CN101531644B - 芫花中的瑞香烷型二萜类化合物及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医药技术领域,涉及从瑞香科植物芫花(Daphne genkwaet.zucc)花蕾中提取分离的一系列新的瑞香烷型二萜类化合物,GenkwanineII,GenkwaninIII,GenkwaninIV,GenkwaninV,GenkwaninVI,GenkwaninVII,它们具有相同的瑞香烷型二萜母核,它们具有式(1)的化学结构通式。本发明还涉及该类新化合物及其制备药物的抗肿瘤生理活性及其医药用途。该类化合物可以和药学上可接受的载体结合制成临床上可接受的剂型,用于各类癌症的治疗。本发明制备方法简单,重现性好,提取纯度高。获得的化合物具有较好的抗肿瘤活性作用。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域,涉及芫花中新的瑞香烷型二萜类化合物及其制备方法,本发明还涉及该类新化合物在抗肿瘤生物活性方面的用途。
背景技术
瑞香科植物芫花(Daphne genkwa sieb.et Zucc)为传统的泻下逐水药。目前对其抗肿瘤、引产、镇咳祛痰、杀虫、抗炎、免疫功能调节等方面研究较多。国内外学者从瑞香科植物芫花的花及花蕾、根、中分离得到了一系列具有特殊结构的瑞香烷型二萜原酸酯类化合物。瑞香烷型二萜又名瑞香毒素类化合物(Daphnetoxin)具有很强的生物活性,20世纪70年代初,人们从瑞香属植物中分离出具有抗肿瘤活性的欧亚瑞香素(Mezerein)和瑞香毒素(Daphnotoxin)后,该类化合物便成为一个研究热点,由于瑞香烷型二萜具有独特的抗肿瘤生理活性而受到重视。
现代医学研究表明癌症是一种特别严重的癌毒扩散症,癌毒的形成是目前的生活方式的产物,并有越来越严重的的趋势。因此寻找更加有效的抗癌、抗肿瘤药物刻不容缓。
发明内容:
本发明的目的旨在从中药芫花中寻找新的抗肿瘤前体药物,提供该类瑞香烷型二萜类化合物的提取、制备方法,并且研究它们的抗肿瘤生物活性和医药用途。本发明的另一个目的在于提供该类化合物的结构鉴定方法。
(一)本发明所述一系列6个新的瑞香烷型二萜类化合物(Genkwanine II,Genkwanin III,GenkwaninIV,Genkwanin V,GenkwaninVI,GenkwaninVII)的结构式如下:
(二)本发明所述新的瑞香烷型二萜类化合物(Genkwanine II,GenkwaninIII,GenkwaninIV,Genkwanin V,GenkwaninVI,GenkwaninVII)的提取、制备方法如下:
选用瑞香科植物芫花(Daphne genkwa.et zucc)的干燥花蕾4000~6000g为原料,5~8倍量的体积比为60%~95%工业乙醇室温下冷浸提取15~20天,每24~48h小时减压浓缩一次,累计总浸膏500~600g,总浸膏用3~5L水混悬后,分别用氯仿,正丁醇以1∶1的体积比进行萃取,萃取3~5次,得到的氯仿层干浸膏200~300g,正丁醇层干浸膏200~300g,及浓缩后水液10~15L;
氯仿层浸膏进行快速减压柱色谱或常压柱色谱分离,沸程为30~60℃,或60~90℃的石油醚-丙酮50∶1~2∶1(V/V)混合溶剂梯度洗脱,每300~500ml体积为一馏分,共收集到40~50个馏分,经硅胶薄层层析检识,合并得到F1~F6的6个馏分,
馏分F4经氯仿-甲醇100∶0~2∶1混合溶剂梯度洗脱,得到F4-1~F4-6的6个馏分,F4-4分别经MCI gel柱色谱甲醇-水***梯度洗脱除去叶绿素,硅胶柱色谱二氯甲烷-甲醇***洗脱分离,C18反相硅胶柱色谱以及制备高效液相色谱甲醇-水***梯度洗脱分离,旋转蒸发仪回收溶剂得到白色粉 末或透明状物质,化合物GenkwaninVI和GenkwaninVII;
馏分F6经氯仿-甲醇80∶0~2∶1或二氯甲烷-甲醇80∶0~2∶1混合溶剂梯度洗脱,得到F6-1~F6-4的4个馏分,F6-2分别经MCI gel柱色谱甲醇-水***梯度洗脱除去叶绿素,硅胶柱色谱二氯甲烷-甲醇***洗脱分离,C18反相硅胶柱色谱以及制备高效液相色谱甲醇-水***梯度洗脱分离,旋转蒸发仪回收溶剂得到白色粉末或透明状物质,化合物Genkwanin II,GenkwaninIII,GenkwaninIV,Genkwanin V。
根据如上所述的提取及萃取方法得到的氯仿层干浸膏经石油醚-丙酮***50∶1~2∶1(V/V)混合溶剂梯度洗脱硅胶柱层析后得到馏分F 1-F6。
馏分F3经石油醚-丙酮80∶0~2∶1或二氯甲烷-甲醇100∶0~2∶1混合溶剂梯度洗脱,得到F3-1~F3-7的7个馏分,馏分F3-3经MCI gel柱色谱以甲醇-水或乙醇-水***梯度洗脱,收集20~50%洗脱的馏分,经C18反相硅胶柱色谱以甲醇-水***梯度洗脱,收集50~80%洗脱的馏分,经反相制备高效液相色谱分离,采用甲醇-水***梯度洗脱,回收溶剂后,共得到化合物Genkwanin II,GenkwaninIV,Genkwanin V。
洗脱后的馏分中含有瑞香烷型二萜的部分用氯仿-甲醇***30∶1~20∶1展开,其Rf值在0.1~0.8;254nm紫外灯鉴别或显色剂鉴别,显色剂可以是10%硫酸显色剂,或10%硫酸偏矾酸铵-显色剂,或10%硫酸-香草醛显色剂。
(三)本发明所述新的瑞香烷型二萜类化合物(Genkwanine II,GenkwaninIII,GenkwaninIV,Genkwanin V,GenkwaninVI,GenkwaninVII)具有较好的抗肿瘤活性。
1.实验材料
1.1受试品:化合物Genkwanine II,GenkwaninIII,GenkwaninIV,Genkwanin V,GenkwaninVI,GenkwaninVII。
1.2实验细胞株及来源HL-60:人急性髓性白血病细胞
2.实验方法
2.1药物处理
药物的溶解
化合物Genkwanine II,GenkwaninIII,GenkwaninIV,Genkwanin V,GenkwaninVI,GenkwaninVII均为粉末状,使用DMSO溶解。配成浓度为100mmol/L的母液,储存于-20℃。临用时用相应的培养液将其稀释为100μmol/L,10μmol/L,1μmol/L进行实验。DMSO配置的样品进行实验时,DMSO的终浓度为1‰。文献报道yuanhuacine具有抗肿瘤活性且结构与待测化合物类似,因此选取yuanhuacine作为阳性对照药,浓度为10μmol/L。
给药处理
取对数生长期的细胞,调整适当的细胞密度,接种于96孔板内,100μL/well,培养于37℃,5%CO2的培养箱内。培养24h后,将药物稀释为100μmol/L,10μmol/L,1μmol/L三个浓度,10μL/well,作用48h。分设空 白组、给药组,每组设5个复孔。
2.2MTT法的测定方法
药物作用48h后,将细胞与0.25mg/ml MTT于37℃下共同孵育4h,吸除培养液后每孔加入100μl二甲基亚砜(DMSO),完全溶解后使用酶标仪于490nm测定其光密度OD值。最后以空白组OD值为100%,计算各组细胞抑制率。
2.3.统计方法
全部资料采用SPSS(13.0)统计软件包进行检验分析。各组数据用均值±标准误(Mean±S.E.)表示,采用One-Way ANOVA评价整体性差异,并进行Dunnett或Dunnett’s T3检验进行组间比较。
3.实验结果
表1化合物对肿瘤细胞HL-60成活的抑制率(%)(M±SE)
***P<0.001Vs Control;**P<0.01Vs Control;*P<0.05Vs Control
表2化合物YH-21对肿瘤细胞HL-60成活的抑制率(%)(M±SE)
control | 6.25μmol/L | 12.5μmol/L | 25μmol/L | 50μmol/L | IC50μmol/L | |
YH-21 | 0.00±0.18 | 24.041±0.24*** | 41.20±0.08*** | 82.96±0.07*** | 86.653±0.15*** | 12.90 |
由上述实验结果可看本发明所涉药物作用48h之后,6种化合物对HL-60细胞株均具有一定杀伤作用。其中化合物GenkwaninVI的作用最为明显,其次是GenkwaninVII。
化合物Genkwanine II,GenkwaninIII,GenkwaninIV,Genkwanin V虽对HL-60细胞株有一定的杀伤作用,但效果不明显。
本发明所涉瑞香烷型二萜类新化合物,部分对HL-60人急性髓性白血病细胞具有显著抑制作用,并且可能对其他肿瘤细胞具有较好的抑制作用,如A-549人非小细胞性肺癌细胞,HeLa子***细胞系等,可用于开发抗肿瘤、抗癌类药物,尤其针对临床化疗阶段药物。
本发明制备方法简单,重现性好,提取纯度高。获得的化合物具有较好的抗肿瘤活性作用。
附图说明
图1为Genkwanine II的1H-NMR
图2为Genkwanine II的13C-NMR
图3为Genkwanine II的HSQC
图4为Genkwanine II的HMBC
图5为GenkwanineIII的1H-NMR
图6为GenkwanineIII的13C-NMR
图7为GenkwanineIII的HSQC
图8为GenkwanineIII的HMBC
图9为GenkwaninIV的1H-NMR
图10为GenkwaninIV的13C-NMR
图11为GenkwaninIV的HMBC
图12为GenkwaninV的1H-NMR
图13为GenkwaninV的13C-NMR
图14为GenkwaninV的HSQC
图15为GenkwaninV的HMBC
图16为GenkwaninVI的1H-NMR
图17为GenkwaninVI的13C-NMR
图18为GenkwaninVI的HMBC
图19为GenkwaninVII的1H-NMR
图20为GenkwaninVII的13C-NMR
图21为GenkwaninVII的HMBC
具体实施方式
制备实施例1
选用瑞香科植物芫花(Daphne genkwa.et zucc)的干燥花蕾6000g为原料,6倍量的体积比为95%工业乙醇室温下冷浸提取20天,每48h小时减压浓缩一次,累计总浸膏525g,总浸膏用4L水混悬后,分别用氯仿,正丁醇以1∶1的体积比进行萃取,萃取4次,得到的氯仿层干浸膏245g,正丁醇层干浸膏250g,及浓缩后水液15L;
氯仿层浸膏进行快速减压柱色谱或常压柱色谱分离,沸程为30~60℃的石油醚-丙酮30∶1,10∶1,5∶1,2∶1(V/V)混合溶剂梯度洗脱,每500ml体积为一馏分,共收集到46个馏分,经硅胶薄层层析检识,合并得到F1~F6的6个馏分,
馏分F4经氯仿-甲醇100∶0,30∶1,8∶1,3∶1,2∶1(V/V)混合溶剂梯度洗脱,得到F4-1~F4-6的6个馏分,F4-4分别经MCI gel柱色谱甲醇-水***梯度洗脱除去叶绿素,硅胶柱色谱二氯甲烷-甲醇***30∶1,8∶1,2∶1(V/V)洗脱分离,C18反相硅胶柱色谱以及制备高效液相色谱甲醇-水***70%,80%,90%梯度洗脱分离,旋转蒸发仪回收溶剂得到白色粉末或透明状物 质,化合物GenkwaninVI和GenkwaninVII;
馏分F6经氯仿-甲醇80∶1,30∶1,8∶1,2∶1(V/V)混合溶剂梯度洗脱,得到F6-1~F6-4的4个馏分,F6-2分别经MCI gel柱色谱甲醇-水***梯度洗脱除去叶绿素,硅胶柱色谱二氯甲烷-甲醇***30∶1,10∶1,2∶1(V/V)洗脱分离,C18反相硅胶柱色谱以及制备高效液相色谱甲醇-水***60%,80%梯度洗脱分离,旋转蒸发仪回收溶剂得到白色粉末或透明状物质,化合物Genkwanin II,GenkwaninIII,GenkwaninIV,Genkwanin V。
制备实施例2
选用瑞香科植物芫花(Daphne genkwa.et zucc)的干燥花蕾6000g为原料,6倍量的体积比为95%工业乙醇室温下冷浸提取20天,每48h小时减压浓缩一次,累计总浸膏525g,总浸膏用4L水混悬后,用氯仿以1∶1的体积比进行萃取,萃取4次,得到的氯仿层干浸膏245g。
氯仿层浸膏进行快速减压柱色谱或常压柱色谱分离,沸程为30~60℃的石油醚-丙酮30∶1,10∶1,5∶1,2∶1(V/V)混合溶剂梯度洗脱,每500ml体积为一馏分,共收集到46个馏分,经硅胶薄层层析检识,合并得到F1~F6的6个馏分,
馏分F3经石油醚-丙酮80∶0,50∶1,10∶1,5∶1,2∶1(V/V)或二氯甲烷-甲醇100∶0,30∶1,10∶1,3∶1,2∶1(V/V)混合溶剂梯度洗脱,得到F3-1~F3-7的7个馏分,馏分F3-3经MCI gel柱色谱以甲醇-水***梯度洗脱,收集30%洗脱的馏分,经C18反相硅胶柱色谱以甲醇-水***梯度洗脱,收集70%洗脱的馏分,经反相制备高效液相色谱分离,采用甲醇-水***55%,65%,80%梯度洗脱,回收溶剂后,共得到化合物Genkwanin II,GenkwaninIV,Genkwanin V。
本发明所述新的瑞香烷型二萜类化合物(Genkwanine II,GenkwaninIII,GenkwaninIV,Genkwanin V,GenkwaninVI,GenkwaninVII)的结构解析
实验例1:
Genkwanine II,白色无定形粉末(甲醇),易溶于氯仿、甲醇。[α]D 22-57.3(c 0.012,CHCl3)高分辨质谱给出准分子离子峰m/z 527.2258[M+Na]+(计算值为527.2252),结合1H,13C NMR谱,确定分子式为C27H36O9,显示有10个不饱和度。
1H NMR(600MHz,CDCl3)信息给出瑞香烷型二萜的基本母核特征, 1H NMR谱中δH 8.12(2H,m),7.56(1H,m)和7.45(2H,m)的存在,提示分子中有一单取代苯基;三个甲基特征质子信号δH 1.87(3H,s),1.00(3H,d,J=6.6),0.96(3H,d,J=7.2);一个连在季碳上的羟甲基氢信号,δH3.70(1H,d,J=12)和3.93(1H,d,J=12);四个连氧碳上的氢信号δH 4.13(1H,d,J=10.2),4.52(1H,s),3.24(1H,bs),5.95(1H,s);以及2个连在末端双键上的特征氢信号δH 5.17(1H,s,H-16)和5.14(1H,s,H-16)。13C NMR谱中可以看到27个碳信号,三个甲基碳信号δC12.8,19.3,21.4;一对末端双键碳信号δC144.9(C-15)和114.0(C-16),一组苯环上的碳信号,其 中瑞香烷型二萜原酸酯的特征季碳信号消失,取而代之的是δC167.1的酯羰基碳信号,说明原酸酯的氧环开裂,形成一苯甲酰氧基;δC67.3和64.5的特征连氧碳信号,提示6,7位成氧环。
通过HSQC谱对除季碳以外的所有碳氢信号进行了直接相关,在HMBC谱中甲基氢信号δH 1.87(δC18.9)与δC 144.9(C-15),114.0(C-16),73.7有远程相关,提示存在结构片段1,说明δH 1.87与末端双键相连,为17位甲基信号。δH 1.00(δC15.4)的甲基氢信号与δC 33.9,36.1,73.1有远程相关,推出结构片段2,δH 0.96(δC15.7)的甲基氢信号与δC35.1,31.4,75.5有远程相关,其化学环境与结构片段2极其相似,暂不能归属δH 1.00与0.96的甲基信号是18位还是19位甲基。H-14(δH5.95)与δC167.1有远程相关,提示苯甲酰氧基与C-14(δC77.2)相连接,H-14(δH5.95)还与δC33.9,73.5,39.5,67.3的碳信号有远程相关,推出结构片段3,说明与δC33.9,73.5有相关的δH 1.00为18位甲基氢信号,δH0.96为19位甲基信号。δH4.13(H-3)与δC15.7(C-19),35.1(C-1),31.4(C-2),79.8(C-4),76.7(C-5)有远程相关,δH 4.52(H-5)与δC 54.4(C-10),64.5(C-6)有远程相关;δH3.24(H-7)与δC 68.0(C-20),64.5(C-6),39.5(C-8),77.2(C-14)有远程相关;由以上推导可确定化合物的结构,分子式为C27H36O9,与HR-ESIMS所给出的分子式一致。经sci finder文献检索,未见报道,为一新化合物,命名为genkwanine II
其1H NMR谱,13C NMR谱信号归属及HMBC见表1,相关图谱见附图1-图4。
表1genkwanin II的1H NMR谱(600MHz,CDCl3)和13C NMR谱(150MHz,CDCl3)数据
实验例2
GenkwanineIII,白色结晶(甲醇),易溶于氯仿、甲醇。[α]D 22-39.3(c0.019,CHCl3)高分辨质谱给出准分子离子峰m/z:527.2251[M+Na]+(计算值为527.2252),结合1H,13C NMR谱,确定分子式为C27H36O9,显示有10个不饱和度,为化合物genkwanin II的同分异构体。
1H NMR(600MHz,CDCl3)信息给出瑞香烷型二萜的基本母核特征, 1H NMR谱中δH 8.00(2H,m),7.55(1H,m)和7.42(2H,m)的存在,提示分子中有一单取代苯基;三个甲基特征氢信号δH 1.82(3H,s),0.82(3H,d,J=7.2),0.95(3H,d,J=6.6);一个连在季碳上的羟甲基特征氢信号δH4.41(1H,d,J=12)和4.82(1H,d,J=12),较化合物genkwanin II移向低场;四个连氧碳上的氢信号δH 4.23(1H,d,J=10.2),5.02(1H,s),4.16(1H,s),4.10(1H,s);以及2个连在末端双键上的特征氢信号δH 5.12(1H,s,H-16)和5.11(1H,s,H-16)。13C NMR谱中可以看到27个碳信号,三个甲基碳信号δC15.9,13.8,19.1;一对末端双键碳信号δC144.7(C-15)和114.8(C-16),一组苯环上的碳信号(δC129.9,129.6×2,128.5,133.3,128.5);其中瑞香烷型二萜原酸酯的特征季碳信号消失,取而代之的是δC167.2的酯羰基碳信号,说明原酸酯的氧环开裂,形成一苯甲酰氧基,δC81.0和83.0的连氧碳信号较genkwanin II移向较低场,提示6,7位氧环开裂。
HSQC谱对除季碳以外的所有碳氢信号进行了直接相关,在HMBC谱中甲基氢信号δH1.82(δC19.1)与δC144.8(C-15),114.0(C-16),74.8有远程相关,提示存在结构片段1,说明δH 1.82与末端双键相连,为17位甲基信号。δH 0.84(δC13.8)的甲基氢信号与δC 35.7,36.4,73.1有远程相关,推出结构片段2,δH 0.95(δC15.9)的甲基氢信号与δC 34.1,31.9,74.1有远程相关,其化学环境与结构片段2相似,暂不能归属δH 0.84与0.95的甲基信号是18位还是19位甲基。H-14(δH 4.10)较化合物genkwanin II移向高场,说明14位不连取代基,同时H-14(δH4.10)与δC 35.7,73.1,44.5,81.0的碳信号有远程相关,推出结构片段3,说明与δC35.7,73.1有相关的δH0.84为18位甲基氢信号,δH 0.96为19位甲基信号。4.82(1H,d,J=12,Hβ-20)和δH 4.41(1H,d,J=12,Hα-20)较化合物genkwanin II移向低场,说明羟基上有取代,并且看到与δC167.2的酯羰基碳信号有相关,证明了苯甲酰基与C-20相连;δH 4.23(H-3)与δC 15.9(C-19),34.1(C-1),31.9(C-2),90.8(C-4),83.1(C-5)有远程相关,δH 5.02(H-5)与δC 47.7(C-10),83.0(C-6)有远程相关,δH 4.16(H-7)与δC 67.4(C-20),80.3(C-6),72.0(C-14)有远程相关;另外还看到δH 4.16(H-7)与δC 90.8(C-4)有三根健的远程相关,即7位和4位通过氧原子相连接,说明7位和4位的羟基脱水成氧环,C-4,C-5,C-6,C-7的化学位移较化合物genkwanin II均移向较低场,也说明其形成五元氧环;推导结构符合HR-ESIMS给出分子量,与不饱和度10相吻合,由此确定了化合物的结构。经sci finder文献检索,未见报道,为一新化合物,命名为genkwanineIII。
其1H NMR谱,13C NMR谱信号归属及HMBC见表2,相关图谱见附图5-图8。
表2genkwaninIII的1H NMR谱(600MHz,CDCl3)和13C NMR谱(150MHz,CDCl3)数据
实验例3
GenkwaninIV,白色结晶(甲醇),易溶于氯仿、甲醇。[α]D 22-14.9(c 0.022,CHCl3)。
1H NMR(600MHz,CDCl3)信息给出瑞香烷型二萜的基本母核特征, 1H NMR谱中δH 8.00(2H,m),7.55(1H,m)和7.45(2H,m)的存在,提示分子中有一单取代苯基;三个甲基特征氢信号δH 1.92(3H,s),0.96(3H,d,J=6.6),0.98(3H,d,J=7.2);一个连在季碳上的羟甲基特征氢信号δH 3.47(1H,d,J=11.4)和3.95(1H,d,J=11.4);四个连氧碳上的氢信号δH 4.23(1H,d,J=10.2),4.59(1H,s),3.90(1H,s),5.79(1H,s);以及2个连在末端双键上的特征氢信号δH 5.20(1H,s,H-16)和5.19(1H,s,H-16)。13C NMR谱中可以看到27个碳信号,三个甲基碳信号δC15.9,13.6,19.2;一对末端双键碳信号δC144.8(C-15)和114.9(C-16),一组苯环上的碳信号(δC129.6×2,128.6×2,130.0,133.0);其中瑞香烷型二萜原酸酯的特征季碳信号消失,取而代之的是δC166.6的酯羰基碳信号,说明原酸酯的氧环开 裂,形成一苯甲酰氧基,δC 80.5和83.8的连氧碳信号较genkwanin II移向低场,提示6,7位氧环开裂,其化学位移值与genkwaninIII相似。
HMBC谱中,甲基氢信号δH 1.92与δC144.8(C-15),114.9(C-16),74.2有远程相关,提示存在结构片段1,说明δH 1.92与末端双键相连,为17位甲基信号。δH 0.96(δC13.6)的甲基氢信号与δC 35.9,35.8,71.8有远程相关,推出结构片段2,δH 0.98(δC15.9)的甲基氢信号与δC 34.9,31.9,74.3有远程相关,其化学环境与结构片段2相似,暂不能归属δH 0.84与0.95的甲基信号是18位还是19位甲基。H-14(δH 5.79)与δC 166.6有远程相关,提示苯甲酰氧基与C-14(δC 72.2)相连接,同时H-14(δH 5.79)还与δC35.9,71.8,45.8,80.5,74.2的碳信号有远程相关,推出结构片段3,说明与δC35.9,71.8有相关的δH 0.96为18位甲基氢信号,δH 0.98为19位甲基信号;以化合物GenkwanineIII化学位移值做参照,δH4.23(1H,d,J=10.2)确定为H-3;δH 4.59(1H,s)确定为H-5;δH 1.59(1H,m)确定为H-11;δH 1.91与δC 34.9(C-1),71.8(C-9),45.8(C-8)相关,确定为H-10;δH 1.84与δC 71.8(C-9),74.3(C-3)有相关,确定其为H-1β,δH 1.18与31.9(C-2)49.0(C-10),71.8(C-9)有相关,确定为H-1α;同时δH 1.18与δC 15.9有相关,确定δC15.9为C-19;由于δH 4.16与C-20(δC 67.4),C-6(δC 80.3),C-14(δC72.2)有远程相关,确定δH 4.16为H-7;与化合物genkwanineIII相似,还看到H-7与C-4有三根健的远程相关,7位和4位通过氧原子相连接,说明7位和4位的羟基脱水成氧环,C-4,C-5,C-6,C-7的化学位移较化合物genkwaninII均移向较低场,说明其形成五元氧环;由以上分析确定了化合物的结构,为genkwanineIII的同分异构体。经scifinder文献检索,未见相关文献报道,为一新化合物,命名为genkwaninIV。
其1H NMR谱,13C NMR谱信号归属及HMBC见表3,相关图谱见附图9-图11。
表3genkwaninIV的1H NMR谱(600MHz,CDCl3)和13C NMR谱(150MHz,CDCl3)数据
实验例4
Genkwanin V:白色结晶(甲醇),易溶于氯仿、甲醇。
1H NMR(600MHz,CDCl3)信息给出瑞香烷型二萜的基本母核特征, 1H NMR谱中δH 8.02(2H,m),7.55(1H,m)和7.42(2H,m)的存在,提示分子中有一单取代苯基;三个甲基特征氢信号δH1.82(3H,s),0.95(3H,d,J=6.6),0.91(3H,d,J=7.2);一个连在季碳上的羟甲基特征氢信号δH3.70(1H,d,J=12)和3.90(1H,d,J=12);四个连氧碳上的氢信号δH4.22(1H,d,J=10.2),5.50(1H,s),4.36(1H,s),5.91(1H,s);以及2个连在末端双键上的特征氢信号δH 5.09(1H,s,H-16)和5.07(1H,s,H-16)。13C NMR谱中可以看到27个碳信号,三个甲基碳信号δC 15.7,15.4,19.1;一对末端双键碳信号δC144.3(C-15),114.9(C-16),一组苯环上的碳信号(δC129.9×2,128.4×2,130.2,133.3);其中瑞香烷型二萜原酸酯的特征季碳信号消失,取而代之的是δC166.8的酯羰基碳信号,说明原酸酯的氧环开裂,形成一苯甲酰氧基。
HSQC谱对除季碳以外的所有碳氢信号进行了直接相关;在HMBC谱中δH 0.95(δC15.4)的甲基氢信号与δC 33.5,36.1,77.0有远程相关,推出结构片段1,δH 0.91(δC15.7)的甲基氢信号与δC 35.1,31.6,73.5有远程相关,其化学环境与结构片段1相似,暂不能归属δH 0.95与0.91的甲基信号是18位还是19位甲基。δH 1.82与δC 74.9,144.3(C-15),114.9(C-16)有相关;δH4.36(δC75.329)与δC 33.5,74.9,77.0,41.2的碳信号有远程相关;δH5.91(δC 75.330)与δC 77.0,73.6,86.1有相关,另外还与δC 166.1的羰基碳信号,及δC 63.2(C-20)有相关,推出结构片段2;结构片段2说明δH5.91为7位氢信号,而苯甲酰基于C-7相连;H-7与δC 77.0(C-9)有相关说明δH 0.95为18位甲基氢信号,0.91为19位甲基氢信号;由以上分析确定了化合物的结构。经scifinder检索,未见相关文献报道,为一新化合物,命名为genkwanin V。
其1H NMR谱,13C NMR谱信号归属及HMBC见表4,相关图谱见附图12-图15。
表4genkwaninV的1H NMR谱(600MHz,CDCl3)和13C NMR谱(150MHz,CDCl3)数据
实验例5
GenkwaninVI无定型粉末(甲醇),易溶于氯仿、甲醇。
1H NMR(600MHz,CDCl3)信息给出瑞香烷型二萜的基本母核特征,1HNMR谱中低场区可以看到两组单取代苯基信号,δH 8.06(2H,m),7.56(1H,m)和7.44(2H,m)为一苯甲酰基信号,δH7.74(2H,m),7.34(3H,m)为与瑞香烷型二萜原酸酯季碳相连的苯基信号;三个甲基特征信号δH 1.84(3H,s),1.31(3H,d,J=6.6),1.05(3H,d,J=6.6),根据文献中同类化合物的化学位移值判断其分别为17,18,19位甲基信号;一个连在季碳上的羟甲基特征氢信号δH4.02(1H,d,J=12)和5.09(1H,d,J=12)为20位羟甲基信号,较化合物genkwaninIV移向低场,说明20位连有取代基,2个连在末端双键上的特征氢信号δH 5.07(1H,s,H-16)和4.92(1H,s,H-16)。13CNMR谱中,三个甲基碳信号δC19.2,20.8,13.0;一对末端双键碳信号δC146.5(C-15)和111.2(C-16),两组苯环上的碳信号(δC129.8×3,129.2×2,128.4×2,127.9×2,126.1×2,133.2,136.0);δC 117.0为瑞香烷型二萜原酸酯的特征季碳信号;δC 166.6为苯甲酰氧基的羰基碳信号;δC 60.2和64.2的特征连氧碳信号,提示6,7位成氧环。
在HMBC谱中δH1.84(CH3-17)与δC 146.5(C-15),111.2(C-16),84.3(C-13)有远程相关,推出结构片段1;δH 1.31(CH3-18)与δC 35.3(C-11),35.9(C-12),80.0(C-9)有远程相关,推出结构片段2;δH1.05(CH3-19)与δC34.3(C-1),36.7(C-2),78.3(C-3)有远程相关,推出结构片段3;20位氢信号δH 5.09移向低场,并且与δC 166.6有远程相关,说明苯甲酰基与20位相连,δH 4.52(H-14)与δC 80.0(C-9),117.0(-C=O)有相关;δH 3.43(H-7)与δC 36.5(C-8),80.0(C-9),82.5(C-14)有远程相关;δH 3.05(1H,d,J=3.0,H-8)与δC 60.2(C-7),64.2(C-6)有远程相关;δH 2.77(H-10)与80.1(C-4),71.3(C-5),35.3(C-11)有远程相关;δH 2.77(H-11)与δC 48.6(C-10),35.3 (C-11),20.8(C-18)有远程相关;通过HMBC将1H,13C信号进行归属,并确定了化合物的结构;通过sci finder进行文献检索,未见报道,说明该化合物为一新化合物,命名为genkwaninVI。
其1H NMR谱,13C NMR谱信号归属及HMBC见表5,相关图谱见附图16-图18。
表5genkwaninVI的1H NMR谱(600MHz,CDCl3)和13C NMR谱(150MHz,CDCl3)数据
实验例6
GenkwaninVII无定型粉末(甲醇),易溶于氯仿、甲醇。
1H NMR(600MHz,CDCl3)信息给出瑞香烷型二萜的基本母核特征,1HNMR谱中低场区可以看到两组单取代苯基信号,δH 8.06(2H,m),7.63(1H,m)和7.50(2H,m)为一苯甲酰基信号,δH7.75(2H,m),7.36(3H,m)为与瑞香烷型二萜原酸酯季碳相连的苯基信号;三个甲基特征信号δH 1.84(3H,s),1.35(3H,d,J=6.6),1.14(3H,d,J=6),根据文献中同类化合物的化学位移值判断其分别为17,18,19位甲基信号;一个连在季碳上的羟甲基特征氢信号δH3.81(1H,d,J=12)和3.86(1H,d,J=12)为20位羟甲基信号,较化合物genkwaninVI移向高场,说明20不连取代基;2个连在末端双键上的特征氢信号δH 5.03(1H,s,H-16)和4.90(1H,s,H-16);δH4.84(H-3)较化合物genkwaninVI移向低场,说明3位连有取代基;13C NMR谱中,三个甲基碳信号δC 19.2,20.8,13.0;一对末端双键碳信号δC 146.5(C-15)和111.2(C-16),两组苯环上的碳信号(δC129.8×3,129.2×2,128.4×2,127.9×2,126.1×2,133.2,136.0);δC117.0为瑞香烷型二萜原酸酯的特征季碳信号;δC 166.6为苯甲酰氧基的羰基碳信号;δC60.2和64.2的特征连氧碳信号,提示6,7位成氧环。
HMBC谱中,δH 1.81(CH3-17)与δC 146.6(C-15),111.4(C-16),84.6(C-13)有远程相关,推出结构片段1;δH 1.50(CH3-18)与δC 35.5(C-11),36.3(C-12),80.5(C-9)有远程相关,δH 1.14(CH3-19)与δC36.1(C-1),36.55(C-2),82.9(C-3)有远程相关,δH 2.88(H-10)与36.1(C-1),80.5(C-9),81.8(C-5)有远程相关,3位氢信号δH 4.84移向低场,并且与δC 168.8有远程相关,说明苯甲酰基与3位相连。以上分析推出结构片段2;δH 4.49(H-14)与δC 80.5(C-9),117.6(-C=O)有相关;δH 3.43(H-7)与δC 36.59(C-8),80.5(C-9),82.7(C-14),66.3(C-20)有相关;δH 4.13(H-5)与δC 82.9(C-3),60.7(C-6),64.2(C-8)有远程相关;由以上1H NMR谱,13C NMR谱,及HMBC谱的分析确定了化合物的结构,并将信号归属;经sci finder文献检索, 未见报道,说明该化合物为一新化合物,命名为genkwaninVII。
其1H NMR谱,13C NMR谱信号归属及HMBC见表6,相关图谱见附图19-图21。
表6genkwaninVII的1H NMR谱(600MHz,CDCl3)和13C NMR谱(150MHz,CDCl3)数据
Claims (7)
2.一种如权利要求1所述的芫花中的瑞香烷型二萜类化合物的制备方法,其特征在于:该方法为:
选用瑞香科植物芫花Daphne genkwa.et zucc的干燥花蕾4000~6000g为原料,5~8倍量的体积比为60%~95%工业乙醇室温下冷浸提取15~20天,每24~48h小时减压浓缩一次,累计总浸膏500~600g,总浸膏用3~5L水混悬后,分别用氯仿,正丁醇以1:1的体积比进行萃取,萃取3~5次,得到的氯仿层干浸膏200~300g, 正丁醇层干浸膏200~300g,及浓缩后水液10~15L;
氯仿层浸膏进行快速减压柱色谱或常压柱色谱分离,沸程为30~60℃,或60~90℃的石油醚-丙酮50:1~2:1(V/V)混合溶剂梯度洗脱,每300~500ml体积为一馏分,共收集到40~50个馏分,经硅胶薄层层析检识,合并得到F1~F6的6个馏分,
馏分F4经氯仿-甲醇100:0~2:1或二氯甲烷-甲醇100:0~2:1混合溶剂梯度洗脱,得到F4-1~F4-6的6个馏分,F4-4分别经MCI gel柱色谱甲醇-水***梯度洗脱除去叶绿素,硅胶柱色谱二氯甲烷-甲醇***洗脱分离,C18反相硅胶柱色谱以及制备高效液相色谱甲醇-水***梯度洗脱分离,旋转蒸发仪回收溶剂得到白色粉末或透明状物质,化合物Genkwanin Ⅵ和Genkwanin Ⅶ;
馏分F6经氯仿-甲醇 80:0~2:1或二氯甲烷-甲醇 80:0~2:1混合溶剂梯度洗脱,得到F6-1~F6-4的4个馏分,F6-2分别经MCI gel柱色谱甲醇-水***梯度洗脱除去叶绿素,硅胶柱色谱二氯甲烷-甲醇***洗脱分离,C18反相硅胶柱色谱以及制备高效液相色谱甲醇-水***梯度洗脱分离,旋转蒸发仪回收溶剂得到白色粉末或透明状物质,化合物GenkwaninⅡ,GenkwaninⅢ,Genkwanin Ⅳ,GenkwaninⅤ。
3.根据权利要求2所述的芫花中瑞香烷型二萜类化合物的制备方法,其特征在于:该方法为:
所述的提取及萃取方法得到的氯仿层干浸膏经石油醚-丙酮***50:1~2:1(V/V)混合溶剂梯度洗脱硅胶柱层析后得到馏分F1-F6;
馏分F3 经石油醚-丙酮 80:0~2:1或二氯甲烷-甲醇100:0~2:1混合溶剂梯度洗脱,得到F3-1~F3-7的7个馏分,馏分F3-3经MCI gel柱色谱以甲醇-水或乙醇-水***梯度洗脱,收集20~50%洗脱的馏分,经C18反相硅胶柱色谱以甲醇-水***梯度洗脱,收集50~80%洗脱的馏分,经反相制备高效液相色谱分离,采用甲醇-水***梯度洗脱,回收溶剂后,共得到化合物GenkwaninⅡ,GenkwaninⅣ,GenkwaninⅤ。
4.根据权利要求2所述的芫花中瑞香烷型二萜类化合物的制备方法,其特征在于:洗脱后的馏分中含有瑞香烷型二萜的部分氯仿-甲醇***30:1~20:1展开,Rf值在0.1~0.8, 254nm紫外灯鉴别或显色剂鉴别,显色剂可以是10%硫酸显色剂,或10%硫酸偏矾酸铵-显色剂,或10%硫酸-香草醛显色剂。
5.如权利要求1所述的瑞香烷型二萜类化合物,其特征在于:所述的化合物可以与一种或多种药学上可接受的载体组成的药物组合,制成临床上可接受的剂型。
6.权利要求1所述的瑞香烷型二萜类化合在制备抗癌药物中的用途。
7.根据权利要求6所述的用途,所述的抗癌药物是针对HL-60人急性髓性白血病细胞癌症的药物。
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