CN1932520B - 检测对虾白斑综合症病毒的试纸条及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测对虾白斑综合症病毒的试纸条及制备方法，该纸条由PVC衬垫、样品垫、金标抗体结合垫、吸收垫、WSSV抗体固相硝酸纤维素膜检测层构成，然后是WSSV、VP19、VP28线纯蛋白、抗WSSV多克隆抗体、抗WSSV金标抗体、WSSV抗体固相硝酸纤维素膜检测层的制备，本发明结构简单，制备方法容易，对虾斑综合病病毒检测简便、快捷、准确。

Description

检测对虾白斑综合症病毒的试纸条及其制备方法

技术领域

本发明属于免疫学和病毒学交叉技术领域，更具体涉及一种检测对虾白斑综合症病毒试纸条，同时还涉及纸条的制备方法。本发明主要对水产养殖业病害病原检测技术的改进，主要是针对对虾白斑综合症病毒(WSSV，White Spot Syndrome Virus)现场检测的试纸条及其制备、使用方法。

背景技术

90年代以来，世界许多国家和地区的主要对虾养殖区虾病爆发性流行，对虾产量锐减，造成了重大的经济损失，严重阻碍了对虾养殖业的持续发展。在众多的对虾病毒中，对虾白斑综合症病毒(WSSV)的危害最为严重，是对虾养殖业的头号杀手。

养殖虾感染对虾白斑综合症病毒(WSSV)后会出现厌食、摄食减少或停止摄食，行动迟钝，弹跳无力，静卧不动或游动异常，直到最后无力活动，典型症状是病虾甲壳内侧出现0.5～2mm大小不等的白色斑点，此病病程短，死亡率高。迄今，对虾白斑综合症还没有效的治疗方法，因此快速准确的病毒分离以及病毒检测诊断技术已成为各国学者研究的焦点之一。

目前对于对虾病毒的检测方法主要包括以下几种：

1、肉眼观察法

肉眼观察法是通过了解养殖过程中对虾急慢性死亡的情况，结合是否出现如头胸甲出现白斑、甲壳***易剥离等典型症状进行判断。这种方法可在现场紧急情况下且没有其他诊断方法时应用，以便采取抢收措施，减少损失，但准确性较差，且需要有丰富的经验。

2、传统组织学方法

从虾池中取对虾或对虾粪便直接作湿标本检查，结合TE或H-E染色法，在光镜下进行检测。患病组织通过组织切片和染色可观察到组织细胞具有典型的核肿大，核内着色特征由嗜酸性逐步转为嗜碱性的两性着染病变。整个制样过程需1台光学显微镜，且这种方法需要操作者具有较丰富的实践经验。

3、电子显微技术

自1993年以来，有关WSSV的很多研究结果是凭借组织病理学和电子显微镜的方法来获得的。这类方法可精确地定位WSSV的复制位置，揭示WSSV的病变特征；展示和比较不同WSSV分离株的病毒粒子及核衣壳的大小形态，证实WSSV的致病性，确定病毒的宿主和传播途径。电镜观察法是最为直观的检测病毒性病原的方法，在电镜下可以直接观察到病毒的形态和大小。但电镜观察法具有操作复杂、需要较严格的实验条件和较高超的实验技术、样品处理时间过长等缺点，不能用于生产实践中WSSV的快速诊断以及大量样品的检测，仅适用于实验室研究。

4、酶联免疫吸附法(ELISA)

酶联免疫吸附试验(ELISA)是根据酶免疫测定原理发展的一种固相免疫酶技术，由于具有灵敏度高、操作简便、重复性好等特点，是应用最广的免疫学技术。对于从宿主组织纯化的病毒抗原制备的多克隆抗体(抗血清)用于检测时，由于多克隆抗体专一性不强，容易造成WSSV免疫检测中的假阳性。其最佳方案是制备高效价单克隆抗体。WSSV的单克隆抗体免疫检测，其特异性、灵敏性和可重复性大大提高。中国科学院水生生物研究所的戴和平等的专利--对虾白斑杆状病毒的诊断试剂盒及其检测方法(申请号CN00131230.8)即是一种基于单克隆抗体酶联免疫技术的病毒检测方法。但是酶联免疫技术检测WSSV必须实验室中完成，对人员和设备有较高地要求，检测时间较长，不适合现场的快速诊断，难于在基层推广使用。

5、核酸探针法

核酸探针是指被某种物质标记了的从而可以被探测到的核酸片段，它能特异性地与待检测的核酸结合、杂交。所谓核酸杂交就是在DNA变性的条件下将标记的DNA探针与被检测核酸共存于一个***内，这样当复性时探针DNA的单链就可能与被检测DNA的单链互补形成稳定的双螺旋结构。常用的方法有斑点杂交和原位杂交。

1)斑点杂交法

斑点杂交是最常用的一种较快捷的基因检测方法，根据杂交膜上点样斑点的有无或强弱就能推测样品是否含有待检物质。即将少量的被检样品DNA固定在硝酸纤维素滤膜上，再用标记探针(如生物素标记探针)杂交，杂交后通过显色反应显色，只有当检测样品中含有病毒DNA，才能出现点状或线状有色区即阳性结果。中国水产科学研究院黄海水产研究所的史成银等利用此种方法来检测WSSV，并申请了专利--对虾流行病病原检测试剂盒及其检测方法(申请号CN00111336.4)，中国科学院武汉病毒研究所的石正丽等也申请了专利--对虾病毒核酸复合点杂交检测的方法(申请号CN03119088.X)。由于未感染病毒的细胞数量大大多于已感染病毒细胞，因此采用斑点杂交法检测标本是否存在病毒核酸时，病毒核酸DNA被大量的细胞核酸DNA所稀释，使得检测的敏感性降低。

2)原位杂交法

原位杂交技术最早应用于60年代末期，由于核酸杂交能在成分复杂的组织中进行，可更为方便的研究那些数量少且散在于组织中的细胞内DNA或RNA；且由于原位杂交不需要从组织提取核酸，对于组织中含量极低的靶序列有极高的敏感性，并可完整的保持组织与细胞的形态，更能准确的反映出组织细胞的相互关系及功能状态，可以直观定位是病毒感染的靶组织及靶组织中对病毒敏感的细胞类型。但此法耗时长，操作繁琐，需要专业技术人员，对实验条件要求很高，检测成本高，不适合在基层使用。

6、聚合酶链式反应(PCR)

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)，是1985年美国Cetus公司的一项专利技术，被誉为八十年代分子生物学领域的一项革命性突破。PCR技术的原理是根据已克隆的病毒DNA序列，设计PCR引物，然后利用该引物直接扩增样品中待检测病毒的DNA片段，从而通过电泳、染色把它显示出来。与传统诊断方法相比，它具有敏感性及特异性高、简单、快速等特点。目前，PCR技术已广泛应用于WSSV的检测，国内外均已开发出商品化的WSSV的PCR检测试剂盒。一些学者还对PCR技术做了不同的改进，使检测结果更快速、准确。如中山大学何建国等的专利--对虾白斑综合症病毒基因诊断试剂盒及检测方法(申请号CN03114366.0)，国家***第三海洋研究所王玮等的专利--对虾白斑杆状病毒快速检测方法(申请号CN97112049.8)，中国科学院武汉病毒研究所的石正丽等的专利--复合多聚酶链-酶联免疫反应检测对虾病毒的方法(申请号CN03125202.8)。

PCR方法的高度灵敏性是其他检验方法无法匹敌的，但是目前PCR技术仍有一些问题需要解决。如病毒DNA提取过程不当所造成样品品质不好，无法有效地进行PCR反应而导致的假阴性结果；因样品交互污染或因PCR终产物的污染而产生的假阳性结果；因样品采集部位的错误而导致实验失败；因病毒的突变而导致原始设计不再能有效检测突变病毒的基因序列等等。而且PCR及其产物的检测需要复杂的仪器设备，不适合在现场进行检测，难于在基层推广使用。

以上技术对于广大虾农而言掌握难度很大，难以推广，限制了这些技术的应用和发展。因此研制一种适用于WSSV的快速、准确、简便、现场、无假阳性的检测方法就具有重要的现实意义，以期达到早发现、早预防的目的。

免疫胶体金技术是60年代继三大标记技术(荧光素、放射性同位素和酶)后发展起来的固相标记免疫测定技术。最初该方法仅用于免疫电镜技术，现在已经发展到被动凝集试验、光镜染色、免疫印迹、免疫斑点渗滤法以及免疫层析技术等。胶体金免疫层析法(GICA)  是利用胶体金本身的显色特点结合免疫层析技术诊断特异性的待测物。该方法最大特点是单份测定、简单快速、特异敏感，不需任何仪器设备和试剂，几分钟就可用观察实验结果，特别适合于广大基层单位、医院、野外作业人员使用。目前已广泛应用于医学及动物医学临床诊断、违禁药物检测、药物监测等许多领域，如菲力普·许等的专利--艾滋病病毒快速检测试纸及其制备方法(申请号：CN01135100.4)，李克生等的专利--结核抗体金标测试条及其制备方法(申请号：CN01131834.1)，刘剑等的专利--一种快速检测***的试剂盒及其制备工艺(申请号CN02145333.0)，林祥等的专利--黄曲霉毒素快速检测装置及其制造方法(申请号：CN02101951.7)，李君文等的专利--免疫纸层析条及用其快速检测食品中致病菌和毒素的方法(申请号：CN03142652.2)。

胶体金免疫层析法基本原理是将特异的抗体或抗原先固定于硝酸纤维素(NC)  膜的某一区带，当该干燥的硝酸纤维素一端浸入样品(尿液或血清)  后，由于毛细管作用，样品将沿着该膜向前移动，当移动至固定有抗体或抗原的区域时，样品中相应的抗原或抗体即与该抗体或抗原发生特异性结合，再通过胶体金标记技术使该区域显示一定的颜色，从而实现特异性的免疫诊断。根据所使用的胶体金标记物的不同可以将胶体金免疫层析法分为间接法、竞争法和双抗夹心法等不同种类。

发明内容

本发明的目的是在于提供一种检测对虾白斑综合症病毒的试纸条，使用方便，操作简便，检测快速、准确。

本发明的另一个目的是在于提供制备对虾白斑综合症病毒试纸条的方法，方法易行，操作简便，成本低廉，使用方便。

本发明的目的是由以下技术方案实现的，研制了一种对虾白斑综合症病毒现场检测试纸条，共包括：适当尺寸的PVC衬垫，兔源抗WSSV VP19+VP28多克隆抗体IgG(简称抗WSSV抗体)、胶体金标记的兔源抗WSV VP19+VP28多克隆抗体IgG(简称金标抗体)和羊抗兔IgG。在该PVC衬垫的两端部，分别设有样品垫和吸收垫；在该PVC衬垫中部段设有硝酸纤维膜检测层，在硝酸纤维膜检测层与样品垫交界处，设有载有金标抗体的结合垫，该结合垫一端部分设置在样品垫之下，其另一端部分设置在该检测层之上；在与结合垫延续的检测层上设有检测线和质控线，该检测线和质控线处分别包被有抗WSSV抗体和羊抗兔IgG。

一种检测对虾白斑综合症病毒的试纸条，它包括下列步骤：

A、所述的抗WSSV抗体，其制备方法如下：

(1)用基因工程大肠杆菌菌株表达并纯化的WSSV VP 19、VP28，按质量比1∶1比例混匀，作为抗原免疫家兔，制备抗WSSV抗血清；

(2)将抗WS SV抗血清用Protein A亲合层析柱纯化，得到抗WSSV抗体。

B、所述的胶体金标抗体，其制备方法如下：

(1)胶体金的制备：取0.01％的氯金酸溶液100ml，加热至沸，搅动下准确加入1％的柠檬酸三钠水溶液2.0ml(Marc&Jacqueline 1977)，金黄色的氯金酸水溶液在2分钟内变为橙色，继续煮沸15分钟，冷却后以去离子水恢复到原体积，用0.1 M K2CO3调pH为9.0。制备的胶体金经一次性灭菌滤器过滤，装入洁净玻璃瓶中4℃冰箱保存备用。

制备好的胶体金溶液用透射电镜检测其颗粒大小及分散性。同时用分光光度计进行400-600nm全波段扫描，确定最大吸收峰。

(2)金标抗体的制备：将抗WSSV抗体加入到上述(1)步的胶体金溶液中，加入牛血清白蛋白，离心后的沉淀用含有牛血清白蛋白、叠氮钠的磷酸盐缓冲液悬起，制成金标抗体溶液；

(3)载有金标抗体的结合垫的制备：将玻璃纤维膜完全浸没于上述(2)步制成的金标抗体溶液中，30分钟后取出，干燥后4℃保存备用，便得到一种检测试纸条。

本对虾白斑综合症病毒现场检测试纸条的检测方法：首先快速地从被检测的虾中提取WSSV，制备检测样品；然后，手持该试纸的手持端，将该试纸的样品垫***该检测样品或在样品垫上滴加该检测样品，5分钟内在位于检测层下端的检测线和在位于检测层上端的质控线处显示红色。检测线显示红色表示WSSV阳性；检测线不显示红色，表示WSSV阴性，即检测样品中不含WSSV或是WSSV含量极低；质控线显示红色，表示试纸有效；质控线处不显示红色，说明试纸失效，检测结果无效。

本发明的特点是：(1)本发明的对虾白斑综合症病毒现场检测试纸条，具有简便、快速、现场、准确、灵敏等特点，无需专门设施和操作技术，适于普通养殖户池边检测。(2)本发明的对虾白斑综合症病毒现场检测试纸条，在使用过程中只需将虾鳃捣碎即可，与传统病毒提取研磨、离心等方法相比，此法方法方便、简单、快速，适合现场检测使用。

本领域的普通技术人员都会理解，在本发明的保护范围内，对于上述实施例进行修改，添加和替换都是可能的，其都没有超出本发明的保护范围。

附图说明

图1为一种检测对虾白斑综合症病毒试纸条的示意图。

1、PVC衬垫；2、样品垫；3、结合垫；4、检测层；5、检测线；6、质控线；7、吸收垫。

图2为一种对虾白斑综合症病毒试纸条的检测结果示意图。

2、样品垫；3、结合垫；4、检测层；5、检测线；6、质控线；7、吸收垫；8、加样最高指示线。

图3目的基因的获得与重组质粒的酶切鉴定

1，DL2000 Marker；2，PCR product of vp19；3，pGET-vp19/BamHI+Hind III；4，pET32b-vp19/BamH I+Hind III；5，Lambda DNA/Hind III Marker.

图4WSSV VP 19表达产物的时相分析

1，pET32b-VP 19 uninduced；2，pET32b-VP19 induced with IPTGfor 1h；3，pET32b-VP19 induced with IPTG for 2h；4，pET32b-VP 19induced with IPTG for 3h；5，pET32b-VP19 induced with IPTG for 4h；M，molecular weight standard；The arrow indicated the location ofrecombinant WSSV VP19.

图5表达产物的纯化和检测

1，pET32b uninduced；2，pET32b induced with IPTG for 4h；3，Purified Trx；4，pET32b-VP19 uninduced；5，pET32b-VP19 induced withfor 4h；6，Purified WSSV VP19；M，molecular weight standard；7，Supernatants of the induced recombinant strains with IPTG for 4h；8，Pellets of the induced recombinant strains with IPTG for 4h；9，Western-blot of purified WSSV VP19；The arrow indicated the locationof recombinant WSSV VP19.

图6重组质粒pET-vp28酶切鉴定图

1.PCR marker；2.PCR回收产物；3.pET-vp28质粒；4.EcoR1/Xho1双酶切pET-vp28；5.EcoR1/HindIII双酶切marker

图7重组表达载体pET-VP28的构建过程图

图8 WSSV VP28在E.coli BL21(DE3)中的表达图

1.BL21(DE3)-p ET-vp28诱导前；  2-4.BL21(DE3)-pET-vp28诱导4h，5h，6h的沉淀；5.蛋白质分子量标准；6-8 BL21(DE3)-pET-vp28诱导4h，5h，6h；9.BL21(DE3)-p ET-vp28未诱导10-12BL21(DE3)-pET-vp28诱导4h，5h，6h的上清

图9 western bloting结果图

M蛋白分子量标准；1 BL21(DE3)-p ET-vp28诱导5h；2BL21(DE3)-p ET-vp28未诱导

具体实施方式

实施例1：

根据图1可知本发明对虾白斑综合症病毒现场检测试纸条，其包括：适当尺寸的PVC衬垫1；在该PVC衬垫1的两端，分别设有样品垫2和吸收垫7；在该PVC衬垫1中部段设有硝酸纤维膜检测层4，在硝酸纤维膜检测层4与样品垫2交界处，设有载有金标抗体的结合垫3，在结合垫3一端部分设置在样品垫之下，其另一端部分设置在该检测层4之上；在与结合垫3延续的检测层4上设有检测线5和质控线6，该检测线5和质控线6处分别包被有抗WSSV抗体和羊抗兔IgG。

实施例2：

WSSV VP19蛋白的制备

1.WSSV vp19的扩增、重组表达载体的构建和鉴定

(1)WSSV vp19的扩增

根据Genebank登录的WSSV基因组，利用引物设计软件Oligo6.0设计vp19引物，上游引物：5’ggatcctatggccacgactaac 3’(划线处为BamH I)，下游引物：5’aagcttctgcctcctcctggggtaagac 3’(划线处为HindIII)，由上海博亚生物技术有限公司合成。

WSSV病毒基因组的制备：于冰上取感染对虾白斑病虾的肺、胃和心脏，加入10倍体积的T N缓冲液(50mmol/L Tris-HCl，0.4mmol/LNaCl，pH 7.4)于匀浆器中，冰浴匀浆，8000r/min离心5min，取上清液，加入蛋白酶K(100μg/ml)，DS(50mmol/L KCl；10mmol/L Tris-Cl PH8.3；明胶0.1mg/ml；NP-40，0.45％；T ween 20，0.45％)，于沸水中煮15min左右，立即冰浴5min，12,000r/min离心10min，4℃保存。

以WSSV病毒基因组DNA为模板，PCR反应体系：10×reactionbuffer 5uL，MgCl2 3uL(1.5mM)，dNTP 1uL(0.2mM)，上下游引物各1uL(30pmol)，Taq DNA聚合酶1uL(5U)，模板4uL，加无菌水至终体积为50uL。PCR扩增目的基因vp19，PCR反应条件：95℃ 5min，94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 30s(29个循环)，72℃ 10min。

(2)重组表达载体的构建

A、PCR产物的回收、纯化与克隆

将以上PCR产物在琼脂糖凝胶上电泳(1×TAE)，用紫外灯观察电泳情况，当要回收的DNA带与其他带完全分离时，停止电泳，在紫外灯下用刀片切下欲回收带，用PCR产物纯化试剂盒纯化。

PCR产物的纯化：

(1)将切下的凝胶放入1.5ml Eppendorf管中，加入4倍凝胶毫克数的Binding Buffer，65℃水浴7min，其间每2min轻摇Eppendorf管一次使凝胶完全熔化。

(2)取750μl溶有凝胶的溶液加到柱子上，12000rpm，室温(20-25℃，以下室温相同)，离心1min，弃去液体。

(3)加入300μl Binding Buffer，同上离心弃去液体。

(4)加入750μl Washing Buffer，同上离心弃去液体，重复该步骤一次。

(5)空柱子12000rpm离心1min以甩干液体。

(6)将柱子放于1.5ml Eppendorf管，加入30μl Elution Buffer，37℃保温2min，12000rpm离心1min。

(7)将得到的PCR产物取2μl电泳检测定量，其余贮于-20℃备用。

PCR产物的克隆：

将纯化的PCR产物与pGEM-T载体(购自Promega公司)连接。连接体系如下：

10×Ligation Buffer 1μl

pGEM-T载体  1μl

纯化后的PCR产物5μl

ddH2O  2μl

T4 DNA Ligase 1μl

总反应体积10μl

连接反应液16℃水浴放置过夜后，存于-20℃备用。

B、重组T载体转化大肠杆菌JM109 pGEM-T(购自Promega公司)

氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞：

1)以无菌牙签挑取固体LB平板上的新复苏的大肠杆菌单菌落，接种到5ml LB培养基中，37℃，250rpm摇床活化过夜。

2)取10-20μl上述活化大肠杆菌，接种到5ml新鲜LB培养基中，37℃，250rpm培养2-3h，至OD600值为0.4-0.6。

3)取1.5ml步骤2的菌液加入无菌的Eppendorf离心管中，4000rpm，4℃离心10min，用移液枪吸干上清。

4)加入800μl冰预冷的0.1M氯化钙，轻轻振荡重悬菌体沉淀，冰浴30min，4000rpm，4℃离心10min，用移液枪吸干上清。

5)加入100μl冰预冷的0.1 M氯化钙溶液重悬沉淀，得到制备好的感受态细胞。置于4℃保存，2天内使用。

重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞：

1)取连接反应液(不超过10μl体积)，加入到100μl上述制备的感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min。

2)42℃水浴中热激90s，迅速移至冰中冰浴2min。

3)加入390μl新鲜LB液体培养基，37℃，150rpm轻摇，使细胞复苏50min。

4)4000rpm离心5min，吸弃400μl上清，将剩余的菌液用移液枪轻轻混匀。

5)取100μl细菌悬液，均匀涂在含IPTG、X-gal、Amp的LB平板上，正向放置1-2h，直至液体被充分吸收，倒置平板，于37℃培养箱中培养过夜，利用α-互补作用筛选阳性克隆。

C、阳性重组子的PCR检测

从LB平板上挑取单菌落，接种于0.5ml加有Amp的LB培养液中，37℃培养4h，取2μl菌液作为模板用于菌落PCR鉴定。反应体系和反应参数如本节2.2.1所述。

D、碱裂解法提取质粒DNA

1)分别用无菌牙签挑取生长在含有氨苄青霉素的LB平板上的单菌落，接种到3ml含相应抗生素的LB液体培养基中，37℃，250rpm培养过夜。

2)次日将培养的菌液4℃，12000rpm离心30sec，吸弃上清，收集菌体沉淀，加入100μl冰预冷的溶液I(50mmol/l葡萄糖，25mmol/l Tris·HCl(pH 8.0)，10mmol/l EDTA(pH8.0)，8磅灭菌15min后置于4℃备用。)，剧烈振荡使沉淀完全悬浮。

3)加入200μl溶液II(0.2mol/l NaOH，1％SDS，使用时新鲜配制。)，温和颠倒数次混匀，冰浴静置5min，待整个溶液澄清。

4)加入150μl冰预冷的溶液III(5mol/l乙酸钾60ml，浓乙酸11.5ml，ddH2O 28.5ml。

)，轻微振荡均匀，冰浴10min，溶液会出现絮状沉淀。

5)12000rpm，4℃离心10-15min，转移上清至一个无菌Eppendorf管中。

6)加入等体积的苯酚，充分混匀，12000rpm，4℃离心5min，取上清液转入另一支无菌的Eppendorf管中，再依次用等体积的苯酚/氯仿(1/1)、苯酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)同上抽提。

7)离心后取上清，加800μl预冷的无水乙醇，-20℃沉淀2h。

8)12000rpm，4℃离心15min，去上清，吸弃液体，将Eppendorf管倒置于无菌滤纸上待其干燥。

9)加入室温放置的70％乙醇1ml，12000rpm，4℃离心10min，吸弃液体，将Eppendorf管倒置于无菌滤纸上37℃温箱内干燥。

10)将DNA沉淀溶于50μl含RNase A(20μg/ml)的TE溶液中-20℃存放。

(3)重组表达载体的鉴定

A、阳性重组子pGEM-vp19的酶切鉴定

用BamH I和Hind III对所提取的质粒DNA进行双酶切，酶切体系如下：

质粒DNA           8μl

BamH I            0.5μl

HindIII           0.5μl

10×H buffer      1μl

总反应体积        10μl

以上酶切反应条件均为37℃，反应时间4 h。酶切产物用琼脂糖凝胶电泳进行结果分析。

用BamH I和Hind III对重组质粒pGEM-vp19和表达载体pET32b同时进行双酶切，胶回收试剂盒回收目的条带，将酶切得到vp19与相应的载体片断连接后转化大肠杆菌JM109感受态细胞，小量提取质粒，用BamH I/Hind III双酶切鉴定阳性重组子，重组质粒命名为pET32b-vp19。

B、DNA序列分析

随机选择3个经酶切鉴定***方向正确的阳性重组菌落送上海生物工程有限公司进行DNA序列测定，并将测序结果与GenBank已经登录的序列进行比较。

取10μL PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，EB染色后紫外灯下观察表明扩增得到一条370bp的条带(图3.1)，与目的基因vp19大小相符。将PCR产物克隆到pGEM-T载体中，经BamH I/Hind III双酶切鉴定，获得了阳性克隆(图3)，DNA序列测定结果表明vp19的基因序列完全正确。通过BamH I和HindIII双酶切将vp19基因定向***表达载体pET32b，BamH I和Hind III双酶切鉴定pET32b-vp19质粒，在1％琼脂糖凝胶电泳上呈现两个条带，大小分别为5900bp和370bp(图3)，分别对应于表达载体pET32b和vp19基因，表明该质粒已正确***表达载体pET32b中。

2.融合蛋白的诱导表达及纯化

(1)Trx蛋白和融合蛋白(WSSV VP19)的诱导表达

1)将经测序表明vp19正确***pET32b载体的重组质粒和pET32b空载体分别转化大肠杆菌Origami(DE3)pLysS感受态，从平板上挑取携带有重组质粒和空载体的大肠杆菌单菌落，接种于20mLLB液体培养基(含终浓度为100mg/L氨苄青霉素，34mg/L氯霉素，15mg/L卡拉霉素)中，在37℃下，250rpm振荡培养8-12h。

2)次日按4％接种到新鲜LB液体培养基中，在37℃下继续振荡培养约2小时。

3)至菌液OD600值为0.6时，加入诱导物IPTG至终浓度为0.8mM，在22℃-35℃下诱导表达4h。

菌液在4℃下12,000离心1min，收集菌体。

(2)大肠杆菌基因工程蛋白的粗提取

1)向收集的菌体加入适量1×Binding Buffer(可进一步用于镍柱纯化)或PBS重悬，-20℃反复冻融几次后，再进行超声波破碎菌处理(冰水混合物中，处理3次，每次10秒，间隔30秒)。

2)待菌液变清亮，绝大部分菌体破裂后，4,000rpm离心菌液15-20分钟。

3)分别收集得到菌体残渣和上清液.上清在4℃下12,000rpm继续离心15分钟。

4)收集两次离心所得上清和沉淀，分别取其1/100加入2×SDS-PAGE加样缓冲液(100mM Tris-C1、200mM  β-巯基乙醇、4％SDS、0.2％溴酚蓝、20％甘油)，经沸水浴10分钟后，用SDS-PAGE进行电泳检测。

(3)Ni2+柱亲和层析法纯化带6×His标记的蛋白

1)Ni2+柱用柱内介质体积10倍的1×Binding Buffer(0.5mM咪唑，0.5mM NaCl，2mMTris-HCl)10倍体积的无菌水洗柱床，用10倍体积的1×Charge Buffer(50mMNiSO4)补充Ni2+，再用10倍体积的1×Binding Buffer清洗柱床，准备开始亲和层析。

2)蛋白溶液用蠕动泵以循环方式加入到平衡好的亲和层析柱中，使带有6×His的样品充分Ni2+结合，过夜后从Ni2+柱出口收集与Ni2+反应后的样品(即穿漏液)。

3)使20倍体积的1×Binding Buffer洗柱，以冲洗下留在柱内的少量未与Ni2+结合的样品。

4)用10mM～100mM的咪唑溶液洗脱Ni2+柱上非目的蛋白(洗脱液体积与浓度视总蛋白含量及非目的蛋白与Ni2+结合能力灵活变化)。

5)用1×Elute Buffer(1M咪唑，0.5M NaCl，20mM Tris-HCl)洗脱Ni2+柱，目的蛋白洗脱下来，以2mL为单位收集洗脱液。

6)取收集的每一管蛋白进行12％SDS-PAGE电泳检测目的蛋白在洗脱液中的分布。

7)Ni2+柱用1×Elute Buffer继续洗脱，洗掉柱床中的全部剩余蛋白，再用1×StripBuffer(100mM EDTA，0.5 M NaCl，20mMTris-HCl)洗去柱子上的Ni2+离子。

8)组氨酸亲和层析柱的洗涤，再生和保存。

一般来说，Ni2+亲和层析柱可以反复使用3-4次，在再次使用前须洗涤而不需再生，若反复多次使用则需再生。

(1)用2倍体积的6M盐酸胍、0.2M的乙酸溶液洗组氨酸亲和层析柱；

(2)用2倍体积的去离子水洗柱；

(3)用1倍体积2％SDS洗柱；

(4)用1倍体积25％乙醇洗柱；

(5)用1倍体积50％乙醇洗柱；

(6)用1倍体积75％乙醇洗柱；

(7)用5倍体积100％乙醇洗柱；

(8)依次重复步骤6、5、4各一次；

(9)用1倍体积的去离子水漂洗柱一次；

(10)用5倍体积100mM EDTA(pH8.0)洗柱，彻底去除层析柱上的Ni2+离子；

(11)将再生的层析柱置于含0.1％叠氮钠的20％  醇溶液中，4℃保存.

(4)纯化后的重组蛋白WSSV VP19 western blotting鉴定

(1)当SDS-PAGE将要结束时，用双蒸水淋洗石墨板后用纸巾揩干电极板上黏附的液滴。

(2)戴一次性手套裁切六张滤纸和一张纤维素滤膜，其大小应与凝胶大小完全吻合，用软铅笔在滤膜的一角做好标记。

①滤膜漂浮于装有去离子水的平皿中，借毛细作用使之从下往上湿润，在水中至少浸泡5min，以驱除留于滤膜上的气泡。

②将剪好的滤纸浸泡于转移缓冲液中，时间为15-30min

(3)戴一次性手套按如下步骤安装转移装置：

①平放半干电转仪的底部电极，石墨一边朝上。

②其上放置三张浸泡好的滤纸，精确对齐，用玻璃棒赶走气泡。

③把润湿后的滤膜放于滤纸之上，标记面朝上，精确对齐，用玻璃棒赶走气泡。

④将用于转膜的凝胶在盛有去离子水的平皿中略微漂洗一下，放于NC膜上，把凝胶的左下角置于NC膜的标记角上，精确对齐，轻轻赶走气泡。

⑤再在凝胶上放三张浸泡好的三张滤纸，对齐并赶走气泡。

(4)放上另一半电极，用胶布将两部分电极固定。连接电源，将电转仪置4℃冰柜，电转1.5-2h。

(5)从上到下拆卸转移装置，逐一掀去各层，将膜放入装有10mL封闭液的小平皿中，在摇摆床上室温摇动60min，凝胶银染以检测转膜效率。

(6)将膜用镊子取出，用TBST冲洗后，转入20mL TBST稀释的抗VP(19+28)IgGs(1∶1000)溶液室温摇动30min。

(7)室温用50mL TBST中冲洗膜，连续洗四次，每次15min。

(8)将膜转入20mL TBST稀释辣根过氧化物酶交联的羊抗兔IgGs(1∶10000)溶液中室温摇动30min。

(9)重复步骤(7)

(10)室温以PBS洗膜15min以去除过量的磷酸盐和吐温20。

(11)将膜浸泡于10mL DAB显色液中10-30min，直至蛋白条带出现。

(13)以PBS清洗以终止显色反应。

将pET32b和重组质粒分别转化Origami(DE3)pLysS宿主菌(购自Promega公司)，构建了pET32b-VP19和pET32b的表达菌株，IPTG(0.8mmol/L)诱导后在不同时间收集菌样，经SDS-PAGE电泳发现目的蛋白WSSV VP19获得了表达(见图4)，分子量约为37kDa，与预期的大小相符，如图2中的箭头所示，并在诱导后4h表达量最大。用Western Blot也检测到WSSV VP19蛋白的表达。将菌体反复冻融3次，超声波破碎，离心(12000r/min，4℃，10min)收集上清，镍离子亲和树脂纯化带6×His标签的融合蛋白后，约37kDa处为单一的条带(见图5)。同样的方法纯化得到pET32b空载体的表达产物Trx，在18kDa处为单一的条带(见图5)。

实施例3：

WSSV VP28蛋白的制备

1.PCR扩增vp28基因

根据GenBank中已经发表的WSSV序列设计引物。

vp28：上游引物：gaattcatggatctttctttcac(划线处为EcoR I位点)

下游引物：ctcgagttactcggtctcagtgc(划线处为XhoI位点)。

上述引物是用Oligo6.0软件分析设计的，由上海生工生物公司合成。

以质粒PUC-vp28为模板，PCR扩增目的基因vp28。PCR反应体系：10×reaction buffer 5uL，  MgC12 3uL(1.5mM)，dNTP1uL(0.2mM)，上下游引物各1uL(30pmol)，Taq DNA聚合酶1uL(5U)，模板4 uL，加无菌水至终体积为50uL。PCR反应条件：  95℃ 5min；95℃ 1min，55℃45s，72℃ 1min(30个循环)；72℃ 10min。  取5uL PCR产物在1.2％的琼脂糖凝胶上电泳，EB染色后紫外灯下观察。

PCR扩增vp28基因，PCR产物在1.2％的琼脂糖凝胶上电泳，EB染色后

紫外灯下观察，有与目的基因vp28大小相符的目的条带，大小为640bp左右，如图6所示。

2克隆载体pMD 18-T28的构建

将vp28 PCR产物用PCR纯化回收试剂盒回收后与克隆载体pMD 18-T(购自宝生物工程有限公司)连接，连接体系为：LigationsolutionI 5μL，pMD 18-T载体0.5μL，纯化后的PCR产物4.5μL，终体积10uL。16℃连接过夜。转化大肠杆菌JM 109感受态细胞。用无菌牙签从转化平皿上挑取单菌落，接种于5mL含100mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基中培养过夜。次日提取质粒，做PCR鉴定和EcoR I、XhoI双酶切鉴定，筛选含有vp28目的片断的重组质粒，命名为pMD 18-T28。

3重组表达载体的构建

EcoR I、XhoI双酶切表达载体pET-22b(+)和筛选到的重组克隆载体pMD18-T28，分别用胶回收试剂盒回收目的片断vp28和pET-22b(+)，再通过T4 DNA Ligase连接，16℃连接15h后，转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。用无菌牙签从转化平皿上挑取单菌落，接种于5mL含100mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基中培养过夜。次日提取质粒，做PCR鉴定和EcoR I、XhoI双酶切鉴定，筛选含有vp28目的片断的重组质粒，命名为pET-vp28，构建图如图7所示。

以EcoR I/XhoI双酶切质粒pET22b(+)和pMD18-T28。胶回收两目的片断并连接，通过EcoR I/XhoI双酶切鉴定，筛选阳性重组体，即为成功构建pET-vp28表达载体，见图6。

4外源蛋白在E.coli BL21(DE3)中的表达

A、E.coli BL21(DE3)-pET-vp28的诱导表达

1)从平板上挑取携带有质粒pET-vp28的大肠杆菌BL21(DE3)单菌落，接种于20mL含100mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基中，在37℃下，250rpm振荡培养8-12h。

2)次日按4％接种到新鲜LB液体培养基中，在37℃下继续振荡培养约2小时左右。

3)至菌液OD600值为0.6时，加入诱导物IPTG至终浓度为0.6mM，在37℃下诱导表达3-5h。

4)菌液在4℃下12,000离心1min，收集菌体。

B、程蛋白的粗提取

1)向收集的菌体加入适量PBS，-20℃反复冻融几次后，再进行超声波破碎菌处理(4℃，处理3次，每次10秒，间隔30秒)。

2)待菌液变清亮，绝大部分菌体破裂后，4,000rpm离心菌液15-20分钟。

3)分别收集得到菌体残渣和上清液。上清在4℃下12,000rpm继续离心15分钟。

4)收集两次离心所得上清和沉淀，分别取其1/100加入2×SDS-PAGE加样缓冲液(100mM Tris-C1、200mM β-巯基乙醇、4％SDS、0.2％溴酚蓝、20％甘油)，经沸水浴10分钟后，用12％SDS-PAGE进行电泳检测。

C、表达产物的SDS-PAGE鉴定

SDS-PAGE电泳按照分子克隆上所讲述的标准方法进行。浓缩胶的浓度为5％，分离胶的浓度为12％，电泳时电压为8V/cm。当溴酚蓝指示线到达分离胶底边时，关掉电源。用0.1％考马斯亮蓝染液染色4-6h后，再用脱色液(甲醇∶乙酸∶ddH2O＝4∶1∶5)将背景色脱尽为止。

表达目的蛋白的重组工程菌株E.coli BL21(DE3)-pET-vp28在IPTG(终浓度为0.6mM)诱导下，37℃诱导表达4-6h。如图8所示，在诱导前，诱导4h、5h、6h的时候分别取样，菌液超声波破碎后得的上清和沉淀用12％SDS-PAGE检测，发现在上清中有与预期大小32kDa相符合的目的蛋白带，而沉淀中有少量的目的蛋白。

D、Western blotting检测

1)制备用于Western blot分析的SDS-PAGE凝胶，按照分子克隆上所讲述的标准方法进行方法

2)待电泳结束后，切下用于移的一半凝胶，用转移缓冲液TBST溶液清洗凝胶；另一半凝胶进行蛋白质染色、脱色。

3)剪取一张与聚丙烯酰胺凝胶大小相似的硝酸纤维素滤膜，剪2张大小与硝酸纤维素滤膜完全一样的3MM滤纸，用转移缓冲液浸润，将其中一张铺于电转移装置上，然后将SDS-PAGE凝胶铺于3MM滤纸上，用玻璃棒在凝胶上轻轻滚动，以防止中间夹有气泡；

4)将硝酸纤维素膜平铺于凝胶表面，用玻璃棒在硝酸纤维素膜上轻轻滚动，以防止中间夹有气泡；

5)将另一张3MM滤纸平铺于硝酸纤维素膜表面，用玻璃棒在滤纸上轻轻滚动，以防止中间夹有气泡，然后将滤纸/凝胶/膜/滤纸夹层放入电泳装置内，注意凝胶面朝向负极；按凝胶面积0.65mA/cm2的电流电转移90min。

6)转移结束后，用25ml TBS.缓冲液洗膜3-5次，每次5min，并不时轻轻地摇动；

7)将硝酸纤维素膜浸入20ml封闭缓冲液中，室温轻轻振荡封闭1小时。

8)将膜浸入20ml用一抗稀释缓冲液稀释的第一抗体中，室温下轻轻振荡反应1小时。

9)用25ml TBST缓冲液洗膜3-5次，每次5min，并不时轻轻地振荡。

10)将硝酸纤维素膜浸入20ml用封闭缓冲液稀释好的辣根过氧化酶标记的第二抗体溶液中，室温下轻轻振荡反应1小时。

11)用50ml TBST缓冲液洗膜3-5次，每次5min，并不时轻轻地振荡。

12)用DAB试剂盒染色。

表达的产物经Western blotting检测，有明显的杂交带，大小约32KD，如图9所示，进一步说明vp28在大肠杆菌中得到了表达。

实施例4：

抗WSSV抗体的制备

(1)取纯化的WSSV VP19、VP28各200μg，混合均匀，免疫新西兰大白兔，每次免疫间隔时间为15天。第三次免疫后第十天取血，全血放置在37℃静置1h，然后在4℃放置过夜，以4000g，4℃离心10min，取上清冻存于-70℃，即为抗WSSV抗血清。

(2)将抗WSSV抗血清用Protein A亲合层析柱纯化，得到抗WSSV抗体，纯化步骤如下：

1)将3mL抗血清用Protein A亲和层析柱的Binding buffer(50mmol/L Tris buffer，pH 7.0)稀释到30mL，以10000g，4℃离心15min，收集上清并用0.45μm滤膜过滤。

2)  将处理好的样品连续两次，以1mL/5min的速度流过预先用Binding buffer平衡好的Protein A Sepharose^TM CL-4B柱(1×10cm玻璃柱，内装2mL Protein A Sepharose填料)。

3)  以0.5mL/min的流速用Binding buffer冲洗柱子直到基线稳定。

4)  以0.25mL/min的流速用5 CV的Elution buffer(0.1mol/L甘氨酸，pH 3.0)洗脱IgGs，分部收集洗脱液，为保持抗体IgGs的活性，收集的同时在每mL洗脱液中加入200μL Neutralizing buffer(1mol/L Tris-HCl，pH 9.0)并立即混匀。

5)用SDS-PAGE分析抗体IgGs的纯化效果。

实施例5

载有金标抗体的结合垫的制备

(1)胶体金的制备：

取0.01％的氯金酸溶液100mL，加热至沸腾，搅动下准确加入1％的柠檬酸三钠水溶液2.0mL，金黄色的氯金酸水溶液在2分钟内变为橙色，继续煮沸15分钟，冷却后以去离子水恢复到原体积，用0.1mol/L K₂CO₃调pH为9.0。制备的胶体金经一次性除菌滤器过滤，装入洁净玻璃瓶中4℃保存备用。

(2)金标抗体的制备：

将1μL抗WSSV抗体加入1mL胶体金溶液中，混均，加入10％氯化钠溶液100μL，观察颜色变化，如果变蓝，则说明抗体不足，然后逐渐增加抗体量，直至胶体金颜色不变为准，在此基础上，将此抗体量增加20-30％，此时为1mL胶体金标记的最适抗体量。将纯化抗WSSV抗体1.25mg用10mmol/L Tris-Cl(pH 9.0)稀释至5mL，搅拌下将其加入100mL(1)步制备的胶体金溶液中，10分钟后加入10％牛血清白蛋白至终浓度为1％；结合物在15,000g，4℃离心1小时，弃上清，沉淀用10mmol/L Tris-Cl(pH 9.0)重悬、洗涤、离心后(重复2次)，用10mL含有1％牛血清白蛋白、0.02％叠氮钠的50mmol/LPB(Na₂HPO₄·12H₂O 1.386g，NaH₂PO₄·2H₂O 0.176g，溶于100mL去离子水，pH 7.4)重悬，即为金标抗体，4℃保存。

(3)结合垫的制备

将玻璃纤维膜完全浸没于上述步骤(2)制成的金标抗体溶液中，30分钟后取出后干燥，即为载有金标抗体的结合垫，4℃保存备用。

实施例6

硝酸纤维素膜的检测层的制备

在硝酸纤维素膜上用纯化后的抗WSSV抗体(1.25mg/mL)划线，做为检测线；相距5mm用羊抗兔IgG(2mg/mL)划线，做为质控线。检测线5近样品垫2，质控线6近吸收垫7，室温<20～25℃>干燥后于37℃用1％酶解干酪素封闭1小时，室温<20～25℃>干燥后，4℃保存备用。

实施例7

对虾白斑综合症病毒检测试纸条应用

本发明所用仪器及试剂：

氯金酸(购自Sigma公司)；羊抗兔IgG(购自Sigma公司)；牛血清白蛋白(购自Amresco公司)；酶解干酪素(购自Sigma公司)；玻璃纤维素膜、硝酸纤维素膜(购自Millipore公司)；羊抗兔IgG(购自Pierce公司)。

使用本发明的对虾白斑综合症病毒现场检测试纸条，检测对虾白斑综合症病毒的步骤：首先，快速地从被检虾的虾鳃中提取对虾白斑综合症病毒，制备检测样品。所述的检测样品的制备过程是：1)对于成虾，取1-2只虾将虾腮取出，加入适量纯净水充分捣碎，制成检测样品；2)对于幼虾，取2-3只整虾，加入适量纯净水充分捣碎，制成检测样品；3)对于虾苗，取30只左右整虾，加入适量纯净水充分捣碎，制成检测样品。然后，将试纸条的样品垫2浸入检测样品中，液面不要超过MAX线，5分钟内观察结果。

阳性结果：检验层4上下呈现两条红色的检测线5和质控线6，表示有WSSV感染；

阴性结果：检验层4上端部呈现一条红色质控线6，表示无WSSV感染或其WSSV含极低；

检测结果无效：加样5分钟内，检验层4上端质检线6处无红线出现，表示该试纸失效，检测结果无效。(见图2)

实施例8

对虾白斑综合症病毒检测试纸的特异性与稳定性

本发明的对虾白斑综合症病毒现场检测试纸的特异性与稳定性测定如下：

(1)特异性实验：

选择二组样品，第一组为：ddH₂O、  50mmol/L PB(pH7.4)及健康虾腮做为阴性样本；第二组为：纯化的VP19+VP28、WSSV及患对虾白斑综合症的虾腮做为阳性样本，分别用本发明的试剂条测试。结果显示，每一组所有样品均为阴性；每二组所有样品均为阳性。

(2)稳定性实验：将本发明的试剂条分别置4℃和室温(20-25℃)30天，取出后分别再用特异性测试的二组样品进行检测。测试的结果与特异性测试结果一致。

Claims (1)

1.一种检测对虾白斑综合病毒试纸条的制备方法，其特征在于：

A、将WSSV VP19、VP28蛋白1∶1混合，免疫新西兰大白兔，纯化后得抗WSSV多克隆抗体；

B、用柠檬酸三钠还原法制备20-40nm的胶体金颗粒，将抗WSSV抗体加入到胶体金溶液中，加入牛血清白蛋白，离心后的沉淀用含有牛血清白蛋白、叠氮钠的磷酸盐缓冲液悬起，制成抗WSSV金标抗体溶液；

D、在硝酸纤维素膜上用纯化后的抗WSSV抗体划线，为检测线；相距5mm用羊抗兔IgG划线，为质控线，室温干燥后于用1％酶解干酪素封闭，干燥后得到WSSV抗体固相硝酸纤维素膜检测层；

制备得到的检测对虾白斑综合病毒试纸条在PVC衬垫(1)的两端分别设有样品垫(2)和吸收垫(7)，在PVC衬垫(1)上设有硝酸纤维膜检测层(4)，在硝酸纤维膜检测层(4)与样品垫(2)交界处设有金标抗体的结合垫(3)，在结合垫(3)一端设置在样品垫(2)下，另一端设置在检测层(4)上，在检测层(4)上设有检测线(5)和质控线(6)，在检测线(5)和质控线(6)处分别包被有抗WSSV抗体和羊抗兔IgG。

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