一种酶法去除普鲁兰多糖提取获得β-聚苹果酸的方法
技术领域
本发明的技术方案属于生物法合成生物可降解高分子材料研究领域。
背景技术
聚苹果酸(聚羟基丁二酸酯)[Poly(malic-acid)或Poly malate,简称为PMLA]是以苹果酸为唯一单体的均聚高分子聚合物。尽管早在20世纪60年代晚期就已发现聚苹果酸,但一直到20年后当它从几种生物中分离出来时才受到了重视。1969年Shimada等发现一种由苹果酸组成的高分子化合物能抑制圆弧青霉(Penicillium cyclopium)的酸性蛋白酶,当时酯键中的羧基位置还没有确定,沉寂几年后,聚苹果酸在黏菌(physarum polycephalum)中被重新发现。而后几年聚苹果酸的发展几乎处于停滞期,1989年Fischer等在黏菌(physarumpolycephalum)中再次发现聚苹果酸它是DNA聚合酶α的抑制剂。迄今为止,以Shimada,Fischer,Holler et al,Lee等为代表的国外学者对PMLA的性能,合成和应用做了较深入地研究,β型聚苹果酸已有商业产品,我国在这方面研究的相对较少,直到近几年才又学者对聚苹果酸的合成与性能做了基础性的研究。因此加强聚苹果酸的研究,构建可降解生物高分子的一个研究的平台,具有重要的理论价值和应用价值。
聚苹果酸属于聚酯类聚合物,是一种新型的完全生物降解性高分子材料。生物降解性材料是指通过自然界微生物(细菌、真菌等)作用而发生降解的高分子物质。该种材料降解的产物无毒无害,不会对环境产生二次污染,近年来这种高分子材料的开发研究得到了飞速发展。PMLA主要有三种结构:即α型、β型、γ型PMLA,唯一存在于人体内的只有β型PMLA。
作为一种水溶性脂肪族聚酯,PMLA具有高度的水溶性、生物相容性、生物可降解性、生物可吸收性、无免疫原性和可化学衍生性,PMLA可在水溶液中自发或由酶促降解为小分子苹果酸,而苹果酸单体可被人体吸收并无任何毒副作用。聚苹果酸分解或燃烧后,最终产物是二氧化碳和水,可被植物吸收,对环境无毒无害。PMLA的羧基上可连接很多其它的基团,正是由于PMLA的这种特殊结构,且PMLA及其降解产物的无毒性及无抗原性,所以它具有很强的药物方面的用途,可以作为药物载体用于心血管及脑肿瘤方面的研究,还可作为微胶囊材料、生物医学材料如手术缝合线及伤口、烧伤治疗的绷带等生物医学材料,直接用于人体,由于聚苹果酸的无毒性和可吸水性,还可用于化妆产品及食品包装等材料。
普鲁兰多糖是出芽短梗霉发酵生产聚苹果酸过程中的副产物,它的存在会导致发酵液粘度增大,更为重要的是普鲁兰多糖的存在会严重影响聚苹果酸的分离提取。
普鲁兰酶(Pullulanase,EC 3.2.1.41)是一种能够专一性切开支链淀粉分支点中的α-1,6-糖苷键,从而剪下整个侧枝,形成直链淀粉的脱支酶。普鲁兰酶在以淀粉为原料的食品加工业中有着重要的用途,是由于其能将最小单位的支链分解,最大限度的利用淀粉原料。
聚苹果酸的合成方法主要有化学法和微生物发酵法两种。化学合成法又分为直接聚合和开环聚合(内酯开环和交酯开环)两种。直接聚合法是在催化剂的条件下以L-苹果酸为单体直接脱水酯化可得。虽然此法直接简单,产物分离提纯容易,产率较高,只是聚苹果酸分子量低,反应温度较高,多为γ-PMLA,实际应用价值较低,而且催化剂有毒;开环聚合法合成聚苹果酸分子量较直接聚合高,产物以β-聚苹果酸为主,反应温度较低,但该合成过程步骤较多产率低,中间产物分离提纯繁琐,产率低;生物途径制备的聚苹果酸主要是通过微生物发酵合成,目前研究发现粘菌(physarum polycephalum)和出芽短梗霉(Aureobasidium Pullulan)具有较高的聚苹果酸合成能力。生物合成PMLA具有突出的优点,通过微生物发酵,产物均为β型、产物分子量高、生产条件温和、生成产物纯度较高,微生物发酵得到的PMLA分子量可达200~760kDa,而化学法合成的分子量最多为174kDa,但微生物发酵生产PMLA产量不高,分离纯化困难,特别是在采用出芽短梗霉(Aureobasidium Pullulan)发酵生产聚苹果酸过程中,发酵副产物普鲁兰多糖的去除一直是PMLA提取中不容忽视的重要问题,也是造成PMLA生产成本巨大的重要原因。因此,副产物普鲁兰多糖的去除一直是困扰出芽短梗霉(Aureobasidium Pullulan)发酵制备PMLA的主要问题之一,需高度重视。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是:提供一种利用出芽短梗霉(AureobasidiumPullulan)发酵生产β-聚苹果酸过程中有效降解去除副产物普鲁兰多糖的方法,实现β-聚苹果酸的快速、高效提取和纯化,提高β-聚苹果酸产率,减少生产成本。
本发明解决该技术问题所采用的技术方案是:
第一步培养基的配制
(1)菌种活化培养基:土豆葡萄糖琼脂培养基(PDA):土豆200g/L,葡萄糖20g/L,琼脂20g/L,pH 4.0~4.5,121℃高压蒸汽灭菌15min;
(2)种子培养基:葡萄糖8%,丁二酸铵0.3%,丁二酸0.2%,K2CO3 0.04%,KH2PO4 0.01%,MgSO4·7H2O 0.01%,ZnSO4·7H2O 5×10-4%,玉米浸出液0.05%,CaCO3 2%(单独灭菌),pH 4.5,121℃高压蒸汽灭菌15min;
(3)发酵培养基:葡萄糖12%,丁二酸铵0.3%,丁二酸0.2%,K2CO3 0.04%,KH2PO4 0.01%,MgSO4·7H2O 0.01%,ZnSO4·7H2O 5×10-4%,玉米浸出液0.05%,CaCO3 3%(单独灭菌),pH 4.5,121℃高压蒸汽灭菌15min;
第二步菌种活化
将斜面菌种——出芽短梗霉(Aureobasidium Pullulan)转接PDA培养基,25℃活化培养3~5d;
第三步种子培养将第二步活化的斜面菌种接种于装有100mL第一步制得的种子培养基的500mL三角瓶中,在24~30℃,120~180r/m下培养48~90h;
第四步发酵培养
将第三步制得的种子培养液以8~10%接种量接种于发酵培养基中,在24~30℃,200r/m下培养7~12d;
第五步分离提取
(1)普鲁兰多糖的降解:在第四步发酵结束后取发酵液,离心或过滤除去菌体,发酵过滤液(上清液)pH调节至pH 5~pH 7,添加普鲁兰酶6~11plu/mL,在30℃~60℃下,缓慢搅拌,反应60min~90min;
(2)β-聚苹果酸的初步提取:将第五步(1)中的发酵液冷却至室温,缓慢搅拌,加入无水甲醇使上清液中甲醇终浓度为40%~60%(v/v),混合液于室温下缓慢搅拌放置过夜,获得的沉淀为β-聚苹果酸,将离心获得的沉淀,按1∶10(m∶v)溶于蒸馏水中,再次离心除去小分子不溶物,上清液经冷冻干燥,得白色粉末状β-聚苹果酸。
本发明与现有技术相比,有益效果是:第一,使用该制备方法以出芽短梗霉菌种进行发酵可获得高度纯化的β-聚苹果酸;第二,使用该方法可有效去除副产物普鲁兰多糖,提高β-聚苹果酸的提取收率;第三,由于副产物普鲁兰多糖的一步去除,既提高了生产效率,降低β-聚苹果酸的生产成本,又避免了提取操作过程中由于使用大量有机溶剂而造成的环境问题,减少环境污染。
具体实施方式
实施例一
按如下步骤去除发酵液中的副产物普鲁兰制备β-聚苹果酸:
第一步培养基的配制
(1)菌种活化培养基:土豆葡萄糖琼脂培养基(PDA):土豆200g/L,葡萄糖20g/L,琼脂20g/L,pH 4.0~4.5,121℃高压蒸汽灭菌15min;
(2)种子培养基:葡萄糖8%,丁二酸铵0.3%,丁二酸0.2%,K2CO3 0.04%,KH2PO4 0.01%,MgSO4·7H2O 0.01%,ZnSO4·7H2O 5×10-4%,玉米浸出液0.05%,CaCO3 2%(单独灭菌),pH 4.5,121℃高压蒸汽灭菌15min;
(3)发酵培养基:葡萄糖12%,丁二酸铵0.3%,丁二酸0.2%,K2CO3 0.04%,KH2PO4 0.01%,MgSO4·7H2O 0.01%,ZnSO4·7H2O 5×10-4%,玉米浸出液0.05%,CaCO3 3%(单独灭菌),pH 4.5,121℃高压蒸汽灭菌15min;
第二步菌种活化
将斜面菌种——出芽短梗霉(Aureobasidium Pullulan)转接PDA培养基,25℃活化培养3d~5d;
第三步种子培养将第二步活化的斜面菌种接种于装有100mL第一步制得的种子培养基的500mL三角瓶中,在24~30℃,120~180r/m下培养48h~90h;
第四步发酵培养
将第三步制得的种子培养液以8~10%接种量接种于发酵培养基中,在24~30℃,200r/m下培养7d~12d;
第五步聚苹果酸分离提取
(1)普鲁兰多糖的降解:在第四步发酵结束后取发酵液,离心或过滤除去菌体,发酵过滤液(上清液)pH调节至pH 5,添加6plu/mL的普鲁兰酶,在60℃下,缓慢搅拌,反应90min以降解去除普鲁兰多糖;
(2)β-聚苹果酸的提取:将第五步(1)中得到的液体冷却至室温,缓慢搅拌,逐步加入无水甲醇使具终浓度为40%(v/v),混合液于室温下缓慢搅拌放置过夜。5000r/m离心10min得β-聚苹果酸沉淀,将沉淀按1∶10(m∶v)溶于蒸馏水中,再次经5000r/m离心10min除去小分子不溶物,上清液冷冻干燥,得白色粉末状β-聚苹果酸;
实施例二
在本实施例中,按照实施例一的方法在第五步发酵过滤液(上清液)pH调至pH6,添加8plu/mL的普鲁兰酶,在40℃下,缓慢搅拌,反应60min,以降解普鲁兰多糖;将该液体缓慢搅拌,逐滴加入无水甲醇至其终浓度达到50%;其它同实施例1。
实施例三
在本实施例中,按照实施例一的方法在第五步发酵过滤液(上清液)pH调至pH7,添加11plu/mL的普鲁兰酶,在30℃下,缓慢搅拌,反应90min,降解普鲁兰多糖;将该液体缓慢搅拌,逐滴加入无水甲醇至其终浓度达到60%;其它同实施例1。