CN102876750B - 一种提取银耳多糖和银耳蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种银耳多糖和银耳蛋白的提取方法，包括：（1）银耳菌的活化培养和发酵培养；（2）超滤膜浓缩和破碎银耳孢子；（3）聚乙二醇/无机盐双水相体系的配制；（4）聚乙二醇/无机盐双水相体系提取；（5）冷冻干燥制备银耳多糖；（6）聚乙二醇/无机盐双水相体系二次提取，超滤膜过滤，冷冻干燥制备银耳蛋白。本发明可以实现银耳孢子生产和多糖提取的连续化、规模化，便于银耳多糖的工业化生产；得到的产物中既有银耳孢子的胞内多糖，又有银耳孢子液体发酵产生的胞外多糖，极大提高了银耳多糖的产率；并且使银耳多糖和蛋白质得到同时分离，避免了现有sevag法去除蛋白质的复杂操作和机溶剂污染的弊端，提高了多糖的纯度。
Description
技术领域
本发明涉及一种银耳多糖和银耳蛋白的提取方法，特别涉及采用双水相萃取体系提取银耳多糖和银耳蛋白的方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
银耳（Tremella fuciformis Berk）是一种食药两用菌，含有丰富的多糖和蛋白质等物质。银耳多糖是银耳的主要活性物质，包括酸性杂多糖、中性杂多糖、胞壁多糖、胞外多糖及酸性低聚糖五类。银耳多糖具有提高人体免疫力、抗肿瘤、抗衰老、降血糖和降血脂等多种生理功能；银耳蛋白质含有17种氨基酸，能提供人体所必需的氨基酸中的3/4。银耳多糖以其丰富的原料来源、独特的生物学功能和良好的食用安全性，近年来在天然功能性食品添加剂、医药保健品、日用化妆品等领域越来越来受到重视，具有广泛的开发应用前景。
银耳多糖可以从银耳子实体中提取获得，也可通过银耳分生孢子发酵生产。银耳子实体的生产存在着培养周期长、产量低、不易规模化生产等缺点，而银耳孢子液体发酵法具有原料来源广泛、产生的活性物质多、发酵周期短、生产成本低、易于实现工业化的特点，因而发酵法生产银耳多糖正逐步取代银耳子实体提取法。
从银耳子实体或孢子中提取银耳多糖的方法主要有热水浸取法、溶剂提取法、酶溶提取法等，这些方法是通过破坏银耳细胞而使胞内多糖溶出，得到的粗多糖中含有大量的蛋白质，为提高多糖纯度，还需要再采用sevag法（氯仿和正丁醇沉淀法）除去多糖中的蛋白质。以上的提取方法或者存在提取效率较低、有溶剂残留，或者存在设备要求高、能耗高、成本高、多糖纯度低、多糖易变性失活等问题。
双水相萃取技术是近年来发展起来的生物分离技术，是分离纯化生物活性物质的有效方法。双水相***是指两种不同种类的聚合物水溶液混合或者一种聚合物水溶液和一种盐溶液混合后，当两者浓度达到一定值时，混合液静置后分层产生的两液相***。双水相***萃取的原理是基于生物物质在体系中的选择性分配。双水相萃取具有操作条件温和、处理量大、分离步骤少、能耗低，无有机溶剂残留，易于工业化操作等优点。目前在生化分离工程中常用的双水相体系是聚合物/聚合物体系以及聚合物/无机盐体系，最常用的体系为聚乙二醇（PEG）/葡聚糖（Dex）体系以及聚乙二醇（PEG）/无机盐体系。
如中国专利文献CN101693735A（申请号200910309154.8），公开了一种双水相萃取分离蛋白质和酶的方法，其特点在于将多元醇与无机盐按比例直接加入到蛋白质或酶溶液中，搅拌均匀，室温下静置，形成两相，蛋白质或酶主要分配到上相，且保留较高的活性，从而达到有效的分离提取目的。
采用双水相体系同步提取银耳多糖和银耳蛋白质的方法尚未见报道。
发明内容
针对目前银耳多糖和银耳蛋白提取方法的不足，本发明的目的在于提供一种工艺简单、多糖收率高、成本低，便于规模化生产的提取银耳多糖和银耳蛋白的方法。
本发明的方法是利用双水相体系提取银耳多糖和银耳蛋白，从而降低生产成本，达到较好的经济效果。
为实现上述目的，本发明采取的具体技术方案如下：
一种利用双水相体系提取银耳多糖和银耳蛋白的方法，包括以下步骤：
（1）将银耳菌接种到斜面培养基上，在24～26℃下活化培养6~8d，然后将银耳孢子接入到液体种子培养基中，在150~200r/min、24～26℃下培养3~5d，制得液体种子；将液体种子按5～10wt%的接种量接入液体发酵培养基中，在温度24～26℃、150～200r/min条件下，培养4～6天，制得发酵液；
（2）将步骤（1）制得的发酵液采用截留分子量为3000～6000Dal的超滤膜浓缩，截留液为含有银耳孢子和胞外多糖的浓缩液，破碎银耳孢子，得到银耳孢子破碎液；
（3）在20~30℃下，配制无机盐水溶液，向该无机盐水溶液中添加聚乙二醇，在总体系中无机盐质量百分比浓度为10～30%，聚乙二醇在总体系中的质量百分比浓度为10%～30%，混合均匀，制得聚乙二醇/无机盐双水相体系；
（4）向步骤（2）制得的银耳孢子破碎液中按体积比1:（1～5）加入步骤（3）制得的聚乙二醇/无机盐双水相体系，搅拌10～30min混匀后，静置5～15min分相，制得无机盐下相和聚乙二醇上相；
（5）将步骤（4）制得的无机盐下相离心分离，取上清液，采用截留分子量为3000～6000Dal的超滤膜浓缩，截留液经冷冻干燥后，制得银耳多糖；
（6）向步骤（4）制得的聚乙二醇上相中加入水和无机盐，使无机盐在总体系中的质量浓度为10～30%，搅拌10～30min混匀后，静置10～20min分相，制得无机盐下相和聚乙二醇上相，将制得的无机盐下相，采用截留分子量为6000～10000Dal的超滤膜过滤，收集截留液，冷冻干燥制得银耳蛋白。
根据本发明优选的，所述步骤（1）中通过液体发酵产生银耳多糖的银耳（Tremellafuciformis）菌种编号为CICC50179、CICC50180，以上菌株均购自中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC）；银耳（Tremella fuciformis）菌种编号为ACCC50546、ACCC51351，以上菌株均购自中国农业微生物菌种保藏管理中心（ACCC）；银耳（Tremella fuciformis）菌种编号为CGMCC5.466、CGMCC5.526，以上菌株均购自中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC）。
根据本发明优选的，所述步骤（1）中的斜面培养基组分如下：葡萄糖20g，蛋白胨10g，KH2PO43g，MgSO41.5g，维生素B10.005g，琼脂20g，20%马铃薯煮汁1000mL，pH自然。
根据本发明优选的，所述步骤（1）中的液体种子培养基组分如下：葡萄糖20g，蛋白胨10g，KH2PO41.5g，MgSO40.75g，20%马铃薯煮汁1000mL，pH自然。
上述20%马铃薯煮汁是将200g马铃薯切块后放入1000mL水中煮沸30min后制得。
根据本发明优选的，所述步骤（1）中的发酵培养基组分如下：可溶性淀粉40g，葡萄糖20g，蛋白胨5g，KH2PO41g，MgSO40.75g，琼脂5g，水1000mL，pH自然。
根据本发明优选的，所述步骤（2）中的超滤浓缩液中孢子的质量百分比浓度为7～10wt%。
根据本发明优选的，所述步骤（2）中的孢子破碎采用珠磨机破碎，转速为2400～5000r/min，时间1~5min，操作温度5~40℃。
根据本发明优选的，所述步骤（2）、（5）、（6）中的超滤膜工作压力为0.1～0.5MPa，温度为25℃。
根据本发明优选的，所述步骤（3）、（6）中的无机盐选自硫酸铵、硫酸钠、磷酸氢二钠、磷酸钾或氯化钠之一；
根据本发明优选的，所述步骤（3）、（6）中的双水相体系中的聚乙二醇分子量为1000。
有益效果:
1、本发明的提取方法与发酵方法相结合，相比于从银耳子实体提取多糖的方法，可以实现银耳孢子生产和多糖提取的连续化、规模化，便于银耳多糖的工业化生产；
2、本发明的提取方法得到的产物中既有银耳孢子的胞内多糖，又有银耳孢子液体发酵产生的胞外多糖，极大提高了银耳多糖的产率；
3、本发明的提取方法使银耳多糖和蛋白质得到同时分离，避免了现有sevag法去除蛋白质的复杂操作和机溶剂污染的弊端，提高了多糖的纯度，制得了具有生理活性作用的银耳多糖；
4、本发明的提取方法工艺简单，易于工程放大，具有生产成本低的优势。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案进行具体描述或作进一步说明，目的在于更好地理解本发明的方法，但本发明的保护范围不限于以下的实施例。
本发明中银耳多糖含量的测定采用苯酚-硫酸法，步骤如下：
a、标准曲线的制作：准确称取标准葡萄糖（购自天津市凯通化学试剂有限公司）20mg于500mL容量瓶中，加水溶解并定容至刻度，分别吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6及1.8mL，各以蒸馏水补至2.0mL，然后加入6wt%苯酚1.0mL及浓硫酸（浓度98wt%）5.0mL，摇匀冷却，室温放置20min，于490nm波长下测定吸光度值，以2.0mL蒸馏水按同样显色操作为空白对照，以葡萄糖浓度（C）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标，制作标准曲线。标准曲线方程为：A=16.356C-0.0164，R2=0.9982，其中：A为吸光度值，C为葡萄糖浓度（mg/mL），R2为相关系数；
b、多糖含量测定：用蒸馏水将制得的银耳多糖配成浓度为1.0mg/mL的溶液，取0.2mL按步骤a的方法测定490nm的吸光度值，根据标准曲线计算多糖的质量；
c、银耳多糖含量（%）=（多糖的质量/银耳多糖的质量）×100%。
本发明中银耳蛋白含量的测定采用凯氏定氮法检测。
实施例中所述20%马铃薯煮汁是将200g马铃薯切块后放入1000mL水中煮沸30min后制得。
实施例1
本实施例所用菌种为银耳菌（Tremella fuciformis）CICC50180，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。
一种利用双水相体系提取银耳多糖和银耳蛋白的方法，包括以下步骤：
（1）将银耳菌接种到斜面培养基上，在25℃下活化培养7天，然后用1wt%生理盐水洗下斜面培养基上的孢子及菌丝体，并接入到10mL液体种子培养基中，在150r/min、25℃下培养4d，制得液体种子；将液体种子按10wt%的接种量接入液体发酵培养基中，在温度25℃、180r/min下，培养5天，制得发酵液；
（2）将步骤（1）制得的发酵液在0.2MPa条件下，通过截留分子量为4000Dal的超滤膜浓缩，收集截留液，截留液为含有银耳孢子质量浓度9wt%和胞外多糖的浓缩液，采用德国公司生产的LM-20型珠磨机，在4200r/min条件下珠磨3min破碎孢子，得含有银耳胞内、胞外多糖和银耳蛋白质的银耳孢子破碎液；
（3）在25℃下，配制硫酸铵水溶液100mL，向该溶液中添加聚乙二醇，使硫酸铵在总体系中的质量百分比浓度为19%，聚乙二醇在总体系中的质量百分比浓度为21%，混合均匀，制得聚乙二醇/硫酸铵双水相体系；
（4）向步骤（2）制得的银耳孢子破碎液中按体积比1:1加入步骤（3）制得的聚乙二醇/硫酸铵双水相体系，搅拌20min混匀后，静置10min分相，制得硫酸铵下相和聚乙二醇上相；聚乙二醇上相含有银耳蛋白质，硫酸铵下相含有银耳多糖；
（5）将步骤（4）制得的硫酸铵下相，在4000r/min的条件下离心分离10min，取上清液，在0.2MPa压力下，通过截留分子量为4000Dal的超滤膜浓缩，截留液经冷冻干燥后，制得银耳多糖3.42g，经测定多糖含量为70.31wt%；
（6）向步骤（4）制得的聚乙二醇上相溶液中加入等体积的水，再加入硫酸铵，使硫酸铵在总体系中的质量浓度为19%，搅拌20min混匀后，静置15min分相，制得硫酸铵下相和聚乙二醇上相。将制得的硫酸铵下相溶液，在0.2MPa压力下，通过截留分子量为8000Dal的超滤膜浓缩，截留液经冷冻干燥后，制得银耳蛋白0.32g。
所述步骤（1）中的斜面培养基组分如下：葡萄糖20g，蛋白胨10g，KH2PO43g，MgSO41.5g，维生素B10.005g，琼脂20g，20%马铃薯汁1000mL，pH自然。
所述步骤（1）中的液体种子培养基组分如下：葡萄糖20g，蛋白胨10g，KH2PO41.5g，MgSO40.75g，20%马铃薯汁1000mL，pH自然。
所述步骤（1）中的发酵培养基组分如下：可溶性淀粉40g，葡萄糖20g，蛋白胨5g，KH2PO41g，MgSO40.75g，琼脂5g，水1000mL，pH自然。
实施例2
如实施例1所述的利用双水相体系提取银耳多糖和蛋白质的方法，不同之处在于：
步骤（3）中，配制磷酸氢二钠水溶液100mL，向该溶液中添加聚乙二醇，使磷酸氢二钠在总体系中的质量百分比浓度为13%，聚乙二醇在总体系中的质量百分比浓度为27%，混合均匀，制得聚乙二醇/磷酸氢二钠双水相体系。
得到银耳多糖产品3.25g，经测定多糖含量为69.24%；得到银耳蛋白0.37g。
实施例3
如实施例1所述的利用双水相体系提取银耳多糖和蛋白质的方法，不同之处在于：
步骤（3）中，分别于100mL水中加入氯化钠和聚乙二醇，建立聚乙二醇/氯化钠双水相体系，使聚乙二醇在总体系中的质量浓度为13%，氯化钠在总体系中的质量浓度为27%；
步骤（4）中，向制得的银耳孢子破碎液中按体积比1:1.5加入制得的聚乙二醇/氯化钠双水相体系中，搅拌萃取。
得到银耳多糖产品3.68g，经测定多糖含量为74.67%；得到银耳蛋白质产品0.29g。
实施例4
本实施例所用菌种为银耳菌ACCC50546，购自中国农业微生物菌种保藏管理中心。
如实施例1所述的利用双水相体系提取银耳多糖和蛋白质的方法，不同之处在于：
步骤（3）中，分别于100mL水中加入磷酸钾和聚乙二醇，建立聚乙二醇/磷酸钾双水相体系，使聚乙二醇在总体系中的质量浓度为16%，磷酸钾在总体系中的质量浓度为23%；
步骤（4）中，向制得的银耳孢子破碎液中按体积比1:2加入制得的聚乙二醇/磷酸钾双水相体系中，搅拌萃取。
得到银耳多糖产品3.58g，经测定多糖含量为77.86%；得到银耳蛋白质产品0.31g。
实施例5
本实施例所用菌种为银耳菌CGMCC5.526，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。
如实施例1所述的利用双水相体系提取银耳多糖和蛋白质的方法，不同之处在于：
步骤（3）中，分别于100mL水中加入硫酸钠和聚乙二醇，建立聚乙二醇/硫酸钠双水相体系，使聚乙二醇在总体系中的质量浓度为23%，硫酸钠在总体系中的质量浓度为16%，混合均匀，制得聚乙二醇/硫酸钠双水相体系。
得到银耳多糖产品3.46g，经测定多糖含量为70.72%；得到银耳蛋白质产品0.34g。
Claims (7)
1.一种利用双水相体系提取银耳多糖和银耳蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将银耳菌接种到斜面培养基上，在24～26℃下活化培养6~8d，然后将银耳孢子接入到液体种子培养基中，在150~200r/min、24～26℃下培养3~5d，制得液体种子；将液体种子按5～10wt%的接种量接入液体发酵培养基中，在温度24～26℃、150～200r/min条件下，培养4～6天，制得发酵液；
（2）将步骤（1）制得的发酵液采用截留分子量为3000～6000Dal的超滤膜浓缩，截留液为含有银耳孢子和胞外多糖的浓缩液，破碎银耳孢子，得到银耳孢子破碎液；
（3）在25℃下，配制无机盐水溶液，向该无机盐水溶液中添加聚乙二醇，在总体系中无机盐质量百分比浓度为19%，聚乙二醇在总体系中的质量百分比浓度为21%，混合均匀，制得聚乙二醇/无机盐双水相体系；
（4）向步骤（2）制得的银耳孢子破碎液中按体积比1: 1加入步骤（3）制得的聚乙二醇/无机盐双水相体系，搅拌10～30min混匀后，静置5～15min分相，制得无机盐下相和聚乙二醇上相；
（5）将步骤（4）制得的无机盐下相离心分离，取上清液，采用截留分子量为3000～6000Dal的超滤膜浓缩，截留液经冷冻干燥后，制得银耳多糖；
（6）向步骤（4）制得的聚乙二醇上相中加入水和无机盐，使无机盐在总体系中的质量浓度为19%，搅拌10～30min混匀后，静置10～20min分相，制得无机盐下相和聚乙二醇上相，将制得的无机盐下相，采用截留分子量为6000～10000Dal的超滤膜过滤，收集截留液，冷冻干燥制得银耳蛋白；
所述无机盐为硫酸铵；所述步骤（3）、（6）中的双水相体系中的聚乙二醇分子量为1000。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中通过液体发酵产生银耳多糖的银耳菌菌种编号为CICC50179、CICC50180、ACCC50546、ACCC51351、CGMCC5.466或CGMCC5.526。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中的斜面培养基组分如下：葡萄糖20g，蛋白胨10g，KH2PO43g，MgSO41.5g，维生素B10.005g，琼脂20g，20%马铃薯煮汁1000mL，pH自然，所述20%马铃薯煮汁是将200g马铃薯切块后放入1000mL水中煮沸30min后制得。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中的液体种子培养基组分如下：葡萄糖20g，蛋白胨10g，KH2PO41.5g，MgSO40.75g，20%马铃薯煮汁1000mL，pH自然，所述20%马铃薯煮汁是将200g马铃薯切块后放入1000mL水中煮沸30min后制得。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中的超滤浓缩液中孢子的质量百分比浓度为7～10wt%。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中的孢子破碎采用珠磨机破碎，转速为2400～5000r/min，时间1~5min，操作温度5~40℃。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）、（5）、（6）中的超滤膜工作压力为0.1～0.5MPa，温度为25℃。
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Granted publication date: 20140507 Termination date: 20161010 |