CN102863517B

CN102863517B - 一种戈舍瑞林的纯化方法

Info

Publication number: CN102863517B
Application number: CN 201210353908
Authority: CN
Inventors: 赵忠卫; 潘俊锋; 马亚平; 袁建成
Original assignee: Hybio Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Hybio Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2012-09-21
Filing date: 2012-09-21
Publication date: 2013-11-06
Anticipated expiration: 2032-09-21
Also published as: CN102863517A

Abstract

本发明提供了一种戈舍瑞林的纯化方法，包括以下步骤：以体积比5%-20%的醋酸和体积比15%-40%的甲醇的水溶液按照50g/L-100g/L的浓度溶解粗肽，得粗肽溶液；步骤2）：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，将粗肽溶液进样，以体积比浓度为0.1%-0.8%和pH值为4.0-7.5盐的水溶液为A相，乙腈为B相，体积比浓度B%为10%-50%，进行梯度洗脱，得戈舍瑞林；步骤3）采用反相高效液相色谱法将戈舍瑞林的非醋酸盐转成醋酸盐。本发明的目的是提供一种操作简单、高收率、纯度高、有利于实现产业化的纯化戈舍瑞林的方法。

Description

一种戈舍瑞林的纯化方法

技术领域

本发明涉及一种多肽的纯化方法，尤其涉及戈舍瑞林的纯化方法。

背景技术

戈舍瑞林分子式为：Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-Azagly-NH₂, 化学结构式为：

Figure 2012103539081100002DEST_PATH_IMAGE001

戈舍瑞林对男性***癌和女性乳腺癌有较好的治疗作用。目前常用的肿瘤药物主要是化学药物，由于化疗反应大，所以寻找一种合适的生物药物是大势所趋，目前比较好的是促性腺释放激素类似物(LHRH-a) ，长期大量应用LHRH-a不仅不会引起***分泌过多，反而抑制垂体释放***，LHRH－a开始使Leydig细胞产生睾酮上升约3月～5月，以后下降21日～28日即可达到去睾水平。该药优点是副作用少，无心血管并发症，停药后睾丸功能有可复性。有时可用之检查前列原癌对雄激素是否依赖，如依赖可继续用药或睾丸切除。LHRH-a常用药为戈舍瑞林，一个月即可达到药物去睾，近年在用常效缓释LHRH-a，一次用药有效期达1个月。在广泛用于治疗***癌的LHRH-a类药物中,以戈舍瑞林为例,大量的数据表明,与睾丸切除术相比,患者在总生存率、症状缓解率、客观反应率和治疗失败时间等方面基本等效;但二者相比,药物去势治疗具有以下优点:有明显的患者选择优势、可逆、心理和生理的微创性、可长期或间歇使用、明显提高生活质量。

目前涉及到戈舍瑞林合成的文献和专利较多，但涉及到纯化的几乎没有，特别是本发明的大规模纯化制备（一批可得精品100克以上）和高纯度（纯度达99.5%以上，最大单杂0.1%），更是没有涉及。现有技术例如专利CN101759777A涉及到有关戈舍瑞林纯化的内容，但其工艺只能达到98.5%，更不用说单杂0.1%以下了；作为一种治疗***癌的新型药品（其在欧洲药典EP有规定单杂要小于0.5%，考虑到其稳定性和有效期等因素，所以其纯化工艺必须达到能够得到单杂小于0.1%的标准，否则很难成药。因此本发明相对现有技术具有显著的进步。

发明内容

本发明提出了一种纯化戈舍瑞林的方法，纯度高且收率好，达到产业化要求。

为实现上述目的，综合考虑戈舍瑞林本身的性质，本发明提供的技术方案包括以下步骤：

步骤1）：以体积比5%—20%的醋酸和体积比15%—40%的甲醇的水溶液按照50g/L—100g/L的浓度溶解粗肽，得粗肽溶液；步骤1）下文表述为“前处理”。其中，溶液的浓度均为体积比浓度，溶剂为水。

选择体积比5%—20%的醋酸和15%—40%的甲醇水溶液混合溶剂***是经过大量试验摸索得到溶剂***和比例区间，在此范围内溶解效果最好，溶解液的体积小，所以上样纯化的体积小，从而确保了纯化的分离效果。否则的话需要对样品溶液进行浓，其他溶剂均达不到此溶解效果。

若溶液中的醋酸和甲醇的体积比例大于20%，用水稀释到20%以下，备用。因为当醋酸和甲醇的体积比例大于20%，易导致粗肽挂不上色谱柱，达不到分离效果。

步骤2）：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，将粗肽溶液进样，以体积比浓度为0.1%—0.8%和pH值为4.0—7.5盐的水溶液为A 相，乙腈为B相，体积比浓度B%为10%—50%(即 A相和B相的比例为10：90-50：50)，进行梯度洗脱；步骤2）下文表述为“纯化”。

体积比浓度为0.1%—0.8%和pH值为4.0—7.5盐的水溶液是指体积比浓度为0.1%—0.8%酸的水溶液用碱的水溶液调节pH值为4.0—7.5得到的水溶液；其中，酸指磷酸、硫酸、醋酸或高氯酸中的一种或两种以上的混合；碱是指氢氧化钠、氨水或三乙胺。

所述“粗肽”是指采用液相合成法或固相合成法得到的，尚未经过精制处理的戈舍瑞林粗肽或者纯度不能满足药用的戈舍瑞林。“粗肽溶液”是指步骤1）所得粗肽溶液，所使用的水为纯净水，并符合注射用水标准，优选超纯水；所使用的醋酸为分析纯的冰醋酸，本发明的“乙腈”的纯度级别优选色谱纯。

A相和B相的体积比例为10：90—50：50，优选20：80—40：60(可表示为体积比浓度B%为20%—40%)，使用该洗脱体系，可以有效的保证分离效果和纯化收率，其中，特别是当洗脱体系中B%不在10%—50%范围内，易导致样品不挂柱或提前冲出，达不到分离效果。

现有技术CN101759777A的洗脱***收率低，纯度仅能达98.5%，而本发明纯化收率可达70%以上，纯度99.5%以上且任一杂质不大于0.1%，可以用来标定工作标准品和进行药品注册申报。

流动相A的pH值至关重要，pH值低于4.0或高于7.5会对样品的后杂分离变差，且样品带有微红色。对纯度影响不明显，但会使收率降低10%左右。

步骤3）采用反相高效液相色谱法将戈舍瑞林的非醋酸盐转成醋酸盐。步骤3）下文表述为“转盐”。

所述“反相高效液相色谱”的固定相为十八烷基硅烷键合硅胶，转盐的方法优选为：用含体积比浓度为3%—10%乙腈的醋酸铵水溶液冲洗15—30min，醋酸铵水溶液中醋酸铵的体积比浓度为0.1%—0.8%，优选0.3%，pH值为6.0—6.5，然后用醋酸水溶液乙腈体系洗脱，收集戈舍瑞林溶液；醋酸水溶液中醋酸的体积比浓度为0.05%—0.2%，优选为0.1%。洗脱步骤所采用醋酸水溶液—乙腈体系中乙腈的体积比浓度为20—60%，优选40%。使用该成盐试剂和洗脱体系及方法，可以有效地达到转盐要求，并且可以将盐离子控制药用级标准内。

醋酸铵水溶液配置：按照体积比0.1%—0.8%的醋酸，用氨水调pH值为6.0—6.5。其浓度过低，体积比低于0.1%会导致离子转换不完全，体积比高于0.8%会损伤色谱填料。

乙腈体积比浓度低于20%样品洗脱不下来，乙腈体积比浓度高于40%样品洗脱不下来过高会增加乙腈的消耗增加生产成本（乙腈比较贵，在规模化生产时尤为明显）；综合收率和成本特别优选40%，收率最高且成本最低。

现有技术CN101759777A该步的收率只能达95%左右，本发明综合兼顾了成本、收率和纯度，特别是在规模化生产过程中尤为明显，明显提高了收率和纯度，降低了成本。

所述步骤3）中各溶液的浓度均为体积比浓度，溶剂为水，所使用的水为纯净水，并符合注射用水标准，优选超纯水。

纯化规模包括以下规格色谱柱（柱子直径×长度）：5 cm × 25 cm、15 cm × 25 cm、30 cm × 25 cm 、45 cm × 25 cm。

采用现有技术对戈舍瑞林进行纯化分离，只能达到纯度98.5%，单杂无从控制，达不到成药的基本要求，且收率大多在50%左右。本发明提供的纯化戈舍瑞林方法操作简单可行、纯度高（可达99.5%以上且最大单杂小于0.1%）、收率高（纯化收率可达70%以上，总收率可达40%以上），达到产业化要求（一批次可获得100克以上的精肽）。

附图说明

图1：采用实施例1得到戈舍瑞林精肽谱图

具体实施方式

实施例一：

1. 前处理：用体积比20%的醋酸和40%的甲醇水溶液按照100g/L的浓度溶解粗肽，搅拌使样品完全溶解后用滤膜过滤，收集滤液。用水将粗肽溶液中的醋酸和甲醇的体积比例稀释到20%以下备用。

2. 纯化：

纯化条件：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为： 5 cm × 25 cm 。流动相：A 相： 0.3%磷酸水溶液(v/v)，用三乙胺调pH值6.5；B相：乙腈，流速：50-100 ml/min，梯度：B%：20%～40%，检测波长：280 nm。进样量为1.0-2.5g 。

纯化过程：将色谱柱用体积比50%以上的乙腈冲洗干净后平衡上样，上样量为1.0-2.5g。线性梯度洗脱60min，收集目的峰，将收集的戈舍瑞林溶液于水温不超过35 ℃的条件下减压旋蒸浓缩至约10-20 mg/mL 后备用。

3. 转盐：色谱柱：以八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为： 5 cm × 25 cm 。将色谱柱用体积比50%以上的乙腈醋酸溶液冲洗干净后上样，上样量1.0-2.5g，用含体积比5%乙腈的0.3%的醋酸铵水溶液冲洗25-35min，然后用含体积比50%乙腈的0.1%的醋酸水溶液洗脱，收集目的峰，将收集的戈舍瑞林溶液于水温不超过35 ℃条件下减压旋蒸浓缩至约50-200 mg/mL 后转至合适大小西林瓶。冷冻干燥后即可得到纯度大于99.5%的戈舍瑞林，HPLC谱图如图1所示。

实施例二：

1. 前处理：用体积比5%的醋酸和40%的甲醇水溶液按照100g/L的浓度溶解粗肽，搅拌使样品完全溶解后用滤膜过滤，收集滤液。用水将粗肽溶液中的醋酸和甲醇的体积比例稀释到20%以下备用。

2. 纯化：

纯化条件：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为： 15 cm × 25 cm 。流动相：A 相： 0.2%硫酸水溶液(v/v)，用氨水调pH值6.0；B相：乙腈，流速：300-600 ml/min，梯度：B%：20%～40%，检测波长：280 nm。进样量为1.0-2.5g 。

纯化过程：将色谱柱用体积比50%以上的乙腈冲洗干净后平衡上样，上样量为20-35g。线性梯度洗脱60min，收集目的峰，将收集的戈舍瑞林溶液于水温不超过35 ℃的条件下减压旋蒸浓缩至约10-20 mg/mL 后备用。

3. 转盐：色谱柱：以八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为： 15 cm × 25 cm 。将色谱柱用体积比50%以上的乙腈醋酸溶液冲洗干净后上样，上样量20-35g，用含体积比5%乙腈的0.3%的醋酸铵水溶液冲洗25-35min，然后用含体积比50%乙腈的0.1%的醋酸水溶液洗脱，收集目的峰，将收集的戈舍瑞林溶液于水温不超过35 ℃条件下减压旋蒸浓缩至约50-200 mg/mL 后转至合适大小西林瓶。冷冻干燥后即可得到纯度大于99.5%的戈舍瑞林。

实施例三：

1. 前处理：用体积比5%的醋酸和15%的甲醇水溶液按照100g/L的浓度溶解粗肽，搅拌使样品完全溶解后用滤膜过滤，收集滤液。用水将粗肽溶液中的醋酸和甲醇的体积比例稀释到20%以下备用。

2. 纯化：

纯化条件：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为： 30 cm × 25 cm 。流动相：A 相： 0.1%磷酸和0.2%醋酸水溶液(v/v)，用氨水调pH值6.5；B相：乙腈，流速：2000-4000 ml/min，梯度：B%：20%～40%，检测波长：280 nm。进样量为80-200g 。

纯化过程：将色谱柱用体积比50%以上的乙腈冲洗干净后平衡上样，上样量为80-200g。线性梯度洗脱60min，收集目的峰，将收集的戈舍瑞林溶液于水温不超过35 ℃的条件下减压旋蒸浓缩至约10-20 mg/mL 后备用。

3. 转盐：色谱柱：以八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为： 30 cm × 25 cm 。将色谱柱用体积比50%以上的乙腈醋酸溶液冲洗干净后上样，上样量80-200g，用含体积比5%乙腈的0.3%的醋酸铵水溶液冲洗25-35min，然后用含体积比50%乙腈的0.1%的醋酸水溶液洗脱，收集目的峰，将收集的戈舍瑞林溶液于水温不超过35 ℃条件下减压旋蒸浓缩至约50-200 mg/mL 后转至合适大小西林瓶。冷冻干燥后即可得到纯度大于99.5%的戈舍瑞林。

实施例四：

1. 前处理：用体积比20%的醋酸和15%的甲醇水溶液按照100g/L的浓度溶解粗肽，搅拌使样品完全溶解后用滤膜过滤，收集滤液。用水将粗肽溶液中的醋酸和甲醇的体积比例稀释到20%以下备用。

2. 纯化：

纯化条件：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为： 45 cm × 25 cm 。流动相：A 相： 0.1%硫酸和0.2%高氯酸水溶液(v/v)，用1N的氢氧化钠水溶液调pH值5.5；B相：乙腈，流速：5000-7000 ml/min，梯度：B%：20%～40%，检测波长：280 nm。进样量为200-350g 。

纯化过程：将色谱柱用体积比50%以上的乙腈冲洗干净后平衡上样，上样量为200-350g。线性梯度洗脱60min，收集目的峰，将收集的戈舍瑞林溶液于水温不超过35 ℃的条件下减压旋蒸浓缩至约10-20 mg/mL 后备用。

3. 转盐：色谱柱：以八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为： 45 cm × 25 cm 。将色谱柱用体积比50%以上的乙腈醋酸溶液冲洗干净后上样，上样量200-350g，用含体积比5%乙腈的0.3%的醋酸铵水溶液冲洗25-35min，然后用含体积比50%乙腈的0.1%的醋酸水溶液洗脱，收集目的峰，将收集的戈舍瑞林溶液于水温不超过35 ℃条件下减压旋蒸浓缩至约50-200 mg/mL 后转至合适大小西林瓶。冷冻干燥后即可得到纯度大于99.5%的戈舍瑞林。

Claims

1.一种戈舍瑞林的纯化方法，包括以下步骤：

步骤1）：以体积比5%—20%的醋酸和体积比15%—40%的甲醇的水溶液按照50g/L—100g/L的浓度溶解粗肽，得粗肽溶液；

步骤2）：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，将粗肽溶液进样，以体积比浓度为0.1%—0.8%和pH值为4.0—7.5盐的水溶液为A相，乙腈为B相，体积比浓度B%为10%—50%，进行梯度洗脱，得戈舍瑞林；

步骤3）采用反相高效液相色谱法将戈舍瑞林的非醋酸盐转成醋酸盐，是指以八烷基硅烷键合硅胶固定相，用含体积比浓度3%—10%乙腈的醋酸铵水溶液冲洗15min—30min，醋酸铵水溶液中醋酸铵的体积比浓度为0.1%—0.8%，pH值为6.0—6.5；然后用醋酸水溶液—乙腈体系洗脱，收集戈舍瑞林溶液，醋酸水溶液中醋酸的体积比浓度为0.05%—0.2%；洗脱步骤所采用的乙腈体积比浓度为20%—60%。

2.根据权利要求1所述一种戈舍瑞林的纯化方法，其特征在于：所述体积浓度为0.1%—0.8%和pH值为4.0—7.5盐的水溶液是指体积比浓度为0.1%—0.8%酸的水溶液用碱的水溶液调节pH值为4.0—7.5得到的水溶液。

3.根据权利要求2所述一种戈舍瑞林的纯化方法，其特征在于：酸指磷酸、硫酸、醋酸或高氯酸中的一种或两种以上的混合；碱是指氢氧化钠、氨水或三乙胺。

4.根据权利要求1至3任意一项所述一种戈舍瑞林的纯化方法，其特征在于：所述步骤2）中，体积比浓度B%为20%—40%。

5.根据权利要求1所述一种戈舍瑞林的纯化方法，其特征在于：所述醋酸铵水溶液中醋酸铵的体积比浓度为0.3%。

6.根据权利要求1所述一种戈舍瑞林的纯化方法，其特征在于：醋酸水溶液中醋酸的体积比浓度为0.1%。

7.根据权利要求1所述一种戈舍瑞林的纯化方法，其特征在于：洗脱步骤所采用醋酸水溶液—乙腈体系中乙腈的体积比浓度为40%。