGGG ATCCA TG-3’(SEQ IDNO：17)和5’-TTAAT TAATC ACTTC CGGGC CTGCT CGTAGTTG-3’(SEQ ID NO：18))从人肾脏cDNA(BD Biosciences，Palo Alto，CA)扩增986bp片段，其对应于人FX基因的ORF。接着将这一片段克隆至pCR2.1，测序并命名为pSH988。
使用上文列出的条件和引物RCD679和RCD680(分别为5’-GCGGC CGCCA CCATG AATAG GGCCC CTCTG AAGCG G-3’(SEQ ID NO：19)和5’-TTAAT TAATC ACACC CCCAT GGCGCTCTTC TC-3’(SEQ ID NO：20))从人脾cDNA(BD Biosciences，PaloAlto，CA)扩增人GFTr的ORF。将所得1113bp片段克隆至pCR2.1，测序并命名为pGLY2133。
使用上文列出的条件以及引物SH420和SH421(分别为5’-GCGGC GCGCC GATAA TGACC ACCCT GATCA CTCCA G-3’(SEQID NO：21)和5’-CCTTA ATTAA CTATT TTTCA GCTTC AGGATATGTG GG-3’(SEQ ID NO：22))从小鼠脑cDNA(BD Biosciences，PaloAlto，CA)扩增小鼠FUT8 ORF的截短形式，其编码氨基酸32至575并缺失编码内源跨膜结构域的核苷酸。将所得1654bp片段克隆至pCR2.1，测序并命名为pSH987。
在酵母表达盒中生成岩藻糖基化基因
通过用NotI和PacI限制性内切酶消化上述载体生成GMD、FX和GFTr的开放阅读框以生成具有NotI相容性5′末端和PacI相容性3’末端的DNA片段。通过用AscI和PacI限制性内切酶消化生成FUT8片段以生成具有AscI相容性5’末端和PacI相容性3’末端的DNA。
为了生成GMD表达盒，将GMD克隆至酵母表达载体pSH995中，其包含巴斯德毕赤酵母GAPDH启动子和酿酒酵母CYC转录终止序列并经设计在Trp2 ORF下游整合入毕赤酵母基因组中，使用诺尔丝菌素抗性标记。这一载体显示于图3A。用NotI和PacI消化载体pSH985以切除包含GMD ORF的1.1Kb片段，接着将其亚克隆至之前已用相同的酶消化的pSH995中。所得载体命名为pSH997.A，其包含GAPDH启动子控制下的GMD。
为了生成FX表达盒，用NotI和PacI消化载体pSH988以切除包含FX ORF的1.0Kb片段，用T4DNA聚合酶将其处理以去除单链突出端(J.Sambrook，D.W.Russell，Molecular Cloning：A laboratoryManual(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，第3版，2001))。接着将这一片段亚克隆至之前已用NotI和AscI消化的载体pGLY359中(Hamilton等，Science 313，1441(2006))并用T4DNA聚合酶处理。所得载体pSH994包含FX表达盒，其由在5′末端与巴斯德毕赤酵母PMA1启动子(PpPMA1prom)并在3′末端与巴斯德毕赤酵母PMA转录终止序列(PpPMA1tt)可操作地连接的FX ORF组成。该表达盒被SwaI限制性位点侧接。
通过用NotI和PacI消化pGLY2133以切除包含GFTr ORF(用T4DNA聚合酶处理)的1.1Kb片段生成GFTr表达盒。接着将这一片段亚克隆至之前已用NotI和PacI消化的载体pGLY363中(Hamilton，上文)并用T4DNA聚合酶处理。所得载体pGLY2143包含GFTr表达盒，其由在5′末端与PpPMA1prom并在3′末端与PpPMA1tt可操作地连接的GFTr ORF组成。该表达盒被RsrII限制性位点侧接。
为了生成与酵母定位信号融合的FUT8催化结构域，用GeneOptimizer软件分析Mnn2酿酒酵母靶向区的前36个氨基酸并经密码子优化用于巴斯德毕赤酵母表达(GeneArt，Regensburg，Germany)。生成具有5’NotI和3’AscI限制性内切酶相容性末端的ScMnn2氨基酸1-36的所得合成DNA，克隆至穿梭载体以产生质粒载体pSH831。接着，用AscI和PacI消化载体pSH987释放编码FUT8催化结构域ORF的1.6Kb片段，接着将其框内亚克隆至载体pSH831(之前已用相同的酶消化)中编码ScMnn2靶向肽的DNA中。所得载体命名为pSH989。为了生成FUT8-ScMnn2表达盒，用NotI和PacI消化pSH989释放1.8Kb片段，将其亚克隆至用相同的酶消化的载体pGLY361(Hamilton等，Science 313，1441(2006))中。所得载体pSH991包含FUT8-Mnn2融合蛋白，其由在5′末端与巴斯德毕赤酵母TEF启动子(PpTEFprom)并在3′末端与巴斯德毕赤酵母TEF转录终止序列(PpTEFtt)可操作地连接的FUT8-Mnn2融合ORF组成。该表达盒被SgfI限制性位点侧接。
生成岩藻糖基化工程载体
用SwaI消化载体pSH994释放包含FX表达盒的2.5Kb片段，将其亚克隆至用PmeI消化的pSH997(包含GMD表达盒)中。所得载体命名为pSH1009，其中PMA-FX和GAPDH-GMD表达盒以相同方向排列。用限制性内切酶RsrII从pGLY2143切除包含PMA-GFTr表达盒的2.7Kb片段并亚克隆至用相同酶消化的pSH1009中。所得载体命名为pSH1019，其中PMA-GFTr和GAPDH表达盒以相同方向排列。最后，用SgfI从pSH991切除1.8Kb TEF-FUT8盒并亚克隆至用相同的酶消化的pSH1019中。所得载体命名为pSH1022，其中TEF-FUT8和GAPDH表达盒以相同方向排列。该载体显示于图2B。
大鼠EPO表达载体的生成
使用Advantage 2聚合酶根据生产商的建议从大鼠肾cDNA(BDBiosciences，Palo Alto，CA)扩增编码氨基酸27至192的大鼠(Rattusnorvegicus)***基因(rEPO)的截短形式。简略而言，使用引物rEPO-正向和rEPO-反向(分别为5’-GGGAA TTCGC TCCCCCACGC CTCAT TTGCG AC-3’(SEQ ID NO：23)和5’-CCTCTAGATC ACCTG TCCCC TCTCC TGCAG GC-3’(SEQ ID NO：24))从大鼠肾cDNA扩增516bp产物，使用下列循环条件：94℃ 1分钟1个循环；94℃ 30秒，72℃ 1分钟，5个循环；94℃ 30秒，70℃ 1分钟，5个循环；94℃ 20秒；68℃ 1分钟，25个循环。接着，将产物克隆至pCR2.1(Invitrogen，Carlsbad，CA)，测序并将所得构建体命名为pSH603。为了生成酵母表达载体，用EcoRI和XbaI消化pSH603释放506bp片段，将其亚克隆至之前用相同酶消化的pPICZαA(Invitrogen，Carlsbad，CA)中。所得表达载体命名为pSH692。pSH692中的rEPO由AOX甲醇-诱导启动子控制。
酵母株生成和小鼠EPO生产
用载体PSH692转化可生产具有优势Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2N-聚糖的重组糖蛋白的巴斯德毕赤酵母糖基化工程细胞系YGLY1062(与美国已公布专利申请号2006/0040353描述的株相似，其可产生具有Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2N-聚糖的糖蛋白)生成株RDP974，其可产生具有Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2N-聚糖的重组大鼠EPO(rEPO)。株RDP974与Hamilton等，Science 313，1441-1443(2006)描述的株RDP762相似，其可产生具有Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2N-聚糖的大鼠EPO。
RPD974株在OCH1、PNO1、MNN4B和BMT2基因中具有缺失并且包括编码全长乳酸克鲁维酵母UDP-GlcNAc转运体、小鼠UDP-GlcNAc转运体、酿酒酵母UDP-半乳糖4-差向异构酶和黑腹果蝇UDP-半乳糖转运体的DNA以及与编码酿酒酵母MNN2前导序列的氨基酸1-36的DNA融合的编码小鼠α1，2-甘露糖苷酶I催化结构域的DNA；与编码酿酒酵母MNN2前导序列的氨基酸1-36的DNA融合的编码人β1，2-GlcNAc转移酶I(GnTI)催化结构域的DNA；与编码酿酒酵母MNN2前导序列的氨基酸1-36的DNA融合的编码黑腹果蝇甘露糖苷酶II催化结构域的DNA；与编码酿酒酵母MNN2前导序列的氨基酸1-97的DNA融合的编码大鼠β1，2-GlcNAc转移酶II(GnTII)催化结构域的DNA；以及与编码酿酒酵母KRE2(MNTI)前导序列的氨基酸1-58的DNA融合的编码人β1，4-半乳糖基转移酶(GalTI)催化结构域的DNA。美国已公布专利申请号2006/0040353公开了制备可在低等酵母中生产半乳糖基化糖蛋白的巴斯德毕赤酵母细胞系的方法(也可参见美国专利号7029872，美国已公布专利申请号2004/0018590、2004/0230042、2005/0208617、2004/0171826、2006/0286637和2007/0037248以及Hamilton等，Science 313，1441-1443(2006)。
接着将株RDP974用作向载体pSH1022中引入岩藻糖基化途径的宿主株。简略而言，用限制性内切酶SfiI消化10μg的对照质粒pSH995或岩藻糖基化途径质粒pSH1022以将载体线性化并经电穿孔转化至宿主株RDP974中。将已转化细胞培养在包含100ng/mL诺尔丝菌素的YDP板子上并26℃温育五天。接着挑取若干克隆并分析岩藻糖是否转移至rEPO的N-聚糖上。用对照载体转化的株命名为YSH660，而用pSH1022转化并显示岩藻糖转移的株命名为YSH661。
通常通过以下方式进行蛋白质表达：使已转化株在作为生长培养基的由1％酵母浸出物、2％蛋白胨、100mM磷酸钾缓冲液，pH 6.0、1.34％酵母氮源、4X10-5％生物素和1％甘油组成的50mL含缓冲剂的甘油复合培养基(BMGY)中于26℃生长。用5mL含缓冲剂的甲醇复合培养基(BMMY)进行蛋白质表达的诱导，其包括1.5％甲醇而不是BMGY中的甘油。
如上文所述表达重组rEPO并如Choi等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100，5022(2003)和Hamilton等(Science 301，1244(2003))所述用Ni-螯合柱纯化。SDS-PAGE(Laemmli，Nature 227，680(1970))分析所得蛋白并用考马斯蓝染色以显色。根据生产商建议用α-1，6-岩藻糖苷酶(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)处理经体外消化去除岩藻糖。
对于聚糖的分析，用PNGase-F处理从rEPO释放聚糖(Choi等，(2003)；Hamilton等，(2003))。用MALDI/飞行时间(TOF)质谱分析所释放的聚糖以验证聚糖结构(Choi等，(2003))。为了定量存在的岩藻糖基化聚糖的相对量，用2-氨基联苯胺(2-AB)标记N-糖苷酶F释放的聚糖并用HPLC分析(Choi等，(2003))。通过比较岩藻糖苷酶处理前后各种类的峰面积计算岩藻糖基化和非-岩藻糖基化聚糖的百分比。
基本如上文所述在株YSH661中生产的N-聚糖的分析显示该株生产包含Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)N-聚糖的重组rEPO。图4A显示了株YSH661中生产的rEPO上N-聚糖的MALDI-TOF分析，结果显示该株生产由Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2N-聚糖组成的N-聚糖。Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)N-聚糖在方框内。图4B显示对照株YSH660(不具有岩藻糖基化途径)生产的rEPO上N-聚糖的MALDI-TOF分析，显示该株仅产生仅包含Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2的非岩藻糖基化N-聚糖。
实施例2
可通过将载体pSH1022引入可生产具有NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2N-聚糖的糖蛋白的巴斯德毕赤酵母株中制备可生产具有NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)N-聚糖的糖蛋白的巴斯德毕赤酵母株。例如，包含编码岩藻糖基化途径组分的基因的载体pSH1022可转化至株YSH597中，其可生产具有NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2N-聚糖的大鼠EPO并公开于美国临时申请号60/801688和Hamilton等，Science 313，1441-1443(2006)。诱导后该株生产的大鼠EPO将包括NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)N-聚糖。
下文提供将编码唾液酸化途径的酶引入实施例1株YSH661的预见性方法。
用GeneOptimizer软件分析人UDP-N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶/N-乙酰甘露糖胺激酶(GNE)、人N-乙酰神经氨酸-9-磷酸合酶(SPS)、人CMP-唾液酸合酶(CSS)、小鼠CMP-唾液酸转运体(CST)和小鼠α-2，6-唾液酸转移酶(ST)的氨基酸40至403的开放阅读框并经密码子优化用于巴斯德毕赤酵母表达(GeneArt，Regensburg，Germany)。生成具有5’BsaI和3’HpaI限制性位点的GNE、SPS、CSS和CST的所得合成DNAs，克隆至穿梭载体中并分别命名为pGLY368、367、366和369。生产具有5’AscI和3’PacI限制性位点的ST的合成DNA，克隆至穿梭载体中并命名为pSH660。为了生成SPS、CSS和CST表达盒，用BsaI和HpaI消化载体pGLY367、366和369以切除1.1、1.3和1.0Kb片段，用T4DNA聚合酶处理去除单链突出端。接着，将这些片段分别亚克隆至载体pGLY35、17和363(前者已用NotI和AscI消化，后两者用NotI和PacI消化)并用T4DNA聚合酶处理。所得载体pSH819，包含被PacI限制性位点侧接的PpPMA1prom-PpPMA1tt盒中的SPS；pSH824包含被5’BglII和3’BamHI限制性位点侧接的PpGAPDH-ScCYCtt盒中的CSS；以及pGLY372，包含被RsrII限制性位点侧接的PpPMA1prom-PpPMA1tt盒中的CST。为了生成与酵母定位信号融合的ST催化结构域，使用Taq DNA聚合酶(Promega，Madison，WI)和引物ScMnt1-正向和ScMnt1-反向(分别为5’-GGGCGGCCGCCACCATGGCCCTCTTTCTCAGTAAGAGACTGTTGAG-3’(SEQ ID NO：25)和5’-CCGGCGCGCCCGATGACTTGTTGTTCAGGGGATATAGATCCTG-3’(SEQ ID NO：26))从基因组DNA扩增Mnt1的酿酒酵母靶向区。所使用的条件为：94℃ 3分钟，1个循环；94℃ 30秒，55℃ 20秒，68℃ 1分钟，30个循环；68℃ 5分钟，1个循环。将所得包含5’NotI和3’AscI限制性位点的174bp片段框内5′端亚克隆至经密码子优化的ST，生成载体pSH861。接着用NotI和PacI消化该载体以切除包含ST-融合的1.3Kb片段，用T4DNA聚合酶处理并亚克隆至经NotI和PacI消化制备的pGLY361中，并用T4DNA聚合酶处理。所得载体命名为pSH893，其包含被SgfI限制性位点侧接的PpTEFprom-PpTEFtt盒中的ST-融合。
包含巴斯德毕赤酵母GAPDH启动子和酿酒酵母CYC转录终止子的酵母表达载体pSH823经设计在Trp2 ORF下游整合入毕赤酵母基因组中。使用限制性内切酶RsrII从pGLY372切除编码PMA-CST表达盒的2.6Kb片段并亚克隆至用相同酶消化的pSH823中。所得载体命名为pSH826，其中PMA-CST和GAPDH表达盒以相同方向排列。接着用限制性内切酶NotI和PacI消化这一载体并用T4DNA聚合酶去除单链突出端。将分离自经BsaI和HpaI消化的pGLY368并用T4DNA聚合酶处理去除单链突出端的GNE的2.2Kb片段亚克隆至这一线性化构建体中。该载体命名为pSH828。接着用PacI消化这一载体，向其中亚克隆编码PMA-SPS表达盒的pSH819的2.7Kb PacI片段。所生成载体命名为pSH830，其中PMA-SPS表达盒的排列方向与GAPDH表达盒相反。在这一阶段通过用XhoI从pSH830切除2.4Kb URA5片段并用来自经相同酶消化的pSH842的HIS1的1.8Kb片段将其替换从而用HIS1替换URA5标记。所得载体命名为pSH870，其中HIS1 ORF与GAPDH-GNE表达盒的排列方向一致。接着，用BamHI消化该载体并亚克隆来自经BamHI和BglII消化分离的pSH824并包含GAPDH-CSS表达盒的2.1Kb片段。所生成的载体命名为pSH872，其中新引入的表达盒与GAPDH-GNE表达盒的方向相反。接着用来自pSH893的SgfI消化包含TEF-ST的2.2Kb表达盒并亚克隆至用相同酶消化的pSH872中。所生成的载体命名为pSH926，其中TEF-ST盒与GAPDH-GNE盒的方向相反。
将pSH926载体转化入株YSH661，其可产生具有NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2N-聚糖的大鼠EPO。
实施例3
可通过将载体pSH1022引入可生产具有NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2N-聚糖的人EPO的巴斯德毕赤酵母株制备可生产具有NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)N-聚糖的人EPO的巴斯德毕赤酵母株。例如，包含编码岩藻糖基化途径组分的基因的载体pSH1022可转化至可生产具有NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2N-聚糖的糖蛋白的株中，例如Hamilton等，Science 313，1441-1443(2006)公开的株YSH597或实施例2的YSH661，其包含编码唾液酸化途径酶的基因但是用编码人EPO的DNA替换编码大鼠EPO的DNA。该株将生产具有NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)N-聚糖的人EPO。
虽然参考举例说明的实施方案在本文中描述了本发明，但应当理解的是本发明并不受限于此。具有本领域普通技术并可领会本文教导的人员将认识到属于其范围内的其他修改和实施方案。因此，本发明不受本文所附权利要求的限制。
序列
SEQ ID NO：1
DNA
人(Homo sapian)
GDP-甘露糖-脱水酶(hGMD)
ATGGCACACGCACCGGCACGCTGCCCCAGCGCCCGGGGCTCCGGGGACGGCGAGATG
GGCAAGCCCAGGAACGTGGCGCTCATCACCGGTATCACAGGCCAGGATGGTTCCTACC
TGGCTGAGTTCCTGCTGGAGAAAGGCTATGAGGTCCATGGAATTGTACGGCGGTCCAG
TTCATTTAATACGGGTCGAATTGAGCATCTGTATAAGAATCCCCAGGCTCACATTGAAG
GAAACATGAAGTTGCACTATGGCGATCTCACTGACAGTACCTGCCTTGTGAAGATCATT
AATGAAGTAAAGCCCACAGAGATCTACAACCTTGGAGCCCAGAGCCACGTCAAAATTT
CCTTTGACCTCGCTGAGTACACTGCGGACGTTGACGGAGTTGGCACTCTACGACTTCT
AGATGCAGTTAAGACTTGTGGCCTTATCAACTCTGTGAAGTTCTACCAAGCCTCAACA
AGTGAACTTTATGGGAAAGTGCAGGAAATACCCCAGAAGGAGACCACCCCTTTCTATC
CCCGGTCACCCTATGGGGCAGCAAAACTCTATGCCTATTGGATTGTGGTGAACTTCCGT
GAGGCGTATAATCTCTTTGCAGTGAACGGCATTCTCTTCAATCATGAGAGTCCCAGAAG
AGGAGCTAATTTCGTTACTCGAAAAATTAGCCGGTCAGTAGCTAAGATTTACCTTGGAC
AACTGGAATGTTTCAGTTTGGGAAATCTGGATGCCAAACGAGATTGGGGCCATGCCAA
GGACTATGTGGAGGCTATGTGGTTGATGTTGCAGAATGATGAGCCGGAGGACTTCGTTA
TAGCTACTGGGGAGGTCCATAGTGTCCGGGAATTTGTCGAGAAATCATTCTTGCACATT
GGAAAAACCATTGTGTGGGAAGGAAAGAATGAAAATGAAGTGGGCAGATGTAAAGAG
ACCGGCAAAGTTCACGTGACTGTGGATCTCAAGTACTACCGGCCAACTGAAGTGGACT
TTCTGCAGGGCGACTGCACCAAAGCGAAACAGAAGCTGAACTGGAAGCCCCGGGTCG
CTTTCGATGAGCTGGTGAGGGAGATGGTGCACGCCGACGTGGAGCTCATGAGGACAA
ACCCCAATGCCTGA
SEQ ID NO：2
蛋白质
人(Homo sapian)
GDP-甘露糖-脱水酶(hGMD)
MAHAPARCPSARGSGDGEMGKPRNVALITGITGQDGSYLAEFLLEKGYEVHGIVRRSSSF
NTGRIEHLYKNPQAHIEGNMKLHYGDLTDSTCLVKIINEVKPTEIYNLGAQSHVKISFDLAE
YTADVDGVGTLRLLDAVKTCGLINSVKFYQASTSELYGKVQEIPQKETTPFYPRSPYGAAK
LYAYWIVVNFREAYNLFAVNGILFNHESPRRGANFVTRKISRSVAKIYLGQLECFSLGNLDA
KRDWGHAKDYVEAMWLMLQNDEPEDFVIATGEVHSVREFVEKSFLHIGKTIVWEGKNE
NEVGRCKETGKVHVTVDLKYYRPTEVDFLQGDCTKAKQKLNWKPRVAFDELVREMVHA
DVELMRTNPNA
SEQ ID NO：3
DNA
人(Homo sapian)
GDP-酮-脱氧-甘露糖-表异构酶/GDP-酮-脱氧-半乳糖-还原酶(FX蛋白质)
ATGGGTGAACCCCAGGGATCCATGCGGATTCTAGTGACAGGGGGCTCTGGGCTGGTAG
GCAAAGCCATCCAGAAGGTGGTAGCAGATGGAGCTGGACTTCCTGGAGAGGACTGGG
TGTTTGTCTCCTCTAAAGACGCCGATCTCACGGATACAGCACAGACCCGCGCCCTGTTT
GAGAAGGTCCAACCCACACACGTCATCCATCTTGCTGCAATGGTGGGGGGCCTGTTCC
GGAATATCAAATACAATTTGGACTTCTGGAGGAAAAACGTGCACATGAACGACAACGT
CCTGCACTCGGCCTTTGAGGTGGGGGCCCGCAAGGTGGTGTCCTGCCTGTCCACCTGT
ATCTTCCCTGACAAGACGACCTACCCGATAGATGAGACCATGATCCACAATGGGCCTCC
CCACAACAGCAATTTTGGGTACTCGTATGCCAAGAGGATGATCGACGTGCAGAACAGG
GCCTACTTCCAGCAGTACGGCTGCACCTTCACCGCTGTCATCCCCACCAACGTTTTCGG
GCCCCACGACAACTTCAACATCGAGGATGGCCACGTGCTGCCTGGCCTCATCCACAAG
GTGCACCTGGCCAAGAGCAGCGGCTCGGCCCTGACGGTGTGGGGTACAGGGAATCCG
CGGAGGCAGTTCATATACTCGCTGGACCTGGCCCAGCTCTTTATCTGGGTCCTGCGGGA
GTACAATGAAGTGGAGCCCATCATCCTCTCCGTGGGCGAGGAAGATGAGGTCTCCATC
AAGGAGGCAGCCGAGGCGGTGGTGGAGGCCATGGACTTCCATGGGGAAGTCACCTTT
GATACAACCAAGTCGGATGGGCAGTTTAAGAAGACAGCCAGTAACAGCAAGCTGAGG
ACCTACCTGCCCGACTTCCGGTTCACACCCTTCAAGCAGGCGGTGAAGGAGACCTGTG
CTTGGTTCACTGACAACTACGAGCAGGCCCGGAAGTGA
SEQ ID NO：4
蛋白质
人(Homo sapian)
GDP-酮-脱氧-甘露糖-表异构酶/GDP-酮-脱氧-半乳糖-还原酶(FX蛋白质)
MGEPQGSMRILVTGGSGLVGKAIQKVVADGAGLPGEDWVFVSSKDADLTDTAQTRALFE
KVQPTHVIHLAAMVGGLFRNIKYNLDFWRKNVHMNDNVLHSAFEVGARKVVSCLSTCIF
PDKTTYPIDETMIHNGPPHNSNFGYSYAKRMIDVQNRAYFQQ
YGCTFTAVIPTNVFGPHDNFNIEDGHVLPGLIHKVHLAKSSGSALTVWGTGNPRRQFIYSL
DLAQLFIWVLREYNEVEPIILSVGEEDEVSIKEAAEAVVEAMDFHGEVTFDTTKSDGQFKK
TASNSKLRTYLPDFRFTPFKQAVKETCAWFTDNYEQARK
SEQ ID NO：5
DNA
人(Homo sapian)
人GDP-岩藻糖转运体
ATGAATAGGGCCCCTCTGAAGCGGTCCAGGATCCTGCACATGGCGCTGACCGGGGCCT
CAGACCCCTCTGCAGAGGCAGAGGCCAACGGGGAGAAGCCCTTTCTGCTGCGGGCAT
TGCAGATCGCGCTGGTGGTCTCCCTCTACTGGGTCACCTCCATCTCCATGGTGTTCCTT
AATAAGTACCTGCTGGACAGCCCCTCCCTGCGGCTGGACACCCCCATCTTCGTCACCTT
CTACCAGTGCCTGGTGACCACGCTGCTGTGCAAAGGCCTCAGCGCTCTGGCCGCCTGC
TGCCCTGGTGCCGTGGACTTCCCCAGCTTGCGCCTGGACCTCAGGGTGGCCCGCAGCG
TCCTGCCCCTGTCGGTGGTCTTCATCGGCATGATCACCTTCAATAACCTCTGCCTCAAGT
ACGTCGGTGTGGCCTTCTACAATGTGGGCCGCTCACTCACCACCGTCTTCAACGTGCT
GCTCTCCTACCTGCTGCTCAAGCAGACCACCTCCTTCTATGCCCTGCTCACCTGCGGTA
TCATCATCGGGGGCTTCTGGCTTGGTGTGGACCAGGAGGGGGCAGAAGGCACCCTGTC
GTGGCTGGGCACCGTCTTCGGCGTGCTGGCTAGCCTCTGTGTCTCGCTCAACGCCATCT
ACACCACGAAGGTGCTCCCGGCGGTGGACGGCAGCATCTGGCGCCTGACTTTCTACAA
CAACGTCAACGCCTGCATCCTCTTCCTGCCCCTGCTCCTGCTGCTCGGGGAGCTTCAG
GCCCTGCGTGACTTTGCCCAGCTGGGCAGTGCCCACTTCTGGGGGATGATGACGCTGG
GCGGCCTGTTTGGCTTTGCCATCGGCTACGTGACAGGACTGCAGATCAAGTTCACCAG
TCCGCTGACCCACAATGTGTCGGGCACGGCCAAGGCCTGTGCCCAGACAGTGCTGGC
CGTGCTCTACTACGAGGAGACCAAGAGCTTCCTCTGGTGGACGAGCAACATGATGGTG
CTGGGCGGCTCCTCCGCCTACACCTGGGTCAGGGGCTGGGAGATGAAGAAGACTCCG
GAGGAGCCCAGCCCCAAAGACAGCGAGAAGAGCGCCATGGGGGTGTGA
SEQ ID NO：6
蛋白质
人(Homo sapian)
人GDP-岩藻糖转运体
MNRAPLKRSRILHMALTGASDPSAEAEANGEKPFLLRALQIALVVSLYWVTSISMVFLNK
YLLDSPSLRLDTPIFVTFYQCLVTTLLCKGLSALAACCPGAVDFPSLRLDLRVARSVLPLSV
VFIGMITFNNLCLKYVGVAFYNVGRSLTTVFNVLLSYLLLKQTTSFYALLTCGIIIGGFWLG
VDQEGAEGTLSWLGTVFGVLASLCVSLNAIYTTKVLPAVDGSIWRLTFYNNVNACILFLPL
LLLLGELQALRDFAQLGSAHFWGMMTLGGLFGFAIGYVTGLQIKFTSPLTHNVSGTAKAC
AQTVLAVLYYEETKSFLWWTSNMMVLGGSSAYTWVRGWEMKKTPEEPSPKDSEKSAMG
V
SEQ ID NO：7
DNA
人(Homo sapian)
α1，6岩藻糖转移酶(hFuT8)
ATGCGGCCATGGACTGGTTCCTGGCGTTGGATTATGCTCATTCTTTTTGCCTGGGGGAC
CTTGCTGTTTTATATAGGTGGTCACTTGGTACGAGATAATGACCATCCTGATCACTCTAG
CCGAGAACTGTCCAAGATTCTGGCAAAGCTTGAACGCTTAAAACAACAGAATGAAGA
CTTGAGGCGAATGGCCGAATCTCTCCGGATACCAGAAGGCCCTATTGATCAGGGGCCA
GCTATAGGAAGAGTACGCGTTTTAGAAGAGCAGCTTGTTAAGGCCAAAGAACAGATTG
AAAATTACAAGAAACAGACCAGAAATGGTCTGGGGAAGGATCATGAAATCCTGAGGA
GGAGGATTGAAAATGGAGCTAAAGAGCTCTGGTTTTTCCTACAGAGTGAATTGAAGAA
ATTAAAGAACTTAGAAGGAAATGAACTCCAAAGACATGCAGATGAATTTCTTTTGGATT
TAGGACATCATGAAAGGTCTATAATGACGGATCTATACTACCTCAGTCAGACAGATGGA
GCAGGTGATTGGCGGGAAAAAGAGGCCAAAGATCTGACAGAACTGGTTCAGCGGAGA
ATAACATATCTTCAGAATCCCAAGGACTGCAGCAAAGCCAAAAAGCTGGTGTGTAATAT
CAACAAAGGCTGTGGCTATGGCTGTCAGCTCCATCATGTGGTCTACTGCTTCATGATTG
CATATGGCACCCAGCGAACACTCATCTTGGAATCTCAGAATTGGCGCTATGCTACTGGT
GGATGGGAGACTGTATTTAGGCCTGTAAGTGAGACATGCACAGACAGATCTGGCATCT
CCACTGGACACTGGTCAGGTGAAGTGAAGGACAAAAATGTTCAAGTGGTCGAGCTTC
CCATTGTAGACAGTCTTCATCCCCGTCCTCCATATTTACCCTTGGCTGTACCAGAAGACC
TCGCAGATCGACTTGTACGAGTGCATGGTGACCCTGCAGTGTGGTGGGTGTCTCAGTT
TGTCAAATACTTGATCCGCCCACAGCCTTGGCTAGAAAAAGAAATAGAAGAAGCCACC
AAGAAGCTTGGCTTCAAACATCCAGTTATTGGAGTCCATGTCAGACGCACAGACAAAG
TGGGAACAGAAGCTGCCTTCCATCCCATTGAAGAGTACATGGTGCATGTTGAAGAACA
TTTTCAGCTTCTTGCACGCAGAATGCAAGTGGACAAAAAAAGAGTGTATTTGGCCACA
GATGACCCTTCTTTATTAAAGGAGGCAAAAACAAAGTACCCCAATTATGAATTTATTAG
TGATAACTCTATTTCCTGGTCAGCTGGACTGCACAATCGATACACAGAAAATTCACTTC
GTGGAGTGATCCTGGATATACATTTTCTCTCTCAGGCAGACTTCCTAGTGTGTACTTTTT
CATCCCAGGTCTGTCGAGTTGCTTATGAAATTATGCAAACACTACATCCTGATGCCTCTG
CAAACTTCCATTCTTTAGATGACATCTACTATTTTGGGGGCCAGAATGCCCACAATCAA
ATTGCCATTTATGCTCACCAACCCCGAACTGCAGATGAAATTCCCATGGAACCTGGAGA
TATCATTGGTGTGGCTGGAAATCATTGGGATGGCTATTCTAAAGGTGTCAACAGGAAAT
TGGGAAGGACGGGCCTATATCCCTCCTACAAAGTTCGAGAGAAGATAGAAACGGTCAA
GTACCCCACATATCCTGAGGCTGAGAAATAA
SEQ ID NO：8
蛋白质
人(Homo sapian)
α1，6岩藻糖转移酶(hFuT8)
MRPWTGSWRWIMLILFAWGTLLFYIGGHLVRDNDHPDHSSRELSKILAKLERLKQQNEDL
RRMAESLRIPEGPIDQGPAIGRVRVLEEQLVKAKEQIENYKKQTRNGLGKDHEILRRRIENG
AKELWFFLQSELKKLKNLEGNELQRHADEFLLDLGHHERSIMTDLYYLSQTDGAGDWRE
KEAKDLTELVQRRITYLQNPKDCSKAKKLVCNINKGCGYGCQLHHVVYCFMIAYGTQRT
LILESQNWRYATGGWETVFRPVSETCTDRSGISTGHWSGEVKDKNVQVVELPIVDSLHPR
PPYLPLAVPEDLADRLVRVHGDPAVWWVSQFVKYLIRPQPWLEKEIEEATKKLGFKHPVIG
VHVRRTDKVGTEAAFHPIEEYMVHVEEHFQLLARRMQVDKKRVYLATDDPSLLKEAKTK
YPNYEFISDNSISWSAGLHNRYTENSLRGVILDIHFLSQADFLVCTFSSQVCRVAYEIMQTL
HPDASANFHSLDDIYYFGGQNAHNQIAIYAHQPRTADEIPMEPGDIIGVAGNHWDGYSKG
VNRKLGRTGLYPSYKVREKIETVKYPTYPEAEK
SEQ ID NO：9
DNA
大鼠(Rat)
α-1，6-岩藻糖转移酶(rFuT8)
ATGCGGGCATGGACTGGTTCCTGGCGTTGGATTATGCTCATTCTTTTTGCCTGGGGGAC
CTTGTTGTTTTATATAGGTGGTCATTTGGTTCGAGATAATGACCACCCTGATCACTCTAG
CAGAGAACTCTCCAAGATTCTTGCAAAGCTTGAACGCTTAAAACAACAAAATGAAGA
CTTGAGGCGAATGGCTGAGTCTCTACGAATACCAGAAGGCCCCATTGACCAGGGGACG
GCTACGGGAAGAGTCCGTGTTTTAGAAGAACAGCTTGTTAAGGCCAAAGAACAGATT
GAAAATTACAAGAAACAAGCCAGAAATGGTCTGGGGAAGGATCATGAACTCTTAAGG
AGGAGGATTGAAAATGGAGCTAAAGAGCTCTGGTTTTTTCTACAAAGTGAACTGAAGA
AATTAAAGCATCTAGAAGGAAATGAACTCCAAAGACATGCAGATGAAATTCTTTTGGAT
TTAGGACACCATGAAAGGTCTATCATGACGGATCTATACTACCTCAGTCAAACAGATGG
AGCAGGGGATTGGCGTGAAAAAGAGGCCAAAGATCTGACAGAGCTGGTCCAGCGGA
GAATAACTTATCTCCAGAATCCCAAGGACTGCAGCAAAGCCAGGAAGCTGGTGTGTAA
CATCAATAAGGGCTGTGGCTATGGTTGCCAACTCCATCACGTGGTCTACTGTTTCATGAT
TGCTTATGGCACCCAGCGAACACTCATCTTGGAATCTCAGAATTGGCGCTATGCTACTG
GTGGATGGGAGACTGTGTTTAGACCTGTAAGTGAGACATGCACAGACAGATCTGGCCT
CTCCACTGGACACTGGTCAGGTGAAGTGAATGACAAAAATATTCAAGTGGTGGAGCTC
CCCATTGTAGACAGCCTCCATCCTCGGCCTCCTTCTTACCACTGGCTGTTCCAGAAGA
CCTTGCAGATCGACTCGTAAGAGTCCATGGTGATCCTGCAGTGTGGTGGGTGTCCCAG
TTCGTCAAATATTTGATTCGTCCACAACCTTGGCTAGAAAAGGAAATAGAAGAAGCCA
CCAAGAAGCTTGGCTTCAAACATCCAGTCATTGGAGTCCATGTCAGACGCACAGACAA
AGTGGGAACAGAGGCAGCCTTCCATCCCATCGAAGAGTACATGGTACATGTTGAAGAA
CATTTTCAGCTTCTCGCACGCAGAATGCAAGTGGATAAAAAAAGAGTATATCTGGCTAC
CGATGACCCTGCTTTGTTAAAGGAGGCAAAGACAAAGTACTCCAATTATGAATTTATTA
GTGATAACTCTATTTCTTGGTCAGCTGGATTACACAATCGGTACACAGAAAATTCACTT
CGGGGCGTGATCCTGGATATACACTTTCTCTCTCAGGCTGACTTCCTAGTGTGTACTTTT
TCATCCCAGGTCTGTCGGGTTGCTTATGAAATCATGCAAACCCTGCATCCTGATGCCTC
TGCAAACTTCCACTCTTTAGATGACATCTACTATTTTGGAGGCCAAAATGCCCACAACC
AGATTGCCGTTTATCCTCACAAACCTCGAACTGATGAGGAAATTCCAATGGAACCTGG
AGATATCATTGGTGTGGCTGGAAACCATTGGGATGGTTATTCTAAAGGTGTCAACAGAA
AACTTGGAAAAACAGGCTTATATCCCTCCTACAAAGTCCGAGAGAAGATAGAAACAGT
CAAGTATCCCACATATCCTGAAGCTGAAAAATAG
SEQ ID NO：10
蛋白质
大鼠(Rat)
α-1，6-岩藻糖转移酶(rFuT8)
MRAWTGSWRWIMLILFAWGTLLFYIGGHLVRDNDHPDHSSRELSKILAKLERLKQQNEDL
RRMAESLRIPEGPIDQGTATGRVRVLEEQLVKAKEQIENYKKQARNGLGKDHELLRRRIEN
GAKELWFFLQSELKKLKHLEGNELQRHADEILLDLGHHE
RSIMTDLYYLSQTDGAGDWREKEAKDLTELVQRRITYLQNPKDCSKARKLVCNINKGCG
YGCQLHHVVYCFMIAYGTQRTLILESQNWRYATGGWETVFRPVSETCTDRSGLSTGHWS
GEVNDKNIQVVELPIVDSLHPRPPYLPLAVPEDLADRLVRVH
GDPAVWWVSQFVKYLIRPQPWLEKEIEEATKKLGFKHPVIGVHVRRTDKVGTEAAFHPIE
EYMVHVEEHFQLLARRMQVDKKRVYLATDDPALLKEAKTKYSNYEFISDNSISWSAGLH
NRYTENSLRGVILDIHFLSQADFLVCTFSSQVCRVAYEIMQTLHPDASANFHSLDDIYYFGG
QNAHNQIAVYPHKPRTDEEIPMEPGDIIGVAGNHWDGYSKGVNRKLGKTGLYPSYKVREK
IETVKYPTYPEAEK
SEQ ID NO：11
DNA
小鼠(Mouse)
α-1，6-岩藻糖转移酶(mFuT8)
ATGCGGGCATGGACTGGTTCCTGGCGTTGGATTATGCTCATTCTTTTTGCCTGGGGGAC
CTTGTTATTTTATATAGGTGGTCATTTGGTTCGAGATAATGACCACCCTGATCACTCCAG
CAGAGAACTCTCCAAGATTCTTGCAAAGCTTGAACGCTTAAAACAGCAAAATGAAGA
CTTGAGGCGAATGGCTGAGTCTCTCCGAATACCAGAAGGCCCCATTGACCAGGGGACA
GCTACAGGAAGAGTCCGTGTTTTAGAAGAACAGCTTGTTAAGGCCAAAGAACAGATT
GAAAATTACAAGAAACAAGCTAGAAATGGTCTGGGGAAGGATCATGAAATCTTAAGAA
GGAGGATTGAAAATGGAGCTAAAGAGCTCTGGTTTTTTCTACAAAGCGAACTGAAGAA
ATTAAAGCATTTAGAAGGAAATGAACTCCAAAGACATGCAGATGAAATTCTTTTGGATT
TAGGACACCATGAAAGGTCTATCATGACAGATCTATACTACCTCAGTCAAACAGATGGA
GCAGGGGATTGGCGTGAAAAAGAGGCCAAAGATCTGACAGAGCTGGTCCAGCGGAG
AATAACATATCTCCAGAATCCTAAGGACTGCAGCAAAGCCAGGAAGCTGGTGTGTAAC
ATCAATAAAGGCTGTGGCTATGGTTGTCAACTCCATCACGTGGTCTACTGTTTCATGATT
GCTTATGGCACCCAGCGAACACTCATCTTGGAATCTCAGAATTGGCGCTATGCTACTGG
TGGATGGGAGACTGTGTTTAGACCTGTAAGTGAGACATGTACAGACAGATCTGGCCTC
TCCACTGGACACTGGTCAGGTGAAGTAAATGACAAAAACATTCAAGTGGTCGAGCTCC
CCATTGTAGACAGCCTCCATCCTCGGCCTCCTTACTTACCACTGGCTGTTCCAGAAGAC
CTTGCAGACCGACTCCTAAGAGTCCATGGTGACCCTGCAGTGTGGTGGGTGTCCCAGT
TTGTCAAATACTTGATTCGTCCACAACCTTGGCTGGAAAAGGAAATAGAAGAAGCCAC
CAAGAAGCTTGGCTTCAAACATCCAGTTATTGGAGTCCATGTCAGACGCACAGACAAA
GTGGGAACAGAAGCAGCCTTCCACCCCATCGAGGAGTACATGGTACACGTTGAAGAA
CATTTTCAGCTTCTCGCACGCAGAATGCAAGTGGATAAAAAAAGAGTATATCTGGCTAC
TGATGATCCTACTTTGTTAAAGGAGGCAAAGACAAAGTACTCCAATTATGAATTTATTA
GTGATAACTCTATTTCTTGGTCAGCTGGACTACACAATCGGTACACAGAAAATTCACTT
CGGGGTGTGATCCTGGATATACACTTTCTCTCACAGGCTGACTTTCTAGTGTGTACTTTT
TCATCCCAGGTCTGTCGGGTTGCTTATGAAATCATGCAAACCCTGCATCCTGATGCCTC
TGCGAACTTCCATTCTTTGGATGACATCTACTATTTTGGAGGCCAAAATGCCCACAATC
AGATTGCTGTTTATCCTCACAAACCTCGAACTGAAGAGGAAATTCCAATGGAACCTGG
AGATATCATTGGTGTGGCTGGAAACCATTGGGATGGTTATTCTAAAGGTATCAACAGAA
AACTTGGAAAAACAGGCTTATATCCCTCCTACAAAGTCCGAGAGAAGATAGAAACAGT
CAAGTATCCCACATATCCTGAAGCTGAAAAATAG
SEQ ID NO：12
蛋白质
小鼠(Mouse)
Alpha-1，6-岩藻糖转移酶(mFuT8)
MRAWTGSWRWIMLILFAWGTLLFYIGGHLVRDNDHPDHSSRELSKILAKLERLKQQNEDL
RRMAESLRIPEGPIDQGTATGRVRVLEEQLVKAKEQIENYKKQARNGLGKDHEILRRRIEN
GAKELWFFLQSELKKLKHLEGNELQRHADEILLDLGHHERSIMTDLYYLSQTDGAGDWR
EKEAKDLTELVQRRITYLQNPKDCSKARKLVCNINKGCGYGCQLHHVVYCFMIAYGTQRT
LILESQNWRYATGGWETVFRPVSETCTDRSGLSTGHWSGEVNDKNIQVVELPIVDSLHPRP
PYLPLAVPEDLADRLLRVHGDPAVWWVSQFVKYLIRPQPWLEKEIEEATKKLGFKHPVIG
VHVRRTDKVGTEAAFHPIEEYMVHVEEHFQLLARRMQVDKKRVYLATDDPTLLKEAKTK
YSNYEFISDNSISWSAGLHNRYTENSLRGVILDIHFLSQADFLVCTFSSQVCRVAYEIMQTL
HPDASANFHSLDDIYYFGGQNAHNQIAVYPHKPRTEEEIPMEPGDIIGVAGNHWDGYSKGI
NRKLGKTGLYPSYKVREKIETVKYPTYPEAEK
SEQ ID NO：13
DNA
猪(Porcine)
α-1，6-岩藻糖转移酶(pFuT8)
ATGCGGCCATGGACTGGTTCGTGGCGTTGGATTATGCTCATTCTTTTTGCCTGGGGGAC
CTTGCTATTTTACATAGGTGGTCACTTGGTACGAGATAATGACCACTCTGATCACTCTAG
CCGAGAACTGTCCAAGATTTTGGCAAAGCTGGAACGCTTAAAACAACAAAATGAAGA
CTTGAGGAGAATGGCTGAATCTCTCCGAATACCAGAAGGCCCCATTGATCAGGGGCCA
GCTTCAGGAAGAGTTCGTGCTTTAGAAGAGCAATTTATGAAGGCCAAAGAACAGATTG
AAAATTATAAGAAACAAACTAAAAATGGTCCAGGGAAGGATCATGAAATCCTAAGGAG
GAGGATTGAAAATGGAGCTAAAGAGCTCTGGTTTTTTCTACAAAGTGAGTTGAAGAAA
TTAAAGAATTTAGAAGGAAATGAACTCCAAAGACATGCAGATGAATTTCTATCAGATTT
GGGACATCATGAAAGGTCTATAATGACGGATCTATACTACCTCAGTCAAACAGATGGGG
CAGGTGATTGGCGTGAAAAGGAGGCCAAAGATCTGACAGAGCTGGTCCAGCGGAGAA
TAACATATCTTCAGAATCCCAAGGACTGCAGCAAAGCCAAGAAGCTAGTGTGTAATATC
AACAAAGGCTGTGGCTATGGCTGTCAGCTCCATCATGTAGTGTACTGCTTTATGATTGCA
TATGGCACCCAGCGAACACTCGCCTTGGAATCTCACAATTGGCGCTACGCTACTGGGG
GATGGGAAACTGTGTTTAGACCTGTAAGTGAGACGTGCACAGACAGATCTGGCAGCTC
CACTGGACATTGGTCAGGTGAAGTAAAGGACAAAAATGTTCAGGTGGTTGAGCTCCCC
ATTGTAGACAGTGTTCATCCTCGTCCTCCATATTTACCCCTGGCTGTCCCAGAAGACCTT
GCAGATCGACTTGTACGAGTCCATGGTGATCCTGCAGTGTGGTGGGTATCCCAGTTTGT
CAAGTACTTGATTCGCCCACAACCCTGGCTGGAAAAGGAAATAGAAGAGGCCACCAA
GAAGCTAGGCTTCAAACATCCAGTTATTGGAGTCCATGTTAGACGCACAGACAAAGTG
GGAGCGGAAGCAGCCTTCCATCCCATTGAGGAATACACGGTGCACGTTGAAGAAGAC
TTTCAGCTTCTTGCTCGCAGAATGCAAGTGGATAAAAAAAGGGTGTATTTGGCCACAG
ATGACCCTGCTTTGTTAAAAGAGGCAAAAACAAAGTACCCCAGTTATGAATTTATTAGT
GATAACTCTATCTCTTGGTCAGCTGGACTACATAATCGATATACAGAAAATTCACTTCGG
GGTGTGATCCTGGATATACACTTTCTCTCCCAGGCAGACTTCCTAGTGTGTACTTTTTCA
TCGCAGGTCTGTAGAGTTGCTTATGAAATCATGCAAGCGCTGCATCCTGATGCCTCTGC
GAACTTCCGTTCTTTGGATGACATCTACTATTTTGGAGGCCCAAATGCCCACAACCAAA
TTGCCATTTATCCTCACCAACCTCGAACTGAAGGAGAAATCCCCATGGAACCTGGAGAT
ATTATTGGTGTGGCTGGAAATCACTGGGATGGCTATCCTAAAGGTGTTAACAGAAAACT
GGGAAGGACGGGCCTATATCCCTCCTACAAAGTTCGAGAGAAGATAGAAACAGTCAAG
TACCCCACATATCCCGAGGCTGACAAGTAA
SEQ ID NO：13
蛋白质
猪(Porcine)
α-1，6-岩藻糖转移酶(pFuT8)
MRPWTGSWRWIMLILFAWGTLLFYIGGHLVRDNDHSDHSSRELSKILAKLERLKQQNEDL
RRMAESLRIPEGPIDQGPASGRVRALEEQFMKAKEQIENYKKQTKNGPGKDHEILRRRIEN
GAKELWFFLQSELKKLKNLEGNELQRHADEFLSDLGHHERSIMTDLYYLSQTDGAGDWR
EKEAKDLTELVQRRITYLQNPKDCSKAKKLVCNINKGCGYGCQLHHVVYCFMIAYGTQR
TLALESHNWRYATGGWETVFRPVSETCTDRSGSSTGHWSGEVKDKNVQVVELPIVDSVH
PRPPYLPLAVPEDLADRLVRVHGDPAVWWVSQFVKYLIRPQPWLEKEIEEATKKLGFKHP
VIGVHVRRTDKVGAEAAFHPIEEYTVHVEEDFQLLARRMQVDKKRVYLATDDPALLKEA
KTKYPSYEFISDNSISWSAGLHNRYTENSLRGVILDIHFLSQADFLVCTFSSQVCRVAYEIM
QALHPDASANFRSLDDIYYFGGPNAHNQIAIYPHQPRTEGEIPMEPGDIIGVAGNHWDGYP
KGVNRKLGRTGLYPSYKVREKIETVKYPTYPEADK
SEQ ID NO：15
DNA
人工序列
PCR引物SH415
GGCGG CCGCC ACCAT GGCAC ACGCA CCGGC ACGCT GC
SEQ ID NO：16
DNA
人工序列
PCR引物SH413
TTAAT TAATC AGGCA TTGGG GTTTG TCCTC ATG
SEQ ID NO：17
DNA
人工序列
PCR引物SH414
GGCGG CCGCC ACCAT GGGTG AACCC CAGGG ATCCA TG
SEQ ID NO：18
DNA
人工序列
PCR引物SH411
TTAAT TAATC ACTTC CGGGC CTGCT CGTAG TTG
SEQ ID NO：19
DNA
人工序列
PCR引物RCD679
GCGGC CGCCA CCATG AATAG GGCCC CTCTG AAGCG G
SEQ ID NO：20
DNA
人工序列
PCR引物RCD680
TTAAT TAATC ACACC CCCAT GGCGC TCTTC TC
SEQ ID NO：21
DNA
人工序列
PCR引物SH420
GCGGC GCGCC GATAA TGACC ACCCT GATCA CTCCA G
SEQ ID NO：22
DNA
人工序列
PCR引物SH421
CCTTA ATTAA CTATT TTTCA GCTTC AGGAT ATGTG GG-
SEQ ID NO：23
DNA
人工序列
PCR引物rEPO-正向
GGGAA TTCGC TCCCC CACGC CTCAT TTGCG AC
SEQ ID NO：24
DNA
人工序列
PCR引物rEPO-反向
CCTCT AGATC ACCTG TCCCC TCTCC TGCAG GC
SEQ ID NO：25
DNA
人工序列
PCR引物ScMnt1-正向
GGGCGGCCGCCACCATGGCCCTCTTTCTC AGTAAGAGACTGTTGAG
SEQ ID NO：26
DNA
人工序列
PCR引物ScMnt1-反向
CCGGCGCGCCCGATGACTTGTTGTTCAGGGGATATAGATCCTG
序列表
<110>Stephen Hamilton
<120>PRODUCTION OF GLYCOPROTEINS WITH
MODIFIED FUCOSYLATION
<130>GF0028Y
<150>60/905,345
<151>2007-03-07
<160>26
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>1119
<212>DNA
<213>人(Homo sapians)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1119)
<223>GDP-甘露糖-脱水酶(hGMD)
<400>1
atg gca cac gca ccg gca cgc tgc ccc agc gcc cgg ggc tcc ggg gac    48
Met Ala His Ala Pro Ala Arg Cys Pro Ser Ala Arg Gly Ser Gly Asp
 1               5                   10                  15
ggc gag atg ggc aag ccc agg aac gtg gcg ctc atc acc ggt atc aca    96
Gly Glu Met Gly Lys Pro Arg Asn Val Ala Leu Ile Thr Gly Ile Thr
             20                  25                  30
ggc cag gat ggt tcc tac ctg gct gag ttc ctg ctg gag aaa ggc tat    144
Gly Gln Asp Gly Ser Tyr Leu Ala Glu Phe Leu Leu Glu Lys Gly Tyr
         35                  40                  45
gag gtc cat gga att gta cgg cgg tcc agt tca ttt aat acg ggt cga    192
Glu Val His Gly Ile Val Arg Arg Ser Ser Ser Phe Asn Thr Gly Arg
     50                  55                  60
att gag cat ctg tat aag aat ccc cag gct cac att gaa gga aac atg    240
Ile Glu His Leu Tyr Lys Asn Pro Gln Ala His Ile Glu Gly Asn Met
 65                  70                  75                  80
aag ttg cac tat ggc gat ctc act gac agt acc tgc ctt gtg aag atc    288
Lys Leu His Tyr Gly Asp Leu Thr Asp Ser Thr Cys Leu Val Lys Ile
                 85                  90                  95
att aat gaa gta aag ccc aca gag atc tac aac ctt gga gcc cag agc    336
Ile Asn Glu Val Lys Pro Thr Glu Ile Tyr Asn Leu Gly Ala Gln Ser
            100                 105                 110
cac gtc aaa att tcc ttt gac ctc gct gag tac act gcg gac gtt gac    384
His Val Lys Ile Ser Phe Asp Leu Ala Glu Tyr Thr Ala Asp Val Asp
        115                 120                 125
gga gtt ggc act cta cga ctt cta gat gca gtt aag act tgt ggc ctt    432
Gly Val Gly Thr Leu Arg Leu Leu Asp Ala Val Lys Thr Cys Gly Leu
    130                 135                 140
atc aac tct gtg aag ttc tac caa gcc tca aca agt gaa ctt tat ggg    480
Ile Asn Ser Val Lys Phe Tyr Gln Ala Ser Thr Ser Glu Leu Tyr Gly
145                 150                 155                 160
aaa gtg cag gaa ata ccc cag aag gag acc acc cct ttc tat ccc cgg    528
Lys Val Gln Glu Ile Pro Gln Lys Glu Thr Thr Pro Phc Tyr Pro Arg
                165                 170                 175
tca ccc tat ggg gca gca aaa ctc tat gcc tat tgg att gtg gtg aac    576
Ser Pro Tyr Gly Ala Ala Lys Leu Tyr Ala Tyr Trp Ile Val Val Asn
            180                 185                 190
ttc cgt gag gcg tat aat ctc ttt gca gtg aac ggc att ctc ttc aat    624
Phe Arg Glu Ala Tyr Asn Leu Phe Ala Val Asn Gly Ile Leu Phe Asn
        195                 200                 205
cat gag agt ccc aga aga gga gct aat ttc gtt act cga aaa att agc    672
His Glu Ser Pro Arg Arg Gly Ala Asn Phe Val Thr Arg Lys Ile Ser
    210                 215                 220
cgg tca gta gct aag att tac ctt gga caa ctg gaa tgt ttc agt ttg    720
Arg Ser Val Ala Lys Ile Tyr Leu Gly Gln Leu Glu Cys Phe Ser Leu
225                 230                 235                 240
gga aat ctg gat gcc aaa cga gat tgg ggc cat gcc aag gac tat gtg    768
Gly Asn Leu Asp Ala Lys Arg Asp Trp Gly His Ala Lys Asp Tyr Val
                245                 250                 255
gag gct atg tgg ttg atg ttg cag aat gat gag ccg gag gac ttc gtt    816
Glu Ala Met Trp Leu Met Leu Gln Asn Asp Glu Pro Glu Asp Phe Val
            260                 265                 270
ata gct act ggg gag gtc cat agt gtc cgg gaa ttt gtc gag aaa tca    864
Ile Ala Thr Gly Glu Val His Ser Val Arg Glu Phe Val Glu Lys Ser
        275                 280                 285
ttc ttg cac att gga aaa acc att gtg tgg gaa gga aag aat gaa aat    912
Phe Leu His Ile Gly Lys Thr Ile Val Trp Glu Gly Lys Asn Glu Asn
    290                 295                 300
gaa gtg ggc aga tgt aaa gag acc ggc aaa gtt cac gtg act gtg gat    960
Glu Val Gly Arg Cys Lys Glu Thr Gly Lys Val His Val Thr Val Asp
305                 310                 315                 320
ctc aag tac tac cgg cca act gaa gtg gac ttt ctg cag ggc gac tgc    1008
Leu Lys Tyr Tyr Arg Pro Thr Glu Val Asp Phe Leu Gln Gly Asp Cys
                325                 330                 335
acc aaa gcg aaa cag aag ctg aac tgg aag ccc cgg gtc gct ttc gat    1056
Thr Lys Ala Lys Gln Lys Leu Asn Trp Lys Pro Arg Val Ala Phe Asp
            340                 345                 350
gag ctg gtg agg gag atg gtg cac gcc gac gtg gag ctc atg agg aca    1104
Glu Leu Val Arg Glu Met Val His Ala Asp Val Glu Leu Met Arg Thr
        355                 360                 365
aac ccc aat gcc tga                                                1119
Asn Pro Asn Ala  *
    370
<210>2
<211>372
<212>PRT
<213>人(Homo sapians)
<400>2
Met Ala His Ala Pro Ala Arg Cys Pro Ser Ala Arg Gly Ser Gly Asp
 1               5                  10                  15
Gly Glu Met Gly Lys Pro Arg Asn Val Ala Leu Ile Thr Gly Ile Thr
            20                  25                  30
Gly Gln Asp Gly Ser Tyr Leu Ala Glu Phe Leu Leu Glu Lys Gly Tyr
        35                  40                  45
Glu Val His Gly Ile Val Arg Arg Ser Ser Ser Phe Asn Thr Gly Arg
    50                  55                  60
Ile Glu His Leu Tyr Lys Asn Pro Gln Ala His Ile Glu Gly Asn Met
65                  70                  75                  80
Lys Leu His Tyr Gly Asp Leu Thr Asp Ser Thr Cys Leu Val Lys Ile
                85                  90                  95
Ile Asn Glu Val Lys Pro Thr Glu Ile Tyr Asn Leu Gly Ala Gln Ser
            100                 105                 110
His Val Lys Ile Ser Phe Asp Leu Ala Glu Tyr Thr Ala Asp Val Asp
        115                 120                 125
Gly Val Gly Thr Leu Arg Leu Leu Asp Ala Val Lys Thr Cys Gly Leu
    130                 135                 140
Ile Asn Ser Val Lys Phe Tyr Gln Ala Ser Thr Ser Glu Leu Tyr Gly
145                 150                 155                 160
Lys Val Gln Glu Ile Pro Gln Lys Glu Thr Thr Pro Phe Tyr Pro Arg
                165                 170                 175
Ser Pro Tyr Gly Ala Ala Lys Leu Tyr Ala Tyr Trp Ile Val Val Asn
            180                 185                 190
Phe Arg Glu Ala Tyr Asn Leu Phe Ala Val Asn Gly Ile Leu Phe Asn
        195                 200                 205
His Glu Ser Pro Arg Arg Gly Ala Asn Phe Val Thr Arg Lys Ile Ser
    210                 215                 220
Arg Ser Val Ala Lys Ile Tyr Leu Gly Gln Leu Glu Cys Phe Ser Leu
225                 230                 235                 240
Gly Asn Leu Asp Ala Lys Arg Asp Trp Gly His Ala Lys Asp Tyr Val
                245                 250                 255
Glu Ala Met Trp Leu Met Leu Gln Asn Asp Glu Pro Glu Asp Phe Val
            260                 265                 270
Ile Ala Thr Gly Glu Val His Ser Val Arg Glu Phe Val Glu Lys Ser
        275                 280                 285
Phe Leu His Ile Gly Lys Thr Ile Val Trp Glu Gly Lys Asn Glu Asn
    290                 295                 300
Glu Val Gly Arg Cys Lys Glu Thr Gly Lys Val His Val Thr Val Asp
305                 310                 315                 320
Leu Lys Tyr Tyr Arg Pro Thr Glu Val Asp Phe Leu Gln Gly Asp Cys
                325                 330                 335
Thr Lys Ala Lys Gln Lys Leu Asn Trp Lys Pro Arg Val Ala Phe Asp
            340                 345                 350
Glu Leu Val Arg Glu Met Val His Ala Asp Val Glu Leu Met Arg Thr
        355                 360                 365
Asn Pro Asn Ala
    370
<210>3
<211>966
<212>DNA
<213>人(Homo sapians)
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(966)
<223>GDP-酮氧基-脱氧-甘露糖-差向异构酶/GDP-酮-脱氧-
半乳糖-还原酶(FX蛋白)
<400>3
atg ggt gaa ccc cag gga tcc atg cgg att cta gtg aca ggg ggc tct  48
Met Gly Glu Pro Gln Gly Ser Met Arg Ile Leu Val Thr Gly Gly Ser
 1               5                   10                  15
ggg ctg gta ggc aaa gcc atc cag aag gtg gta gca gat gga gct gga  96
Gly Leu Val Gly Lys Ala Ile Gln Lys Val Val Ala Asp Gly Ala Gly
             20                  25                  30
ctt cct gga gag gac tgg gtg ttt gtc tcc tct aaa gac gcc gat ctc  144
Leu Pro Gly Glu Asp Trp Val Phe Val Ser Ser Lys Asp Ala Asp Leu
         35                  40                  45
acg gat aca gca cag acc cgc gcc ctg ttt gag aag gtc caa ccc aca  192
Thr Asp Thr Ala Gln Thr Arg Ala Leu Phe Glu Lys Val Gln Pro Thr
     50                  55                  60
cac gtc atc cat ctt gct gca atg gtg ggg ggc ctg ttc cgg aat atc  240
His Val Ile His Leu Ala Ala Met Val Gly Gly Leu Phe Arg Asn Ile
65                  70                  75                  80
aaa tac aat ttg gac ttc tgg agg aaa aac gtg cac atg aac gac aac  288
Lys Tyr Asn Leu Asp Phe Trp Arg Lys Asn Val His Met Asn Asp Asn
                 85                  90                  95
gtc ctg cac tcg gcc ttt gag gtg ggg gcc cgc aag gtg gtg tcc tgc  336
Val Leu His Ser Ala Phe Glu Val Gly Ala Arg Lys Val Val Ser Cys
            100                 105                 110
ctg tcc acc tgt atc ttc cct gac aag acg acc tac ccg ata gat gag  384
Leu Ser Thr Cys Ile Phe Pro Asp Lys Thr Thr Tyr Pro Ile Asp Glu
        115                 120                 125
acc atg atc cac aat ggg cct ccc cac aac agc aat ttt ggg tac tcg 432
Thr Met Ile His Asn Gly Pro Pro His Asn Ser Asn Phe Gly Tyr Ser
    130                 135                 140
tat gcc aag agg atg atc gac gtg cag aac agg gcc tac ttc cag cag 480
Tyr Ala Lys Arg Met Ile Asp Val Gln Asn Arg Ala Tyr Phe Gln Gln
145                 150                 155                 160
tac ggc tgc acc ttc acc gct gtc atc ccc acc aac gtt ttc ggg ccc  528
Tyr Gly Cys Thr Phe Thr Ala Val Ile Pro Thr Asn Val Phe Gly Pro
                165                 170                 175
cac gac aac ttc aac atc gag gat ggc cac gtg ctg cct ggc ctc atc  576
His Asp Asn Phe Asn Ile Glu Asp Gly His Val Leu Pro Gly Leu Ile
            180                 185                 190
cac aag gtg cac ctg gcc aag agc agc ggc tcg gcc ctg acg gtg tgg  624
His Lys Val His Leu Ala Lys Ser Ser Gly Ser Ala Leu Thr Val Trp
        195                 200                 205
ggt aca ggg aat ccg cgg agg cag ttc ata tac tcg ctg gac ctg gcc  672
Gly Thr Gly Asn Pro Arg Arg Gln Phe Ile Tyr Ser Leu Asp Leu Ala
    210                 215                 220
cag ctc ttt atc tgg gtc ctg cgg gag tac aat gaa gtg gag ccc atc  720
Gln Leu Phe Ile Trp Val Leu Arg Glu Tyr Asn Glu Val Glu Pro Ile
225                 230                 235                 240
atc ctc tcc gtg ggc gag gaa gat gag gtc tcc atc aag gag gca gcc  768
Ile Leu Ser Val Gly Glu Glu Asp Glu Val Ser Ile Lys Glu Ala Ala
                245                 250                 255
gag gcg gtg gtg gag gcc atg gac ttc cat ggg gaa gtc acc ttt gat 816
Glu Ala Val Val Glu Ala Met Asp Phe His Gly Glu Val Thr Phe Asp
            260                 265                 270
aca acc aag tcg gat ggg cag ttt aag aag aca gcc agt aac agc aag 864
Thr Thr Lys Ser Asp Gly Gln Phe Lys Lys Thr Ala Ser Asn Ser Lys
        275                 280                 285
ctg agg acc tac ctg ccc gac ttc cgg ttc aca ccc ttc aag cag gcg  912
Leu Arg Thr Tyr Leu Pro Asp Phe Arg Phe Thr Pro Phe Lys Gln Ala
    290                 295                 300
gtg aag gag acc tgt gct tgg ttc act gac aac tac gag cag gcc cgg  960
Val Lys Glu Thr Cys Ala Trp Phe Thr Asp Asn Tyr Glu Gln Ala Arg
305                 310                 315                 320
aag tga                                                          966
Lys*
<210>4
<211>321
<212>PRT
<213>人(Homo sapians)
<400>4
Met Gly Glu Pro Gln Gly Ser Met Arg Ile Leu Val Thr Gly Gly Ser
 1               5                  10                  15
Gly Leu Val Gly Lys Ala Ile Gln Lys Val Val Ala Asp Gly Ala Gly
            20                  25                  30
Leu Pro Gly Glu Asp Trp Val Phe Val Ser Ser Lys Asp Ala Asp Leu
        35                  40                  45
Thr Asp Thr Ala Gln Thr Arg Ala Leu Phe Glu Lys Val Gln Pro Thr
    50                  55                  60
His Val Ile His Leu Ala Ala Met Val Gly Gly Leu Phe Arg Asn Ile
65                  70                  75                  80
Lys Tyr Asn Leu Asp Phe Trp Arg Lys Asn Val His Met Asn Asp Asn
                85                  90                  95
Val Leu His Ser Ala Phe Glu Val Gly Ala Arg Lys Val Val Ser Cys
            100                 105                 110
Leu Ser Thr Cys Ile Phe Pro Asp Lys Thr Thr Tyr Pro Ile Asp Glu
        115                 120                 125
Thr Met Ile His Asn Gly Pro Pro His Asn Ser Asn Phe Gly Tyr Ser
    130                 135                 140
Tyr Ala Lys Arg Met Ile Asp Val Gln Asn Arg Ala Tyr Phe Gln Gln
145                 150                 155                 160
Tyr Gly Cys Thr Phe Thr Ala Val Ile Pro Thr Asn Val Phe Gly Pro
                165                 170                 175
His Asp Asn Phe Asn Ile Glu Asp Gly His Val Leu Pro Gly Leu Ile
            180                 185                 190
His Lys Val His Leu Ala Lys Ser Ser Gly Ser Ala Leu Thr Val Trp
        195                 200                 205
Gly Thr Gly Asn Pro Arg Arg Gln Phe Ile Tyr Ser Leu Asp Leu Ala
    210                 215                 220
Gln Leu Phe Ile Trp Val Leu Arg Glu Tyr Asn Glu Val Glu Pro Ile
225                 230                 235                 240
Ile Leu Ser Val Gly Glu Glu Asp Glu Val Ser Ile Lys Glu Ala Ala
                245                 250                 255
Glu Ala Val Val Glu Ala Met Asp Phe His Gly Glu Val Thr Phe Asp
            260                 265                 270
Thr Thr Lys Ser Asp Gly Gln Phe Lys Lys Thr Ala Ser Asn Ser Lys
        275                 280                 285
Leu Arg Thr Tyr Leu Pro Asp Phe Arg Phe Thr Pro Phe Lys Gln Ala
    290                 295                 300
Val Lys Glu Thr Cys Ala Trp Phe Thr Asp Asn Tyr Glu Gln Ala Arg
305                 310                 315                 320
Lys
<210>5
<211>1095
<212>DNA
<213>人(Homo sapians)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1095)
<223>GDP-岩藻糖转运体
<400>5
atg aat agg gcc cct ctg aag cgg tcc agg atc ctg cac atg gcg ctg  48
Met Asn Arg Ala Pro Leu Lys Arg Ser Arg Ile Leu His Met Ala Leu
 1               5                   10                  15
acc ggg gcc tca gac ccc tct gca gag gca gag gcc aac ggg gag aag  96
Thr Gly Ala Ser Asp Pro Ser Ala Glu Ala Glu Ala Asn Gly Glu Lys
             20                  25                  30
ccc ttt ctg ctg cgg gca ttg cag atc gcg ctg gtg gtc tcc ctc tac  144
Pro Phe Leu Leu Arg Ala Leu Gln Ile Ala Leu Val Val Ser Leu Tyr
         35                  40                  45
tgg gtc acc tcc atc tcc atg gtg ttc ctt aat aag tac ctg ctg gac  192
Trp Val Thr Ser Ile Ser Met Val Phe Leu Asn Lys Tyr Leu Leu Asp
    50                  55                  60
agc ccc tcc ctg cgg ctg gac acc ccc atc ttc gtc acc ttc tac cag    240
Ser Pro Ser Leu Arg Leu Asp Thr Pro Ile Phe Val Thr Phe Tyr Gln
65                  70                  75                  80
tgc ctg gtg acc acg ctg ctg tgc aaa ggc ctc agc gct ctg gcc gcc    288
Cys Leu Val Thr Thr Leu Leu Cys Lys Gly Leu Ser Ala Leu Ala Ala
                 85                  90                  95
tgc tgc cct ggt gcc gtg gac ttc ccc agc ttg cgc ctg gac ctc agg    336
Cys Cys Pro Gly Ala Val Asp Phe Pro Ser Leu Arg Leu Asp Leu Arg
            100                 105                 110
gtg gcc cgc agc gtc ctg ccc ctg tcg gtg gtc ttc atc ggc atg atc    384
Val Ala Arg Ser Val Leu Pro Leu Ser Val Val Phe Ile Gly Met Ile
        115                 120                 125
acc ttc aat aac ctc tgc ctc aag tac gtc ggt gtg gcc ttc tac aat    432
Thr Phe Asn Asn Leu Cys Leu Lys Tyr Val Gly Val Ala Phe Tyr Asn
    130                 135                 140
gtg ggc cgc tca ctc acc acc gtc ttc aac gtg ctg ctc tcc tac ctg    480
Val Gly Arg Ser Leu Thr Thr Val Phe Asn Val Leu Leu Ser Tyr Leu
145                 150                 155                 160
ctg ctc aag cag acc acc tcc ttc tat gcc ctg ctc acc tgc ggt atc    528
Leu Leu Lys Gln Thr Thr Ser Phe Tyr Ala Leu Leu Thr Cys Gly Ile
                165                 170                 175
atc atc ggg ggc ttc tgg ctt ggt gtg gac cag gag ggg gca gaa ggc    576
Ile Ile Gly Gly Phe Trp Leu Gly Val Asp Gln Glu Gly Ala Glu Gly
            180                 185                 190
acc ctg tcg tgg ctg ggc acc gtc ttc ggc gtg ctg gct agc ctc tgt    624
Thr Leu Ser Trp Leu Gly Thr Val Phe Gly Val Leu Ala Ser Leu Cys
        195                 200                 205
gtc tcg ctc aac gcc atc tac acc acg aag gtg ctc ccg gcg gtg gac    672
Val Ser Leu Asn Ala Ile Tyr Thr Thr Lys Val Leu Pro Ala Val Asp
    210                 215                 220
ggc agc atc tgg cgc ctg act ttc tac aac aac gtc aac gcc tgc atc    720
Gly Ser Ile Trp Arg Leu Thr Phe Tyr Asn Asn Val Asn Ala Cys Ile
225                 230                 235                 240
ctc ttc ctg ccc ctg ctc ctg ctg ctc ggg gag ctt cag gcc ctg cgt    768
Leu Phe Leu Pro Leu Leu Leu Leu Leu Gly Glu Leu Gln Ala Leu Arg
                245                 250                 255
gac ttt gcc cag ctg ggc agt gcc cac ttc tgg ggg atg atg acg ctg    816
Asp Phe Ala Gln Leu Gly Ser Ala His Phe Trp Gly Met Met Thr Leu
            260                 265                 270
ggc ggc ctg ttt ggc ttt gcc atc ggc tac gtg aca gga ctg cag atc    864
Gly Gly Leu Phe Gly Phe Ala Ile Gly Tyr Val Thr Gly Leu Gln Ile
        275                 280                 285
aag ttc acc agt ccg ctg acc cac aat gtg tcg ggc acg gcc aag gcc    912
Lys Phe Thr Ser Pro Leu Thr His Asn Val Ser Gly Thr Ala Lys Ala
    290                 295                 300
tgt gcc cag aca gtg ctg gcc gtg ctc tac tac gag gag acc aag agc    960
Cys Ala Gln Thr Val Leu Ala Val Leu Tyr Tyr Glu Glu Thr Lys Ser
305                 310                 315                 320
ttc ctc tgg tgg acg agc aac atg atg gtg ctg ggc ggc tcc tcc gcc    1008
Phe Leu Trp Trp Thr Ser Asn Met Met Val Leu Gly Gly Ser Ser Ala
                325                 330                 335
tac acc tgg gtc agg ggc tgg gag atg aag aag act ccg gag gag ccc    1056
Tyr Thr Trp Val Arg Gly Trp Glu Met Lys Lys Thr Pro Glu Glu Pro
            340                 345                 350
agc ccc aaa gac agc gag aag agc gcc atg ggg gtg tga    1095
Ser Pro Lys Asp Ser Glu Lys Ser Ala Met Gly Val*
        355                 360
<210>6
<211>364
<212>PRT
<213>人(Homo sapians)
<400>6
Met Asn Arg Ala Pro Leu Lys Arg Ser Arg Ile Leu His Met Ala Leu
 1               5                  10                  15
Thr Gly Ala Ser Asp Pro Ser Ala Glu Ala Glu Ala Asn Gly Glu Lys
            20                  25                  30
Pro Phe Leu Leu Arg Ala Leu Gln Ile Ala Leu Val Val Ser Leu Tyr
        35                  40                  45
Trp Val Thr Ser Ile Ser Met Val Phe Leu Asn Lys Tyr Leu Leu Asp
    50                  55                  60
Ser Pro Ser Leu Arg Leu Asp Thr Pro Ile Phe Val Thr Phe Tyr Gln
65                  70                  75                  80
Cys Leu Val Thr Thr Leu Leu Cys Lys Gly Leu Ser Ala Leu Ala Ala
                85                  90                  95
Cys Cys Pro Gly Ala Val Asp Phe Pro Ser Leu Arg Leu Asp Leu Arg
            100                 105                 110
Val Ala Arg Ser Val Leu Pro Leu Ser Val Val Phe Ile Gly Met Ile
        115                 120                 125
Thr Phe Asn Asn Leu Cys Leu Lys Tyr Val Gly Val Ala Phe Tyr Asn
    130                 135                 140
Val Gly Arg Ser Leu Thr Thr Val Phe Asn Val Leu Leu Ser Tyr Leu
145                 150                 155                 160
Leu Leu Lys Gln Thr Thr Ser Phe Tyr Ala Leu Leu Thr Cys Gly Ile
                165                 170                 175
Ile Ile Gly Gly Phe Trp Leu Gly Val Asp Gln Glu Gly Ala Glu Gly
            180                 185                 190
Thr Leu Ser Trp Leu Gly Thr Val Phe Gly Val Leu Ala Ser Leu Cys
        195                 200                 205
Val Ser Leu Asn Ala Ile Tyr Thr Thr Lys Val Leu Pro Ala Val Asp
    210                 215                 220
Gly Ser Ile Trp Arg Leu Thr Phe Tyr Asn Asn Val Asn Ala Cys Ile
225                 230                 235                 240
Leu Phe Leu Pro Leu Leu Leu Leu Leu Gly Glu Leu Gln Ala Leu Arg
                245                 250                 255
Asp Phe Ala Gln Leu Gly Ser Ala His Phe Trp Gly Met Met Thr Leu
            260                 265                 270
Gly Gly Leu Phe Gly Phe Ala Ile Gly Tyr Val Thr Gly Leu Gln Ile
        275                 280                 285
Lys Phe Thr Ser Pro Leu Thr His Asn Val Ser Gly Thr Ala Lys Ala
    290                 295                 300
Cys Ala Gln Thr Val Leu Ala Val Leu Tyr Tyr Glu Glu Thr Lys Ser
305                 310                 315                 320
Phe Leu Trp Trp Thr Ser Asn Met Met Val Leu Gly Gly Ser Ser Ala
                325                 330                 335
Tyr Thr Trp Val Arg Gly Trp Glu Met Lys Lys Thr Pro Glu Glu Pro
            340                 345                 350
Ser Pro Lys Asp Ser Glu Lys Ser Ala Met Gly Val
        355                 360
<210>7
<211>1728
<212>DNA
<213>人(Homo sapians)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1728)
<223>α-1，6-岩藻糖基转移酶(hFuT8)
<400>7
atg cgg cca tgg act ggt tcc tgg cgt tgg att atg ctc att ctt ttt    48
Met Arg Pro Trp Thr Gly Ser Trp Arg Trp Ile Met Leu Ile Leu Phe
 1               5                   10                  15
gcc tgg ggg acc ttg ctg ttt tat ata ggt ggt cac ttg gta cga gat    96
Ala Trp Gly Thr Leu Leu Phe Tyr Ile Gly Gly His Leu Val Arg Asp
             20                  25                  30
aat gac cat cct gat cac tct agc cga gaa ctg tcc aag att ctg gca    144
Asn Asp His Pro Asp His Ser Ser Arg Glu Leu Ser Lys Ile Leu Ala
         35                  40                  45
aag ctt gaa cgc tta aaa caa cag aat gaa gac ttg agg cga atg gcc    192
Lys Leu Glu Arg Leu Lys Gln Gln Asn Glu Asp Leu Arg Arg Met Ala
     50                  55                  60
gaa tct ctc cgg ata cca gaa ggc cct att gat cag ggg cca gct ata    240
Glu Ser Leu Arg Ile Pro Glu Gly Pro Ile Asp Gln Gly Pro Ala Ile
 65                  70                  75                  80
gga aga gta cgc gtt tta gaa gag cag ctt gtt aag gcc aaa gaa cag    288
Gly Arg Val Arg Val Leu Glu Glu Gln Leu Val Lys Ala Lys Glu Gln
                 85                  90                  95
att gaa aat tac aag aaa cag acc aga aat ggt ctg ggg aag gat cat    336
Ile Glu Asn Tyr Lys Lys Gln Thr Arg Asn Gly Leu Gly Lys Asp His
            100                 105                 110
gaa atc ctg agg agg agg att gaa aat gga gct aaa gag ctc tgg ttt    384
Glu Ile Leu Arg Arg Arg Ile Glu Asn Gly Ala Lys Glu Leu Trp Phe
        115                 120                 125
ttc cta cag agt gaa ttg aag aaa tta aag aac tta gaa gga aat gaa    432
Phe Leu Gln Ser Glu Leu Lys Lys Leu Lys Asn Leu Glu Gly Asn Glu
    130                 135                 140
ctc caa aga cat gca gat gaa ttt ctt ttg gat tta gga cat cat gaa    480
Leu Gln Arg His Ala Asp Glu Phe Leu Leu Asp Leu Gly His His Glu
145                 150                 155                 160
agg tct ata atg acg gat cta tac tac ctc agt cag aca gat gga gca    528
Arg Ser Ile Met Thr Asp Leu Tyr Tyr Leu Ser Gln Thr Asp Gly Ala
                165                 170                 175
ggt gat tgg cgg gaa aaa gag gcc aaa gat ctg aca gaa ctg gtt cag    576
Gly Asp Trp Arg Glu Lys Glu Ala Lys Asp Leu Thr Glu Leu Val Gln
            180                 185                 190
cgg aga ata aca tat ctt cag aat ccc aag gac tgc agc aaa gcc aaa    624
Arg Arg Ile Thr Tyr Leu Gln Asn Pro Lys Asp Cys Ser Lys Ala Lys
        195                 200                 205
aag ctg gtg tgt aat atc aac aaa ggc tgt ggc tat ggc tgt cag ctc    672
Lys Leu Val Cys Asn Ile Asn Lys Gly Cys Gly Tyr Gly Cys Gln Leu
    210                 215                 220
cat cat gtg gtc tac tgc ttc atg att gca tat ggc acc cag cga aca    720
His His Val Val Tyr Cys Phe Met Ile Ala Tyr Gly Thr Gln Arg Thr
225                 230                 235                 240
ctc atc ttg gaa tct cag aat tgg cgc tat gct act ggt gga tgg gag    768
Leu Ile Leu Glu Ser Gln Asn Trp Arg Tyr Ala Thr Gly Gly Trp Glu
                245                 250                 255
act gta ttt agg cct gta agt gag aca tgc aca gac aga tct ggc atc    816
Thr Val Phe Arg Pro Val Ser Glu Thr Cys Thr Asp Arg Ser Gly Ile
            260                 265                 270
tcc act gga cac tgg tca ggt gaa gtg aag gac aaa aat gtt caa gtg    864
Ser Thr Gly His Trp Ser Gly Glu Val Lys Asp Lys Asn Val Gln Val
        275                 280                 285
gtc gag ctt ccc att gta gac agt ctt cat ccc cgt cct cca tat tta    912
Val Glu Leu Pro Ile Val Asp Ser Leu His Pro Arg Pro Pro Tyr Leu
    290                 295                 300
ccc ttg gct gta cca gaa gac ctc gca gat cga ctt gta cga gtg cat    960
Pro Leu Ala Val Pro Glu Asp Leu Ala Asp Arg Leu Val Arg Val His
305                 310                 315                 320
ggt gac cct gca gtg tgg tgg gtg tct cag ttt gtc aaa tac ttg atc    1008
Gly Asp Pro Ala Val Trp Trp Val Ser Gln Phe Val Lys Tyr Leu Ile
                325                 330                 335
cgc cca cag cct tgg cta gaa aaa gaa ata gaa gaa gcc acc aag aag    1056
Arg Pro Gln Pro Trp Leu Glu Lys Glu Ile Glu Glu Ala Thr Lys Lys
            340                 345                 350
ctt ggc ttc aaa cat cca gtt att gga gtc cat gtc aga cgc aca gac    1104
Leu Gly Phe Lys His Pro Val Ile Gly Val His Val Arg Arg Thr Asp
        355                 360                 365
aaa gtg gga aca gaa gct gcc ttc cat ccc att gaa gag tac atg gtg    1152
Lys Val Gly Thr Glu Ala Ala Phe His Pro Ile Glu Glu Tyr Met Val
    370                 375                 380
cat gtt gaa gaa cat ttt cag ctt ctt gca cgc aga atg caa gtg gac    1200
His Val Glu Glu His Phe Gln Leu Leu Ala Arg Arg Met Gln Val Asp
385                 390                 395                 400
aaa aaa aga gtg tat ttg gcc aca gat gac cct tct tta tta aag gag    1248
Lys Lys Arg Val Tyr Leu Ala Thr Asp Asp Pro Ser Leu Leu Lys Glu
                405                 410                 415
gca aaa aca aag tac ccc aat tat gaa ttt att agt gat aac tct att    1296
Ala Lys Thr Lys Tyr Pro Asn Tyr Glu Phe Ile Ser Asp Asn Ser Ile
            420                 425                 430
tcc tgg tca gct gga ctg cac aat cga tac aca gaa aat tca ctt cgt    1344
Ser Trp Ser Ala Gly Leu His Asn Arg Tyr Thr Glu Asn Ser Leu Arg
        435                 440                 445
gga gtg atc ctg gat ata cat ttt ctc tct cag gca gac ttc cta gtg    1392
Gly Val Ile Leu Asp Ile His Phe Leu Ser Gln Ala Asp Phe Leu Val
    450                 455                 460
tgt act ttt tca tcc cag gtc tgt cga gtt gct tat gaa att atg caa    1440
Cys Thr Phe Ser Ser Gln Val Cys Arg Val Ala Tyr Glu Ile Met Gln
465                 470                 475                 480
aca cta cat cct gat gcc tct gca aac ttc cat tct tta gat gac atc    1488
Thr Leu His Pro Asp Ala Ser Ala Asn Phe His Ser Leu Asp Asp Ile
                485                 490                 495
tac tat ttt ggg ggc cag aat gcc cac aat caa att gcc att tat gct    1536
Tyr Tyr Phe Gly Gly Gln Asn Ala His Asn Gln Ile Ala Ile Tyr Ala
            500                 505                 510
cac caa ccc cga act gca gat gaa att ccc atg gaa cct gga gat atc    1584
His Gln Pro Arg Thr Ala Asp Glu Ile Pro Met Glu Pro Gly Asp Ile
        515                 520                 525
att ggt gtg gct gga aat cat tgg gat ggc tat tct aaa ggt gtc aac    1632
Ile Gly Val Ala Gly Asn His Trp Asp Gly Tyr Ser Lys Gly Val Asn
    530                 535                 540
agg aaa ttg gga agg acg ggc cta tat ccc tcc tac aaa gtt cga gag    1680
Arg Lys Leu Gly Arg Thr Gly Leu Tyr Pro Ser Tyr Lys Val Arg Glu
545                 550                 555                 560
aag ata gaa acg gtc aag tac ccc aca tat cct gag gct gag aaa taa    1728
Lys Ile Glu Thr Val Lys Tyr Pro Thr Tyr Pro Glu Ala Glu Lys  *
                565                 570                 575
<210>8
<211>575
<212>PRT
<213>人(Homo sapians)
<400>8
Met Arg Pro Trp Thr Gly Ser Trp Arg Trp Ile Met Leu Ile Leu Phe
 1               5                  10                  15
Ala Trp Gly Thr Leu Leu Phe Tyr Ile Gly Gly His Leu Val Arg Asp
            20                  25                  30
Asn Asp His Pro Asp His Ser Ser Arg Glu Leu Ser Lys Ile Leu Ala
        35                  40                  45
Lys Leu Glu Arg Leu Lys Gln Gln Asn Glu Asp Leu Arg Arg Met Ala
    50                  55                  60
Glu Ser Leu Arg Ile Pro Glu Gly Pro Ile Asp Gln Gly Pro Ala Ile
65                  70                  75                  80
Gly Arg Val Arg Val Leu Glu Glu Gln Leu Val Lys Ala Lys Glu Gln
                85                  90                  95
Ile Glu Asn Tyr Lys Lys Gln Thr Arg Asn Gly Leu Gly Lys Asp His
            100                 105                 110
Glu Ile Leu Arg Arg Arg Ile Glu Asn Gly Ala Lys Glu Leu Trp Phe
        115                 120                 125
Phe Leu Gln Ser Glu Leu Lys Lys Leu Lys Asn Leu Glu Gly Asn Glu
    130                 135                 140
Leu Gln Arg His Ala Asp Glu Phe Leu Leu Asp Leu Gly His His Glu
145                 150                 155                 160
Arg Ser Ile Met Thr Asp Leu Tyr Tyr Leu Ser Gln Thr Asp Gly Ala
                165                 170                 175
Gly Asp Trp Arg Glu Lys Glu Ala Lys Asp Leu Thr Glu Leu Val Gln
            180                 185                 190
Arg Arg Ile Thr Tyr Leu Gln Asn Pro Lys Asp Cys Ser Lys Ala Lys
        195                 200                 205
Lys Leu Val Cys Asn Ile Asn Lys Gly Cys Gly Tyr Gly Cys Gln Leu
    210                 215                 220
His His Val Val Tyr Cys Phe Met Ile Ala Tyr Gly Thr Gln Arg Thr
225                 230                 235                 240
Leu Ile Leu Glu Ser Gln Asn Trp Arg Tyr Ala Thr Gly Gly Trp Glu
                245                 250                 255
Thr Val Phe Arg Pro Val Ser Glu Thr Cys Thr Asp Arg Ser Gly Ile
            260                 265                 270
Ser Thr Gly His Trp Ser Gly Glu Val Lys Asp Lys Asn Val Gln Val
        275                 280                 285
Val Glu Leu Pro Ile Val Asp Ser Leu His Pro Arg Pro Pro Tyr Leu
    290                 295                 300
Pro Leu Ala Val Pro Glu Asp Leu Ala Asp Arg Leu Val Arg Val His
305                 310                 315                 320
Gly Asp Pro Ala Val Trp Trp Val Ser Gln Phe Val Lys Tyr Leu Ile
                325                 330                 335
Arg Pro Gln Pro Trp Leu Glu Lys Glu Ile Glu Glu Ala Thr Lys Lys
            340                 345                 350
Leu Gly Phe Lys His Pro Val Ile Gly Val His Val Arg Arg Thr Asp
        355                 360                 365
Lys Val Gly Thr Glu Ala Ala Phe His Pro Ile Glu Glu Tyr Met Val
    370                 375                 380
His Val Glu Glu His Phe Gln Leu Leu Ala Arg Arg Met Gln Val Asp
385                 390                 395                 400
Lys Lys Arg Val Tyr Leu Ala Thr Asp Asp Pro Ser Leu Leu Lys Glu
                405                 410                 415
Ala Lys Thr Lys Tyr Pro Asn Tyr Glu Phe Ile Ser Asp Asn Ser Ile
            420                 425                 430
Ser Trp Ser Ala Gly Leu His Asn Arg Tyr Thr Glu Asn Ser Leu Arg
        435                 440                 445
Gly Val Ile Leu Asp Ile His Phe Leu Ser Gln Ala Asp Phe Leu Val
    450                 455                 460
Cys Thr Phe Ser Ser Gln Val Cys Arg Val Ala Tyr Glu Ile Met Gln
465                 470                 475                 480
Thr Leu His Pro Asp Ala Ser Ala Asn Phe His Ser Leu Asp Asp Ile
                485                 490                 495
Tyr Tyr Phe Gly Gly Gln Asn Ala His Asn Gln Ile Ala Ile Tyr Ala
            500                 505                 510
His Gln Pro Arg Thr Ala Asp Glu Ile Pro Met Glu Pro Gly Asp Ile
        515                 520                 525
Ile Gly Val Ala Gly Asn His Trp Asp Gly Tyr Ser Lys Gly Val Asn
    530                 535                 540
Arg Lys Leu Gly Arg Thr Gly Leu Tyr Pro Ser Tyr Lys Val Arg Glu
545                 550                 555                 560
Lys Ile Glu Thr Val Lys Tyr Pro Thr Tyr Pro Glu Ala Glu Lys
                565                 570                 575
<210>9
<211>1728
<212>DNA
<213>大鼠(Rattus norvegicus)
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(1728)
<223>α-1，6-岩藻糖基转移酶(rFuT8)
<400>9
atg cgg gca tgg act ggt tcc tgg cgt tgg att atg ctc att ctt ttt  48
Met Arg Ala Trp Thr Gly Ser Trp Arg Trp Ile Met Leu Ile Leu Phe
 1               5                  10                  15
gcc tgg ggg acc ttg ttg ttt tat ata ggt ggt cat ttg gtt cga gat  96
Ala Trp Gly Thr Leu Leu Phe Tyr Ile Gly Gly His Leu Val Arg Asp
             20                  25                  30
aat gac cac cct gat cac tct agc aga gaa ctc tcc aag att ctt gca  144
Asn Asp His Pro Asp His Ser Ser Arg Glu Leu Ser Lys Ile Leu Ala
         35                  40                  45
aag ctt gaa cgc tta aaa caa caa aat gaa gac ttg agg cga atg gct  192
Lys Leu Glu Arg Leu Lys Gln Gln Asn Glu Asp Leu Arg Arg Met Ala
     50                  55                  60
gag tct cta cga ata cca gaa ggc ccc att gac cag ggg acg gct acg  240
Glu Ser Leu Arg Ile Pro Glu Gly Pro Ile Asp Gln Gly Thr Ala Thr
 65                  70                  75                  80
gga aga gtc cgt gtt tta gaa gaa cag ctt gtt aag gcc aaa gaa cag  288
Gly Arg Val Arg Val Leu Glu Glu Gln Leu Val Lys Ala Lys Glu Gln
                 85                  90                  95
att gaa aat tac aag aaa caa gcc aga aat ggt ctg ggg aag gat cat  336
Ile Glu Asn Tyr Lys Lys Gln Ala Arg Asn Gly Leu Gly Lys Asp His
            100                 105                 110
gaa ctc tta agg agg agg att gaa aat gga gct aaa gag ctc tgg ttt  384
Glu Leu Leu Arg Arg Arg Ile Glu Asn Gly Ala Lys Glu Leu Trp Phe
        115                 120                 125
ttt cta caa agt gaa ctg aag aaa tta aag cat cta gaa gga aat gaa  432
Phe Leu Gln Ser Glu Leu Lys Lys Leu Lys His Leu Glu Gly Asn Glu
    130                 135                 140
ctc caa aga cat gca gat gaa att ctt ttg gat tta gga cac cat gaa  480
Leu Gln Arg His Ala Asp Glu Ile Leu Leu Asp Leu Gly His His Glu
145                 150                 155                 160
agg tct atc atg acg gat cta tac tac ctc agt caa aca gat gga gca  528
Arg Ser Ile Met Thr Asp Leu Tyr Tyr Leu Ser Gln Thr Asp Gly Ala
                165                 170                 175
ggg gat tgg cgt gaa aaa gag gcc aaa gat ctg aca gag ctg gtc cag  576
Gly Asp Trp Arg Glu Lys Glu Ala Lys Asp Leu Thr Glu Leu Val Gln
            180                 185                 190
cgg aga ata act tat ctc cag aat ccc aag gac tgc agc aaa gcc agg    624
Arg Arg Ile Thr Tyr Leu Gln Asn Pro Lys Asp Cys Ser Lys Ala Arg
        195                 200                 205
aag ctg gtg tgt aac atc aat aag ggc tgt ggc tat ggt tgc caa ctc    672
Lys Leu Val Cys Asn Ile Asn Lys Gly Cys Gly Tyr Gly Cys Gln Leu
    210                 215                 220
cat cac gtg gtc tac tgt ttc atg att gct tat ggc acc cag cga aca    720
His His Val Val Tyr Cys Phe Met Ile Ala Tyr Gly Thr Gln Arg Thr
225                 230                 235                 240
ctc atc ttg gaa tct cag aat tgg cgc tat gct act ggt gga tgg gag    768
Leu Ile Leu Glu Ser Gln Asn Trp Arg Tyr Ala Thr Gly Gly Trp Glu
                245                 250                 255
act gtg ttt aga cct gta agt gag aca tgc aca gac aga tct ggc ctc    816
Thr Val Phe Arg Pro Val Ser Glu Thr Cys Thr Asp Arg Ser Gly Leu
            260                 265                 270
tcc act gga cac tgg tca ggt gaa gtg aat gac aaa aat att caa gtg    864
Ser Thr Gly His Trp Ser Gly Glu Val Asn Asp Lys Asn Ile Gln Val
        275                 280                 285
gtg gag ctc ccc att gta gac agc ctc cat cct cgg cct cct tac tta    912
Val Glu Leu Pro Ile Val Asp Ser Leu His Pro Arg Pro Pro Tyr Leu
    290                 295                 300
cca ctg gct gtt cca gaa gac ctt gca gat cga ctc gta aga gtc cat    960
Pro Leu Ala Val Pro Glu Asp Leu Ala Asp Arg Leu Val Arg Val His
305                 310                 315                 320
ggt gat cct gca gtg tgg tgg gtg tcc cag ttc gtc aaa tat ttg att    1008
Gly Asp Pro Ala Val Trp Trp Val Ser Gln Phe Val Lys Tyr Leu Ile
                325                 330                 335
cgt cca caa cct tgg cta gaa aag gaa ata gaa gaa gcc acc aag aag    1056
Arg Pro Gln Pro Trp Leu Glu Lys Glu Ile Glu Glu Ala Thr Lys Lys
            340                 345                 350
ctt ggc ttc aaa cat cca gtc att gga gtc cat gtc aga cgc aca gac    1104
Leu Gly Phe Lys His Pro Val Ile Gly Val His Val Arg Arg Thr Asp
        355                 360                 365
aaa gtg gga aca gag gca gcc ttc cat ccc atc gaa gag tac atg gta    1152
Lys Val Gly Thr Glu Ala Ala Phe His Pro Ile Glu Glu Tyr Met Val
    370                 375                 380
cat gtt gaa gaa cat ttt cag ctt ctc gca cgc aga atg caa gtg gat    1200
His Val Glu Glu His Phe Gln Leu Leu Ala Arg Arg Met Gln Val Asp
385                 390                 395                 400
aaa aaa aga gta tat ctg gct acc gat gac cct gct ttg tta aag gag    1248
Lys Lys Arg Val Tyr Leu Ala Thr Asp Asp Pro Ala Leu Leu Lys Glu
                405                 410                 415
gca aag aca aag tac tcc aat tat gaa ttt att agt gat aac tct att    1296
Ala Lys Thr Lys Tyr Ser Asn Tyr Glu Phe Ile Ser Asp Asn Ser Ile
            420                 425                 430
tct tgg tca gct gga tta cac aat cgg tac aca gaa aat tca ctt cgg    1344
Ser Trp Ser Ala Gly Leu His Asn Arg Tyr Thr Glu Asn Ser Leu Arg
        435                 440                 445
ggc gtg atc ctg gat ata cac ttt ctc tct cag gct gac ttc cta gtg    1392
Gly Val Ile Leu Asp Ile His Phe Leu Ser Gln Ala Asp Phe Leu Val
    450                 455                 460
tgt act ttt tca tcc cag gtc tgt cgg gtt gct tat gaa atc atg caa  1440
Cys Thr Phe Ser Ser Gln Val Cys Arg Val Ala Tyr Glu Ile Met Gln
465                 470                 475                 480
acc ctg cat cct gat gcc tct gca aac ttc cac tct tta gat gac atc  1488
Thr Leu His Pro Asp Ala Ser Ala Asn Phe His Ser Leu Asp Asp Ile
                485                 490                 495
tac tat ttt gga ggc caa aat gcc cac aac cag att gcc gtt tat cct  1536
Tyr Tyr Phe Gly Gly Gln Asn Ala His Asn Gln Ile Ala Val Tyr Pro
            500                 505                 510
cac aaa cct cga act gat gag gaa att cca atg gaa cct gga gat atc  1584
His Lys Pro Arg Thr Asp Glu Glu Ile Pro Met Glu Pro Gly Asp Ile
        515                 520                 525
att ggt gtg gct gga aac cat tgg gat ggt tat tct aaa ggt gtc aac  1632
Ile Gly Val Ala Gly Asn His Trp Asp Gly Tyr Ser Lys Gly Val Asn
    530                 535                 540
aga aaa ctt gga aaa aca ggc tta tat ccc tcc tac aaa gtc cga gag  1680
Arg Lys Leu Gly Lys Thr Gly Leu Tyr Pro Ser Tyr Lys Val Arg Glu
545                 550                 555                 560
aag ata gaa aca gtc aag tat ccc aca tat cct gaa gct gaa aaa tag  1728
Lys Ile Glu Thr Val Lys Tyr Pro Thr Tyr Pro Glu Ala Glu Lys *
                565                 570                 575
<210>10
<211>575
<212>PRT
<213>大鼠(Rattus norvegicus)
<400>10
Met Arg Ala Trp Thr Gly Ser Trp Arg Trp Ile Met Leu Ile Leu Phe
 1               5                  10                  15
Ala Trp Gly Thr Leu Leu Phe Tyr Ile Gly Gly His Leu Val Arg Asp
            20                  25                  30
Asn Asp His Pro Asp His Ser Ser Arg Glu Leu Ser Lys Ile Leu Ala
        35                  40                  45
Lys Leu Glu Arg Leu Lys Gln Gln Asn Glu Asp Leu Arg Arg Met Ala
    50                  55                  60
Glu Ser Leu Arg Ile Pro Glu Gly Pro Ile Asp Gln Gly Thr Ala Thr
65                  70                  75                  80
Gly Arg Val Arg Val Leu Glu Glu Gln Leu Val Lys Ala Lys Glu Gln
                85                  90                  95
Ile Glu Asn Tyr Lys Lys Gln Ala Arg Asn Gly Leu Gly Lys Asp His
            100                 105                 110
Glu Leu Leu Arg Arg Arg Ile Glu Asn Gly Ala Lys Glu Leu Trp Phe
        115                 120                 125
Phe Leu Gln Ser Glu Leu Lys Lys Leu Lys His Leu Glu Gly Asn Glu
    130                 135                 140
Leu Gln Arg His Ala Asp Glu Ile Leu Leu Asp Leu Gly His His Glu
145                 150                 155                 160
Arg Ser Ile Met Thr Asp Leu Tyr Tyr Leu Ser Gln Thr Asp Gly Ala
                165                 170                 175
Gly Asp Trp Arg Glu Lys Glu Ala Lys Asp Leu Thr Glu Leu Val Gln
            180                 185                 190
Arg Arg Ile Thr Tyr Leu Gln Asn Pro Lys Asp Cys Ser Lys Ala Arg
        195                 200                 205
Lys Leu Val Cys Asn Ile Asn Lys Gly Cys Gly Tyr Gly Cys Gln Leu
    210                 215                 220
His His Val Val Tyr Cys Phe Met Ile Ala Tyr Gly Thr Gln Arg Thr
225                 230                 235                 240
Leu Ile Leu Glu Ser Gln Asn Trp Arg Tyr Ala Thr Gly Gly Trp Glu
                245                 250                 255
Thr Val Phe Arg Pro Val Ser Glu Thr Cys Thr Asp Arg Ser Gly Leu
            260                 265                 270
Ser Thr Gly His Trp Ser Gly Glu Val Asn Asp Lys Asn Ile Gln Val
        275                 280                 285
Val Glu Leu Pro Ile Val Asp Ser Leu His Pro Arg Pro Pro Tyr Leu
    290                 295                 300
Pro Leu Ala Val Pro Glu Asp Leu Ala Asp Arg Leu Val Arg Val His
305                 310                 315                 320
Gly Asp Pro Ala Val Trp Trp Val Ser Gln Phe Val Lys Tyr Leu Ile
                325                 330                 335
Arg Pro Gln Pro Trp Leu Glu Lys Glu Ile Glu Glu Ala Thr Lys Lys
            340                 345                 350
Leu Gly Phe Lys His Pro Val Ile Gly Val His Val Arg Arg Thr Asp
        355                 360                 365
Lys Val Gly Thr Glu Ala Ala Phe His Pro Ile Glu Glu Tyr Met Val
    370                 375                 380
His Val Glu Glu His Phe Gln Leu Leu Ala Arg Arg Met Gln Val Asp
385                 390                 395                 400
Lys Lys Arg Val Tyr Leu Ala Thr Asp Asp Pro Ala Leu Leu Lys Glu
                405                 410                 415
Ala Lys Thr Lys Tyr Ser Asn Tyr Glu Phe Ile Ser Asp Asn Ser Ile
            420                 425                 430
Ser Trp Ser Ala Gly Leu His Asn Arg Tyr Thr Glu Asn Ser Leu Arg
        435                 440                 445
Gly Val Ile Leu Asp Ile His Phe Leu Ser Gln Ala Asp Phe Leu Val
    450                 455                 460
Cys Thr Phe Ser Ser Gln Val Cys Arg Val Ala Tyr Glu Ile Met Gln
465                 470                 475                 480
Thr Leu His Pro Asp Ala Ser Ala Asn Phe His Ser Leu Asp Asp Ile
                485                 490                 495
Tyr Tyr Phe Gly Gly Gln Asn Ala His Asn Gln Ile Ala Val Tyr Pro
            500                 505                 510
His Lys Pro Arg Thr Asp Glu Glu Ile Pro Met Glu Pro Gly Asp Ile
        515                 520                 525
Ile Gly Val Ala Gly Asn His Trp Asp Gly Tyr Ser Lys Gly Val Asn
    530                 535                 540
Arg Lys Leu Gly Lys Thr Gly Leu Tyr Pro Ser Tyr Lys Val Arg Glu
545                 550                 555                 560
Lys Tle Glu Thr Val Lys Tyr Pro Thr Tyr Pro Glu Ala Glu Lys
                565                 570                 575
<210>11
<211>1728
<212>DNA
<213>小鼠(Mus musculus)
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(1728)
<223>α-1，6-岩藻糖基转移酶(mFuT8)
<400>11
atg cgg gca tgg act ggt tcc tgg cgt tgg att atg ctc att ctt ttt  48
Met Arg Ala Trp Thr Gly Ser Trp Arg Trp Ile Met Leu Ile Leu Phe
 1               5                   10                  15
gcc tgg ggg acc ttg tta ttt tat ata ggt ggt cat ttg gtt cga gat  96
Ala Trp Gly Thr Leu Leu Phe Tyr Ile Gly Gly His Leu Val Arg Asp
             20                  25                  30
aat gac cac cct gat cac tcc agc aga gaa ctc tcc aag att ctt gca  144
Asn Asp His Pro Asp His Ser Ser Arg Glu Leu Ser Lys Ile Leu Ala
         35                  40                  45
aag ctt gaa cgc tta aaa cag caa aat gaa gac ttg agg cga atg gct  192
Lys Leu Glu Arg Leu Lys Gln Gln Asn Glu Asp Leu Arg Arg Met Ala
     50                  55                  60
gag tct ctc cga ata cca gaa ggc ccc att gac cag ggg aca gct aca  240
Glu Ser Leu Arg Ile Pro Glu Gly Pro Ile Asp Gln Gly Thr Ala Thr
 65                  70                  75                  80
gga aga gtc cgt gtt tta gaa gaa cag ctt gtt aag gcc aaa gaa cag  288
Gly Arg Val Arg Val Leu Glu Glu Gln Leu Val Lys Ala Lys Glu Gln
                 85                  90                  95
att gaa aat tac aag aaa caa gct aga aat ggt ctg ggg aag gat cat    336
Ile Glu Asn Tyr Lys Lys Gln Ala Arg Asn Gly Leu Gly Lys Asp His
            100                 105                 110
gaa atc tta aga agg agg att gaa aat gga gct aaa gag ctc tgg ttt    384
Glu Ile Leu Arg Arg Arg Ile Glu Asn Gly Ala Lys Glu Leu Trp Phe
        115                 120                 125
ttt cta caa agc gaa ctg aag aaa tta aag cat tta gaa gga aat gaa    432
Phe Leu Gln Ser Glu Leu Lys Lys Leu Lys His Leu Glu Gly Asn Glu
    130                 135                 140
ctc caa aga cat gca gat gaa att ctt ttg gat tta gga cac cat gaa    480
Leu Gln Arg His Ala Asp Glu Ile Leu Leu Asp Leu Gly His His Glu
145                 150                 155                 160
agg tct atc atg aca gat cta tac tac ctc agt caa aca gat gga gca    528
Arg Ser Ile Met Thr Asp Leu Tyr Tyr Leu Ser Gln Thr Asp Gly Ala
                165                 170                 175
ggg gat tgg cgt gaa aaa gag gcc aaa gat ctg aca gag ctg gtc cag    576
Gly Asp Trp Arg Glu Lys Glu Ala Lys Asp Leu Thr Glu Leu Val Gln
            180                 185                 190
cgg aga ata aca tat ctc cag aat cct aag gac tgc agc aaa gcc agg    624
Arg Arg Ile Thr Tyr Leu Gln Asn Pro Lys Asp Cys Ser Lys Ala Arg
        195                 200                 205
aag ctg gtg tgt aac atc aat aaa ggc tgt ggc tat ggt tgt caa ctc    672
Lys Leu Val Cys Asn Ile Asn Lys Gly Cys Gly Tyr Gly Cys Gln Leu
    210                 215                 220
cat cac gtg gtc tac tgt ttc atg att gct tat ggc acc cag cga aca    720
His His Val Val Tyr Cys Phe Met Ile Ala Tyr Gly Thr Gln Arg Thr
225                 230                 235                 240
ctc atc ttg gaa tct cag aat tgg cgc tat gct act ggt gga tgg gag    768
Leu Ile Leu Glu Ser Gln Asn Trp Arg Tyr Ala Thr Gly Gly Trp Glu
                245                 250                 255
act gtg ttt aga cct gta agt gag aca tgt aca gac aga tct ggc ctc    816
Thr Val Phe Arg Pro Val Ser Glu Thr Cys Thr Asp Arg Ser Gly Leu
            260                 265                 270
tcc act gga cac tgg tca ggt gaa gta aat gac aaa aac att caa gtg    864
Ser Thr Gly His Trp Ser Gly Glu Val Asn Asp Lys Asn Ile Gln Val
        275                 280                 285
gtc gag ctc ccc att gta gac agc ctc cat cct cgg cct cct tac tta    912
Val Glu Leu Pro Ile Val Asp Ser Leu His Pro Arg Pro Pro Tyr Leu
    290                 295                 300
cca ctg gct gtt cca gaa gac ctt gca gac cga ctc cta aga gtc cat    960
Pro Leu Ala Val Pro Glu Asp Leu Ala Asp Arg Leu Leu Arg Val His
305                 310                 315                 320
ggt gac cct gca gtg tgg tgg gtg tcc cag ttt gtc aaa tac ttg att    1008
Gly Asp Pro Ala Val Trp Trp Val Ser Gln Phe Val Lys Tyr Leu Ile
                325                 330                 335
cgt cca caa cct tgg ctg gaa aag gaa ata gaa gaa gcc acc aag aag    1056
Arg Pro Gln Pro Trp Leu Glu Lys Glu Ile Glu Glu Ala Thr Lys Lys
            340                 345                 350
ctt ggc ttc aaa cat cca gtt att gga gtc cat gtc aga cgc aca gac    1104
Leu Gly Phe Lys His Pro Val Ile Gly Val His Val Arg Arg Thr Asp
        355                 360                 365
aaa gtg gga aca gaa gca gcc ttc cac ccc atc gag gag tac atg gta    1152
Lys Val Gly Thr Glu Ala Ala Phe His Pro Ile Glu Glu Tyr Met Val
    370                 375                 380
cac gtt gaa gaa cat ttt cag ctt ctc gca cgc aga atg caa gtg gat    1200
His Val Glu Glu His Phe Gln Leu Leu Ala Arg Arg Met Gln Val Asp
385                 390                 395                 400
aaa aaa aga gta tat ctg gct act gat gat cct act ttg tta aag gag    1248
Lys Lys Arg Val Tyr Leu Ala Thr Asp Asp Pro Thr Leu Leu Lys Glu
                405                 410                 415
gca aag aca aag tac tcc aat tat gaa ttt att agt gat aac tct att    1296
Ala Lys Thr Lys Tyr Ser Asn Tyr Glu Phe Ile Ser Asp Asn Ser Ile
            420                 425                 430
tct tgg tca gct gga cta cac aat cgg tac aca gaa aat tca ctt cgg    1344
Ser Trp Ser Ala Gly Leu His Asn Arg Tyr Thr Glu Asn Ser Leu Arg
        435                 440                 445
ggt gtg atc ctg gat ata cac ttt ctc tca cag gct gac ttt cta gtg    1392
Gly Val Ile Leu Asp Ile His Phe Leu Ser Gln Ala Asp Phe Leu Val
    450                 455                 460
tgt act ttt tca tcc cag gtc tgt cgg gtt gct tat gaa atc atg caa    1440
Cys Thr Phe Ser Ser Gln Val Cys Arg Val Ala Tyr Glu Ile Met Gln
465                 470                 475                 480
acc ctg cat cct gat gcc tct gcg aac ttc cat tct ttg gat gac atc    1488
Thr Leu His Pro Asp Ala Ser Ala Asn Phe His Ser Leu Asp Asp Ile
                485                 490                 495
tac tat ttt gga ggc caa aat gcc cac aat cag att gct gtt tat cct    1536
Tyr Tyr Phe Gly Gly Gln Asn Ala His Asn Gln Ile Ala Val Tyr Pro
            500                 505                 510
cac aaa cct cga act gaa gag gaa att cca atg gaa cct gga gat atc    1584
His Lys Pro Arg Thr Glu Glu Glu Ile Pro Met Glu Pro Gly Asp Ile
        515                 520                 525
att ggt gtg gct gga aac cat tgg gat ggt tat tct aaa ggt atc aac    1632
Ile Gly Val Ala Gly Asn His Trp Asp Gly Tyr Ser Lys Gly Ile Asn
    530                 535                 540
aga aaa ctt gga aaa aca ggc tta tat ccc tcc tac aaa gtc cga gag    1680
Arg Lys Leu Gly Lys Thr Gly Leu Tyr Pro Ser Tyr Lys Val Arg Glu
545                 550                 555                 560
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Lys Ile Glu Thr Val Lys Tyr Pro Thr Tyr Pro Glu Ala Glu Lys  *
                565                 570                 575
<210>12
<211>575
<212>PRT
<213>小鼠(Mus musculus)
<400>12
Met Arg Ala Trp Thr Gly Ser Trp Arg Trp Ile Met Leu Ile Leu Phe
 1               5                  10                  15
Ala Trp Gly Thr Leu Leu Phe Tyr Ile Gly Gly His Leu Val Arg Asp
            20                  25                  30
Asn Asp His Pro Asp His Ser Ser Arg Glu Leu Ser Lys Ile Leu Ala
        35                  40                  45
Lys Leu Glu Arg Leu Lys Gln Gln Asn Glu Asp Leu Arg Arg Met Ala
    50                  55                  60
Glu Ser Leu Arg Ile Pro Glu Gly Pro Ile Asp Gln Gly Thr Ala Thr
65                  70                  75                  80
Gly Arg Val Arg Val Leu Glu Glu Gln Leu Val Lys Ala Lys Glu Gln
                85                  90                  95
Ile Glu Asn Tyr Lys Lys Gln Ala Arg Asn Gly Leu Gly Lys Asp His
            100                 105                 110
Glu Ile Leu Arg Arg Arg Ile Glu Asn Gly Ala Lys Glu Leu Trp Phe
        115                 120                 125
Phe Leu Gln Ser Glu Leu Lys Lys Leu Lys His Leu Glu Gly Asn Glu
    130                 135                 140
Leu Gln Arg His Ala Asp Glu Ile Leu Leu Asp Leu Gly His His Glu
145                 150                 155                 160
Arg Ser Ile Met Thr Asp Leu Tyr Tyr Leu Ser Gln Thr Asp Gly Ala
                165                 170                 175
Gly Asp Trp Arg Glu Lys Glu Ala Lys Asp Leu Thr Glu Leu Val Gln
            180                 185                 190
Arg Arg Ile Thr Tyr Leu Gln Asn Pro Lys Asp Cys Ser Lys Ala Arg
        195                 200                 205
Lys Leu Val Cys Asn Ile Asn Lys Gly Cys Gly Tyr Gly Cys Gln Leu
    210                 215                 220
His His Val Val Tyr Cys Phe Met Ile Ala Tyr Gly Thr Gln Arg Thr
225                 230                 235                 240
Leu Ile Leu Glu Ser Gln Asn Trp Arg Tyr Ala Thr Gly Gly Trp Glu
                245                 250                 255
Thr Val Phe Arg Pro Val Ser Glu Thr Cys Thr Asp Arg Ser Gly Leu
            260                 265                 270
Ser Thr Gly His Trp Ser Gly Glu Val Asn Asp Lys Asn Ile Gln Val
        275                 280                 285
Val Glu Leu Pro Ile Val Asp Ser Leu His Pro Arg Pro Pro Tyr Leu
    290                 295                 300
Pro Leu Ala Val Pro Glu Asp Leu Ala Asp Arg Leu Leu Arg Val His
305                 310                 315                 320
Gly Asp Pro Ala Val Trp Trp Val Ser Gln Phe Val Lys Tyr Leu Ile
                325                 330                 335
Arg Pro Gln Pro Trp Leu Glu Lys Glu Ile Glu Glu Ala Thr Lys Lys
            340                 345                 350
Leu Gly Phe Lys His Pro Val Ile Gly Val His Val Arg Arg Thr Asp
        355                 360                 365
Lys Val Gly Thr Glu Ala Ala Phe His Pro Ile Glu Glu Tyr Met Val
    370                 375                 380
His Val Glu Glu His Phe Gln Leu Leu Ala Arg Arg Met Gln Val Asp
385                 390                 395                 400
Lys Lys Arg Val Tyr Leu Ala Thr Asp Asp Pro Thr Leu Leu Lys Glu
                405                 410                 415
Ala Lys Thr Lys Tyr Ser Asn Tyr Glu Phe Ile Ser Asp Asn Ser Ile
            420                 425                 430
Ser Trp Ser Ala Gly Leu His Asn Arg Tyr Thr Glu Asn Ser Leu Arg
        435                 440                 445
Gly Val Ile Leu Asp Ile His Phe Leu Ser Gln Ala Asp Phe Leu Val
    450                 455                 460
Cys Thr Phe Ser Ser Gln Val Cys Arg Val Ala Tyr Glu Ile Met Gln
465                 470                 475                 480
Thr Leu His Pro Asp Ala Ser Ala Asn Phe His Ser Leu Asp Asp Ile
                485                 490                 495
Tyr Tyr Phe Gly Gly Gln Asn Ala His Asn Gln Ile Ala Val Tyr Pro
            500                 505                 510
His Lys Pro Arg Thr Glu Glu Glu Ile Pro Met Glu Pro Gly Asp Ile
        515                 520                 525
Ile Gly Val Ala Gly Asn His Trp Asp Gly Tyr Ser Lys Gly Ile Asn
    530                 535                 540
Arg Lys Leu Gly Lys Thr Gly Leu Tyr Pro Ser Tyr Lys Val Arg Glu
545                 550                 555                 560
Lys Ile Glu Thr Val Lys Tyr Pro Thr Tyr Pro Glu Ala Glu Lys
                565                 570                 575
<210>13
<211>1728
<212>DNA
<213>猪(Sus scrofa)
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(1728)
<223>α-1，6-岩藻糖基转移酶(pFuT8)
<400>13
atg cgg cca tgg act ggt tcg tgg cgt tgg att atg ctc att ctt ttt    48
Met Arg Pro Trp Thr Gly Ser Trp Arg Trp Ile Met Leu Ile Leu Phe
 1               5                   10                  15
gcc tgg ggg acc ttg cta ttt tac ata ggt ggt cac ttg gta cga gat    96
Ala Trp Gly Thr Leu Leu Phe Tyr Ile Gly Gly His Leu Val Arg Asp
             20                  25                  30
aat gac cac tct gat cac tct agc cga gaa ctg tcc aag att ttg gca    144
Asn Asp His Ser Asp His Ser Ser Arg Glu Leu Ser Lys Ile Leu Ala
        35                  40                  45
aag ctg gaa cgc tta aaa caa caa aat gaa gac ttg agg aga atg gct    192
Lys Leu Glu Arg Leu Lys Gln Gln Asn Glu Asp Leu Arg Arg Met Ala
    50                  55                  60
gaa tct ctc cga ata cca gaa ggc ccc att gat cag ggg cca gct tca    240
Glu Ser Leu Arg Ile Pro Glu Gly Pro Ile Asp Gln Gly Pro Ala Ser
 65                  70                  75                  80
gga aga gtt cgt gct tta gaa gag caa ttt atg aag gcc aaa gaa cag    288
Gly Arg Val Arg Ala Leu Glu Glu Gln Phe Met Lys Ala Lys Glu Gln
                 85                  90                  95
att gaa aat tat aag aaa caa act aaa aat ggt cca ggg aag gat cat    336
Ile Glu Asn Tyr Lys Lys Gln Thr Lys Asn Gly Pro Gly Lys Asp His
            100                 105                 110
gaa atc cta agg agg agg att gaa aat gga gct aaa gag ctc tgg ttt    384
Glu Ile Leu Arg Arg Arg Ile Glu Asn Gly Ala Lys Glu Leu Trp Phe
        115                 120                 125
ttt cta caa agt gag ttg aag aaa tta aag aat tta gaa gga aat gaa    432
Phe Leu Gln Ser Glu Leu Lys Lys Leu Lys Asn Leu Glu Gly Asn Glu
    130                 135                 140
ctc caa aga cat gca gat gaa ttt cta tca gat ttg gga cat cat gaa    480
Leu Gln Arg His Ala Asp Glu Phe Leu Ser Asp Leu Gly His His Glu
145                 150                 155                 160
agg tct ata atg acg gat cta tac tac ctc agt caa aca gat ggg gca    528
Arg Ser Ile Met Thr Asp Leu Tyr Tyr Leu Ser Gln Thr Asp Gly Ala
                165                 170                 175
ggt gat tgg cgt gaa aag gag gcc aaa gat ctg aca gag ctg gtc cag    576
Gly Asp Trp Arg Glu Lys Glu Ala Lys Asp Leu Thr Glu Leu Val Gln
            180                 185                 190
cgg aga ata aca tat ctt cag aat ccc aag gac tgc agc aaa gcc aag    624
Arg Arg Ile Thr Tyr Leu Gln Asn Pro Lys Asp Cys Ser Lys Ala Lys
        195                 200                 205
aag cta gtg tgt aat atc aac aaa ggc tgt ggc tat ggc tgt cag ctc    672
Lys Leu Val Cys Asn Ile Asn Lys Gly Cys Gly Tyr Gly Cys Gln Leu
    210                 215                 220
cat cat gta gtg tac tgc ttt atg att gca tat ggc acc cag cga aca    720
His His Val Val Tyr Cys Phe Met Ile Ala Tyr Gly Thr Gln Arg Thr
225                 230                 235                 240
ctc gcc ttg gaa tct cac aat tgg cgc tac gct act ggg gga tgg gaa    768
Leu Ala Leu Glu Ser His Asn Trp Arg Tyr Ala Thr Gly Gly Trp Glu
                245                 250                 255
act gtg ttt aga cct gta agt gag acg tgc aca gac aga tct ggc agc    816
Thr Val Phe Arg Pro Val Ser Glu Thr Cys Thr Asp Arg Ser Gly Ser
            260                 265                 270
tcc act gga cat tgg tca ggt gaa gta aag gac aaa aat gtt cag gtg    864
Ser Thr Gly His Trp Ser Gly Glu Val Lys Asp Lys Asn Val Gln Val
        275                 280                 285
gtt gag ctc ccc att gta gac agt gtt cat cct cgt cct cca tat tta    912
Val Glu Leu Pro Ile Val Asp Ser Val His Pro Arg Pro Pro Tyr Leu
    290                 295                 300
ccc ctg gct gtc cca gaa gac ctt gca gat cga ctt gta cga gtc cat    960
Pro Leu Ala Val Pro Glu Asp Leu Ala Asp Arg Leu Val Arg Val His
305                 310                 315                 320
ggt gat cct gca gtg tgg tgg gta tcc cag ttt gtc aag tac ttg att    1008
Gly Asp Pro Ala Val Trp Trp Val Ser Gln Phe Val Lys Tyr Leu Ile
                325                 330                 335
cgc cca caa ccc tgg ctg gaa aag gaa ata gaa gag gcc acc aag aag    1056
Arg Pro Gln Pro Trp Leu Glu Lys Glu Ile Glu Glu Ala Thr Lys Lys
            340                 345                 350
cta ggc ttc aaa cat cca gtt att gga gtc cat gtt aga cgc aca gac    1104
Leu Gly Phe Lys His Pro Val Ile Gly Val His Val Arg Arg Thr Asp
        355                 360                 365
aaa gtg gga gcg gaa gca gcc ttc cat ccc att gag gaa tac acg gtg    1152
Lys Val Gly Ala Glu Ala Ala Phe His Pro Ile Glu Glu Tyr Thr Val
    370                 375                 380
cac gtt gaa gaa gac ttt cag ctt ctt gct cgc aga atg caa gtg gat    1200
His Val Glu Glu Asp Phe Gln Leu Leu Ala Arg Arg Met Gln Val Asp
385                 390                 395                 400
aaa aaa agg gtg tat ttg gcc aca gat gac cct gct ttg tta aaa gag    1248
Lys Lys Arg Val Tyr Leu Ala Thr Asp Asp Pro Ala Leu Leu Lys Glu
                405                 410                 415
gca aaa aca aag tac ccc agt tat gaa ttt att agt gat aac tct atc    1296
Ala Lys Thr Lys Tyr Pro Ser Tyr Glu Phe Ile Ser Asp Asn Ser Ile
            420                 425                 430
tct tgg tca gct gga cta cat aat cga tat aca gaa aat tca ctt cgg    1344
Ser Trp Ser Ala Gly Leu His Asn Arg Tyr Thr Glu Asn Ser Leu Arg
        435                 440                 445
ggt gtg atc ctg gat ata cac ttt ctc tcc cag gca gac ttc cta gtg    1392
Gly Val Ile Leu Asp Ile His Phe Leu Ser Gln Ala Asp Phe Leu Val
    450                 455                 460
tgt act ttt tca tcg cag gtc tgt aga gtt gct tat gaa atc atg caa    1440
Cys Thr Phe Ser Ser Gln Val Cys Arg Val Ala Tyr Glu Ile Met Gln
465                 470                 475                 480
gcg ctg cat cct gat gcc tct gcg aac ttc cgt tct ttg gat gac atc    1488
Ala Leu His Pro Asp Ala Ser Ala Asn Phe Arg Ser Leu Asp Asp Ile
                485                 490                 495
tac tat ttt gga ggc cca aat gcc cac aac caa att gcc att tat cct    1536
Tyr Tyr Phe Gly Gly Pro Asn Ala His Asn Gln Ile Ala Ile Tyr Pro
            500                 505                 510
cac caa cct cga act gaa gga gaa atc ccc atg gaa cct gga gat att    1584
His Gln Pro Arg Thr Glu Gly Glu Ile Pro Met Glu Pro Gly Asp Ile
        515                 520                 525
att ggt gtg gct gga aat cac tgg gat ggc tat cct aaa ggt gtt aac    1632
Ile Gly Val Ala Gly Asn His Trp Asp Gly Tyr Pro Lys Gly Val Asn
    530                 535                 540
aga aaa ctg gga agg acg ggc cta tat ccc tcc tac aaa gtt cga gag    1680
Arg Lys Leu Gly Arg Thr Gly Leu Tyr Pro Ser Tyr Lys Val Arg Glu
545                 550                 555                 560
aag ata gaa aca gtc aag tac ccc aca tat ccc gag gct gac aag taa    1728
Lys Ile Glu Thr Val Lys Tyr Pro Thr Tyr Pro Glu Ala Asp Lys *
                565                 570                 575
<210>14
<211>575
<212>PRT
<213>猪(Sus scrofa)
<400>14
Met Arg Pro Trp Thr Gly Ser Trp Arg Trp Ile Met Leu Ile Leu Phe
 1               5                  10                  15
Ala Trp Gly Thr Leu Leu Phe Tyr Ile Gly Gly His Leu Val Arg Asp
            20                  25                  30
Asn Asp His Ser Asp His Ser Ser Arg Glu Leu Ser Lys Ile Leu Ala
        35                  40                  45
Lys Leu Glu Arg Leu Lys Gln Gln Asn Glu Asp Leu Arg Arg Met Ala
    50                  55                  60
Glu Ser Leu Arg Ile Pro Glu Gly Pro IIe Asp Gln Gly Pro Ala Ser
65                  70                  75                  80
Gly Arg Val Arg Ala Leu Glu Glu Gln Phe Met Lys Ala Lys Glu Gln
                85                  90                  95
Ile Glu Asn Tyr Lys Lys Gln Thr Lys Asn Gly Pro Gly Lys Asp His
            100                 105                 110
Glu Ile Leu Arg Arg Arg Ile Glu Asn Gly Ala Lys Glu Leu Trp Phe
        115                 120                 125
Phe Leu Gln Ser Glu Leu Lys Lys Leu Lys Asn Leu Glu Gly Asn Glu
    130                 135                 140
Leu Gln Arg His Ala Asp Glu Phe Leu Ser Asp Leu Gly His His Glu
145                 150                 155                 160
Arg Ser Ile Met Thr Asp Leu Tyr Tyr Leu Ser Gln Thr Asp Gly Ala
                165                 170                 175
Gly Asp Trp Arg Glu Lys Glu Ala Lys Asp Leu Thr Glu Leu Val Gln
            180                 185                 190
Arg Arg Ile Thr Tyr Leu Gln Asn Pro Lys Asp Cys Ser Lys Ala Lys
        195                 200                 205
Lys Leu Val Cys Asn Ile Asn Lys Gly Cys Gly Tyr Gly Cys Gln Leu
    210                 215                 220
His His Val Val Tyr Cys Phe Met Ile Ala Tyr Gly Thr Gln Arg Thr
225                 230                 235                 240
Leu Ala Leu Glu Ser His Asn Trp Arg Tyr Ala Thr Gly Gly Trp Glu
                245                 250                 255
Thr Val Phe Arg Pro Val Ser Glu Thr Cys Thr Asp Arg Ser Gly Ser
            260                 265                 270
Ser Thr Gly His Trp Ser Gly Glu Val Lys Asp Lys Asn Val Gln Val
        275                 280                 285
Val Glu Leu Pro Ile Val Asp Ser Val His Pro Arg Pro Pro Tyr Leu
    290                 295                 300
Pro Leu Ala Val Pro Glu Asp Leu Ala Asp Arg Leu Val Arg Val His
305                 310                 315                 320
Gly Asp Pro Ala Val Trp Trp Val Ser Gln Phe Val Lys Tyr Leu Ile
                325                 330                 335
Arg Pro Gln Pro Trp Leu Glu Lys Glu Ile Glu Glu Ala Thr Lys Lys
            340                 345                 350
Leu Gly Phe Lys His Pro Val Ile Gly Val His Val Arg Arg Thr Asp
        355                 360                 365
Lys Val Gly Ala Glu Ala Ala Phe His Pro Ile Glu Glu Tyr Thr Val
    370                 375                 380
His Val Glu Glu Asp Phe Gln Leu Leu Ala Arg Arg Met Gln Val Asp
385                 390                 395                 400
Lys Lys Arg Val Tyr Leu Ala Thr Asp Asp Pro Ala Leu Leu Lys Glu
                405                 410                 415
Ala Lys Thr Lys Tyr Pro Ser Tyr Glu Phe Ile Ser Asp Asn Ser Ile
            420                 425                 430
Ser Trp Ser Ala Gly Leu His Asn Arg Tyr Thr Glu Asn Ser Leu Arg
        435                 440                 445
Gly Val Ile Leu Asp Ile His Phe Leu Ser Gln Ala Asp Phe Leu Val
    450                 455                 460
Cys Thr Phe Ser Ser Gln Val Cys Arg Val Ala Tyr Glu Ile Met Gln
465                 470                 475                 480
Ala Leu His Pro Asp Ala Ser Ala Asn Phe Arg Ser Leu Asp Asp Ile
                485                 490                 495
Tyr Tyr Phe Gly Gly Pro Asn Ala His Asn Gln Ile Ala Ile Tyr Pro
            500                 505                 510
His Gln Pro Arg Thr Glu Gly Glu Ile Pro Met Glu Pro Gly Asp Ile
        515                 520                 525
Ile Gly Val Ala Gly Asn His Trp Asp Gly Tyr Pro Lys Gly Val Asn
    530                 535                 540
Arg Lys Leu Gly Arg Thr Gly Leu Tyr Pro Ser Tyr Lys Val Arg Glu
545                 550                 555                 560
Lys Ile Glu Thr Val Lys Tyr Pro Thr Tyr Pro Glu Ala Asp Lys
                565                 570                 575
<210>15
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物SH415
<400>15
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<223>PCR引物SH421
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<223>PCR引物rEPO-正向
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<223>PCR引物ScMnt1-反向
<400>26
ccggcgcgcc cgatgacttg ttgttcaggg gatatagatc ctg    43

Claims (21)

1.一种重组低等真核生物宿主细胞，其包含岩藻糖基化途径。
2.权利要求1的宿主细胞，其为酵母或丝状真菌。
3.权利要求2的宿主细胞，其中所述酵母为毕赤酵母属酵母。
4.权利要求3的宿主细胞，其中所述毕赤酵母属酵母为巴斯德毕赤酵母。
5.权利要求1的宿主细胞，其中所述宿主细胞就糖蛋白上的N-聚糖而言进一步不显示α1，6-甘露糖基转移酶活性并且包括与细胞靶向信号肽融合的α1，2-甘露糖苷酶催化结构域，该信号肽通常与该催化结构域无关并选用来将α1，2-甘露糖苷酶活性靶向宿主细胞的ER或高尔基体，藉此当重组糖蛋白通过宿主细胞的ER或高尔基体时产生了包含岩藻糖基化Man5GlcNAc2糖形的重组糖蛋白。
6.权利要求5的宿主细胞，其进一步包括与细胞靶向信号肽融合的GlcNAc转移酶I催化结构域，该信号肽通常与该催化结构域无关并选用来将GlcNAc转移酶I活性靶向宿主细胞的ER或高尔基体；藉此当重组糖蛋白通过宿主细胞的ER或高尔基体时产生了包含岩藻糖基化GlcNAcMan5GlcNAc2糖形的重组糖蛋白。
7.权利要求6的宿主细胞，其进一步包括与细胞靶向信号肽融合的甘露糖苷酶II催化结构域，该信号肽通常与该催化结构域无关并选用来将甘露糖苷酶II活性靶向宿主细胞的ER或高尔基体；藉此当重组糖蛋白通过宿主细胞的ER或高尔基体时产生了包含岩藻糖基化GlcNAcMan3GlcNAc2糖形的重组糖蛋白。
8.权利要求7的宿主细胞，其进一步包括与细胞靶向信号肽融合的GlcNAc转移酶II催化结构域，该信号肽通常与该催化结构域无关并选用来将GlcNAc转移酶II活性靶向宿主细胞的ER或高尔基体；藉此当重组糖蛋白通过宿主细胞的ER或高尔基体时产生了包含岩藻糖基化GlcNAc2Man3GlcNAc2糖形的重组糖蛋白。
9.权利要求8的宿主细胞，其进一步包括与细胞靶向信号肽融合的半乳糖转移酶II催化结构域，该信号肽通常与该催化结构域无关并选用来将半乳糖转移酶II活性靶向宿主细胞的ER或高尔基体；藉此当重组糖蛋白通过宿主细胞的ER或高尔基体时产生了包含岩藻糖基化Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2糖形的重组糖蛋白。
10.权利要求9的宿主细胞，其进一步包括与细胞靶向信号肽融合的唾液酸转移酶催化结构域，该信号肽通常与该催化结构域无关并选用来将唾液酸转移酶活性靶向宿主细胞的ER或高尔基体；藉此当重组糖蛋白通过宿主细胞的ER或高尔基体时产生了包含岩藻糖基化NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2糖形的重组糖蛋白。
11.一种糖蛋白组合物，其包含多种糖形，各糖形包含至少一种与之结合的N-聚糖，其中所述糖蛋白组合物因此包含多种N-聚糖，其中多种N-聚糖中大于25摩尔百分比基本由选自以下的岩藻糖基化N-聚糖组成：Man5GlcNAc2、GlcNAcMan5GlcNAc2、Man3GlcNAc2、GlcNAcMan3GlcNAc2、GlcNAc2Man3GlcNAc2、GalGlcNAc2Man3GlcNAc2、Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2、NANAGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2和NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2。
12.权利要求11的糖蛋白组合物，其中所述岩藻糖基化N-聚糖占多种N-聚糖的摩尔百分比大于50。
13.权利要求11的糖蛋白组合物，其中所述岩藻糖基化N-聚糖占多种N-聚糖的摩尔百分比大于75。
14.权利要求11的糖蛋白组合物，其中所述岩藻糖基化N-聚糖占多种N-聚糖的摩尔百分比大于80。
15.权利要求11的糖蛋白组合物，其中所述岩藻糖与N-聚糖还原末端的GlcNAc以α1，3-键连接。
16.权利要求11的糖蛋白组合物，其中所述岩藻糖与N-聚糖还原末端的GlcNAc以α1，6-键连接。
17.权利要求11的糖蛋白组合物，其中所述岩藻糖与N-聚糖非还原末端的Gal以α1，2-键连接。
18.权利要求11的糖蛋白组合物，其中所述岩藻糖与N-聚糖非还原末端的GlcNAc以α1，3-键连接。
19.权利要求11的糖蛋白组合物，其中所述岩藻糖与N-聚糖非还原末端的GlcNAc以α1，4-键连接。
20.一种杂交载体，其包括(a)在低等真核宿主细胞中具有功能的DNA调控元件，该调控原件可操作地连接至(b)编码融合蛋白的DNA编码序列，其编码(i)靶向序列；和(b)岩藻糖基化途径酶的催化结构域。
21.权利要求17的载体，其中所述岩藻糖基化途径酶为岩藻糖基转移酶。
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