CN105585574A - 一种二萜化合物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种二萜化合物及其制备方法，属于新化合物领域，具体涉及从芫花中分离得到的一种新的二萜类化合物、制备方法和该化合物的医药用途。该化合物为首次报道，可以从芫花中提取、分离纯化得到，纯度高。体外试验证明其能抑制多种乳腺癌细胞的增殖，显示出较强的体外细胞毒性，具有体外抗乳腺癌效应，具有进一步研究开发成制备治疗乳腺癌的药物。

Description

一种二萜化合物及其制备方法
技术领域
本发明属于新化合物领域，具体涉及从芫花中分离得到的一种新的二萜化合物及其制备方法。
背景技术
芫花又称紫芫花、南芫花、头痛花、药鱼草等，始载于《神农本草经》，列为下品，为传统的峻下逐水药。《本草纲目》列入毒草类，按《吴普本草》谓芫花“二月生青叶，加厚则黑，花有紫、赤、白者，三月实落尽，叶乃生。”韩保昇《蜀本草》谓“近道处处有之，苗高二三尺。叶似白前及柳叶，根皮黄似桑根，正月二月花发，紫碧色，叶未生时收。”结合《本草图经》“安徽滁州芫花”和“四川锦州芫花”附图看，古今药用芫花品种一致，其原植物均为Daphnegenkwasieb.Etzucc.无疑。《中国药典》2010版收载其为瑞香科(Thymelaeaceae)瑞香属(Daphne)植物芫花(Daphnegenkwasiebetzucc)的干燥花蕾。谢宗万曾对芫花进行了本草学考证，确证了历代本草中所记载的芫花应该为紫芫花Daphnegenkwasieb.Etzucc的干燥花蕾。该植物为全国大多数地区临床习用的品种，其野生主要产于河南、山东、江苏、安徽、四川等省，河南省主要分布在信阳、南阳等地的山区。
到目前为止，从芫花的花、花蕾、叶、枝条、根中提取分离出化合物有70多种，其中含有黄酮类成分、二萜原酸酯类成分、香豆素类成分、绿原酸类成分、木脂素类成分、酚苷类等多种成分。
芫花为传统的峻下逐水药，有毒，功能泻水逐饮，解毒杀虫，现代研究表明其具有以下药理作用：①利尿作用；②镇咳祛痰作用；③杀虫、抗寄生虫作用；④引产作用；⑤抗炎、抗肿瘤作用；⑥免疫调节作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从芫花中分离得到的一种新的二萜类化合物；
本发明的另一目的在于提供该新化合物的制备方法；
本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：
一种二萜化合物，它是具有下述结构式的化合物(Ⅰ)，
作为优选，它是从干燥的芫花中，通过如下提取步骤分离获得：
a、将干燥的芫花粉碎，乙醇热回流提取，浓缩，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；
b、步骤a中乙酸乙酯萃取物用大孔树脂除杂，依次用10％乙醇和75％乙醇洗脱，收集75％乙醇洗脱液，减压浓缩得75％乙醇洗脱物浸膏；
c、步骤b中75％乙醇洗脱浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为80:1、40:1、20:1、10:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到5个组分；
d、步骤c中组分3用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为25:1、20:1和10:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；
e、步骤d中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为70％的甲醇水溶液等度洗脱，收集9-13个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的二萜化合物。
一种上述的二萜化合物的制备方法，包括如下步骤：
a、将干燥的芫花粉碎，乙醇热回流提取，浓缩，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；
b、步骤a中乙酸乙酯萃取物用大孔树脂除杂，依次用10％乙醇和75％乙醇洗脱，收集75％乙醇洗脱液，减压浓缩得75％乙醇洗脱物浸膏；
c、步骤b中75％乙醇洗脱浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为80:1、40:1、20:1、10:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到5个组分；
d、步骤c中组分3用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为25:1、20:1和10:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；
e、步骤d中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为70％的甲醇水溶液等度洗脱，收集9-13个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物(Ⅰ)。
作为上述二萜化合物的制备方法的进一步优选方案，其中：
步骤a中的乙醇热回流提取是采用；75％乙醇热回流提取，合并提取液。
作为上述二萜化合物的制备方法的进一步优选方案，其中：
步骤a中浓缩的终点是浓缩至无醇味。
作为上述二萜化合物的制备方法的进一步优选方案，其中：
所述大孔树脂为AB-8型大孔吸附树脂。
本发明的有益效果：本发明化合物可以作为药物，具有药用价值。在用作药物时，可以直接使用，或者以药物组合物的形式使用。以药物组合物的形式使用时，该药物组合物含有治疗有效量的本发明二萜化合物(Ⅰ)，其余为药物学上可接受的、对人和动物无毒和惰性的可药用载体和/或赋形剂。可药用载体或赋形剂可以是一种或多种选自固体、半固体和液体稀释剂、填料以及药物制品辅剂。将本发明化合物制成药物组合物可以单位体重服用量的形式使用。本发明的二萜化合物(Ⅰ)在药用上的功效在于：本发明的二萜化合物(Ⅰ)可显著诱导乳腺癌细胞凋亡，发挥抗肿瘤作用。具体是，化合物Ⅰ可使三种乳腺癌细胞增殖活性降低，显著抑制其增殖，显示出较强的体外细胞毒性，具有体外抗乳腺癌效应。
作为临床药物时，本发明药物可通过口服或注射的形式施用于需要治疗的患者。用于口服时，可将其制成片剂、缓释片、控释片、胶囊、滴丸、微丸、混悬剂、乳剂、散剂或颗粒剂、口服液等；用于注射时，可制成灭菌的水性或油性溶液、无菌粉针、脂质体或乳剂等。
附图说明
图1为化合物(Ⅰ)结构式；
图2为不同剂量化合物(Ⅰ)对乳腺癌细胞增殖活力的影响；
图3为不同剂量化合物(Ⅰ)对乳腺癌细胞凋亡的影响。
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
实施例1：化合物(Ⅰ)分离制备及结构确证
药材和试剂来源：乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷为分析纯，购自上海凌峰化学试剂有限公司，甲醇，分析纯，购自江苏汉邦化学试剂有限公司。芫花购自安徽亳州中药材市场，产地福建。
制备方法：(a)芫花(8kg)粉碎至绿豆大小，用75％乙醇热回流提取(25L×3次)，合并提取液，浓缩至无醇味(6L)，依次用石油醚(6L×3次)、乙酸乙酯(6L×3次)和水饱和的正丁醇(6L×3次)萃取，浓缩，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物(315g)和正丁醇萃取物；(b)步骤(a)中乙酸乙酯萃取物用纯净水溶解至2L，医用脱脂棉过滤，滤液用AB-8型大孔树脂(1.5kg)分离，依次用10％乙醇(10L)和75％(12L)乙醇洗脱，收集75％乙醇洗脱液，减压浓缩得75％乙醇洗脱物浸膏(155g)；(c)步骤(b)中75％乙醇洗脱浸膏用200-300目正相硅胶分离，依次用体积比为80:1(10个柱体积)、40:1(8个柱体积)、20:1(8个柱体积)、10:1(8个柱体积)和1:1(5个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到5个组分；(d)步骤(c)中组分3(36g)用200-300目正相硅胶进一步分离，依次用体积比为25:1(8个柱体积)、20:1(8个柱体积)和10:1(5个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；(e)步骤(d)中组分2(12g)用十八烷基硅烷键合的反相硅胶ODS-C18分离，用体积百分浓度为70％的甲醇水溶液等度洗脱，收集9-13个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物(Ⅰ)(25mg)。
结构确证：HR-ESIMS显示[M+Na]+为m/z401.1612，结合核磁特征可得分子式为C20H26O7，不饱和度为8。核磁共振氢谱数据δH(ppm,DMSO-d6,500MHz)：H-1(1.95，m)，H-1(2.07，m)，H-2(1.63，m)，H-2(2.86，m)，H-3(4.63，m)，H-4(1.98，br，s)，H-6(4.61，t，J＝8.9)，H-7(2.26，dd，J＝14.4，8.4)，H-7(1.80，dd，J＝14.4，9.6)，H-10(2.24，m)，H-11(2.20，dd，J＝14.4，8.4)，H-11(2.33，dd，J＝14.4，6.0)，H-12(5.29，dd，J＝8.4，6.0)，H-14(6.28，br，s)，H-15(7.38，br，s)，H-16(7.35，br，s)，H-17(1.21，s)，H-19(1.37，s)，H-20(5.25，s)；核磁共振碳谱数据δC(ppm,DMSO-d6，125Hz)：18.2(CH2，1-C)，25.0(CH2，2-C)，72.1(CH，3-C)，54.9(CH，4-C)，39.1(C，5-C)，84.6(CH，6-C)，41.8(CH2，7-C)，73.2(C，8-C)，56.0(C，9-C)，42.7(CH，10-C)，40.0(CH2，11-C)，70.6(CH，12-C)，128.9(C，13-C)，108.2(CH，14-C)，144.0(CH，15-C)，138.5(CH，16-C)，26.9(CH3，17-C)，177.8(C，18-C)，29.6(CH3，19-C)，105.8(CH，20-C)；碳原子标记参见图1。IR光谱显示该化合物含有羟基和内酯基团(3444cm-1和1770cm-1)。NMR谱数据表明该化合物含有一个典型的β-单取代呋喃环[δH6.28(br，s，H-14)，7.38(br，s，H-15)，和7.35(br，s，H-16)；δC128.9(C-13)，108.2(C-14)，144.0(C-15)，和138.5(C-16)〕，一个酯羰基[δC177.8(C-18)]，三个含氧次甲基[δC72.1(C-3)，84.6(C-6)，和70.6(C-12)]，连氧季碳[δC73.2(C-8)]和两个甲基[δH1.21(3H，s，H3-17)和1.37(3H，s，H3-19)]。根据它的分子式和NMR数据，该化合物鉴定为高含氧二萜类化合物。1H-1HCOSY谱表明C-1与C-4，C-6与C-7，C-11与C-12以及C-14与C-15具有相关性。HMBC谱中，H3-19与C-4，C-5，C-6，和C-10以及H3-17与C-7，C-8和C-9的相关性表明化合物为含有5,8-二甲基以及3,6,8-三含氧的六元二环双萜。HMBC谱中H-6与C-18以及H-3与C-18的相关性，表明存在一个γ-内酯环。此外根据HMBC谱中H-12与C-14和C-16的相关性，可推断呋喃环位于C-12位上。NOESY谱中H3-19与H-4，H-6和H-10相关性表明，它们均为α构型。H-16和H3-17的相关性表明CH3-17为β构型。此外，H3-17与H-20的相关性表明H-20、H-11和H-7为β构型。此该化合物结构如图1所示。
实施例2：化合物(Ⅰ)药理作用试验
一、材料和仪器
DMEM/F12高糖培养液购于北京Hyclone公司。改良型RPMI-l640培养基购于北京Hyclone公司。标准胎牛血清购于天津TBD公司。CCK-8细胞活力检测试剂购于日本株式会社同仁化学研究所。AnnexinV-FITC/PI凋亡检测试剂盒购于上海炎彬化工科技有限公司。JC-1线粒体膜电位探针购于江苏碧云天生物技术研究所。二甲基亚矾(DMSO)和磷酸盐缓冲溶液(PBS)购于Sigma公司产品。
-70℃低温冰箱(FormaScientificInc.公司，美国)，电子天平(岛津AEL-200型，日本)，超净工作台(SW-CJ-IC型，苏州)，恒温振荡器(THZ一C型，国产)，高压蒸汽消毒锅(YX-400B型，国产)，CO2细胞培养箱(FormaSeriesⅡ，Thermalelectroncorp.，美国)，恒温水浴锅(BHW2-I型，国产)，倒置相差显微镜(CK40型，Olympus，日本)，显微镜(BX51型，Olympus，日本)，显微数码采集***(DP71型，Olympus，日本)，多功能酶标仪(InfiniteM200型，TECAN，瑞士)，台式室温高速离心机(TGL-16G型，北京)，台式低温高速离心机(2K15型，sigma公司，美国)，BL60电子天平(北京赛多利斯仪器***有限公司)，LD4-40大容量离心机(北京京立离心机有限公司)，2K15高温低速冷冻离心机(sigma公司)，UV765紫外分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)，激光共聚焦扫描显微镜(MRC-1024型，Bio-Rad，英国)。
二、试验方法
1、细胞株及培养
选用乳腺癌MCF-7细胞(***受体阳性ER+，人类表皮生长因子受体-2阴性HERZ/neu-)、乳腺癌MDA-MB-231细胞(ER-，HERZ/neu-)和乳腺癌MDA-MB-453(ER-，HERZ/neu+)细胞株，三种细胞株均来自于中国科学院生物化学与细胞生物学研究所。MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞培养于含10％标准胎牛血清的DMEM/F12高糖培养液中，MDA-MB-453细胞培养于含10％标准胎牛血清的RPMI-1640培养液中，以上细胞均于37℃、5％CO2条件下常规培养传代。三种乳腺癌细胞均为贴壁细胞，贴壁细胞的传代：待细胞贴壁生长2～3d至80％融合时，弃去旧培养液，用适量的0.1mol/LPBS(pH7.4)漂洗细胞2次后向瓶内加入适量0.25％的胰酶(pH7.4)的0.1mol/LPBS配制，过滤除菌。消化，以刚好盖住细胞培养瓶底部为宜，光镜下观察，待细胞质回缩，细胞间隙增大后，立即加入新鲜的培养液终止消化，并用吸管轻轻反复吹打，使细胞脱离瓶底形成细胞悬液；调整细胞浓度，吸取适量细胞悬液加入新培养瓶中，加入6mL新鲜培养基，显微镜下观察，放置于细胞培养箱。
2、细胞增殖活力检测
利用CCK-8法检测化合物(Ⅰ)对三种乳腺癌细胞增殖活力的影响。CCK-8试剂盒(CellCountingKit-8)是由日本同仁化学研究所开发的检测细胞增殖的试剂盒，CCK-8试剂中含有WST-8[2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐]，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯(1-MethoxyPMS)的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲臜产物，生成的甲臜物的数量与活细胞的数量成正比。用酶标仪在450nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。
具体操作为：将对数生长期的乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-453常规传代，细胞计数，以2.5×105/mL细胞浓度接种于96孔细胞培养板内，每孔200μL，培养过夜，待细胞贴壁且生长良好。实验分5组，每组作6个平行孔，分别加入不同量的化合物(Ⅰ)，使其终浓度分别为200、150、100、50mg/mL，对照组加等量蒸馏水，培养24h，弃掉培养液，以PBS洗3次，加入新鲜培养液每孔200μL，然后每孔加入10μLCCK-8，培养4h收获细胞，以酶标仪检测450nm处光密度值[D(450)]，以蒸馏水空白调零，计算不同浓度化合物(Ⅰ)作用的增殖抑制率。
细胞增殖抑制率＝[对照D(450)一实验组D(450)]/对照D(450)×100％
3、细胞凋亡的检测
利用AnnexinV/PI双染流式细胞分析技术检测化合物(Ⅰ)对乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-453凋亡的影响。实验严格按照AnnexinV凋亡检测试剂盒操作说明进行。具体操作为：将对数生长期的乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-453常规传代，细胞计数，以105/mL细胞浓度接种于6孔细胞培养板内，每孔5mL，培养过夜，待细胞贴壁且生长良好。实验分5组，每组作3个平行孔，分别加入不同剂量的化合物(Ⅰ)，使其终浓度分别为150、100、50mg/mL，对照组加等量蒸馏水，培养24h，弃掉培养液，用4℃预冷的PBS(pH7.2)洗细胞3次，常规胰酶消化，制作单细胞悬液，离心，用250μL稀释的binding缓冲液重新悬浮细胞，并使其浓度为1×106/mL，取100μL的细胞悬液于5mL流式管中，加5μLAnnexinV/FITC溶液，静置5min，加入20μg/mL的PI溶液10μL，混匀后于室温避光放置10min，在反应管中加400μLPBS，利用流式细胞仪上机检测各组荧光状况。细胞根据AnnexinV和PI染色情况分别分至4个相，AnnexinV和PI染色均阴性细胞为正常存活细胞，PI染色阳性、AnnexinV染色阴性为机械损伤或破裂细胞，AnnexinV和PI染色均阳性为坏死或晚期凋亡细胞，AnnexinV染色阳性、PI染色阴性判定为早期凋亡细胞。
4、细胞线粒体膜电位的检测
利用细胞线粒体膜电位分子探针JC-1和激光共聚焦扫描显微镜检测化合物(Ⅰ)对乳腺癌细胞MBA-MD-453线粒体膜电位的影响。具体操作为：将对数生长期的乳腺癌细胞MDA-MB-453常规传代，细胞计数，以105/mL细胞浓度接种于6孔细胞培养板内，每孔5mL，培养过夜，待细胞贴壁且生长良好实验分5组，每组作3个平行孔，分别加入不同剂量的化合物(Ⅰ)，使其终浓度分别为150、100、50mg/mL，对照组加等量蒸馏水，培养24h，弃掉培养液，用4℃预冷的PBS(pH7.2)洗细胞3次，加入1.0mLPBS，加入10μL2.5mmol/L的JC-l，使其终浓度为25μmol/L，在37℃、5％CO2培养箱内避光孵育20min，用PBS洗涤3次，激光共聚焦扫描显微镜检测分析。
5、数据的统计分析
所有数据均以平均数士标准差表示，采用SPSS12.0统计软件，对实验结果进行单因素方差分析，P<0.05认为两者间存在显著差异。
三、结果及结论
1、细胞增殖活力检测结果
利用CCK-8法检测不同浓度化合物(Ⅰ)作用对三种乳腺癌细胞增殖活力的影响，结果表明，化合物(Ⅰ)作用可使三种乳腺癌细胞增殖活性均降低，且随作用浓度的增加降低程度增加，显示出剂量-效应关系，100、150和200mg/mL组与对照组相比均出现显著性差异(P<0.05，P<0.01)，化合物(Ⅰ)作用可显著抑制乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-453的增殖，显示出较强的体外细胞毒性，表明化合物(Ⅰ)具有较强的体外抗乳腺癌效应。结果见图2和表1。
表1不同剂量化合物(Ⅰ)对乳腺癌细胞增殖的抑制率(％)
50mg/mL 100mg/mL 150mg/mL 200mg/mL
MDA-MB-453细胞 14.80 29.80 33.10 44.30
MDA-MB-231细胞 11.40 24.00 30.60 37.50
MCF-7细胞 10.30 20.20 26.20 35.10
2、细胞凋亡的检测结果
利用AnnexinV/PI双染流式细胞分析技术检测化合物(Ⅰ)对乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-453凋亡的影响，凋亡分析结果显示，化合物(Ⅰ)作用24h可使三种乳腺癌细胞的凋亡率均升高，显示出促凋亡效应，且具有剂量-效应关系，100和150mg/mL组与对照组相比具有显著差异(P<0.05)表明化合物(Ⅰ)可显著诱导乳腺癌细胞凋亡，发挥抗肿瘤作用。结果见图3。
总结，本研究通过对化合物Ⅰ抗乳腺癌作用研究，发现化合物Ⅰ可使三种乳腺癌细胞增殖活性降低，显著抑制其增殖，显示出较强的体外细胞毒性，具有体外抗乳腺癌效应。
实施例3
片剂的制备：按实施例1方法先制得化合物(Ⅰ)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按其与赋形剂重量比为1:9的比例加入赋形剂，制粒压片。
实施例4
口服液的制备：按实施例1方法先制得化合物(Ⅰ)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按常规口服液制法制成口服液。
实施例5
胶囊剂或颗粒剂的制备：按实施例1方法先制得化合物(Ⅰ)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按其与赋形剂重量比为1:9的比例加入赋形剂，制成胶囊或颗粒剂。
实施例6
注射液的制备：按实施例1方法先制得化合物(Ⅰ)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按常规加注射用水，精滤，灌封灭菌制成注射液。
实施例7
无菌粉针的制备：按实施例1方法先制得化合物(Ⅰ)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，将其溶于无菌注射用水中，搅拌使溶，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于安瓿中，低温冷冻干燥后无菌熔封得粉针剂。

Claims (6)

1.一种二萜化合物，其特征在于：它是具有下述结构式的化合物(Ⅰ)，
2.根据权利要求1所述的二萜化合物，其特征在于：它是从干燥的芫花中，通过如下提取步骤分离获得：
a、将干燥的芫花粉碎，乙醇热回流提取，浓缩，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；
b、步骤a中乙酸乙酯萃取物用大孔树脂除杂，依次用10％乙醇和75％乙醇洗脱，收集75％乙醇洗脱液，减压浓缩得75％乙醇洗脱物浸膏；
c、步骤b中75％乙醇洗脱浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为80:1、40:1、20:1、10:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到5个组分；
d、步骤c中组分3用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为25:1、20:1和10:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；
e、步骤d中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为70％的甲醇水溶液等度洗脱，收集9-13个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的二萜化合物。
3.权利要求1所述的二萜化合物的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
a、将干燥的芫花粉碎，乙醇热回流提取，浓缩，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；
b、步骤a中乙酸乙酯萃取物用大孔树脂除杂，依次用10％乙醇和75％乙醇洗脱，收集75％乙醇洗脱液，减压浓缩得75％乙醇洗脱物浸膏；
c、步骤b中75％乙醇洗脱浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为80:1、40:1、20:1、10:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到5个组分；
d、步骤c中组分3用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为25:1、20:1和10:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；
e、步骤d中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为70％的甲醇水溶液等度洗脱，收集9-13个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物(Ⅰ)。
4.根据权利要求3所述的二萜化合物的制备方法，其特征在于：
步骤a中的乙醇热回流提取是采用；75％乙醇热回流提取，合并提取液。
5.根据权利要求3所述的二萜化合物的制备方法，其特征在于：
步骤a中浓缩的终点是浓缩至无醇味。
6.根据权利要求3所述的二萜化合物的制备方法，其特征在于：
所述大孔树脂为AB-8型大孔吸附树脂。
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