CN100552035C

CN100552035C - 一种利用三孢布拉氏霉菌发酵制备番茄红素的方法

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Publication number: CN100552035C
Application number: CNB2005100909960A
Authority: CN
Inventors: 袁其朋; 徐芳; 朱艳
Original assignee: Beijing University of Chemical Technology
Current assignee: Beijing University of Chemical Technology
Priority date: 2005-08-24
Filing date: 2005-08-24
Publication date: 2009-10-21
Anticipated expiration: 2025-08-24
Also published as: CN1920046A

Abstract

本发明涉及一种利用三孢布拉氏霉菌发酵制备番茄红素的方法。通过在发酵培养基中添加适宜的氧载体，提供一种氧载体发酵体系，在没有额外能源消耗的条件下，提高培养基中的溶氧浓度，从而提高细胞的生物量和细胞中番茄红素的含量，大幅度提高番茄红素的产率。

Description

一种利用三孢布拉氏霉菌发酵制备番茄红素的方法

技术领域：

本发明涉及一种利用三孢布拉氏霉菌发酵制备番茄红素的方法。属于食品、医药、化工领域。

背景技术：

番茄红素(lycopene)是一种脂溶性类胡萝卜素，为许多类胡萝卜素生物合成的中间体。与β-胡萝卜素相比，番茄红素虽然不是维生素A的前体，但对单线态氧、自由基的消除能力以及抗氧化作用均优于β-胡萝卜素，具有防癌、抗癌、防治心血管病等一系列重要的生理功能。

番茄红素是由11个共扼及2个非共扼碳-碳双键组成的直链型碳氢化合物，具有易氧化、易异构化等特点，因而提取比较困难。目前，常用的提取方法有：有机溶剂提取法、超临界萃取法、皂化法，其检测法主要有分光光度法、纸层析和高效液相色谱法。

番茄红素制剂得自番茄(EP 608027)，或通过一些毛霉属真菌发酵制得(GB 1008469，US 3097146，US 3369974和JP 73016189)。三孢布拉氏霉菌(Blakeslea trispora)是最常用的β-胡萝卜素高产菌株。根据Blakeslea trispora的代谢途径，若在发酵过程中添加合适的阻断剂，阻断番茄红素到β-胡萝卜素的环化途径，就可以积累大量的番茄红素(见GB 1008469，US 3097146，JP09313167，US 3369974；Gavrilov AS.Kiseleva AI.Matushikina SA.1996.Appl.Biochem.Microbio.32：492-494)。

在使用Blakeslea trispora生产番茄红素的方法中，由于Blakeslea trispora属于高度嗜氧嗜粘度的微生物，所使用的培养基粘度大、固型物含量高，同时还含有5％的植物油(为代谢提供双键，致使发酵***的溶氧速率较低)；生长过程中容易纠结成团，导致对数生长期溶氧量远远不够，因此供氧问题是制约三孢布拉氏霉菌发酵过程中生物反应和生命过程的重要因素(Jeong JC.Lee IY.Kim SW.Park YH.1999.Biotechnol.Lett.21：683-686；Kim SW.SeoWr.Park YH.1997.J.Ferment.Bioeng.84：330-332)。

对大多数发酵来说，氧的不足会造成代谢异常、生物量和目标代谢产物产量降低；而且由于氧在水溶液中的溶解度很低(其饱和度不过7mg/L)，发酵中氧的供给很容易成为主要矛盾，因此如何保障发酵中氧的供给，以满足生产菌株对氧的需求是提高发酵生产能力，降低成本的关键之一。目前，传统机械供氧方式如搅拌通气和摇床振荡等均存在如下问题：降低设备操作条件时使供氧出现严重限制，目标代谢产物的生成受到阻遏；提高操作条件时，高机械强度会增强剪切对细胞的伤害，使菌体受损不能正常代谢，另外操作费用也会大大增加；而改进生物反映器、搅拌桨和空气分布器的设计、以及使用富氧的空气则会使生产成本大幅度提高，因此有必要寻找新的强化供氧方式。

发明内容：

本发明的目的是提供一种利用三孢布拉氏霉菌发酵制备番茄红素的方法，通过向培养基中添加适宜的氧载体，提供一种氧载体发酵体系，在没有额外能源消耗的条件下，提高培养基中的溶氧浓度，从而提高Blakesleatrispora细胞的生物量和细胞中番茄红素的含量，以提高番茄红素的产率。

本发明采用三孢布拉氏霉菌(Blakeslea trispora)(+)(-)为微生物菌种，经种子培养、发酵培养、分离提纯得到番茄红素，其特征是在发酵培养过程中添加正己烷或正十二烷作为氧载体。

具体步骤和方法如下：

(1)种子培养：

将三孢布拉霉(+)(-)菌种分别接种到pH6.5的种子培养基，在24-30℃，150-200rpm摇床中培养36-40h。

其中种子培养基的组份和含量为：淀粉20-60g/L、玉米浆40-60g/L、KH₂PO₄0.5-2g/L、MgSO₄0.05-0.2g/L、维生素B₁0.005-0.02g/L。

(2)发酵培养：

将经种子培养得到的三孢布拉霉(+)(-)菌种培养液以体积比为1∶2-1∶4的比例混合得种子液，将种子液接种到添加有正己烷或正十二烷pH6.5的发酵培养基，在24-30℃，200-280rpm摇床培养4-7天后收获菌体。在发酵至46-50小时加入浓度为1.5g/L吡啶或叔胺类化合物阻断剂。

其中发酵培养基组份和含量为：淀粉30-60g/L、大豆饼粉10-40g/L、玉米浆20-30g/L、KH₂PO₄0.5-2g/L、MgSO₄0.05-0.2g/L、维生素B₁0.005-0.02g/L、3-50ml/L正己烷或正十二烷。正己烷或正十二烷在这里是一种与水不互溶、对微生物无毒、具有较高溶氧能力的氧载体；除此之外，还可以加入浓度为0.5-2g/L的span-20或tween-80等表面活性剂以降低培养基的粘度，促进细胞生长及番茄红素的合成。

(3)提取：

将步骤(2)得到的湿菌体在50℃真空干燥，将得到的干菌粉用石油醚萃取，萃取液减压浓缩后，再加入无水乙醇进行冷冻结晶，得到番茄红素。

上述种子培养基和发酵培养基的pH值采用现有技术常用的碱溶液调节，如氢氧化钠溶液等。

本发明利用三孢布拉氏霉菌发酵制备番茄红素的方法，由于选用了适当的氧载体，使发酵体系具有氧传递速度快，能耗低，气泡生成少，剪切力小等优点，可以显著提高三孢布拉霉细胞的生物量和细胞内番茄红素产量。如同时加入氧载体和表面活性剂，三孢布拉霉中番茄红素的产量更高，最高产量可达未加氧载体时的2.2倍。

具体实施方式：

实施例1：

(1)种子培养：

将三孢布拉霉ATCC 14271(+)、ATCC 14272(-)菌种接种到种子培养基，种子培养基组份和含量为：淀粉40g/L，玉米浆50g/L，KH₂PO₄1g/L，MgSO₄0.1g/L，VB₁0.01g/L，pH6.5。28℃，180rpm摇床培养40h，(+)(-)菌培养所得的培养液以1∶2混合得种子液。

(2)发酵培养：

将种子液按照10％接种量接种到发酵培养基中，发酵培养基组份和含量为：淀粉40g/L，大豆饼粉20g/L，玉米浆25g/L，KH₂PO₄1g/L，MgSO₄0.1g/L，VB₁0.01g/L，20ml/L经过滤灭菌的正己烷，pH6.5。发酵培养采用500ml三角瓶，装液量为100ml，于26℃，220rpm摇床培养4天后收获菌体。发酵至46小时加入1.5g吡啶或叔胺类化合物阻断剂。

(3)提取：

发酵液用纱布过滤得湿菌体，湿菌体放真空干燥箱内50℃真空干燥48h后，得干菌粉5.27g。干菌粉破碎，用石油醚提取(取5μl提取液，用高效液相色谱测番茄红素含量，得到番茄红素产量达到373.2mg L^-1，是未加氧载体的1.5倍(250.7mg L^-1))，萃取液减压浓缩后，加入无水乙醇进行冷冻结晶，得番茄红素。

实施例2

(1)种子培养：

将三孢布拉霉ATCC 14271(+)、ATCC 14272(-)菌种接种到种子培养基，种子培养基组份和含量为：淀粉500g/L，玉米浆40g/L，KH₂PO₄1.5g/L，MgSO₄0.2g/L，VB₁0.02g/L，pH6.5。26℃，200rpm摇床培养38h，(+)(-)菌培养所得的培养液以1∶2混合得种子液。

(2)发酵培养：

发酵培养基组份和含量为：淀粉40g/L，大豆饼粉20g/L，玉米浆25g/L，KH₂PO₄1g/L，MgSO₄0.1g/L，VB₁0.01g/L，15ml/L经过滤灭菌的正十二烷，于30℃，230rpm摇床培养6天后收获菌体。发酵至50小时加入1.5g吡啶或叔胺类化合物阻断剂，其它同实施例1。

(3)提取

发酵液用纱布过滤得湿菌体，湿菌体放真空干燥箱内50℃真空干燥48h后，得干菌粉5.91g。干菌粉破碎，用石油醚提取(取5μl提取液，用高效液相色谱测番茄红素含量，得到番茄红素产量达到433.1mg L^-1，是未加氧载体的1.7倍)，萃取液减压浓缩后，加入无水乙醇进行冷冻结晶，得番茄红素。

实施例3

(1)种子培养：

种子培养过程同实施例1。

(2)发酵培养：

将种子液按照10％接种量接种到发酵培养基中，发酵培养基组份和含量为：淀粉50g/L，大豆饼粉25g/L，玉米浆20g/L，KH₂PO₄1.5g/L，MgSO₄0.05g/L，VB₁0.01g/L，tween-801g/L，10ml/L经过滤灭菌的正己烷，pH6.5。于28℃，250rpm摇床培养5天后收获菌体。在发酵至48小时加入1.5g吡啶或叔胺类化合物阻断剂，其它同实施例1。

(3)提取：

发酵液用纱布过滤得湿菌体，湿菌体放真空干燥箱内50℃真空干燥48h后，得干菌粉5.08g。干菌粉破碎，用石油醚提取(取5μl提取液，用高效液相色谱测番茄红素含量，得到番茄红素产量达到399.8mg L^-1，是未加氧载体的1.6倍)，萃取液减压浓缩后，加入无水乙醇进行冷冻结晶，得番茄红素。

实施例4：

(1)种子培养：

种子培养过程同实施例1。

(2)发酵培养：

发酵培养基组份和含量为：淀粉50g/L，大豆饼粉25g/L，玉米浆20g/L，KH₂PO₄1.5g/L，MgSO₄0.05g/L，VB₁0.01g/L，tween-801g/L，10ml/L的经过滤灭菌的正十二烷，于28℃，250rpm摇床培养5天后收获菌体。在发酵至48小时加入1.5g吡啶或叔胺类化合物阻断剂，其它同实施例1。

(3)提取：

发酵液用纱布过滤得湿菌体，湿菌体放真空干燥箱内50℃真空干燥48h后，得干菌粉5.68g。干菌粉破碎，用石油醚提取(取5μl提取液，用高效液相色谱测番茄红素含量，得到番茄红素产量达到539.6mg L^-1，是未加氧载体的2.2倍)，萃取液减压浓缩后，加入无水乙醇进行冷冻结晶，得番茄红素。

实施例5

(1)种子培养：

种子培养过程同实施例2。

(2)发酵培养：

将种子液按照10％接种量接种到发酵培养基中，发酵培养基组份和含量为：淀粉30g/L，大豆饼粉30g/L，玉米浆25g/L，KH₂PO₄1g/L，MgSO₄0.1g/L，VB₁0.02g/L，span-202g/L，10ml/L经过滤灭菌的正己烷，pH6.5。于28℃，250rpm摇床培养5天后收获菌体。在发酵至48小时加入1.5g吡啶或叔胺类化合物阻断剂，其它同实施例1。

(3)提取：

发酵液用纱布过滤得湿菌体，湿菌体放真空干燥箱内50℃真空干燥48h后，得干菌粉5.4g。干菌粉破碎，用石油醚提取(取5μl提取液，用高效液相色谱测番茄红素含量，得到番茄红素产量达到390.7mg L^-1，是未加氧载体的1.6倍)，萃取液减压浓缩后，加入无水乙醇进行冷冻结晶，得番茄红素。

实施例6

(1)种子培养：

种子培养过程同实施例2。

(2)发酵培养：

发酵培养基组份和含量为：淀粉30g/L，大豆饼粉30g/L，玉米浆25g/L，KH₂PO₄1g/L，MgSO₄0.1g/L，VB₁0.02g/L，span-202g/L，15ml/L经过滤灭菌的正十二烷，于28℃，250rpm摇床培养5天后收获菌体。在发酵至48小时加入1.5g吡啶或叔胺类化合物阻断剂，其它同实施例1。

(3)提取：

发酵液用纱布过滤得湿菌体，湿菌体放真空干燥箱内50℃真空干燥48h后，得干菌粉5.72g。干菌粉破碎，用石油醚提取(取5μl提取液，用高效液相色谱测番茄红素含量，得到番茄红素产量达到532.9mg L^-1，是未加氧载体的2.1倍)，萃取液减压浓缩后，加入无水乙醇进行冷冻结晶，得番茄红素。

Claims

1.一种利用三孢布拉氏霉菌发酵制备番茄红素的方法，采用三孢布拉氏霉菌(+)和三孢布拉氏霉菌(-)为微生物菌种，经种子培养、发酵培养、提纯得到番茄红素，其特征是发酵培养基中添加正己烷或正十二烷作为氧载体；具体步骤和方法如下：

(1)种子培养：

将三孢布拉霉(+)(-)菌种分别接种到pH6.5的种子培养基，在24-30℃，150-200rpm摇床中培养36-40h，种子培养基的组份和含量为：淀粉20-60g/L、玉米浆40-60g/L、KH₂PO₄ 0.5-2g/L、MgSO₄ 0.05-0.2g/L、维生素B₁ 0.005-0.02g/L；

(2)发酵培养：

将步骤(1)得到的三孢布拉霉(+)(-)菌种培养液以1∶2-1∶4的体积比混合得到种子液，将种子液接种到添加有正己烷或正十二烷且pH6.5的发酵培养基，在24-30℃，200-280rpm摇床培养4-7天后收获菌体，在发酵培养46-50小时后，加入浓度为1.5g/L吡啶或叔胺类化合物阻断剂，发酵培养基组份和含量为：淀粉30-60g/L、大豆饼粉10-40g/L、玉米浆20-30g/L、KH₂PO₄0.5-2g/L、MgSO₄ 0.05-0.2g/L、维生素B₁0.005-0.02g/L、3-50ml/L正己烷或正十二烷；

(3)提取：

将步骤(2)得到的湿菌体在50℃真空干燥，得到的干菌粉用石油醚萃取，萃取液减压浓缩后，再加入无水乙醇进行冷冻结晶，得到番茄红素。

2.根据权利要求1的方法，其特征是：发酵培养基中添加浓度为0.5-2g/L的表面活性剂span-20或tween-80。