CN118166016A - 多形汉逊酵母中游离在染色体外的稳定质粒及其构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种能在多形汉逊酵母中游离在染色体外的稳定质粒，所述质粒为环形双链DNA分子，所述质粒含有选择性标记基因表达盒、大肠杆菌复制起点ORI、乳清酸核苷‑5‑磷酸脱羧酶基因表达盒、用于启动外源基因转录的启动子、多形汉逊酵母着丝粒序列和自主复制序列。本发明的质粒有多形汉逊酵母的5号染色体、1号染色体或2号染色体的着丝粒区域，以及多形汉逊酵母HPURA3表达盒，无需线性化，可直接转化多形汉逊酵母，转化效率约1.2×103，质粒拷贝数为1。利用本发明构建的质粒可在多形汉逊酵母中表达不同来源的蛋白，扩大多形汉逊酵母在代谢工程和合成生物学方面的应用。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种多形汉逊酵母中游离在染色体外的稳定质粒的构建方法。
背景技术
多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)属于甲醇营养型酵母，是公认安全的微生物(Generally regarded as safe,GRAD)。多形汉逊酵母作为单细胞低等真核生物，易培养，繁殖快，可利用多种底物，无毒性代谢产物，可耐受50℃高温，对金属胁迫和氧胁迫等多种环境胁迫具有更高的耐受性；特别的，多形汉逊酵母具有与高等真核生物相似的蛋白修饰机制，在重组蛋白翻译后修饰的过程中进行适度糖基化可降低免疫原性，这些特点使其成为生产医药用蛋白的重要宿主，多形汉逊酵母表达***近年来迅速发展成为生物工程领域中备受关注的细胞工厂之一。
多形汉逊酵母菌株基因组测序和部分注释也已经完成，但在多形汉逊酵母中的已报道质粒基本都为整合质粒，个别质粒能以游离状态暂时存在，但极不稳定，后期会整合到基因组上。由于多形汉逊酵母菌株体内缺乏稳定复制的游离质粒，在多形汉逊酵母遗传操作中，首先需将目标蛋白表达盒连入质粒并将质粒线性化后再进行转化，通过质粒上的同源DNA片段定点整合到基因组的特定位置。多形汉逊酵母体内主要存在的是非同源性末端接合途径(NHEJ)的DNA双链缺口修复***，外源基因的整合大都是随机整合到基因组上，同源重组率低，这就需要大量的后续实验来验证外源基因是否正确整合到所设计的基因组特定位点上。多形汉逊酵母中缺乏稳定的游离质粒限制了它在代谢工程和合成生物学方面的应用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何在多形汉逊酵母中构建稳定的游离质粒，以及如何利用构建的质粒表达不同来源(外源)的蛋白。
着丝粒是真核生物染色体上的重要功能元件。在不同的物种中，着丝粒染色质的结构具有多样性，着丝粒的序列和大小都差异显著。多形汉逊酵母菌株DL-1的7条染色体中间有一段10-20kb的AT富集区，只有极少的蛋白编码基因，推测可能为多形汉逊酵母的着丝粒区。本发明通过在多形汉逊酵母中挖掘其着丝粒及其相邻的自主复制序列，以此为基础构建在多形汉逊酵母中可以游离在染色体外的稳定质粒。
为了解决上述技术问题，本发明首先提供了一种多形汉逊酵母中游离在染色体外的稳定质粒，所述质粒为环形双链DNA分子，所述质粒含有选择性标记基因表达盒、大肠杆菌复制起点ORI、乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶基因表达盒、用于启动外源基因转录的启动子、多形汉逊酵母着丝粒序列和自主复制序列。
上述质粒中，所述质粒还含有用于***外源基因的多克隆位点。
上述质粒中，所述选择性标记基因可为氨苄青霉素抗性基因(AmpR)，可用于大肠杆菌中质粒的筛选，具体所述选择性标记基因表达盒的核苷酸序列可如SEQ IDNo.1第4267-5402位所示，其中第5298-5402位为AmpR启动子，第4437-5297位为氨苄青霉素抗性基因AmpR，第4267-4436位为AmpR终止子。
上述质粒中，所述大肠杆菌复制起点ORI的核苷酸序列可如SEQ ID No.1第3678-4266位所示。
上述质粒中，所述乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶基因表达盒为表达氨基酸序列是SEQID No.5的蛋白质的双链DNA分子。
上述质粒中，所述乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶基因表达盒的核苷酸序列可如SEQID No.1第397-1701位所示，其中第397-678位为HPURA3启动子，第679-1470位为乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶基因(HPURA3)的编码序列(CDS)，编码氨基酸序列为SEQ ID No.5的蛋白质，第1471-1701位为HPURA3终止子。
上述质粒中，所述用于启动外源基因转录的启动子可为组成型启动子，具体可为启动子GAPp，所示启动子GAPp的核苷酸序列可如SEQ ID No.1第1702-2497位所示。
上述质粒中，所述多形汉逊酵母着丝粒序列和自主复制序列为如下任一种：
A1、多形汉逊酵母5号染色体的着丝粒序列和自主复制序列；
A2、多形汉逊酵母1号染色体的着丝粒序列和自主复制序列；
A3、多形汉逊酵母2号染色体的着丝粒序列和自主复制序列。
上述质粒中，所述多形汉逊酵母5号染色体的着丝粒序列和自主复制序列为SEQID No.2；所述多形汉逊酵母1号染色体的着丝粒序列和自主复制序列为SEQ IDNo.3；所述多形汉逊酵母2号染色体的着丝粒序列和自主复制序列为SEQ ID No.4的。
上述质粒中，所述质粒一条链的核苷酸序列为如下任一种：
B1、为将SEQ ID No.1第171-396位替换为SEQ ID No.2，保持SEQ ID No.1其它序列不变；
B2、为将SEQ ID No.1第171-396位替换为SEQ ID No.3，保持SEQ ID No.1其它序列不变；
B3、为将SEQ ID No.1第171-396位替换为SEQ ID No.4，保持SEQ ID No.1其它序列不变。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种DNA分子，所述DNA分子由多形汉逊酵母着丝粒序列和自主复制序列组成。
上述DNA分子中，所述DNA分子的核苷酸序列为如下任一种：
C1、为SEQ ID No.2；
C2、为SEQ ID No.3；
C3、为SEQ ID No.4。
本发明还提供了生物材料，所述生物材料为含有权利要求7或8所述DNA分子的表达盒、载体或重组微生物。
为构建多形汉逊酵母中游离在染色体外的稳定质粒，本发明还提供了初始质粒，所述质粒为环形双链DNA分子，所述质粒含有选择性标记基因表达盒、大肠杆菌复制起点ORI、乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶基因表达盒、用于启动外源基因转录的启动子、和lacZα编码序列。
所述lacZα编码序列的核苷酸序列可为SEQ ID No.1的第171-396位。
所述初始质粒可为质粒PGG，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
本发明还提供所述的DNA分子和/或所述初始质粒在构建游离在染色体外的质粒中的应用。
本发明还提供一种能在多形汉逊酵母中游离在染色体外的稳定质粒的构建方法，包括如下步骤：以多形汉逊酵母着丝粒序列和自主复制序列替换初始质粒的lacZα编码序列，保持初始质粒的其它序列不变，获得能在多形汉逊酵母中游离在染色体外的稳定质粒。
上述方法中，所述方法具体可包括如下步骤：以多形汉逊酵母着丝粒序列和自主复制序列替换质粒PGG中SEQ ID No.1的第171-396位序列，保持质粒PGG的其它序列不变，获得能在多形汉逊酵母中游离在染色体外的稳定质粒。
上述方法中，所述多形汉逊酵母着丝粒序列和自主复制序列为如下任一种：
A1、多形汉逊酵母5号染色体的着丝粒序列和自主复制序列；
A2、多形汉逊酵母1号染色体的着丝粒序列和自主复制序列；
A3、多形汉逊酵母2号染色体的着丝粒序列和自主复制序列。
上述方法中，所述多形汉逊酵母5号染色体的着丝粒序列和自主复制序列为SEQID No.2；所述多形汉逊酵母1号染色体的着丝粒序列和自主复制序列为SEQ IDNo.3；所述多形汉逊酵母2号染色体的着丝粒序列和自主复制序列为SEQ ID No.4的。
本发明还提供上述质粒、上述DNA分子、上述生物材料、上述初始质粒和/或上述方法在多形汉逊酵母相关代谢工程和/或合成生物学中的应用。
本发明构建了一种可在多形汉逊酵母和大肠杆菌中穿梭，并在多形汉逊酵母中稳定遗传的游离质粒，该质粒具有多形汉逊酵母的5号染色体、1号染色体或2号染色体的着丝粒序列和自主复制序列，以及多形汉逊酵母乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶基因HPURA3表达盒。该质粒无需线性化，可直接转化多形汉逊酵母，转化效率为1.2×103，质粒拷贝数为1。利用本发明构建的质粒可在多形汉逊酵母中表达不同来源的蛋白，扩大多形汉逊酵母在代谢工程和合成生物学方面的应用。
附图说明
图1为本发明实施例1中质粒PGG-CEN5-2.6K的图谱。
图2为本发明实施例1中流式细胞仪分析菌株HPGG-CEN5-2.6K的传代稳定性的结果。
图3为本发明实施例1中质粒PGG-CEN1-3.1K的图谱。
图4为本发明实施例1中流式细胞仪分析菌株HPGG-CEN1-3.1K的传代稳定性的结果。
图5为本发明实施例1中质粒PGG-CEN2-2.5K的图谱。
图6为本发明实施例1中流式细胞仪分析菌株HPGG-CEN2-2.5K的传代稳定性的结果。
保藏说明
生物材料的分类命名：多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)
生物材料的菌株编号：HP20110424
生物材料的保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
生物材料的保藏单位简称：CGMCC
生物材料的保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101
生物材料的保藏日期：2017年05月02日
生物材料的保藏中心登记入册编号：CGMCC No.7.89
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
1、试剂菌株质粒
本发明所用野生型多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)菌HP20110424，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号：CGMCCNo.7.89。
本发明所用尿嘧啶营养缺陷型多形汉逊酵母菌HP7.89-ura3的构建方法记载于专利“尿嘧啶营养缺陷型多形汉逊酵母及其制备方法与应用(申请号201710338267.5，公开号CN107418967A)”中。
质粒PUC19记载于如下文献中：Iakubovich NV,Zemlianaia NIu,Ermakova LM,Novikova IS,Krylova MD.Klonirovanie v.Escherichia coli mutantnogo gena,kodiruiushchegotoksin[Cloning in Escherichia coli of the mutant genecoding the diphtheria toxin].Mol Gen Mikrobiol Virusol.1985Jan；(1):17-22.Russian.PMID:3025674。公众可以从申请人处获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。
质粒pYC-AGA记载于如下文献中：“Zhou C,Li M,Lu S,Cheng Y,Guo X,He X,WangZ,He XP.Engineering of cis-Element in Saccharomyces cerevisiae for EfficientAccumulation of Value-Added Compound Squalene via Downregulation of theDownstream Metabolic Flux.J Agric Food Chem.2021Oct 27；69(42):12474-12484.doi:10.1021/acs.jafc.1c04978.Epub 2021Oct 18.PMID:34662105.”公众可以从申请人处获得，以重复本申请实验。
2、培养条件
常规培养，酵母菌常规培养用YPD培养基，液体培养在37℃、200rpm条件下进行，固体培养在37℃静置培养。
实施例中用到的各种培养平板：
YPD固体培养基：该培养基由溶质和溶剂组成；溶质为酵母粉、蛋白胨、葡萄糖和琼脂粉，溶剂为水；溶质的浓度如下：10g/L酵母粉、20g/L蛋白胨、20g/L葡萄糖和20g/L琼脂粉，自然pH。
SD固体培养基：该培养基由溶质和溶剂组成；溶质为酵母基础氮源(YeastNitrogen Base，YNB)、葡萄糖和琼脂粉，溶剂为水；溶质的浓度如下：6.7g/L YNB、10g/L葡萄糖和20g/L琼脂粉，自然pH。
SD+URA固体培养基：该培养基由溶质和溶剂组成；溶质为酵母基础氮源(YeastNitrogen Base，YNB)、葡萄糖、尿嘧啶和琼脂粉，溶剂为水；溶质的浓度如下：6.7g/L YNB、10g/L葡萄糖、20mg/L尿嘧啶和20g/L琼脂粉，自然pH。
以上培养基的液体培养基由不添加其中的琼脂粉制成，其余成分以及浓度与相应固体培养基相同。
下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA的3′末端核苷酸。
实施例1
1着丝粒骨架质粒的构建
以质粒PUC19为模板，以P19-F和P19-R组成的引物对扩增出2430bp的包含AmpR(氨苄青霉素抗性基因)表达盒(作为选择性标记基因表达盒)和大肠杆菌复制起点ORI的质粒骨架，称为AMP-ORI片段(核苷酸序列如SEQ ID No.1的第3678-5402位所示，其第3678-4266位核苷酸为大肠杆菌复制起点ORI，第4267-5402位为氨苄青霉素抗性基因表达盒)。
P19-F:TGAACTATACAAATAATAATTTTTTTGTTTTTTATGTCTgagtcgacctgcaggc atgc(其中大写字母指示的序列与引物SUPt-R的第7-45位序列反向互补，小写字母指示的序列为质粒PUC19中β-半乳糖苷酶N端α片段(lacZα)的编码区前端同源臂序列)；
P19-R:GAAACATGTTTGAACAAGTGCGCTGtacaatctgctctgatgccgc。(其中大写字母指示的序列与引物HPURA-F的第26-50位序列反向互补，小写字母指示的序列为质粒PUC19中β-半乳糖苷酶N端α片段(lacZα)的编码区中间同源臂序列)
以野生型多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)菌HP20110424的基因组为模板，以HPURA-F和HUPRA-R组成的引物扩增出1305bp乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶基因的HPURA3表达盒，称为HPURA3片段(核苷酸序列如SEQ ID No.1的第397-1701位所示)。引物序列如下：
HPURA-F:cgacgttgtaaaacgacggccagtgCAGCGCACTTGTTCAAACATGTTTC(其中大写字母指示的序列与引物P19-R的第1-25位序列反向互补，小写字母指示的序列为多形汉逊酵母菌HP20110424基因组中HPURA3表达盒上游同源臂序列)；HPURA-R:ggtcgatatcaccaaaacggcattgagcaaaggCGGCGTCGCTTCTTCAAACTC(其中大写字母指示的序列与引物GAPp-F的第12-32位序列反向互补，小写字母指示的序列为多形汉逊酵母菌HP20110424基因组中HPURA3表达盒下游同源臂序列)。
以野生型多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)菌HP20110424的基因组为模板，以GAPp-F和GAPp-R组成的引物扩增出796bp GAP启动子GAPp(作为用于启动外源基因转录的启动子)，称为GAPp片段(核苷酸序列如SEQ ID No.1的第1702-2497位所示)。引物序列如下：
GAPp-F:GAATTATAGTAGAGTTTGAAGAAGCGACGCCGcctttgctcaatgccgttttgg
(其中大写字母指示的序列与引物HPURA-R的第34-54位序列反向互补，小写字母指示的序列为多形汉逊酵母菌HP20110424基因组中启动子GAPp上游同源臂序列)；
GAPp-R:GTGAAAAGTTCTTCTCCTTTACTCATattgtttctatattatctttgtactaaagagc(其中大写字母指示的序列与引物GFP-F的第33-58位序列反向互补，小写字母指示的序列为多形汉逊酵母菌HP20110424基因组中启动子GAPp下游同源臂序列)。
以质粒pYC-AGA为模板，以GFP-F和SUPt-R组成的引物对扩增出740bp GFP ORF和SUPt终止子，称为GFP-ORF-SUPt片段(核苷酸序列如SEQ ID No.1的第2498-3237位所示)。
GFP-F:gctctttagtacaaagataatatagaaacaatATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCAC(其中大写字母指示的序列与引物GAPp-R的第1-26位序列反向互补，小写字母指示的序列为质粒pYC-AGA中GFP的上游同源臂序列)；
SUPt-R:
cgactcAGACATAAAAAACAAAAAAATTATTATTTGTATAGTTCATCCATGCCATG TG(其中第7-45位序列与引物P19-F的第1-39位序列反向互补，小写字母指示的序列为质粒pYC-AGA中SUPt终止子的下游同源臂序列)；
将上述4个DNA片段(AMP-ORI片段、HPURA3片段、GAPp片段和GFP-ORF-SUPt片段)纯化回收，利用一步克隆试剂盒进行连接，
转化大肠杆菌感受态，涂布于100μg/mL氨苄青霉素LB平板上，37℃静置培养。利用M13-F和M13-R组成的引物对对长出的转化子单菌落进行PCR验证，将验证正确的质粒进行测序，测序结果与预期一致，该质粒命名为PGG，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示)。
M13-F:gtaaaacgacggccagt；
M13-R:caggaaacagctatgac。
利用限制性内切酶BstXⅠ单酶切质粒PGG(SEQ ID No.1的第481-492位为BstXⅠ酶识别序列)，将其通过电转化转入尿嘧啶缺陷型菌株HP7.89-ura3(按照专利“尿嘧啶营养缺陷型多形汉逊酵母及其制备方法与应用”，申请号201710338267.5，公开号CN107418967A记载的方法构建)，通过在SD固体培养基的平板上筛选转化子，进一步通过引物HPURAt-F和M13-R进行PCR验证(可以扩增出1611bp的DNA片段)，获得线性化质粒整合到染色体上的菌株，将该菌株命名为HPGG。
HPURAt-F:AGTTTGAAGAAGCGACGCCG；
M13-R:caggaaacagctatgac。
2多形汉逊酵母5号染色体着丝粒质粒的构建
以野生型多形汉逊酵母菌HP20110424(CGMCC No.7.89)基因组为模板，设计引物CEN5-2-F和CEN5-2-R扩增出2615bp的CEN5-2 DNA片段(核苷酸序列如SEQ ID No.2所示)。
CEN5-2-F:ctatgcggcatcagagcagattgtaTTGAACCTGCTACCATGCACCT(第1-25位与引物Plasmid-R反向互补，第26-47位和SEQ ID No.2的第1-22位相同)；CEN5-2-R:GAAACATGTTTGAACAAGTGCGCTGGAGTGTATAGATGGCCACCT GT(第1-25位和Plasmid-F反向互补，第26-47位和SEQ ID No.2的第2764-2785位反向互补)。
利用限制性内切酶KasⅠ酶切质粒PGG(SEQ ID No.1的第235-240位为KasⅠ酶识别序列)，回收线性化后的质粒DNA片段为模板，以引物Plasmid-F和Plasmid-R扩增出5271bp的质粒骨架。
Plasmid-F:CAGCGCACTTGTTCAAACATGTTTC(和引物CEN5-2-R的第1-25位反向互补)
Plasmid-R:tacaatctgctctgatgccgc(和引物CEN5-2-F的第1-25位反向互补)
通过一步克隆法将5号染色体着丝粒序列与其相邻的自主复制序列(CEN5-2DNA片段，核苷酸序列如SEQ ID No.2所示)与质粒骨架连接。
利用VC-TF和HPURAP-MR组成的引物对进行PCR验证。
VC-TF:gacggtcacagcttgtctgtaag
HPURAP-MR:TGTTTGAACAAGTGCGCTG
进一步进行测序分析，将测序结果正确的质粒命名为PGG-CEN5-2.6K(如图1所示)。PGG-CEN5-2.6K是将质粒PGG上的lacZα编码序列(SEQ ID No.1的第171-396位)替换为5号染色体着丝粒序列和与其相邻的自主复制序列DNA片段(CEN5-2 DNA片段，核苷酸序列如SEQ ID No.2所示)，保持质粒PGG其它序列不变，得到的环形重组质粒。PGG-CEN5-2.6K(核苷酸序列为将SEQ ID No.1的第171-396位替换为SEQ ID No.2，保持SEQ ID No.1其它序列不变)为环形双链DNA分子，所述质粒含有选择性标记基因表达盒(SEQ ID No.1第4267-5402位为AmpR表达盒，其中第5298-5402位为AmpR启动子，第4437-5297位为氨苄青霉素抗性基因AmpR，第4267-4436位为AmpR终止子)、大肠杆菌复制起点ORI(SEQ ID No.1第3678-4266位)、乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶基因表达盒(SEQ ID No.1第397-1701位：其中第397-678位为HPURA3启动子；第679-1470位为乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶基因(HPURA3)的编码序列(CDS)，编码氨基酸序列为SEQ ID No.5的蛋白质；第1471-1701位为HPURA3终止子)、用于启动外源基因转录的启动子(SEQ ID No.1第1702-2497位为组成型启动子GAPp)、多形汉逊酵母5号染色体着丝粒序列与其相邻的自主复制序列(SEQ ID No.2)。
通过电转化的方法将环形质粒PGG-CEN5-2.6K转入尿嘧啶缺陷型菌株HP7.89-ura3，通过在SD固体培养基的平板上初步筛选转化子，将平板上长出的转化子在SD的液体培养基中培养24h，通过酵母质粒提取试剂盒提取酵母质粒，进一步通过VC-TF和HPURAP-MR组成的引物对进行PCR验证，将验证正确的菌株分别命名为HPGG-CEN5-2.6K。
将菌株HPGG-CEN5-2.6K分别在SD液体培养基和SD+URA液体培养基中传代3次，每代培养24h，取适量菌液涂布SD固体培养基平板和SD+URA固体培养基平板，从中随机挑取三个单菌落，接种到SD液体培养基和SD+URA液体培养基培养24h，提取酵母质粒，利用引物VC-TF和HPURAP-MR组成的引物对进行PCR验证，均可以从质粒中扩增出相应的DNA片段，说明传代3次后着丝粒质粒稳定遗传。将菌株HPGG-CEN5-2.6K分别在SD液体培养基和SD+URA液体培养基中传代3次，收集酵母细胞用PBS缓冲液洗两次，采用流式细胞仪分析第一代，第二代和第三代的中30000细胞中带有GFP绿色荧光细胞的比例来评估质粒的稳定性。
结果见图2，以PGG质粒的基因组整合菌株HPGG菌株为阳性对照，以野生型菌株HP20110424(保藏登记号CGMCC7.89)为阴性对照，在选择压和非选择压下，质粒PGG-CEN5-2.6K稳定性在95％-99％之间，稳定性好。
3多形汉逊酵母1号染色体的着丝粒质粒的构建
以野生型多形汉逊酵母菌HP20110424(CGMCC No.7.89)基因组为模板，设计引物CEN1-3K-F和CEN1-3K-R扩增出3121bp的CEN1-3.1K DNA片段(核苷酸序列如SEQ ID No.3所示)。
CEN1-3K-F:ctatgcggcatcagagcagattgtaTACATAATCGATTgtgaaaaaatataaaaaaG(第1-25位与引物Plasmid-R反向互补，第26-57位和SEQ ID No.3的第1-32位相同)；
CEN1-3K-R:GAAACATGTTTGAACAAGTGCGCTGAGTCATGAATAAAGAAGTGA ATAAGC(第1-25位和引物Plasmid-F反向互补，第26-51位和SEQ ID No.3的第3096-3121位反向互补)。
利用限制性内切酶KasⅠ酶切质粒PGG，回收线性化后的质粒DNA片段为模板，以引物Plasmid-F和Plasmid-R扩增出5271bp的质粒骨架。
通过一步克隆法将1号染色体着丝粒序列与其相邻的自主复制序列DNA片段(CEN1-3.1K DNA片段，核苷酸序列如SEQ ID No.3所示)与质粒骨架连接。
利用VC-TF和HPURAP-MR组成的引物对进行PCR验证。将验证正确的质粒进一步进行测序分析，将测序结果正确的质粒命名为PGG-CEN1-3.1K(如图3所示)。PGG-CEN1-3.1K是将质粒PGG上的lacZα编码序列(SEQ ID No.1的第171-396位)替换为1号染色体着丝粒序列和与其相邻的自主复制序列片段(CEN1-3.1K DNA片段，核苷酸序列如SEQ ID No.3所示)，保持质粒PGG其它序列不变，得到的环形重组质粒。PGG-CEN1-3.1K(核苷酸序列为将SEQ IDNo.1第171-396位替换为SEQ ID No.3，保持SEQ ID No.1其它序列不变)为环形双链DNA分子，所述质粒含有选择性标记基因表达盒(SEQ ID No.1第4267-5402位为AmpR表达盒，其中第5298-5402位为AmpR启动子，第4437-5297位为氨苄青霉素抗性基因AmpR，第4267-4436位为AmpR终止子)、大肠杆菌复制起点ORI(SEQ ID No.1第3678-4266位)、乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶基因表达盒(SEQ ID No.1第397-1701位，其中第397-678位为HPURA3启动子，第679-1470位为乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶基因(HPURA3)的编码序列(CDS)，编码氨基酸序列为SEQ ID No.5的蛋白质，第1471-1701位为HPURA3终止子)、用于启动外源基因转录的启动子(SEQ ID No.1第1702-2497位为组成型启动子GAPp)、多形汉逊酵母1号染色体着丝粒序列及与其相邻的自主复制序列(SEQ ID No.3)。
通过电转化的方法将环形质粒PGG-CEN1-3.1K转入尿嘧啶缺陷型菌株HP7.89-ura3，通过在SD固体培养基的平板上初步筛选转化子，将平板上长出的转化子在SD的液体培养基中培养24h，通过酵母质粒提取试剂盒提取酵母质粒，进一步通过VC-TF和HPURAP-MR组成的引物对进行PCR验证，将验证正确的菌株分别命名为HPGG-CEN1-3.1K。
将菌株HPGG-CEN1-3.1K分别在SD液体培养基和SD+URA液体培养基中传代3次，每代培养24h，取适量菌液涂布SD固体培养基平板和SD+URA固体培养基平板，从中随机挑取三个单菌落，接种到SD液体培养基和SD+URA液体培养基培养24h，提取酵母质粒，利用引物VC-TF和HPURAP-MR组成的引物对进行PCR验证，均可以从质粒中扩增出相应的DNA片段，说明传代3次后着丝粒质粒稳定遗传。
将菌株HPGG-CEN1-3.1K分别在SD液体培养基和SD+URA液体培养基中传代3次，收集酵母细胞用PBS缓冲液洗两次，采用流式细胞仪分析第一代，第二代和第三代的中30000细胞中带有GFP绿色荧光细胞的比例来评估质粒的稳定性。
结果见图4，以PGG质粒的基因组整合菌株HPGG菌株为阳性对照，以野生型菌株HP20110424(CGMCC7.89)为阴性对照，在选择压下或非选择压下，质粒PGG-CEN1-3.1K稳定性在91％-99％之间，稳定性好。
4多形汉逊酵母2号染色体的着丝粒质粒的构建
以野生型多形汉逊酵母菌HP20110424(CGMCC No.7.89)基因组为模板，设计引物CEN1-3K-F和CEN1-3K-R扩增出2553bp的CEN2-2.5K DNA片段(核苷酸序列如SEQ ID No.4所示)。
CEN2-2.5K-F:ctatgcggcatcagagcagattgtaTTTGGTAAGCACTTTGGGGAGCC(第1-25位与引物Plasmid-R反向互补，第26-48位和SEQ ID No.4的第1-23位相同)；CEN2-2.5K-R:GAAACATGTTTGAACAAGTGCGCTGAACACCTCACACTCGTTCT Tctgt(第1-25位和引物Plasmid-F反向互补，第26-49位和SEQ ID No.4的第2530-2553位反向互补)。
利用限制性内切酶KasⅠ酶切质粒PGG，回收线性化后的质粒DNA片段为模板，以引物Plasmid-F和Plasmid-R扩增出5271bp的质粒骨架。
通过一步克隆法将2号染色体着丝粒序列与其相邻的自主复制序列DNA片段(CEN2-2.5K DNA片段，核苷酸序列如SEQ ID No.4所示)与质粒骨架连接。
利用VC-TF和HPURAP-MR组成的引物对进行PCR验证。将验证正确的质粒进一步进行测序分析，将测序结果正确的质粒分别命名为PGG-CEN2-2.5K(如图5所示)。PGG-CEN2-2.5K是将质粒PGG上的lacZα编码序列(SEQ ID No.1的第171-396位)替换为2号染色体着丝粒序列和与其相邻的自主复制序列DNA片段(CEN2-2.5K DNA片段，核苷酸序列如SEQ IDNo.4所示)，保持质粒PGG其它序列不变，得到的环形重组质粒。PGG-CEN2-2.5K(核苷酸序列为将SEQ ID No.1第171-396位替换为SEQ ID No.4，保持SEQ ID No.1其它序列不变)为环形双链DNA分子，所述质粒含有选择性标记基因表达盒(SEQ ID No.1第4267-5402位为AmpR表达盒，其中第5298-5402位为AmpR启动子，第4437-5297位为氨苄青霉素抗性基因AmpR，第4267-4436位为AmpR终止子)、大肠杆菌复制起点ORI(SEQ ID No.1第3678-4266位)、乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶基因表达盒(SEQ ID No.1第397-1701位，其中第397-678位为HPURA3启动子，第679-1470位为乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶基因(HPURA3)的编码序列(CDS)，编码氨基酸序列为SEQ IDNo.5的蛋白质，第1471-1701位为HPURA3终止子)、用于启动外源基因转录的启动子(SEQ ID No.1第1702-2497位为组成型启动子GAPp)、多形汉逊酵母2号染色体着丝粒序列与其相邻的自主复制序列(SEQ ID No.4)。
通过电转化的方法将环形质粒PGG-CEN2-2.5K转入尿嘧啶缺陷型菌株HP7.89-ura3，通过在SD固体培养基的平板上初步筛选转化子，将平板上长出的转化子在SD的液体培养基中培养24h，通过酵母质粒提取试剂盒提取酵母质粒，进一步通过VC-TF和HPURAP-MR组成的引物对进行PCR验证，将验证正确的菌株分别命名HPGG-CEN2-2.5K。
将菌株HPGG-CEN2-2.5K分别在SD液体培养基和SD+URA液体培养基中传代3次，每代培养24h，取适量菌液涂布SD固体培养基平板和SD+URA固体培养基平板，从中随机挑取三个单菌落，接种到SD液体培养基和SD+URA液体培养基培养24h，提取酵母质粒，利用引物VC-TF和HPURAP-MR组成的引物对进行PCR验证，均可以从质粒中扩增出相应的DNA片段，说明传代3次后着丝粒质粒稳定遗传。
将菌株HPGG-CEN2-2.5K分别在SD液体培养基和SD+URA液体培养基中传代3次，收集酵母细胞用PBS缓冲液洗两次，采用流式细胞仪分析第一代，第二代和第三代的中30000细胞中带有GFP绿色荧光细胞的比例来评估质粒的稳定性。
结果见图6，以PGG质粒的基因组整合菌株HPGG菌株为阳性对照，以野生型菌株HP20110424(保藏登记号CGMCC7.89)为阴性对照，在选择压下或非选择压下，质粒PGG-CEN2-2.5K稳定性在97％-99％之间，稳定性好。
5利用荧光定量PCR进行着丝粒质粒的拷贝数分析及质粒游离存在的证明
提取着丝粒质粒菌株HPGG-CEN5-2.6K、HPGG-CEN1-3.1K、HPGG-CEN2-2.5K、野生型多形汉逊酵母HP20110424(保藏登记号CGMCC7.89)的基因组为模板，通过荧光定量PCR计算基因间的2-ΔΔCt的比值来分析基因的拷贝数。利用所构建的着丝粒质粒中GAPp(采用由GAPQRT-F和GAPQRT-R组成的引物对)的拷贝数来分析着丝粒质粒的拷贝数。将野生型菌株中GAPp和MOX ORF(采用由MOXqRT-F和MOXqRT-R组成的引物对)的拷贝数的比值设为1，将着丝粒质粒的转化菌株中GAPp和MOX ORF的拷贝数的比值减去1即为多出来的GAPp的拷贝数，也就是着丝粒质粒的拷贝数。通过拷贝数分析可知本发明中所有的着丝粒质粒的拷贝数均为1，符合着丝粒质粒拷贝数的特征。
GAPQRT-F：ggtgcgtggggtaaagacaa
GAPQRT-R：ccagaagtggacatcaccca
MOXqRT-F：AATCACCTCGGCAAACCCAT
MOXqRT-R：TTGGCAGTGAGGTGCTTAGG
提取着丝粒质粒菌株HPGG-CEN5-2.6K、HPGG-CEN1-3.1K、HPGG-CEN2-2.5K的酵母质粒，将其转化大肠杆菌感受态，涂布于100μg/mL氨苄青霉素LB平板上，37℃静置培养，可以获得大肠杆菌转化子，挑取转化子接到100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中进行培养，提取大肠杆菌质粒，将质粒进行测序，测序结果显示与质粒PGG-CEN5-2.6K、PGG-CEN1-3.1K、HPGG-CEN2-2.5K序列一致。如果酵母着丝粒质粒整合到染色体上，酵母质粒转化大肠杆菌后不会获得转化子，大肠杆菌的转化子中提取到质粒并测序正确，说明有游离存在的酵母质粒，而质粒的拷贝数为1，说明了质粒唯一且游离存在，没有整合到染色体上。
6利用着丝粒质粒在多形汉逊酵母中表达GFP外源蛋白
将着丝粒质粒菌株HPGG-CEN5-2.6K、HPGG-CEN1-3.1K和HPGG-CEN2-2.5K分别接种到3mL的SD液体培养基中培养18h，然后转接到50mL的SD液体培养基(葡萄糖浓度为4％)，37℃，200rpm培养，24h和48h取样分析GFP的荧光强度，以PBS缓冲液为空白对照，测定菌液OD600，为使绿色荧光测定准确，OD600控制在0.2-0.8之间。取200μL菌液于黑色酶标板中，以PBS缓冲液为空白对照，在激发波长为488nm，发射波长为509nm条件下测定GFP荧光强度；用相对荧光强度(Relative fluorescence intensity,RFU)，即荧光强度和OD600的比值表征不同菌株的GFP表达水平(三次实验平均值)。本发明所构建的着丝粒质粒是多形汉逊酵母有效的遗传操作工具，可以表达不同来源的蛋白。当以GFP为报告蛋白进行表征时，菌株HPGG-CEN5-2.6K、HPGG-CEN1-3.1K和HPGG-CEN2-2.5K都可以表达GFP,其中48h菌株HPGG-CEN1-3.1K和HPGG-CEN2-2.5K的GFP表达水平是菌株HPGG-CEN5-2.6K的3.28和2.11倍。
结果表明，菌株HPGG-CEN5-2.6K、HPGG-CEN1-3.1K、HPGG-CEN2-2.5K均能够表达GFP蛋白(见表1)。
表1着丝粒质粒菌株表达GFP
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、含量和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
Claims (10)
1.一种质粒，其特征在于：所述质粒为环形双链DNA分子，所述质粒含有选择性标记基因表达盒、大肠杆菌复制起点ORI、乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶基因表达盒、用于启动外源基因转录的启动子、多形汉逊酵母着丝粒序列和自主复制序列。
2.根据权利要求1所述的质粒，其特征在于：所述乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶基因表达盒为表达氨基酸序列是SEQ ID No.5的蛋白质的双链DNA分子。
3.根据权利要求1-2任一所述的质粒，其特征在于：所述多形汉逊酵母着丝粒序列和自主复制序列为如下任一种：
A1、多形汉逊酵母5号染色体的着丝粒序列和自主复制序列；
A2、多形汉逊酵母1号染色体的着丝粒序列和自主复制序列；
A3、多形汉逊酵母2号染色体的着丝粒序列和自主复制序列。
4.根据权利要求3所述的质粒，其特征在于：所述多形汉逊酵母5号染色体的着丝粒序列和自主复制序列为SEQ ID No.2；所述多形汉逊酵母1号染色体的着丝粒序列和自主复制序列为SEQ ID No.3；所述多形汉逊酵母2号染色体的着丝粒序列和自主复制序列为SEQ IDNo.4的。
5.根据权利要求4所述的质粒，其特征在于：所述质粒一条链的核苷酸序列为如下任一种：
B1、为将SEQ ID No.1第171-396位替换为SEQ ID No.2，保持SEQ ID No.1其它序列不变；
B2、为将SEQ ID No.1第171-396位替换为SEQ ID No.3，保持SEQ ID No.1其它序列不变；
B3、为将SEQ ID No.1第171-396位替换为SEQ ID No.4，保持SEQ ID No.1其它序列不变。
6.DNA分子，其特征在于：所述DNA分子由多形汉逊酵母着丝粒序列和多形汉逊酵母的自主复制序列组成。
7.根据权利要求6所述DNA分子，其特征在于：所述DNA分子的核苷酸序列为如下任一种：
C1、为SEQ ID No.2；
C2、为SEQ ID No.3；
C3、为SEQ ID No.4。
8.初始质粒，其特征在于：所述初始质粒为如SEQ ID No.1。
9.构建权利要求1-5任一所述质粒的方法，其特征在于：包括如下步骤：以多形汉逊酵母着丝粒序列和自主复制序列替换SEQ ID No.1的第171-396位序列，保持SEQ ID No.1其它序列不变，获得构建权利要求1-5任一所述质粒。
10.权利要求6或7所述的DNA分子和/或权利要求8所述初始质粒和/或权利要求9所述方法在构建游离在染色体外的质粒中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410099068.3A CN118166016A (zh) | 2024-01-24 | 2024-01-24 | 多形汉逊酵母中游离在染色体外的稳定质粒及其构建方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| CN202410099068.3A CN118166016A (zh) | 2024-01-24 | 2024-01-24 | 多形汉逊酵母中游离在染色体外的稳定质粒及其构建方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
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| CN118166016A true CN118166016A (zh) | 2024-06-11 |
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ID=91351740
Family Applications (1)
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2024
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