CN102703558B - 一种利用亚麻刺盘孢霉羟化去氢表雄酮的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种利用亚麻刺盘孢霉（Colletotrichum lini）ST-1羟化去氢表雄酮（DHEA）的方法，其特征在于，转化过程中采用了先将DHEA与等摩尔比的甲基-β-环糊精预包合后再投料的方式，从而显著提高DHEA的水溶性和转化效率。在底物投料量为10g/L的条件下，转化率高达95%，产物7α-OH-去氢表雄酮和7,15α-OH-去氢表雄酮的总得率为80.94%。

Description

一种利用亚麻刺盘孢霉羟化去氢表雄酮的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高效利用亚麻刺盘孢霉（Colletotrichum lini）ST-1羟化去氢表雄酮（DHEA）为7α-羟基-去氢表雄酮(7α-OH-DHEA)和7,15α-羟基-去氢表雄酮(7,15α-OH-DHEA)的方法。
背景技术
7α-羟基-去氢表雄酮(7α-OH-DHEA)和7,15α-羟基-去氢表雄酮(7,15α-OH-DHEA)是生物体内重要的活性物质，对代谢具有重要的调节作用。目前，有研究表明7α-OH-DHEA可阻止体外神经元的缺氧细胞死亡，而且具有抗氧化作用和抗肿瘤作用。7,15α-羟基-去氢表雄酮(7,15α-OH-DHEA)，是一种重要的甾体药物中间体，可用于合成多种甾体激素类药物，如合成“***”口服避孕药的主成分屈罗酮。由于上述两种羟基甾体化合物都具有重要药理作用和药用价值，其市场前景相当可观，成为当前甾体药物领域研究的一大热点。
自1952年，Upjohn公司的Murray和Peterson应用Rhizopus nigricans成功把11α-OH引入孕甾酮的C11，解决了可的松生产的大难题，从此微生物甾体转化技术引起了人们的高度重视。近年来，国内外研究者开始利用生物转化法在DHEA的C7位导入羟基，但关于DHEA双羟化的研究相对较少。甾体微生物转化过程中，底物的水溶性低、生物相容性差是限制转化速率的关键因素，直接成为微生物转化甾体化合物工业生产中的瓶颈。针对这一现状，许多研究者开始改善底物的投料方式，如超声波细化、有机溶剂助溶及双水相催化等，但由于有机溶剂通常对微生物具有一定的毒性，会对酶活性造成一定程度的抑制作用，故对转化率的提高幅度不大。因此，采用一种高效的底物投料方式具有非常重要的意义，而目前关于甲基-β-环糊精（M-β-CD）用于亚麻刺盘孢霉（Colletotrichum lini）羟化DHEA的研究未见报道，其显著提高底物的水溶性和转化率更是工业生产的一大优势。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高效利用亚麻刺盘孢霉（Colletotrichum lini）ST-1羟化去氢表雄酮的方法，通过添加适量的甲基-β-环糊精（M-β-CD），达到高底物投料浓度、高底物高转化率、高产物得率的要求。该菌种于2012年4月24日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.6051，分类命名为亚麻刺盘孢霉（Colletotrichum lini）。
应用上述方法转化DHEA生产7α-OH-DHEA和7,15α-OH-DHEA的方法，其步骤如下：
（1）制备DHEA/M-β-CD的包合物：称取摩尔比为1:1的DHEA、M-β-CD溶于适量水中，30℃下搅拌24 h后通过0.45 μm的膜，滤液冷冻干燥即得DHEA/M-β-CD的包合物。
（2）采用保藏号为CGMCC No.4903的亚麻刺盘孢霉（Colletotrichum lini）ST-1为生产菌种，25-40℃，120-220 r/min条件下活化培养得到种子液，然后将种子液稀释涂布到PDA平板上。
（3）制备C.lini ST-1菌株的细胞液体培养物：挑取步骤（1）的PDA固体培养基上的亚麻刺盘孢霉（Colletotrichum lini）ST-1菌株一环，接种于已灭菌的装有20-50 mL种子培养基的250 mL锥形瓶中，培养温度为25-40℃，置摇床上以120-220 r/min的转速培养12-16 h至对数生长中期，即得到C.lini ST-1菌株的细胞液体培养物。
（4）发酵培养：将步骤（2）中制备好的细胞液体培养物以8-10%（v/v）的接种量接入发酵培养基，装液量为250 mL锥形瓶中装20-50 mL发酵培养基，培养温度为25-40℃，在120-220 r/min的转速下培养20-24 h，得发酵液。
（5）生物转化：称取适量步骤（1）中所述的DHEA/M-β-CD的包合物，投入步骤（3）中的菌体发酵液，使其终浓度为18-20 g/L，在转化温度28℃，200-220 r/min的转速下转化48-60 h，即得转化液。
（6）产物检测：将步骤（4）的转化液在8000-12000 r/min下离心5-10 min，上清用等体积乙酸乙酯抽提3次，菌体用适量氯仿抽提3次，合并抽提液后于旋转蒸发仪中旋至有晶体出现，乙腈复溶晶体并通过0.22 μm的有机膜过滤除杂，滤液利用高效液相色谱法分析DHEA、7α-OH-DHEA和7,15α-OH-DHEA的含量。
其中步骤（2）中所述的PDA培养基的成分及配比为：土豆 200-500 g/L；葡萄糖20-50 g/L；酵母粉2-10 g/L；琼脂粉10-20 g/L；pH自然，在121℃高压蒸汽下灭菌20min；步骤（2）所述种子培养基的成分及配比为：花生饼粉5-15 g/L，葡萄糖20-50 g/L；KCl 0.1-1 g/L；酵母粉10-30g/L；K2HPO4 0.1-1.0 g/L；MgSO4·7H2O 0.01-0.1 g/L；FeSO4·7 H2O 0.01-0.1 g/L g/L；灭菌前调培养基的pH至 6.5-7.5，在121℃高压蒸汽下灭菌20min；
步骤（4）所述发酵培养基的成分及配比为：葡萄糖10-100 g/L；酵母粉5-50g/L；蛋白胨5-50 g/L；NaCl 0.2-2 g/L；K2HPO4 0.1-1.0 g/L；KH2PO40.1-1.0 g/L；MgSO4 0.01-0.1 g/L；FeSO4·7 H2O 0.01-0.10 g/L；pH 6.5-7.5，121℃高压蒸汽下灭菌20 min。
本发明所述的利用亚麻刺盘孢霉（Colletotrichum lini）ST-1羟化去氢表雄酮的方法，是首次提出先将底物DHEA和适量的M-β-CD进行预包合处理后再投料的转化方式，最终达到高底物投料浓度、高底物转化率、高产物得率的目的，此方法对微生物转化甾体类化合物具有重要的意义。
附图说明
图1 DHEA/M-β-CD 包合物相平衡曲线。
图2 为本发明的亚麻刺盘孢霉（Colletotrichum lini）ST-1在发酵培养基中转化DHEA/M-β-CD包合物的过程研究。
具体实施方式
实施例1 冻干法制备包合物DHEA/M-β-CD。
（1）相平衡曲线确定包合比。
称取适量的M-β-CD，250 mL三角瓶中装30mL去离子水配置成浓度为10 mM、20 mM、30 mM、40 mM、50 mM、60 mM的浓度梯度，分别加入过量的底物DHEA后置于20-40℃，120-200 r/min的摇床上振荡24 h至包合平衡。包合液1000 r离心3 min除去未包合的底物，上清经适当倍数稀释后用0.22 μm的水膜过滤除杂，再利用高效液相色谱法检测底物浓度。以M-β-CD浓度为横坐标，DHEA浓度为纵坐标绘制相平衡曲线，确定DHEA与M-β-CD的包合比。
（2）冻干法制备DHEA/M-β-CD的包合物。
称取摩尔比为1:1的DHEA、M-β-CD溶于适量水中，20-40℃下搅拌24 h至包合过程平衡后用0.45 μm的水膜过滤除杂，滤液冷冻干燥后即得DHEA/M-β-CD的包合物。
实施例2利用亚麻刺盘孢霉（Colletotrichum lini）ST-1羟化DHEA/M-β-CD的包合物。
（1）制备亚麻刺盘孢霉（Colletotrichum lini）ST-1菌株的细胞液体培养物
挑取固体PDA培养基上的亚麻刺盘孢霉（Colletotrichum lini）ST-1菌株一环，接种在装有30 mL 种子培养基的250 mL锥形瓶中，在30℃下，置于摇床上以200 r/min的转速培养20-24 h至对数期，即制得亚麻刺盘孢霉菌株的细胞液体培养物。
（3）发酵培养基的成分及配比为：葡萄糖20-50 g/L；酵母粉10-30g/L；蛋白胨5-20 g/L；玉米浆 3-10 g/L；NaCl 0.2-2 g/L；K2HPO4 0.1-1.0 g/L；MgSO4 0.1-1 g/L；FeSO4·7 H2O 0.01-0.10 g/L；pH 6.5-7.5，121℃高压蒸汽下灭菌20 min。
（4）摇瓶发酵：将上述亚麻刺盘孢霉（Colletotrichum lini）ST-1菌株的细胞液体培养物以8-10%（w/w）的接种量接种在装有已灭菌的装有30 mL发酵培养基的250 mL锥形瓶中，在20-40℃条件下，置于摇床上以120-200 r/min的转速培养，发酵20-24 h，菌体进入对数生长期。
（5）生物转化：精确称取适量DHEA/M-β-CD包合物，投入步骤（3）中的菌体发酵液，使DHEA终浓度为20 g/L，在转化温度28℃，200-220 r/min的转速下转化48-60 h。

Claims (2)

1.一种利用亚麻刺盘孢霉ST-1羟化去氢表雄酮（DHEA）的方法，该菌株于2012年4月24日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.6051，该菌株的命名为亚麻刺盘孢霉（Colletotrichum lini），其特征为：250 mL三角瓶装20-40 mL的发酵培养基，接种量为8-10%（w/w），培养温度25-40℃，摇床转速180-220 r/min，培养20-24 h后投入适量DHEA/甲基-β-环糊精（M-β-CD）的包合物，转化温度28℃，继续转化48-60 h。
2.如权利要求1所述的亚麻刺盘孢霉（Colletotrichum lini）ST-1羟化DHEA的方法，其特征在于，所用发酵培养基组成如下：葡萄糖10-100 g/L；酵母粉5-50g/L；蛋白胨5-50 g/L；NaCl 0.2-2 g/L；K2HPO4 0.1-1.0 g/L；KH2PO4 0.1-1.0 g/L；MgSO4 0.01-0.1 g/L；FeSO4·7 H2O 0.01-0.10 g/L；pH 6.5-7.5，121℃高压蒸汽下灭菌20 min。
3.如权利要求1所述的亚麻刺盘孢霉（Colletotrichum lini）ST-1羟化DHEA的方法，其特征在于，所述包合物的制备方法如下：DHEA与M-β-CD以摩尔比1:1溶于适量水中，30℃下搅拌24 h后通过0.45 μm的膜，滤液冷冻干燥。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104561216A (zh) * 2014-11-09 2015-04-29 浙江仙居君业药业有限公司 一种利用亚麻刺盘孢霉制备7α，15α-二羟基去氢表雄酮的方法

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103060201A (zh) * 2012-11-01 2013-04-24 江南大学 复合诱变筛选获得高效转化DHEA为3β,7α,15α-三羟基雄甾-5-烯-17-酮菌株
CN103911418A (zh) * 2014-03-14 2014-07-09 江南大学 一种利用亚麻刺盘孢霉静息细胞高效催化去氢表雄酮的方法
CN104611400A (zh) * 2014-11-25 2015-05-13 江南大学 一种辅酶再生与树脂原位萃取促进Colletotrichum lini ST-1对DHEA的羟化方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101182565A (zh) * 2006-11-14 2008-05-21 上海医药工业研究院 7α,15α-二羟基雄烯醇酮的提取纯化方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101182565A (zh) * 2006-11-14 2008-05-21 上海医药工业研究院 7α,15α-二羟基雄烯醇酮的提取纯化方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
andrea romano.steroid hydroxylations with bortyodiplodia malorum and colletotrichum lini.《steroids》.2006,第71卷429-434.
M.V.Donova.Methyl-β-cyclodextrinaltersgrowth actibity and cell enbelope features of sterol-transforming mycobacteria.《Microbiology》.2007
Methyl-β-cyclodextrin alters growth, actibity and cell enbelope features of sterol-transforming mycobacteria;M.V.Donova;《Microbiology》;20071231;第153卷;1981-1992 *
steroid hydroxylations with bortyodiplodia malorum and colletotrichum lini;andrea romano;《steroids》;20060331;第71卷;429-434 *
尚珂.微生物转化法合成7α,15α-二羟基雄烯醇酮.《中国医学生物技术应用杂志》.2004,30-34. *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104561216A (zh) * 2014-11-09 2015-04-29 浙江仙居君业药业有限公司 一种利用亚麻刺盘孢霉制备7α，15α-二羟基去氢表雄酮的方法
CN104561216B (zh) * 2014-11-09 2019-01-11 浙江仙居君业药业有限公司 一种利用亚麻刺盘孢霉制备7α，15α-二羟基去氢表雄酮的方法

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