CN101679087B - 防止和减少生物膜形成与浮游增殖 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于防止和/或减少一种或多种所选细菌菌株或细菌混合物的生物膜形成和/或浮游增殖的方法。

Description

防止和减少生物膜形成与浮游增殖
发明领域
本发明提供方法和组合物，用于防止和/或减少表面上的生物膜形成和/或水环境中的浮游增殖，特别是在生活/家庭和工业环境中。
发明背景
由不期望的微生物引起的生物膜形成和浮游增殖是家庭以及工业环境中公知的现象。例如，便器在表面和溶液中携带不期望的细菌，其能引起便器表面出现明显的污秽。此外，便器中存在不期望的微生物可能导致冲洗时浮质(aerosol)的分散。已知水***例如管路、泵和容器中大量的生物膜形成与浮游增殖可引起健康护理风险、腐蚀和美观问题。
防止或减少由不期望的微生物引起的生物膜形成和/或浮游增殖通常需要使用分散剂、表面活性剂、酶、微生物、抗微生物剂、杀生物剂、煮沸(boil-out)步骤，和/或化学品。
美国专利5,171,591涉及使用蛭弧菌属(Bdellovibrio)的寄生细菌，在某些食品中，或在食品或食品接触表面上控制或消除不期望细菌。
美国专利5,242,593涉及通过向循环水加入单一形式的非固着微生物(non-sessile microbe)而减少水循环***中粘质物(slime)和/或膜的形成的方法。
美国专利5,360,517公开了调节含水造纸电路/过程流中存在的微生物/细菌群落生长的方法，包括引入有效消毒量的肉葡萄球菌(Staphylococcuscarnosus)菌种的细菌。
美国专利5,863,882涉及液体清洁和消毒制剂，其中包含消毒组合物，活的芽孢杆菌属(Bacillus)孢子，和能减少四种病原微生物的表面活性剂。
澳大利亚专利719544涉及通过加入非病原***而控制水体中病原细菌数量的方法。
WO 2006/031554公开了通过用源自细菌的α-淀粉酶接触所述表面而防止、去除、减少或破坏表面上生物膜的方法。
尽管本领域已知减少和防止不期望的微生物的生物膜形成和浮游增殖的方法，但是仍然需要用于这方面的方法和组合物。
附图简述
图1显示在芽孢杆菌属混合物(6BB)存在时，在不同的芽孢杆菌属：假单胞菌属(Pseudomonas)比例，假单胞菌属群落的浮游增殖减少。
图2显示在芽孢杆菌属混合物(6BB)存在时，在不同的芽孢杆菌属：假单胞菌属比例，假单胞菌属生物膜群落的减少。
图3显示在芽孢杆菌属混合物(6BB)存在时，在不同的芽孢杆菌属：假单胞菌属比例，浮游的假单胞菌属增殖的减少。
发明详述
本发明涉及用于减少和/防止水环境中生物膜形成和/或浮游增殖的方法和组合物。
本发明的发明人已经分离并测试了众多细菌菌株在水环境中减少和/或防止生物膜形成和/或浮游增殖的能力。他们发现，当与不期望的微生物共培养时，芽孢杆菌属的测试菌株中有少量能减少和/或防止生物膜形成和/或浮游增殖，所述不期望的微生物包括铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，蒙氏假单胞菌(Pseudomonas montelli)，恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)，哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)，溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)，费氏弧菌(Vibrio fischerii)和/或大肠杆菌(Escherichia coli)。
防止和/或减少生物膜形成的方法
在第一方面，本发明涉及用于防止和/或减少表面上的生物膜形成的方法，包括使所述表面接触选自下组的一种或多种细菌菌株：
具有保藏登录号NRRL B-50014的菌株；
具有保藏登录号NRRL B-50015的菌株；
具有保藏登录号NRRL B-50016的菌株；
具有保藏登录号NRRL B-50017的菌株；
具有保藏登录号NRRL B-50018的菌株；
具有保藏登录号PTA-7541的菌株；
具有保藏登录号PTA-7542的菌株；
具有保藏登录号PTA-7543的菌株；
具有保藏登录号PTA-7544的菌株；
具有保藏登录号PTA-7545的菌株；
具有保藏登录号PTA-7546的菌株；
具有保藏登录号PTA-7547的菌株；
具有保藏登录号PTA-7549的菌株；
具有保藏登录号PTA-7790的菌株；
具有保藏登录号PTA-7791的菌株；
具有保藏登录号PTA-7792的菌株；
具有保藏登录号PTA-7793的菌株；或这些菌株中两种或多种的混合物。
在一个实施方案中，本发明涉及用于防止和/或减少表面上的生物膜形成的方法，包括使所述表面接触具有保藏登录号NRRL B-50014的菌株。在一个实施方案中，本发明涉及用于防止和/或减少表面上的生物膜形成的方法，包括使所述表面接触具有保藏登录号NRRL B-50015的菌株。在一个实施方案中，本发明涉及用于防止和/或减少表面上的生物膜形成的方法，包括使所述表面接触具有保藏登录号NRRL B-50016的菌株。在一个实施方案中，本发明涉及用于防止和/或减少表面上的生物膜形成的方法，包括使所述表面接触具有保藏登录号NRRL B-50017的菌株。在一个实施方案中，本发明涉及用于防止和/或减少表面上的生物膜形成的方法，包括使所述表面接触具有保藏登录号NRRL B-50018的菌株。在一个实施方案中，本发明涉及用于防止和/或减少表面上的生物膜形成的方法，包括使所述表面接触具有保藏登录号NRRL B-50019的菌株。在一个实施方案中，本发明涉及用于防止和/或减少表面上的生物膜形成的方法，包括使所述表面接触具有保藏登录号PTA-7541的菌株。在一个实施方案中，本发明涉及用于防止和/或减少表面上的生物膜形成的方法，包括使所述表面接触具有保藏登录号PTA-7542的菌株。在一个实施方案中，本发明涉及用于防止和/或减少表面上的生物膜形成的方法，包括使所述表面接触具有保藏登录号PTA-7543的菌株。在一个实施方案中，本发明涉及用于防止和/或减少表面上的生物膜形成的方法，包括使所述表面接触具有保藏登录号PTA-7544的菌株。在一个实施方案中，本发明涉及用于防止和/或减少表面上的生物膜形成的方法，包括使所述表面接触具有保藏登录号PTA-7545的菌株。在一个实施方案中，本发明涉及用于防止和/或减少表面上的生物膜形成的方法，包括使所述表面接触具有保藏登录号PTA-7546的菌株。在一个实施方案中，本发明涉及用于防止和/或减少表面上的生物膜形成的方法，包括使所述表面接触具有保藏登录号PTA-7547的菌株。在一个实施方案中，本发明涉及用于防止和/或减少表面上的生物膜形成的方法，包括使所述表面接触具有保藏登录号PTA-7549的菌株。在一个实施方案中，本发明涉及用于防止和/或减少表面上的生物膜形成的方法，包括使所述表面接触具有保藏登录号PTA-7550的菌株。在一个实施方案中，本发明涉及用于防止和/或减少表面上的生物膜形成的方法，包括使所述表面接触具有保藏登录号PTA-7789的菌株。在一个实施方案中，本发明涉及用于防止和/或减少表面上的生物膜形成的方法，包括使所述表面接触具有保藏登录号PTA-7790的菌株。在一个实施方案中，本发明涉及用于防止和/或减少表面上的生物膜形成的方法，包括使所述表面接触具有保藏登录号PTA-7791的菌株。在一个实施方案中，本发明涉及用于防止和/或减少表面上的生物膜形成的方法，包括使所述表面接触具有保藏登录号PTA-7792的菌株。在一个实施方案中，本发明涉及用于防止和/或减少表面上的生物膜形成的方法，包括使所述表面接触具有保藏登录号PTA-7793的菌株。
在一个实施方案中，根据本发明的方法，可以使用细菌的混合物。混合物的实例可以在下面的“细菌菌株和细菌菌株混合物”部分中找到。
术语“生物膜形成”表示由不期望的微生物在表面上形成粘液层或膜。生物膜形成是不期望的微生物的生长结果，所述微生物单独或以菌落形式附着在表面上。
术语“表面”指任何表面，优选硬表面，其可以容易引起微生物的生物膜形成和粘附。期望的表面的实例包括由下述材料中一种或多种制成的硬表面：金属、塑料、橡胶、板、玻璃、木材、纸、混凝土、岩石、大理石、石膏和陶瓷材料，如瓷，其可选地用例如涂料或瓷釉涂覆。软表面的实例包括由任何种类纤维制成的表面(例如，纱、织物、植物纤维、石棉/岩棉(rock wool)和毛发)；或任何多孔表面；皮肤(人或动物)；角质材料(例如指(趾)甲)；和体内器官(例如，肺)。
硬表面可以在例如浴室中找到，例如，固定装置、水槽、浴缸、便器，和冲洗水箱；在冷却塔；水处理装置；水槽(water tank)；奶制品、食品加工装置等；化学或药物加工装置；或医疗设备(例如，导管，整形外科设备和植入物)中找到。易于引起生物膜形成的表面也可以是多孔表面。多孔表面可以，例如存在于滤器中，例如膜滤器。
用于防止和/或减少浮游增殖的方法
本发明还涉及用于防止和/或减少微生物浮游增殖的方法，包括使水溶液中的所述微生物接触选自下组的一种或多种细菌菌株：
具有保藏登录号NRRL B-50014的菌株；
具有保藏登录号NRRL B-50015的菌株；
具有保藏登录号NRRL B-50016的菌株；
具有保藏登录号NRRL B-50017的菌株；
具有保藏登录号NRRL B-50018的菌株；
具有保藏登录号PTA-7541的菌株；
具有保藏登录号PTA-7542的菌株；
具有保藏登录号PTA-7543的菌株；
具有保藏登录号PTA-7544的菌株；
具有保藏登录号PTA-7545的菌株；
具有保藏登录号PTA-7546的菌株；
具有保藏登录号PTA-7547的菌株；
具有保藏登录号PTA-7549的菌株；
具有保藏登录号PTA-7790的菌株；
具有保藏登录号PTA-7791的菌株；
具有保藏登录号PTA-7792的菌株；
具有保藏登录号PTA-7793的菌株；或这些菌株中两种或多种的混合物。
在一个实施方案中，本发明涉及用于防止和/或减少微生物浮游增殖的方法，包括使水溶液中的所述微生物接触具有保藏登录号NRRL B-50014的菌株。在一个实施方案中，本发明涉及用于防止和/或减少微生物浮游增殖的方法，包括使水溶液中的所述微生物接触具有保藏登录号NRRL B-50015的菌株。在一个实施方案中，本发明涉及用于防止和/或减少微生物浮游增殖的方法，包括使水溶液中的所述微生物接触具有保藏登录号NRRL B-50016的菌株。在一个实施方案中，本发明涉及用于防止和/或减少微生物浮游增殖的方法，包括使水溶液中的所述微生物接触具有保藏登录号NRRL B-50017的菌株。在一个实施方案中，本发明涉及用于防止和/或减少微生物浮游增殖的方法，包括使水溶液中的所述微生物接触具有保藏登录号NRRLB-50018的菌株。在一个实施方案中，本发明涉及用于防止和/或减少微生物浮游增殖的方法，包括使水溶液中的所述微生物接触具有保藏登录号NRRL B-50019的菌株。
在一个实施方案中，本发明涉及用于防止和/或减少微生物浮游增殖的方法，包括使水溶液中的所述微生物接触具有保藏登录号PTA-7541的菌株。在一个实施方案中，本发明涉及用于防止和/或减少微生物浮游增殖的方法，包括使水溶液中的所述微生物接触具有保藏登录号PTA-7542的菌株。在一个实施方案中，本发明涉及用于防止和/或减少微生物浮游增殖的方法，包括使水溶液中的所述微生物接触具有保藏登录号PTA-7543的菌株。在一个实施方案中，本发明涉及用于防止和/或减少微生物浮游增殖的方法，包括使水溶液中的所述微生物接触具有保藏登录号PTA-7544的菌株。在一个实施方案中，本发明涉及用于防止和/或减少微生物浮游增殖的方法，包括使水溶液中的所述微生物接触具有保藏登录号PTA-7545的菌株。在一个实施方案中，本发明涉及用于防止和/或减少微生物浮游增殖的方法，包括使水溶液中的所述微生物接触具有保藏登录号PTA-7546的菌株。在一个实施方案中，本发明涉及用于防止和/或减少微生物浮游增殖的方法，包括使水溶液中的所述微生物接触具有保藏登录号PTA-7547的菌株。在一个实施方案中，本发明涉及用于防止和/或减少微生物浮游增殖的方法，包括使水溶液中的所述微生物接触具有保藏登录号PTA-7549的菌株。在一个实施方案中，本发明涉及用于防止和/或减少微生物浮游增殖的方法，包括使水溶液中的所述微生物接触具有保藏登录号PTA-7550的菌株。在一个实施方案中，本发明涉及用于防止和/或减少微生物浮游增殖的方法，包括使水溶液中的所述微生物接触具有保藏登录号PTA-7789的菌株。在一个实施方案中，本发明涉及用于防止和/或减少微生物浮游增殖的方法，包括使水溶液中的所述微生物接触具有保藏登录号PTA-7790的菌株。在一个实施方案中，本发明涉及用于防止和/或减少微生物浮游增殖的方法，包括使水溶液中的所述微生物接触具有保藏登录号PTA-7791的菌株。在一个实施方案中，本发明涉及用于防止和/或减少微生物浮游增殖的方法，包括使水溶液中的所述微生物接触具有保藏登录号PTA-7792的菌株。在一个实施方案中，本发明涉及用于防止和/或减少微生物浮游增殖的方法，包括使水溶液中的所述微生物接触具有保藏登录号PTA-7793的菌株。
在一个实施方案中，根据本发明的方法，可以使用细菌的混合物(blend)。混合物的实例可以在下面的“细菌菌株和细菌菌株混合物”部分中找到。
术语“浮游增殖”表示不期望的微生物(优选不期望的细菌)在水环境中(如水体)中的生长。不期望的微生物通常在水环境中自由存在。所涵盖的水环境的实例是便器中的冲洗水和装置/工厂(plant)中循环的冷却水。
细菌菌株和细菌菌株混合物
应理解的是，根据本发明使用的细菌菌株可以是上述保藏菌株之一的培养物，但是还可以是与上述分离和保藏菌株具有基本相同的性质的菌株的培养物。在优选的实施方案中，菌株是保藏菌株之一或其子代。
细菌菌株可以是组合物中的活性成分，所述组合物还包含其他活性和/或非活性成分。
术语“有效量”，“有效浓度”或“有效剂量”在本文定义为一种或多种细菌菌株的量，浓度或剂量，其能减少和/或防止表面上不期望的微生物引起的生物膜形成和/或减少和/或防止不期望的微生物在水环境中的浮游增殖。实际有效剂量在绝对数目上依赖于多种因素，包括待研究的不期望的微生物；无论目标是防止还是减少；菌株或包含所述菌株的组合物的接触时间；存在的其他成分，以及待研究的表面或水环境。在一个实施方案中，细菌例如下述六株芽孢杆菌属菌株混合物的有效剂量在1至1x108cfu/ml，优选50至1x107cfu/ml的范围中。此外，在一个实施方案中，本文涉及的细菌菌株或混合物与待研究的不期望的微生物之间的比例可为1∶100,000-100,000∶1(菌株/混合物：不期望的微生物)，优选1∶10,000至10,000∶1，更优选1∶1,000至1,000∶1，更优选1∶100至100∶1，甚至更优选1∶10至10∶1。
通常地，接受高负荷不期望的微生物和营养物质的环境需要高剂量的缓和用细菌菌株(mitigating bacteria strain)，而不期望生物体负荷低的环境需要较低剂量的缓和用细菌菌株。此外，例如，防止表面上的生物膜形成或防止水环境中浮游状态的形成所需要的相关细菌菌株的剂量，通常，低于减少相应表面上的生物膜形成或减少相应水环境中已经存在的不期望微生物数所需的剂量。
因此，本发明的方法可以用于抑制一种或多种不期望的微生物(优选已经存在在表面上或已经存在于水环境中的细菌)的生长(即，导致生物膜形成的减少)。在另一个实施方案中，本发明涉及防止和/或显著延迟基本上清洁的表面(即，基本上不含不期望微生物的表面)上生物膜的形成和/或基本上清洁的水(即，基本上不含不期望微生物的水环境)中的浮游增殖。换句话说，相关细菌菌株保护表面和/或水环境将来不生长一种或多种不期望的微生物。本发明的方法可以导致已经存在的不期望微生物的减少或者甚至消除/去除。相关的细菌菌株在优选实施方案中可以应用于待研究表面和/或定期加入至待研究的水环境中。定期表示本发明的方法可以在一段时间(例如，每分钟、小时、天、周、月等)内重复或者反复。如上所述，效果可以不持续长时间。这需要再施用(redosing)细菌菌株。例如，当表面和水环境分别是便器内部表面和便器中的冲洗水时，可(定期)进行再施用，例如，随每次冲水进行。相关的细菌菌株可以，例如，并入唇面区(rim block)中。
本发明的方法还可以如下进行：由手动和/或机械使细菌菌株或包含一种或多种细菌菌株的组合物(即，混合物)接触(即，施用或接触)待研究表面。
在优选的实施方案中，可以单独使用或与其他细菌组合使用的细菌是NRRL B-50014。在优选的实施方案中，可以单独使用或与其他细菌组合使用的细菌是NRRL B-50015。在优选的实施方案中，可以单独使用或与其他细菌组合使用的细菌是NRRL B-50016。在优选的实施方案中，可以单独使用或与其他细菌组合使用的细菌是NRRL B-50017。在优选的实施方案中，可以单独使用或与其他细菌组合使用的细菌是NRRL B-50018。
在优选的实施方案中，细菌菌株是2007年3月14日保藏的如下保藏菌株中两种、三种、四种、五种或六种的混合物：NRRL B-50014、NRRL B-50015、NRRL B-50016、NRRL B-50017、NRRL B-50018和NRRL B-50019。
在另一个优选的实施方案中，细菌菌株是2007年3月14日保藏的如下保藏菌株中两种、三种、四种或五种的混合物：NRRL B-50014、NRRLB-50015、NRRL B-50016、NRRL B-50017和NRRL B-50018。应理解的是，本发明的混合物可以或者可以不包含除本发明相关保藏菌株之外的其他菌株。应理解的是，本发明的混合物可以在本发明相关保藏菌株之外还包含其他菌株。一个实例是美国2005/0036990中公开的巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)SB-3112(ATCC保藏号PTA-3142)。在一个实施方案中，混合物包含NRRL B-50014、NRRL B-50015、NRRL B-50016、NRRL B-50017、NRRLB-50018和PTA-3142。
不期望的微生物
在本发明的上下文中，术语“不期望的微生物”表示可能产生认为对于待研究表面和/或待研究水环境为消极的作用/效果的微生物，特别是在家庭或工业环境中。这样的消极作用的实例包括气味、腐蚀、点蚀或材料的其他降解；感染；染色或以其他方式(otherwise)使表面显得不美观/美感上不愉悦(aestheticallyunpleasing)。不期望的微生物还包括病原微生物，特别是病原细菌。
通过使用有效量的本文相关的一种或多种分离的细菌菌株，可以减少和/或防止表面上的生物膜形成和/或水环境中的浮游增殖。
在优选的实施方案中，待研究的容易引起生物膜形成的表面可以在任何生物膜形成/建立之前接触一种或多种细菌菌株作为预防措施。这会导致生物膜形成明显减少。或者，如果生物膜已经形成，或者刚刚出现生物膜建立的迹象，可以使用本发明的方法减少进一步的生物膜形成。本发明的方法甚至可能导致生物膜的部分或全部去除。
不期望的微生物的实例包括下文所公开的那些。
不期望的微生物包括，但不限于，好氧细菌或厌氧细菌，革兰氏阳性和革兰氏阴性，真菌(酵母或丝状真菌)，藻类和/或原生动物。期望的细菌包括选自下组的细菌：假单胞菌属菌种包括铜绿假单胞菌、棕色固氮菌(Azotobactervinelandii)、大肠杆菌、白喉棒杆菌(Corynebacterium diphteriae)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、链球菌属菌种(Streptococcus spp.)、醋酸杆菌属(Acetobacter)、明串珠菌属(Leuconostoc)、异型乳酸杆菌亚属(Betabacterium)、肺炎球菌属(Pneumococcus)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、气单胞菌属(Aeromonas)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、黄杆菌属(Flavobacterium)、沙门氏菌属(Salmonella)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、弧菌属菌种、利斯特菌属菌种(Listeria spp.)和军团菌属菌种(Legionella spp.)。
在优选的实施方案中，不期望的微生物是好氧细菌。在更优选的实施方案中，好氧细菌是气单胞菌属菌株。在另一个更优选的实施方案中，好氧细菌是伯克霍尔德氏菌属菌株。在另一个更优选的实施方案中，好氧细菌是黄杆菌属菌株。在另一个更优选的实施方案中，好氧细菌是微杆菌属(Microbacterium)菌株。在另一个更优选的实施方案中，好氧细菌是假单胞菌属菌株。在另一个更优选的实施方案中，好氧细菌是沙门氏菌属菌株。在另一个更优选的实施方案中，好氧细菌是葡萄球菌属菌株。在另一个更优选的实施方案中，好氧细菌来自肠杆菌科(包括例如大肠杆菌)。
在最优选的实施方案中，好氧细菌是洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderiacepacia)。在另一个最优选的实施方案中，好氧细菌是蛾微杆菌(Microbacterium imperiale)或结核分枝杆菌。在另一个最优选的实施方案中，好氧细菌是铜绿假单胞菌。在另一个最优选的实施方案中，好氧细菌是荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)。在另一个最优选的实施方案中，好氧细菌是食油假单胞菌(Pseudomonas oleovorans)。在另一个最优选的实施方案中，好氧细菌是类产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)。在另一个最优选的实施方案中，好氧细菌是肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)。在另一个最优选的实施方案中，好氧细菌是金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。在另一个最优选的实施方案中，好氧细菌是表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)。
在另一个最优选的实施方案中，细菌是单核细胞增生利斯特菌(Listeriamonocytogenes)。
在另一个最优选的实施方案中，细菌是阿德莱德军团菌(Legionellaadelaidensis)。在另一个最优选的实施方案中，细菌是嗜肺军团菌(Legionellapneumophila)。在另一个最优选的实施方案中，细菌是菲氏军团菌(Legionellafeeleii)。在另一个最优选的实施方案中，细菌是摩拉维采军团菌(Legionellamoravica)。
在另一个实施方案中，细菌是哈维氏弧菌，费氏弧菌和/或溶藻弧菌。
在另一个优选的实施方案中，微生物是厌氧细菌。在另一个更优选的实施方案中，厌氧细菌是脱硫弧菌属(Desulfovibrio)菌株。在另一个最优选的实施方案中，厌氧细菌是脱硫脱硫弧菌(Desulfovibrio desulfuricans)。
在另一个优选的实施方案中，不期望的微生物是真菌如酵母或丝状真菌。在另一个更优选的实施方案中，酵母是念珠菌属(Candida)菌株。在另一个最优选的实施方案中，酵母是白色念珠菌(Candida albicans)。
本发明的组合物
本发明还涉及包含本文所述一种或多种保藏细菌的组合物。应理解的是，本发明的组合物可以包含本文所述一种或多种细菌菌株作为单一菌株或两种或多种菌株的混合物，但是还可以包括其他细菌菌株和/或活性成分。在一个实施方案中，组合物进一步包含下述的表面活性剂或一种或多种其他成分。
表面活性剂
表面活性剂可以是非离子型，包括半极性和/或阴离子和/或阳离子和/或两性离子型。表面活性剂应对细菌培养物的活性引起尽可能少的危害。
表面活性剂可以以按重量计0.01％至60％的水平存在于组合物中。
当包括于本文中时，组合物通常包含约0至约40％的阴离子表面活性剂，如线性烷基苯磺酸盐(酯)，α-烯烃磺酸盐(酯)，烷基硫酸盐(酯)(脂肪醇硫酸盐(酯))，醇乙氧基硫酸盐(酯)，仲烷磺酸盐(酯)，α-磺基脂肪酸甲酯，烷基或烯基琥珀酸或肥皂。
当包括于本文时，组合物通常包含从约0至约40％的非离子表面活性剂，如醇乙氧基化物，壬基酚乙醇酯，烷基聚葡糖苷，烷基二甲基胺氧化物，乙氧基化的脂肪酸单乙醇酰胺，脂肪酸单乙醇酰胺，聚羟基烷基脂肪酸酰胺，或葡萄糖胺的N-酰基N-烷基衍生物(“葡糖酰胺”)。
其他成分
组合物可以包含一种或多种酶。涵盖的酶的实例在“酶”部分中提及。
其他成分包括，但不限于，分散剂、稳定剂、抗微生物剂、香料、染料，和杀生物剂。
酶
一种或多种酶可以存在于本发明的组合物中。特别期望的酶包括蛋白酶、α-淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶、过氧化物酶/氧化酶、果胶酸裂合酶和甘露聚糖酶，或它们的混合物。
蛋白酶：合适的蛋白酶包括那些动物、植物或微生物来源的蛋白酶。优选微生物来源。包括化学修饰或蛋白质工程化的突变体。蛋白酶可以是丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶，优选碱性微生物蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的实例是枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)，特别是源自芽孢杆菌属的那些，例如，枯草杆菌蛋白酶Novo，枯草杆菌蛋白酶Carlsberg，枯草杆菌蛋白酶309，枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168(在WO 89/06279中描述)。胰蛋白酶样蛋白酶的实例是WO 89/06270与WO 94/25583中所述的镰孢属(Fusarium)蛋白酶和胰蛋白酶(例如猪或牛来源的)。
有用的蛋白酶的实例是WO 92/19729、WO 98/20115、WO 98/20116和WO 98/34946中所述的变体，特别是在下述位置中一个或多个位置具有取代的变体：27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、194、206、218、222、224、235和274。优选的商业上可得到的蛋白酶包括ALCALASETM、SAVINASETM、PRIMASETM、DURALASETM、DYRAZYMTM、ESPERASETM、EVERLASETM、POLARZYMETM和KANNASETM、LIQUANASETM(Novozymes A/S)，MAXATASETM、MAXACALTM、MAXAPEMTM、PROPERASETM、PURAFECTTM、PURAFECT OxPTM、FN2TM和FN3TM(Genencor International Inc.)。
脂肪酶：合适的脂肪酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰或蛋白质工程化的突变体。有用的脂肪酶的实例包括来自腐质霉属(Humicola)(同物异名嗜热霉属(Thermomyces))的脂肪酶，例如来自疏棉状腐质霉(H.lanuginosa(细毛嗜热霉(T.lanuginosus))脂肪酶，如EP 258068和EP 305216中所述，或来自特异腐质霉(H.insolens)，如WO 96/12580所述，假单胞菌属脂肪酶，例如来自产碱假单胞菌(P.alcaligenes)或类产碱假单胞菌(EP 218272)，洋葱假单胞菌(P.cepacia)(EP 331376)，施氏假单胞菌(GB 1,372,034)，荧光假单胞菌，假单胞菌属菌种SD 705(WO 95/06720和WO 96/27002)，威斯康星假单胞菌(P.wisconsinensis)(WO 96/12012)，芽孢杆菌属脂肪酶，例如，来自枯草芽孢杆菌(B.subtilis)(Dartois等，1993，Biochemica et Biophysica acta 1131，253-260)，嗜热脂肪芽孢杆菌脂肪酶(B.stearothermophhilus)(JP 64/744992)或短小芽孢杆菌(B.pumilus)(WO 91/16422)。
其他实例是脂肪酶变体，如WO 92/05249，WO 94/01541，EP 407225，EP 260105，WO 95/35381，WO 96/00292，WO 95/30744，WO 94/25578，WO 95/14783，WO 95/22615，WO 97/04079和WO 97/07202中所述的那些。
优选的商业提供脂肪酶包括LIPOLASETM和LIPOLASE ULTRATM、LIPOZYMETM和LIPEXTM(Novozymes A/S)。
角质酶：本发明的方法可以在分类为EC 3.1.1.74的角质酶的存在下进行。
根据本发明使用的角质酶可以是任何来源的。优选微生物来源的角质酶，特别是细菌，真菌或酵母来源的。
角质酶是能降解角质的酶。在优选的实施方案中，角质酶源自曲霉属(Aspergillus)菌株，特别是米曲霉(Aspergillus oryzae)，链格孢霉属(Alternaria)菌株，特别是芸薹链格孢(Alternaria brassiciola)，镰孢属(Fusarium)菌株，特别是腐皮镰孢(Fusarium solani)，豌豆腐皮镰孢(Fusarium solani pisi)，大刀粉红镰孢(Fusarium roseum culmorum)，或粉红镰孢接骨木亚种(Fusarium roseumsambucium)，长蠕孢属(Helminthosporum)菌株，特别是小麦长蠕孢菌(Helminthosporum sativum)，腐质霉属(Humicola)菌株，特别是特异腐质霉，假单胞菌属(Pseudomonas)菌株，特别是门多萨假单胞菌(Pseudomonasmendocina)，或恶臭假单胞菌，丝核菌属(Rhizoctonia)菌株，特别是立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)，链霉菌属(Streptomyces)菌株，特别是疮痂链霉菌(Streptomyces scabies)，或细基格孢属(Ulocladium)菌株，特别是群生细基格孢(Ulocladium consortiale)。在最优选的实施方案中，角质酶源自特异腐质霉菌株，特别是特异腐质霉菌株DSM 1800。特异腐质霉角质酶在WO 96/13580中描述，其通过提述并入本文。角质酶可以是变体，如WO 00/34450和WO 01/92502中所公开的变体之一，所述文献通过提述并入本文。优选的角质酶变体包括WO 01/92502的实施例2中列出的变体，所述文献通过提述并入本文。
优选的商业角质酶包括NOVOZYMTM 51032(可从Novozymes A/S，Denmark获得)。
可以在分类为EC 3.1.1.4和/或EC 3.1.1.32的磷脂酶存在时进行本发明的方法。如本文所使用的，术语磷脂酶是具有针对磷脂的活性的酶。磷脂，如卵磷脂或磷脂酰胆碱，由在外部(sn-1)和中部(sn-2)位置用两个脂肪酸酯化的和在第三个位置用磷酸酯化的甘油组成；磷酸又可以酯化成为氨基醇。磷脂酶是参与磷脂水解的酶。可以识别几种类型的磷脂酶活性，包括磷脂酶A1和A2，其将一个脂肪酰基(分别在sn-1和sn-2位置)水解形成溶血磷脂；而溶血磷脂酶(或磷脂酶B)能将溶血磷脂中剩余的脂肪酰基水解。磷脂酶C和磷脂酶D(磷酸二脂酶)分别释放二酰基甘油或磷脂酸。
术语磷脂酶包括具有磷脂酶活性的酶，例如，磷脂酶A(A1或A2)，磷脂酶B活性，磷脂酶C活性或磷脂酶D活性。本文与本发明一起使用的术语“磷脂酶A”意欲涵盖具有磷脂酶A1和/或磷脂酶A2活性的酶。可以同样地由具有其他活性如具有磷脂酶活性的脂肪酶提供磷脂酶活性。磷脂酶活性可以，例如，来自具有磷脂酶副活性(side activity)的脂肪酶。在本发明的其他实施方案中，由基本上仅具有磷脂酶活性的酶提供磷脂酶酶活性，其中磷脂酶酶活性不是副活性。
磷脂酶可以是任何来源的，例如，动物(如哺乳动物)来源的，例如，来自胰脏(例如，牛或猪胰脏)，或蛇毒或蜜蜂毒液。优选地，磷脂酶可以是微生物来源的，例如，来自丝状真菌、酵母或细菌，如以下的属或种：曲霉属，例如，黑曲霉(A.niger)，网柄菌属(Dictyostelium)，例如盘基网柄菌(D.discoideum)；毛霉属(Mucor)，例如爪哇毛霉(M.javanicus)，高大毛霉(M.mucedo)，细孢毛霉(M.subtilissimus)，脉孢菌属(Neurospora)，例如粗糙脉孢菌(N.crassa)，根毛霉属(Rhizomucor)，例如，微小根毛霉(R.pusillus)；根霉属(Rhizopus)，例如，少根根霉(R.arrhizus)，日本根霉(R.japonicus)，葡枝根霉(R.stolonifer)；核盘菌属(Sclerotinia)，例如，白腐核盘菌(S.libertiana)；毛癣菌属(Trichophyton)，例如，红色毛癣菌(T.rubrum)；维氏核盘菌属(Whetzelinia)，例如，W.sclerotiorum；芽孢杆菌属，例如，巨大芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌；柠檬酸细菌属(Citrobacter)，例如，弗氏柠檬酸细菌(C.freundii)；肠杆菌属(Enterobacter)，例如，产气肠杆菌(E.aerogenes)，阴沟肠杆菌(E.cloacae)；爱德华菌属(Edwardsiella)，迟缓爱德华菌(E.tarda)；欧文氏菌属(Erwinia)，例如，草生欧文氏菌(E.herbicola)；埃希氏菌属(Escherichia)，例如大肠杆菌；克雷伯氏菌属(Klebsiella)，例如，肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)；变形杆菌属(Proteus)，例如，普通变形杆菌(P.vulgaris)；普罗维登斯菌属(Providencia)，例如，斯氏普罗维登斯菌(P.stuartii)；沙门氏菌属，例如，鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)；沙雷氏菌属(Serratia)，例如，液化沙雷氏菌(S.liquefasciens)，粘质沙雷氏菌(S.marcescens)；志贺氏菌属(Shigella)，例如，弗氏志贺氏菌(S.flexneri)；链霉菌属，例如，紫红链霉菌(S.violeceoruber)；耶尔森氏菌属(Yersinia)，例如，小肠结肠耶尔森氏菌(Y.enterocolitica)。因此，磷脂酶可以是真菌的，例如，来自核菌纲(Pyrenomycetes)，如镰孢属，如大刀镰孢(F.culmorum)、异孢镰孢(F.heterosporum)、腐皮镰孢的菌株或尖镰孢(F.oxysporum)的菌株。磷脂酶还可以来自曲霉属中的丝状真菌菌株，如泡盛曲霉(Aspergillus awamori)，臭曲霉(Aspergillus foetidus)，日本曲霉(Aspergillusjaponicus)，黑曲霉或米曲霉的菌株。
优选的磷脂酶源自腐质霉菌株，特别是疏棉状腐质霉。磷脂酶可以是变体，如WO 00/32758中公开的变体之一，其通过提述并入本文。优选的磷脂酶变体包括WO 00/32758中列出的变体，其通过提述并入本文。在另一个优选的实施方案中，磷脂酶是WO 04/111216中所述的磷脂酶，特别是实施例1中表格所列的变体。
在另一个优选的实施方案中，磷脂酶源自镰孢属，特别是尖镰孢的菌株。磷脂酶可以是WO 98/026057中涉及的示于SEQ ID NO：2源自尖镰孢DSM2672的磷脂酶，或其变体。
在本发明的优选实施方案中，磷脂酶是磷脂酶A1(EC.3.1.1.32)。在本发明的另一个优选实施方案，磷脂酶是磷脂酶A2(EC.3.1.1.4)。
商业磷脂酶的实例包括LECITASETM和LECITASETM ULTRA，YIELSMAX，或LIPOPAN F(可从Novozymes A/S，Denmark获得)。
淀粉酶：合适的淀粉酶包括那些细菌或真菌来源的淀粉酶。包括化学修饰或蛋白质工程化的突变体。淀粉酶包括，例如，从芽孢杆菌例如地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)的特定菌株获得的α-淀粉酶，其在GB 1,296,839中详细描述，或者在WO 95/026397或WO 00/060060中公开的芽孢杆菌属菌种菌株。
优选的淀粉酶的实例是WO 94/02597，WO 94/18314，WO 96/23873，WO 97/43424，WO 01/066712，WO 02/010355，WO 02/031124和WO2006/002643中所述变体(通过提述全部并入本文)。
商业上可得到的淀粉酶为DURAMYLTM，TERMAMYLTM，TERMAMYLULTRATM，NATALASETM，STAINZYMETM，STAINZYME ULTRATM，FUNGAMYLTM和BANTM(Novozymes A/S)，RAPIDASETM和PURASTARTM(来自Genencor International Inc.)。
纤维素酶：合适的纤维素酶包括那些细菌或真菌来源的纤维素酶。包括化学修饰或蛋白质工程化的突变体。合适的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰孢属、梭孢壳属(Thielavia)、枝顶孢霉属(Acremonium)的纤维素酶，例如由特异腐质霉、土生梭孢霉(Thielavia terrestris)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)和尖镰孢产生的真菌纤维素酶，其公开于US4,435,307，US 5,648,263，US 5,691,178，US 5,776,757，WO 89/09259，WO96/029397和WO 98/012307中。
特别合适的纤维素酶是具有色彩保护益处的碱性或中性纤维素酶。这种纤维素酶的实例是EP 0495257，EP 0531372，WO 96/11262，WO 96/29397，WO 98/08940中所述纤维素酶。其他实例是纤维素酶变体，如WO 94/07998，EP 0531315，US 5,457,046，US 5,686,593，US 5,763,254，WO 95/24471，WO 98/12307和WO 1999/001544中所述。
商业上可得到的纤维素酶包括CELLUZYMETM，CELLUCLASTTM，CAREZYMETM，ENDOLASETM，RENOZYMETM  (Novozymes  A/S)，CLAZINASETM和PURADAX HATM，ACCELERASETM  1000(GenencorInternational Inc.)，和KAC-500(B)TM(Kao Corporation)。
过氧化物酶/氧化酶：合适的过氧化物酶/氧化酶包括那些植物、细菌或真菌来源的酶。包括化学修饰或蛋白质工程化的突变体。有用的过氧化物酶的实例包括来自鬼伞属(Coprinus)，例如来自灰盖鬼伞(C.cinereus)的过氧化物酶及其变体，如WO 93/24618、WO 95/10602和WO 98/15257中所述。
商业上可得到的过氧化物酶包括GuardzymeTM和NovozymTM 51004(Novozymes A/S)。
果胶酸裂合酶(也称作多聚半乳糖醛酸裂合酶)：果胶酸裂合酶的实例包括已经从不同细菌属如欧文氏菌属、假单胞菌属、克雷伯氏菌属和黄单孢菌属(Xanthomonas)，以及从枯草芽孢杆菌(Nasser等，1993，FEBSLetts.335：319-326)和芽孢杆菌属菌种YA-14(Kim等，1994，Biosci.Biotech.Biochem.58：947-949)克隆的果胶酸裂合酶。也已经描述了由短小芽孢杆菌(Dave和Vaughn，1971，J.Bacteriol.108：166-174)、多粘芽孢杆菌(B.polymyxa)(Nagel和Vaughn，1961，Arch.Biochem.Biophys.93：344-352)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Karbassi和Vaughn，1980，Can.J.Microbiol.26：377-384)、芽孢杆菌属菌种RK9(Kelly和Fogarty，1978，Can.J.Microbiol.24：1164-1172)产生的在8-10的pH范围中具有最大活性的果胶酸裂合酶的纯化。上述任一种酶，以及二价阳离子-非依赖性和/或热稳定的果胶酸裂合酶，可用于本发明的实施。在优选的实施方案中，果胶酸裂合酶包含Heffron等，1995，Mol.Plant-Microbe Interact.8：331-334和Henrissat等，1995，Plant Physiol.107：963-976中公开的果胶酸裂合酶的氨基酸序列。特别期望的果胶酸裂合酶公开于WO 99/27083和WO 99/27084中。其他衍生自地衣芽孢杆菌的特别期望的果胶酸裂合酶在美国专利6,284,524(所述文献通过提述并入本文)中作为SEQ ID NO：2公开。特别期望的果胶酸裂合酶变体公开于WO 02/006442中，特别是WO 02/006442(所述文献通过提述并入本文)的实施例中公开的变体。
商业上可得到的碱性果胶酸裂合酶的实例包括来自Novozymes A/S，Denmark的BIOPREPTM和SCOURZYMETM L。
甘露聚糖酶：甘露聚糖酶(EC 3.2.1.78)的实例包括细菌和真菌来源的甘露聚糖酶。在特定的实施方案中，甘露聚糖酶衍生自丝状真菌曲霉属，优选黑曲霉或棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)(WO 94/25576)的菌株。WO 93/24622公开了分离自里氏木霉(Trichoderma reesei)的甘露聚糖酶。从几种细菌中也分离出了甘露聚糖酶，包括芽孢杆菌属生物。例如，Talbot等，1990，Appl.Environ.Microbiol.56(11)：3505-3510描述了源自嗜热脂肪芽孢杆菌的β-甘露聚糖酶。Mendoza等，1994，World J.Microbiol.Biotech.10(5)：551-555描述了源自枯草芽孢杆菌的β-甘露聚糖酶。JP-A-03047076公开了源自芽孢杆菌属菌种的β-甘露聚糖酶。JP-A-63056289描述了碱性热稳定β-甘露聚糖酶的产生。JP-A-63036775涉及产生β-甘露聚糖酶和β-甘露糖苷酶的芽孢杆菌属微生物FERM P-8856。JP-A-08051975公开了来自嗜碱芽孢杆菌AM-001的碱性β-甘露聚糖酶。WO 97/11164中公开了来自解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)的纯化的甘露聚糖酶。WO 91/18974描述了半纤维素酶，如有活性的葡聚糖酶，木聚糖酶或甘露聚糖酶。期望的是源自WO 99/64619中公开的Bacillus agaradhaerens、地衣芽孢杆菌、耐盐芽孢杆菌(Bacillushalodurans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、芽孢杆菌属菌种和特异腐质霉的碱性家族5和26甘露聚糖酶。特别期望的是WO 99/64619的实施例中涉及的芽孢杆菌属菌种甘露聚糖酶，所述文献通过提述并入本文。
商业上可得到的甘露聚糖酶的实例包括可从Novozymes A/S Denmark获得的MANNAWAYTM。
材料与方法
用作缓冲液和试剂的化学品是至少试剂级的商业产品。
平板计数培养液(Plate Count Broth)(Difco 275120)
MacConkey琼脂(Smith River Biologicals，Ferrum，VA cat#11-00380)
Luria培养液(Difco 241420)
标准方法琼脂平板(SMA平板)(Smith River Biologicals，Ferrum，VA cat#11-00450)
细菌菌株：
-芽孢杆菌属混合物(6BB)：六种芽孢杆菌属菌种菌株的混合物，由下述保藏菌株组成：NRRL#B-50014(30％)，B-50015(30％)，B-50016(10％)，B-50017(10％)，B-50018(10％)，B-50019(10％)。6BB混合物中菌株之间的实际比例在括号中表示(x％)。
-铜绿假单胞菌：在所有实施例中使用的铜绿假单胞菌配有组成型表达绿色荧光蛋白的质粒，菌株如Nivens等，2001，J.Bacteriol.183：1047-1057所述构建。
-蒙氏假单胞菌(ATCC 700412)
-恶臭假单胞菌(ATCC 49451)
-哈维氏弧菌(ATCC 25919)
-溶藻弧菌(ATCC 17749)
-费氏弧菌(MJ-1)：野生型菌株
生物材料的保藏
已经依据布达佩斯条约的规定将生物材料保藏于
-美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801University Blvd.，Manassas，VA20108，USA.，和
-用于农业利用研究的微生物基因组和生物加工研究单位(NRRL)国家中心(农业研究培养物保藏中心)，1815N.University Street，Peoria，IL 61604，USA。
-细菌菌株给出了下述登录号：#
 鉴定   登录号   保藏日期
 解淀粉芽孢杆菌   PTA-7541   2006年4月20日
 解淀粉芽孢杆菌   PTA-7542   2006年4月20日
 萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)   PTA-7543   2006年4月20日
 解淀粉芽孢杆菌   PTA-7544   2006年4月20日
 解淀粉芽孢杆菌   PTA-7545   2006年4月20日
 解淀粉芽孢杆菌   PTA-7546   2006年4月20日
 枯草芽孢杆菌枯草亚种   PTA-7547   2006年4月20日
 Bacillus velezensis   PTA-7548   2006年4月20日
 解淀粉芽孢杆菌   PTA-7549   2006年4月20日
 简单芽孢杆菌(Bacillus simplex)   PTA-7550   2006年4月20日
 简单芽孢杆菌   PTA-7789   2006年8月18日
 解淀粉芽孢杆菌   PTA-7790   2006年8月18日
 解淀粉芽孢杆菌   PTA-7791   2006年8月18日
  萎缩芽孢杆菌   PTA-7792   2006年8月18日
  解淀粉芽孢杆菌   PTA-7793   2006年8月18日
  解淀粉芽孢杆菌   NRRL B-50017   2007年3月14日
  巨大芽孢杆菌   NRRL B-50019   2007年3月14日
  解淀粉芽孢杆菌   NRRL B-50018   2007年3月14日
  地衣芽孢杆菌   NRRL B-50014   2007年3月14日
  地衣芽孢杆菌   NRRL B-50015   2007年3月14日
  短小芽孢杆菌   NRRL B-50016   2007年3月14日
菌株于下述条件下保藏：确保在本专利申请未决期间，由专利与商标委员依据37C.F.R.§1.14和35U.S.C.§122授权的人能够获得该培养物。该保藏物代表纯的培养物。在提交了该申请的副本或其后续文本的国家，依据该外国专利法律的要求，可以获得该保藏物。然而，应当理解，保藏物的获得并不构成对实施本发明的许可，实施本发明是对政府行为所授予的专利权的侵犯。
保藏于ATCC的细菌菌株源自分离的天然存在的细菌菌株。所有菌株都于2005年在美国收集。
对于保藏于NRRL的细菌菌株，两株收集自美国的土壤(作为NRRLB-50017和NRRL B-50018保藏)，四株来自美国培养物保藏中心。我们相信NRRL B-50014与ATCC#23842相同；NRRL B-50015与ATCC#21415相同；NRRL B-50016与NRRL B-4064；而且NRRL B-50019＝NRRL B3254。
菌株可以由休眠细菌孢子和/或活细菌组成。
设备
荧光动力学微量滴定板阅读器(BioTek Synergy HT-I)
聚碳酸酯支架(Biosurfaces Technology，USA)
磁挂片(porcelain coupon)(Tyler Research Instruments Corp.，Edmonton，Alberta，Canada)
宽口试管(Fisher cat#NC9421998，Pittsburg，PA，USA)
实施例
实施例1
在芽孢杆菌属混合物(6BB)存在时假单胞菌属的浮游增殖-荧光微量滴定 板(FMP)
用200微升平板计数培养液(Difco DF0751-17-2)装满96孔微量滴定板的孔，并用配有组成型表达绿色荧光蛋白的质粒的铜绿假单胞菌接种。向孔中加入六种芽孢杆菌属菌种的混合物(6BB)。假单胞菌属的初始剂量是2.4x108或2.4x108cfu/ml，而芽孢杆菌属菌种剂量为6.8x106至1.0x107cfu/ml，使假单胞菌属∶芽孢杆菌属的比例为24∶1和70∶1。用荧光动力学微量滴定板阅读器(BioTek SynergyHT-I)追踪微量滴定板，在21℃温育并在485/20nm激发波长，528/20nm发射波长处读荧光值，每20分钟读数，进行43小时。得到的荧光动力学曲线显示gfp荧光的芽孢杆菌属剂量依赖性抑制(即，假单胞菌属群落抑制)(图1)。
实施例2
在芽孢杆菌属混合物存在时假单胞菌属生物膜形成和浮游增殖的减少- 试管+挂片生物对照(TTCBC)
将带有三个瓷挂片(Tyler Research Instruments Corp.，Edmonton，Alberta)的聚碳酸酯支架(Biosurfaces Technology)***宽口试管(Fishercat#NC9421998)，并加入根据标签说明制成的50mL平板计数培养液(DifcoDF0751-17-2)，并高压灭菌。用芽孢杆菌属孢子的混合物接种试管，并在28℃以温和搅拌温育过夜，从而使其萌发(germination)。芽孢杆菌属孢子的初始剂量从2.6x102至7.8x105cfu/mL。
第二天，以70cfu/ml的浓度向试管加入表达gfp的铜绿假单胞菌菌株，使假单胞菌属∶芽孢杆菌属初始接种比例为1∶3.5至1∶10,000。在另外培养24和48小时后，通过如下方式对试管进行破坏性取样：将每个挂片(生物膜细胞)刮入磷酸盐缓冲盐水中，将悬浮液均质化，然后稀释并涂布在MacConkey琼脂(Difco DF0075-17-1)上，仅计数假单胞菌属细胞。还对试管中的培养液(浮游细胞)取样、稀释并涂布。存在芽孢杆菌属菌种时的假单胞菌属计数与不存在芽孢杆菌属菌种的阴性对照比较，应注意的是，芽孢杆菌属菌种处理导致生物膜(图2)和浮游状态(图3)中假单胞菌属群落显著的且为粗略地剂量依赖性的减少。
实施例3
在芽孢杆菌属分离菌株存在时假单胞菌属生物膜形成和浮游增殖的减少 -试管+挂片生物对照(TTCBC)
将带有三个瓷挂片(Tyler Research Instruments Corp.，Edmonton，Alberta)的聚碳酸酯支架(Biosurfaces Technology)***宽口试管(Fishercat#NC9421998)，并加入根据标签说明制成的50mL平板计数培养液(DifcoDF0751-17-2)，并高压灭菌。用各种芽孢杆菌属候选菌株的过夜营养细胞培养物和配有gfp质粒的铜绿假单胞菌的过夜培养物接种每个试管。在28℃以温和搅拌温育试管。芽孢杆菌属细胞的初始剂量在1.0x103至8.2x105cfu/mL的范围内，而假单胞菌属的初始剂量为约1x103至1x105。假单胞菌属与芽孢杆菌属的比例为1∶2至1∶147。
在培养的时间点24和48小时，通过如下方式对试管进行破坏性取样：将每个挂片(生物膜细胞)刮入磷酸盐缓冲盐水中，将悬浮液均质化，然后稀释并涂布在MacConkey琼脂(Difco DF0075-17-1)上，仅计数假单胞菌属细胞。还对试管中的培养液(浮游细胞)取样、稀释并涂布。存在芽孢杆菌属菌种时假单胞菌属计数与不存在芽孢杆菌属菌种的阴性对照比较，并对于浮游和附着细胞，计算在24和48小时时对于每种芽孢杆菌属候选菌株的假单胞菌属的log对照。
 log对照  log对照  log对照  log对照
  菌株   P∶B比例1∶x B   24小时浮游   24小时附着   48小时浮游   48小时附着
  PTA-7544   9.5   3.4   2.2   5.4   4.1
  PTA-7790   22.8   3.0   1.9   5.1   4.4
  PTA-7791   85   4.8   2.7   4.5   4.8
  PTA-7792   4.2   3.2   3.0   5.4   4.0
  PTA-7549   147.1   4.5   3.7   6.0   4.3
  PTA-7542   2.8   2.9   2.8   5.8   4.5
  PTA-7545   3.7   3.6   3.2   7.1   5.3
  NRRL B-50017   2.3   3.1   2.4   5.8   4.4
  NRRL B-50016   4.8   0.9   1.4   0.6   0.5
实施例4
在芽孢杆菌属分离菌株存在时大肠杆菌生物膜形成和浮游增殖的减少- 试管+挂片生物对照(TTCBC)
将带有三个瓷挂片的聚碳酸酯支架(Biosurfaces Technology)***宽口试管(Fisher cat#NC9421998)，并加入根据标签说明制成的50mL平板计数培养液(Difco DF0751-17-2)，并高压灭菌。用各种芽孢杆菌属候选菌株的过夜营养细胞培养物和大肠杆菌的过夜培养物接种每个试管。在28℃以温和搅拌温育试管。芽孢杆菌属细胞的初始剂量从1.0x103至8.2x105cfu/mL，而大肠杆菌的初始剂量为1x103至1x105。大肠杆菌与芽孢杆菌属的比例为1∶0.6至1∶32。
在培养的时间点24和48小时，通过如下方式对试管进行破坏性取样：将每个挂片(生物膜细胞)刮入磷酸盐缓冲盐水中，将悬浮液均质化，然后稀释并涂布在MacConkey琼脂(Difco DF0075-17-1)上以仅计数大肠杆菌细胞。还对试管中的培养液(浮游细胞)取样、稀释并涂布。存在芽孢杆菌属菌种时大肠杆菌计数与不存在芽孢杆菌属菌种的阴性对照比较，并对于浮游和附着细胞，计算在24和48小时时对于每种芽孢杆菌属候选菌株的大肠杆菌的log对照。
  log对照   log对照   log对照   log对照
  菌株   P∶B比例   24小时浮游   24小时附着   48小时浮游   48小时附着
  PTA-7544   2.7   4.4   5.2   ＞9   ＞9
  PTA-7790   21.0   5.2   6.3   ＞9   ＞9
  PTA-7791   2.8   2.5   2.1   7.3   4.2
  PTA-7792   2.3   0.0   0.6   0.0   0.0
  PTA-7549   0.8   5.2   6.8   9.7   6.5
  PTA-7542   5.7   5.1   4.7   ＞9   5.4
  PTA-7545   17.0   5.1   4.9   ＞9   ＞9
  NRRL B-50017   0.6   3.7   4.1   8.7   7.4
  PTA-7546   32.4   4.0   3.9   9.7   7.2
实施例5
Petri平板大肠杆菌抑制区(zone of inhibition)
芽孢杆菌属候选菌株在平板计数培养液中生长18至24小时，获得约107至108cfu/mL。将生长18至24小时的大肠杆菌(约108至1010cfu/mL)划线，以在标准方法琼脂平板(SMA板)(Smith River Biologicals，Ferrum，VA)的表面上形成菌苔(lawn)，并用无菌不锈钢钢管在琼脂中钻四个5mm的孔。向孔中加入50微升每种芽孢杆菌属液体培养物(每孔1种菌株)，并将平板在35℃温育18至48小时，琼脂面朝下(agar side down)。将孔周围受抑制的大肠杆菌菌苔评分为芽孢杆菌属候选菌株的阳性生物对照。以毫米(mm)测量抑制区以半定量评价对照。将可辨别的抑制＞1mm评分为阳性。
  菌株   大肠杆菌抑制
  NRRL B-50016   -
  NRRL B-50017   -
  PTA-7541   +
  PTA-7792   +
  PTA-7542   +
  PTA-7543   +
  PTA-7544   +
  PTA-7545   +
  PTA-7546   +
  PTA-7547   -
  PTA-7549   +
  PTA-7791   +
  PTA-7790   +
实施例6
Petri平板铜绿假单胞菌抑制区
芽孢杆菌属候选菌株在平板计数培养液中生长18至24小时，获得约107至108cfu/mL培养物。将生长18至24小时的铜绿假单胞菌(约108至1010cfu/mL)划线以在标准方法琼脂平板(Smith River Biologicals，Ferrum，VA)的表面上形成菌苔，并用无菌不锈钢钢管在琼脂中钻四个5mm的孔。向孔中加入50微升每种芽孢杆菌属液体培养物(每孔1种菌株)，并将平板在35℃温育18至48小时，琼脂面朝下。将孔周围受抑制的铜绿假单胞菌菌苔评分为芽孢杆菌属候选菌株的阳性生物对照。也以毫米测量抑制区以半定量评价对照。
将可辨别的抑制＞0.5mm评分为阳性。
  菌株   铜绿假单胞菌抑制
  NRRL B-50016   -
  NRRL B-50017   +
  PTA-7542   +
  PTA-7545   +
  PTA-7791   +
实施例7
Petri平板上蒙氏假单胞菌和恶臭假单胞菌抑制区
芽孢杆菌属候选菌株NRRL B-50014在平板计数培养液中生长18至24小时，获得约107至108cfu/mL培养物。将生长18至24小时的蒙氏假单胞菌(ATCC 700412)和恶臭假单胞菌(ATCC 49451)(约108至1010cfu/mL培养物)以在标准方法琼脂平板的表面上形成菌苔，并用无菌不锈钢钢管在琼脂中钻四个5mm的孔。向孔中加入50微升芽孢杆菌属液体培养物，并将平板在35℃温育18至48小时，琼脂面朝下。将孔周围受抑制的假单胞菌属菌苔评分为芽孢杆菌属候选菌株的阳性生物对照。也以毫米(mm)测量抑制区以半定量评价对照。
将可辨别的抑制＞1mm评分为阳性。
  菌株   蒙氏假单胞菌抑制   恶臭假单胞菌抑制
  NRRL B-50014   +   +
实施例8
群体感应抑制(Quorum Sensing Inhibition)
使用红色沙雷氏菌(Serratia rubidaea)(ATCC 27593)作为指示细菌，因为它的色素依赖于完整的(in tact)群体感应途径。群体感应化合物使细菌“交流”并影响表型如色素形成(pigmentation)、运动性(motility)、致病性(pathogenicity)和生物膜形成，因此群体感应抑制是生物膜控制的作用模式。
芽孢杆菌属候选菌株在平板计数培养液中35℃生长18至24小时，至约107cfu/mL的密度。将枯草芽孢杆菌属点样(10微升)在标准方法琼脂平板(Smith River Biologicals，Ferrum，VA)上，并在26℃温育18至24小时，此后菌落是可见的。向5mL 0.5％融化的LB琼脂(Luria培养液30.5g/L和0.5％诺布尔琼脂)中加入沙雷氏菌属培养物(5微升)(Luri培养液，18至24小时，26℃，约107cfu/ml)，充分混合，并倾倒在包含成熟芽孢杆菌属候选菌落的平板上。琼脂凝固(set)后，将平板在26℃温育18至24小时。对QSI将色素形成受抑制而沙雷氏菌生长本身不受抑制的区域评分为阳性，并测量它们的外径(full diameter)用作半定量结果。
  菌株   受抑制的色素形成的直径(mm)
  NRRL B-50014   27
  NRRL B-50015   27
  NRRL B-50016   45
  NRRL B-50017   42
  NRRL B-50018   36
  PTA-7541   39
  PTA-7792   43
  PTA-7542   31
  PTA-7543   24
  PTA-7544   49
  PTA-7545   -
  PTA-7546   43
  PTA-7547   28
  PTA-7548   -
  PTA-7549   50
  PTA-7793   -
  PTA-7790   -
  PTA-7791   40
实施例9
CDC生物膜反应器中存在芽孢杆菌属候选菌株时对假单胞菌属生物膜 和浮游细胞增殖的控制
向带有瓷挂片(Tyler Research Instruments Corp.，Edmonton，Alberta)的CDC生物膜反应器(Biosurfaces Technology，Bozeman，MT，Cat#CBR90-2)装入400ml平板计数培养液并高压灭菌。向两个反应器中冷却的培养基中加入PTA-7546孢子(反应器中的初始剂量＝4.5x105cfu/mL)，以室温温育下预萌发(pregermination)24小时，在假单胞菌属加入前将搅拌棒设为60rpm。不接种芽孢杆菌属的情况下，处理另外两个反应器作为对照。铜绿假单胞菌在平板计数培养液中过夜生长，然后向全部四个反应器中加入20微升假单胞菌属培养物的1∶100稀释物(3590cfu/mL)，得到的共培养比例为1份假单胞菌属∶127份芽孢杆菌属。生长24小时后，培养基再加入(media redosing)以3mL/min的速率开始稀释平板计数培养液(1g/L浓度)。将搅拌设定为60rpm。
一天后(开始共培养两天后)，从每个反应器取液体样品，稀释并涂布在Maconkey琼脂上，在35℃温育约18小时以获得革兰氏阴性菌(＝假单胞菌属＝不期望的微生物)计数。类似地，用无菌木制涂棒刮削挂片，将刮削物(scraping)悬浮于无菌磷酸盐缓冲液中，均质化，稀释并涂布于在35℃温育18小时的MacConkey琼脂上。比较了经处理和未处理反应器中的假单胞菌属计数，以计算“芽孢杆菌属反应器中的log控制”。
Figure G2008800095964D00261
Figure G2008800095964D00262
计数cfu/mL或cfu/挂片
实施例10
再加入芽孢杆菌属孢子的CDC生物膜反应器中存在芽孢杆菌属候选菌 株时对假单胞菌属生物膜和浮游细胞增殖的控制
向带有瓷挂片(Tyler Research Instruments Corp.，Edmonton，Alberta)的CDC生物膜反应器(Biosurfaces Technology，Bozeman，MT，Cat#CBR90-2)装入400ml平板计数培养液(全浓度(full strength))并高压灭菌。向两个反应器中冷却的培养基中加入PTA-7545(实验1)或NRRL B-50017(实验2)孢子以在假单胞菌属加入之前在室温以60rpm搅拌棒搅拌预萌发24小时(反应器实验1中的初始芽孢杆菌属剂量＝1.3x105cfu/ml，实验2中为1012cfu/ml)。不接种芽孢杆菌属的情况下，处理另外两个反应器作为对照。铜绿假单胞菌在平板计数培养液中过夜生长，然后向全部四个反应器中加入20微升假单胞菌培养物的1∶100稀释物(实验1为127cfu/ml，实验2为1x105cfu/ml)，实验1得到的共培养比例为1份假单胞菌属：104份芽孢杆菌属，实验2为1∶0.1。生长24小时后，培养基再加入以90ml/15min的速率开始稀释平板计数培养液(1g/L浓度)，每小时稀释15分钟。对于经处理的反应器，以1.5ml孢子浓度历时2.7小时的速率加入芽孢杆菌属孢子，使实验1的终浓度为1.1x108cfu芽孢杆菌属孢子/天，实验2为1.8x107cfu芽孢杆菌属孢子/天。将搅拌设定为60rpm。
一天后(开始共培养两天后)，从每个反应器取液体样品，稀释并涂布在Maconkey琼脂上，在35℃温育约18小时以获得革兰氏阴性菌(不期望的生物)计数。类似地，用无菌木制涂棒刮削挂片，将刮削物悬浮于无菌磷酸盐缓冲液中，均质化，稀释并涂布于在35℃温育18小时的MacConkey琼脂上。比较了经处理和未处理反应器中的假单胞菌属计数，以计算“芽孢杆菌属反应器中的log控制”。
  条件   PTA-7545平均log控制   NRRL B-50017平均log控制
  生物膜(从挂片刮下的)   4.5   2.9
  浮游(液体)样品   4.4   3.5
实施例11
Petri平板哈维氏弧菌抑制区
芽孢杆菌属候选菌株在营养培养液(3g/L牛肉提取物，5g/L蛋白胨)中在35℃生长18-24小时。哈维氏弧菌ATCC 25919在加入1.5％NaCl的营养培养液中在28℃生长18-24小时。将加入1.5％NaCl的营养琼脂(1.5％琼脂)以25mL的等分试样高压灭菌，并向熔融琼脂的每个等分试样中加入250微升过夜培养的弧菌属培养物，使弧菌属在琼脂中达到约1x106cfu/mL。在琼脂凝固后，使用一块无菌不锈钢管件在每个平板中打四个孔。将50微升每种过夜的芽孢杆菌属培养物转移至每个孔中。将平板(琼脂面朝下)在28℃温育18-24小时。测量弧菌属菌苔的抑制区。将可辨别的抑制＞0.5mm评分为阳性。
  菌株   哈维氏弧菌
  NRRL B-50015   +
  NRRL B-50016   +
  NRRL B-50017   +
  PTA-7542   +
  PTA-7543   +
  PTA-7544   +
  PTA-7545   +
  PTA-7546   +
  PTA-7547   +
  PTA-7548   +
  PTA-7749   +
  PTA-7793   +
  PTA-7790   +
  PTA-7791   +
实施例12
Petri平板溶藻弧菌的抑制区
芽孢杆菌属候选菌株在营养培养液(3g/L牛肉提取物，5g/L蛋白胨)中在35℃生长18-24小时。溶藻弧菌ATCC 17749在加入1.5％NaCl的营养培养液中在28℃生长18-24小时。将加入1.5％NaCl的营养琼脂(1.5％琼脂)以25mL的等分试样高压灭菌，并向熔融琼脂的每个等分试样中加入250微升过夜弧菌属培养物，使弧菌属在琼脂中达到约1x106cfu/mL。在琼脂凝固后，使用一块无菌不锈钢管件在每个平板中打四个孔。将50微升每种过夜芽孢杆菌属培养物转移至每个孔中。将平板琼脂面朝下在28℃温育18-24小时。测量弧菌属菌苔的抑制区。将可辨别的抑制＞0.5mm评分为阳性。
  菌株   溶藻弧菌
  NRRL B-50015   +
  NRRL B-50016   +
  NRRL B-50017   +
  PTA-7541   +
  PTA-7592   +
  PTA-7542   +
  PTA-7543   +
  PTA-7544   +
  PTA-7545   +
  PTA-7546   +
  PTA-7747   +
  PTA-7748   +
  PTA-7749   +
  PTA-7793   +
  PTA-7790   +
  PTA-7791   +
实施例13
Petri平板费氏弧菌抑制区
芽孢杆菌属候选菌株在营养培养液(3g/L牛肉提取物，5g/L蛋白胨)中在35℃生长18-24小时。费氏弧菌在加入1.5％NaCl的营养培养液中在28℃生长18-24小时。将加入1.5％NaCl的营养琼脂(1.5％琼脂)以25mL的等分试样高压灭菌，并向熔融琼脂的每个等分试样中加入250微升过夜弧菌属培养物，使弧菌属在琼脂中达到约1x106cfu/mL。在琼脂凝固后，使用一块无菌不锈钢管件在每个平板中打四个孔。将50微升每种过夜芽孢杆菌属培养物转移至每个孔中。将平板琼脂面朝下在28℃温育18-24小时。测量弧菌属菌苔的抑制区。将可辨别的抑制＞0.5mm评分为阳性。
  菌株   费氏弧菌
  PTA-7543   +
  PTA-7545   +
  PTA-7546   +
  PTA-7547   +
  PTA-7548   +
  PTA-7793   +
  PTA-7790   +
  PTA-7791   +

Claims (21)

1.用于防止和/或减少表面上生物膜形成的方法，包括使所述表面接触选自下组的一种或多种细菌菌株：
具有保藏登录号NRRL B-50014的菌株；
具有保藏登录号NRRL B-50015的菌株；
具有保藏登录号NRRL B-50016的菌株；
具有保藏登录号NRRL B-50017的菌株；
具有保藏登录号NRRL B-50018的菌株；
具有保藏登录号PTA-7541的菌株；
具有保藏登录号PTA-7542的菌株；
具有保藏登录号PTA-7543的菌株；
具有保藏登录号PTA-7544的菌株；
具有保藏登录号PTA-7545的菌株；
具有保藏登录号PTA-7546的菌株；
具有保藏登录号PTA-7547的菌株；
具有保藏登录号PTA-7549的菌株；
具有保藏登录号PTA-7790的菌株；
具有保藏登录号PTA-7791的菌株；
具有保藏登录号PTA-7792的菌株；
具有保藏登录号PTA-7793的菌株；或这些菌株中两种或多种的混合物。
2.权利要求1的方法，其中表面是硬表面，该硬表面由选自下组的一种或多种材料制成：金属、塑料、橡胶、玻璃、木材、纸、混凝土、岩石和陶瓷材料；或软表面，该软表面由选自下组的一种或多种材料制成：纱、织物、植物纤维、石棉、毛发；皮肤；角质材料；和体内器官肺；或多孔表面。
3.权利要求2的方法，其中所述岩石选自大理石和石膏。
4.权利要求2或3的方法，其中硬表面是便器；便器水箱；水处理装置；水槽；奶制品、食品加工装置；化学或药物加工装置；或医疗设备。
5.权利要求2或3的方法，其中硬表面是冷却塔。
6.权利要求1的方法，其中由一种或多种不期望的微生物引起生物膜形成。
7.权利要求6的方法，其中不期望的微生物引起所述材料的腐蚀、降解；感染；染色或者以其他方式使表面显得不美观。
8.权利要求1的方法，其中所述方法是定期重复的。
9.权利要求1的方法，其进一步包括使所述表面接触选自下组的酶：蛋白酶、α-淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶、过氧化物酶/氧化酶、果胶酸裂合酶和甘露聚糖酶，或其混合物。
10.权利要求1的方法，其进一步包括使所述表面接触选自下组的一种或多种作用剂：分散剂、表面活性剂、抗微生物剂和杀生物剂。
11.用于防止和/或减少微生物浮游增殖的方法，包括使所述微生物在水溶液中与选自下组的一种或多种细菌菌株接触：
具有保藏登录号NRRL B-50014的菌株；
具有保藏登录号NRRL B-50015的菌株；
具有保藏登录号NRRL B-50016的菌株；
具有保藏登录号NRRL B-50017的菌株；
具有保藏登录号NRRL B-50018的菌株；
具有保藏登录号PTA-7541的菌株；
具有保藏登录号PTA-7542的菌株；
具有保藏登录号PTA-7543的菌株；
具有保藏登录号PTA-7544的菌株；
具有保藏登录号PTA-7545的菌株；
具有保藏登录号PTA-7546的菌株；
具有保藏登录号PTA-7547的菌株；
具有保藏登录号PTA-7549的菌株；
具有保藏登录号PTA-7790的菌株；
具有保藏登录号PTA-7791的菌株；
具有保藏登录号PTA-7792的菌株；
具有保藏登录号PTA-7793的菌株；或这些菌株中两种或多种的混合物。
12.权利要求11的方法，其中由一种或多种不期望的微生物引起浮游增殖。
13.权利要求11的方法，其中所述方法是定期重复的。
14.权利要求11的方法，其中进一步存在选自下组的一种或多种作用剂：酶、分散剂、表面活性剂、抗微生物剂和杀生物剂。
15.权利要求11的方法，其中所述细菌细胞计数在1至1x108cfumL的范围内。
16.权利要求11的方法，其中所述细菌细胞计数在50至1x107cfu/mL的范围内。
17.包含权利要求1中的一种或多种培养物的组合物。
18.权利要求17的组合物，其进一步包含表面活性剂。
19.权利要求17或18的组合物，其进一步包含一种或多种酶。
20.权利要求19的组合物，其中所述酶选自下组：蛋白酶、α-淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶、过氧化物酶/氧化酶、果胶酸裂合酶和甘露聚糖酶，或其混合物。
21.权利要求17的组合物，其进一步包含选自下组的一种或多种成分：分散剂、稳定剂、抗微生物剂、香料、染料和杀生物剂。
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