CN101521067B - 一种核/壳型磁性微粒制品的制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种核/壳型磁性微粒制品及其制备方法。该方法包括制备磁性氧化物纳米粒子、有机硅源包覆、化学还原、无机硅源包覆、带各种功能基团的硅烷化试剂修饰等5个步骤。制得的核/壳型磁性微粒在水中的分散良好，内核物质磁性强；氧化硅壳层结构致密，化学稳定性高，抗氧化能力强；无裸露的磁粒子，有很好的抗漏能力；本发明制品适用于生物材料和医药制品的分离和纯化，并可以作为生物分子和药物分子的载体。
Description
技术领域
本发明属于磁性和纳米材料制备，涉及一种核/壳型磁性微粒的制备方法及其在生物分离中的应用。
技术背景
磁性微粒在核酸、蛋白质的分离和纯化、靶向药物、细胞标记和分选、生物分子标记和检测、免疫分析、酶的固定等生物医学、细胞学和生物工程学领域有着广阔的应用。它是利用了磁性微粒磁可控的特征，磁可控是指磁性微粒在外磁场的作用下，向指定的方向移动和富集。与常用的分离方法如离心法、沉淀法、离子交换法和层析法相比较，在外磁场作用下固液相的磁分离，具有操作简单快捷，分离效率高、所需设备简单、能耗低、成本少、无污染等诸多优点。磁性微粒作为靶向药物载体，能实现在体内定向移动、定点富集，从而达到提高治疗效果、降低毒副作用的目的，在***、癌症等方面有广泛的应有前景。用磁性微粒于分离癌细胞和正常细胞在动物、临床试验中已获成功，展现了令人瞩目的应用前景。已有的制品中，磁性微粒多是通过包埋法、单体共聚法或高分子微球溶涨-褪溶胀法等制得的高分子微球，或是由多糖分子包覆的磁性微球。高分子微球由磁性粒与表面聚合高分子材料复合而成，其合成工艺一般比较复杂，合成工艺中常会使用一些有毒的有机溶剂或聚合单体，对已成型微球表面很难再进行修饰，且该微球生物相容性较差，仅适合在体外应用；多糖包覆的微球虽然生物相容性较好，能应用于体内的药物输送，但包覆层不稳定，存在磁性粒子容易脱落的缺点，这些都限制了其应用范围。
壳/核型磁性微粒的制备方法报道很多，但其内核为磁性较弱的Fe3O4等铁氧体。例如，专利ZL02109817.4公开了一种复合磁性粒子的制备方法，其内核是粒径为5～8nm的超顺磁性Fe3O4纳米粒子；专利ZL03111351.6也公开了具有强磁场响应能力的磁性核壳微粒及其制备方法，其内核是磁性铁氧体纳米粒子，外壳是二氧化硅。其磁性铁氧体纳米粒子乃指Fe3O4纳米粒子、γ-Fe2O3纳米粒子或掺过渡金属元素及其化合物的磁性铁氧体纳米粒子(粒径为3～12nm)。制备该磁性铁氧体～二氧化硅核壳结构微粒的方法是：制备磁性铁氧体纳米粒子～无机硅源包覆～有机硅源包覆。其磁性铁氧体纳米粒子采用已知的共沉淀法制备。上述无机硅源包覆是以Na2SiO3作为无机硅源，将洗好的磁性铁氧体纳米粒子不经过任何表面处理直接分散到含有SiO2的水溶液中，搅拌进行第一次二氧化硅包覆，经过这次无机硅源包覆在磁性铁氧体纳米粒子表面形成1～2nm厚的二氧化硅层。有机硅源是以正硅酸乙酯为硅源，以醇和水混合物为溶剂，在碱的催化下，通过正硅酸乙酯水解反应进行第二次二氧化硅包覆，得到的多层核/壳型磁性微粒的粒径在0.2～10μm，核/壳磁性微粒含有20～1000个磁性铁氧体纳米粒子，微粒中磁性铁氧体纳米粒子的质量百分含量为10～60％。制备过程中通过0.05～0.15T的永磁铁提供的恒磁场下利用倾注法进行纯水清洗除去杂质。微粒的磁场响应能力为：10ml该核壳微粒的水溶胶，在0.05T的外加磁场下，粒子富集时间在1分钟以内。
已有专利(ZL03111351.6)的Fe3O4-二氧化硅核/壳型磁性微粒的包覆层是二氧化硅，因而微粒既有良好的生物相容性，较好的化学稳定性，还可以通过不同的硅烷化试剂进行各种表面修饰，经修饰后的微粒表面可以载戴各种易与生物材料连接的活性基团。但该类微粒的核是磁性较弱的铁氧体，致使该类微粒对外磁场的响应能力偏弱，需要施加高强度的外磁场才能实现该微粒的富集。此外，也可以通过增加核中纳米微粒的个数(导致微粒增大)来达到增强微粒磁响应能力，但微粒直径增加造成的比表面下降会导致表面活性的降低，从而会直接降低分离效率。因此，需要在保持微粒粒度适度(最好处于纳米尺度范畴)的条件下，进一步增加微粒对外加磁场的磁响应能力才是最佳的选择。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服上述不足之处，研究能提高微粒的磁敏感度，提高微粒对外磁场的响应能力，使内核磁性纳米粒子安全和稳定。
本发明提供一种核/壳型磁性微粒的制品。
本发明的以金属纳米晶为核的核/壳型磁性微粒，其内核是磁性金属纳米粒子或磁性金属纳米粒子与磁性氧化物纳米粒子的混合物，外壳是氧化硅。所说的磁性金属纳米粒子或磁性金属纳米粒子和磁性氧化物纳米粒子的混合物指Fe、Co、Ni、或其合金、Fe3O4、γ-Fe2O3、Co3O4、Co2O3或Fe(1-x)MxFe2O4(M＝Fe，Co，Ni，Zn，Mn等两价过渡金属离子)的纳米粒子，它们粒径在10nm以下，具有超顺磁性。所说的还原剂是指氢气(H2)、水合肼(H4N2.H2O)、硼氢化钾(KBH4)、硼氢化钠(NaBH4)或其混合物中的任意一种。所述的微粒具有多核结构，粒径在0.05～5μm，通过透射电镜看到氧化硅核/壳型磁性微粒中内核的磁性纳米微粒的个数为5～500个。
本发明的另一目的是提供一种核/壳型磁性微粒制品的制备方法。
本发明方法为首先在磁性金属氧化物纳米粒子(核)外包覆一薄层网眼结构氧化硅(壳)，然后用还原剂将核全部或部分地原位还原成磁性金属纳米粒子，最终得到氧化硅包覆的、以磁性金属纳米粒子或磁性金属纳米粒子和少部分磁性氧化物纳米粒子的混合物为内核的核/壳型磁性微粒。原位还原的结果，不仅使核内磁性物质的高含量得以保持，而且由于核内磁性较弱的金属氧化物全部或大部分地变成了磁性更强的金属，从而使磁核对外磁场具有更强的响应能力。经过进一步的氧化硅增厚包覆，氧化硅壳层的致密性和化学稳定性得到进一步提高，大大加强了对内核磁性金属的保护，内核磁性金属得以免受外部空气的影响而处于安全稳定的状态。再经过带各种功能基团的硅烷化试剂对微粒表面的第三次单层包覆(修饰)，使表面具备各种应用所需的功能基团，从而可适应各种广泛的应用需求。
本发明的以金属纳米晶为核的核/壳型磁性微粒的制备技术包括：制备磁性氧化物纳米粒子、有机硅源包覆、化学还原、无机硅源包覆、带各种功能基团的硅烷化试剂修饰等5个工艺过程。具体步骤如下：
(1)利用专利(200410073680.6)的制备方法制备磁性氧化物纳米粒子，即铁盐与碱溶液混和反应后，加入水搅拌，完成粒子的结晶反应；再将结晶粒子通过外磁场或离心分离，用蒸馏水清洗杂质，制得的磁性氧化物纳米粒子的粒径在3～10nm；
(2)将洗涤后的磁性氧化物纳米粒子直接分散在醇和水的混合溶剂中，在碱性条件下，通过硅酸酯(正硅酸甲酯、正硅酸乙酯、正硅酸丁酯等)水解反应进行第一次氧化硅包覆，经过有机硅源包覆的磁性氧化物纳米粒子的表面有介孔结构的氧化硅包覆薄层，包覆层的厚度可以通过调控有机硅的量来调节，通过外磁场或离心分离，用蒸馏水清洗杂质；
(3)将完成第一次氧化硅包覆的磁性氧化物纳米粒子水溶胶用氢气(H2)、水合肼(H4N2.H2O)、硼氢化钾(KBH4)、硼氢化钠(NaBH4)或其混合物中的任意一种还原剂进行还原，由于表面的氧化硅层具有介孔结构，还原剂透过氧化硅网眼进入内核，磁性氧化物纳米粒子在还原剂的作用下，全部或部分被还原成磁性金属单质纳米粒子，得到以氧化硅第一次包覆的、金属纳米晶为核的核/壳型磁性复合粒子，通过外磁场或离心分离，用蒸馏水清洗杂质；
(4)将完成氧化硅第一次包覆和还原反应的磁性复合粒子分散在SiO2的水溶胶液中搅拌，用0.5mol/L醋酸、盐酸、硫酸，调节溶液pH值到6～10，搅拌混合溶液2～20小时，完成磁性复合粒子的再次氧化硅包覆，使核/壳型磁性微粒的氧化硅壳层足够致密厚实，能隔绝空气和核外介质、避免金属纳米粒子被空气或溶液中的氧化性物质所氧化；通过外磁场或离心分离，用蒸馏水清洗杂质；得到粒径在0.05～5μm范围的以金属纳米晶为核的氧化硅包覆的核/壳型磁性微粒。
(5)步骤(4)核/壳型磁性微粒用带有氨基、巯基、环氧基、酯基、烯烃基等基团的硅烷化试剂进行表面修饰，得到表面带有不同官能团的氧化硅包覆、以金属纳米晶为核的核/壳型磁性微粒。
其中所述的磁性金属纳米粒子是指纳米Fe粒子、纳米Co粒子、纳米Ni粒子或纳米合金粒子，磁性氧化物纳米粒子是指纳米Fe3O4粒子、纳米γ-Fe2O3粒子、纳米Co3O4粒子、纳米Co2O3或Fe(1-x)MxFe2O4粒子等。
上述包覆工艺中，步骤(2)所述有机硅源包覆时，分散在醇和水的混合溶剂中磁性氧化物纳米粒子的浓度为0.01～0.15mol/L，有机硅的浓度为0.01～1.0mol/L，有机硅可以是正硅酸甲酯、正硅酸乙酯或正硅酸丁酯；醇和水的混合溶剂中的醇可以是甲醇、乙醇、乙二醇、丙醇、丙二醇、丙三醇、异丙醇或丁醇，混合溶剂中的醇体积百分含量40％～98％，水的体积百分含量2％～60％；向上述的溶液中加入质量百分比浓度为25％～28％的浓氨水，氨水在反应体系中的浓度为0.2～1.5mol/L，然后在100～2000rpm的速度下搅拌反应2～20小时。在有机硅源包覆中，有机硅的加入可以是逐滴加入，也可以一次性加入，还可以分批加入，分批相邻两次加入的时间间隔为1～5小时，有机硅全部加完后，在继续反应3～20小时。通过控制有机硅的加入量，可以调节第一次包覆的氧化硅层的厚度。
步骤(3)所述所述进行化学还原时，还原剂的用量与磁性氧化物纳米粒子的摩尔比为0.1～5，还原反应时间为0.5～10小时。无机硅源包覆时，SiO2的浓度为0.05～3mol/L，用0.5mol/L盐酸将反应溶液的pH值调节到6～10之间，搅拌速度为100～2000rpm的条件下反应2～20小时。硅烷化试剂的修饰可以在水溶液中也可以在上述的醇中进行，硅烷化试剂的体积百分比含量为0.1％～10％。
本发明所描述的氧化硅双层包覆的核壳型磁性微粒在水中的分散良好，内核物质磁性强；氧化硅壳层结构致密，因此化学稳定性高，抗氧化能力强；无裸露的磁粒子，有很好的抗漏能力。
本发明的又一目的是提供一种核/壳型磁性微粒制品在生物分离中的应用。
将本发明制备的核/壳型磁性微粒加入到含核酸的溶液中混合，通过加入结合液，在外磁场下，分离出核酸-磁性微粒复合物，再用体积分数为70％乙醇对核酸-磁性微粒复合物进行清洗，最后再用pH值为7～9的TE缓冲液或灭菌水将核酸洗脱下来，实现快速、高效分离核酸的目的。
利用带有氨基、巯基、环氧基等基团的硅烷偶联剂对氧化硅表面进行修饰，得到带有氨基、巯基、环氧基等功能团的表面，易与蛋白质、抗原、抗体、酶等各种生物活性物质和药物分子连接。特别适用于生物材料和医药制品的分离和纯化，并可以作为生物分子和药物分子的载体。
具体实施方式
实施例1：核壳型磁性微粒内核的制备
将0.1mol/L FeCl2和0.2mol/L FeCl3与浓氨水混和，反应10分钟后，加入100倍量、10℃的水，在5000rpm下搅拌3小时，粒子的结晶反应完成；在10000rpm下将结晶粒子离心分离，洗净后即得到粒径为2～12nm的Fe3O4纳米粒子。取2.3克Fe3O4纳米粒子分散在由500ml乙醇、10ml水、15ml质量百分比浓度为25％～28％的浓氨水的混合溶剂中，在室温下，以500rpm搅拌速度滴加0.1mol/L的正硅酸甲酯，反应12小时，用0.1T的永磁铁分离出黑色固体，固体物质用蒸馏水洗涤3～5次，完成第一次氧化硅包覆。将第一次氧化硅包覆的磁性复合材料分散在水中，在室温下加入4克NaBH4进行还原反应，用0.1T的永磁铁进行分离，所得固体用蒸馏水充分洗涤，即得磁性Fe纳米粒子和Fe3O4纳米粒子混合为内核的氧化硅包覆的复合材料。
实施例2：核壳型磁性微粒内核的制备
将0.2mol/L FeCl2和0.4mol/L FeCl3与2mol/L NaOH混和，反应25分钟后，加入100倍量、15℃的水，在10000rpm下搅拌1小时，粒子的结晶反应完成；通过施加磁场将结晶粒子分离，用蒸馏水洗净后即得到粒径为2～12nm的Fe3O4纳米粒子。取3.5克Fe3O4纳米粒子分散在由1000ml异丙醇、20ml水、40ml质量百分比浓度为25％～28％的浓氨水的混合溶剂中，在室温下，以800rpm搅拌速度滴加0.6mol/L的正硅酸乙酯，反应20小时，用0.1T的永磁铁分离出黑色固体，固体物质用蒸馏水洗涤3～5次，完成第一次氧化硅包覆。将第一次氧化硅包覆的磁性复合材料分散在水中，在室温下加入8克KBH4进行还原反应，用0.05T的永磁铁进行分离，所得固体用蒸馏水充分洗涤，即得磁性Fe纳米粒子和Fe3O4纳米粒子混合为内核的氧化硅包覆的复合材料。
实施例3：核壳型磁性微粒内核的制备
将0.3mol/L FeCl2和0.6mol/L CoCl3与浓氨水混和，反应10分钟后，加入100倍量、8℃的水，在20000rpm下搅拌4.5小时，粒子的结晶反应完成；在0.1T磁场下将结晶粒子分离，洗净后即得到粒径为2～12nm的FeCo2O4纳米粒子。取4.6克FeCo2O4纳米粒子分散在由500ml丙二醇、10ml水、15ml质量百分比浓度为25％～28％的浓氨水的混合溶剂中，在室温下，以500rpm搅拌速度滴加0.1mol/L的正硅酸丁酯，反应12小时，用0.1T的永磁铁分离出黑色固体，固体物质用蒸馏水洗涤3～5次，完成第一次氧化硅包覆。将第一次氧化硅包覆的磁性复合材料分散在水中，在室温下加入9克水合肼进行还原反应，用0.05T的永磁铁进行分离，所得固体用蒸馏水充分洗涤，即得磁性Co纳米粒子和FeCo2O4纳米粒子为内核的。
实施例4：核壳型磁性微粒外壳包覆
称实施例1、实施例2或实施例3的氧化硅包覆的复合材料1克，分散在5.0克Na2SiO3(SiO2含量为27％)溶解的450ml水溶液中，用醋酸调节溶液的pH值为8.5，在室温下，以300rpm搅拌速度在1000ml的烧瓶中反应12小时，反应完毕后，用0.08T的永磁铁分离，用蒸馏水洗涤3～5次，得到粒径为平均粒径0.5μm的氧化硅核/壳型磁性微粒，将0.5g氧化硅核/壳型磁性微粒加入到0.3％的氨丙基三乙氧基硅烷偶联剂乙醇溶液中，在75℃温度下搅拌，得到氨基化的核/壳型磁性微粒。
实施例5：核壳型磁性微粒外壳包覆
称实施例1、实施例2或实施例3的氧化硅包覆的复合材料2.5克，分散在7.5克Na2SiO3(SiO2含量为27％)溶解的850ml水溶液中，用盐酸调节溶液的pH值为6.5，在室温下，以500rpm搅拌速度在1000ml的烧瓶中反应18小时，反应完毕后，用0.08T的永磁铁分离，用蒸馏水洗涤3～5次，得到粒径为平均粒径1.5μm的氧化硅核壳型磁性微粒，将1.5g氧化硅核/壳型磁性微粒加入到1.0％的巯丙基三乙氧基硅烷偶联剂水溶液中，在85℃温度下搅拌，得到巯基化的核/壳型磁性微粒。
实施例6：核壳型磁性微粒外壳包覆
称实施例1、实施例2或实施例3的氧化硅包覆的复合材料5.0克，分散在10.0克Na2SiO3(SiO2含量为27％)溶解的1100ml水溶液中，用硫酸调节溶液的pH值为7.0，在室温下，以800rpm搅拌速度在2000ml的烧瓶中反应20小时，反应完毕后，用0.08T的永磁铁分离，用蒸馏水洗涤3～5次，得到粒径为3.0μm的氧化硅核壳型磁性微粒，将1g氧化硅核/壳型磁性微粒加入到0.8％的γ-环氧丙氧丙基三烷氧硅烷偶联剂丙三醇溶液中，在90℃温度下搅拌，得到环氧基化的核/壳型磁性微粒。
实施例7：核壳型磁性微粒分离提纯质粒DNA
将1.5ml大肠杆菌培养液倒入微量离心管，离心弃上清收集菌体；向菌体加入100ul含20ug/ml RNA酶的TE缓冲液，200ul含0.2M NaOH和1％(m/v)SDS的碱裂解液，再加150ul的pH值为5的5M乙酸钾溶液，混合，12000rpm离心5分钟，将上清液转移到新的离心管中；向离心管中加入本发明的核壳型磁性微粒1.5mg，震荡混匀，温育2-5min，将离心管置于磁分离架上，吸弃上清液；加500ul 70％乙醇清洗质粒DNA-磁性微粒复合物两次，加50ul TE缓冲液悬浮磁性微粒，磁分离收集洗脱液，得到约20ug高纯度的质粒DNA。
实施例8：核壳型磁性微粒分离提纯大肠杆菌基因组DNA
将过夜培养的大肠杆菌100μL，离心；弃上清液，沉淀重悬于TSEl缓冲液(50mM Tris-HCl，pH8.0，20％蔗糖，50mM EDTA，100μg溶菌酶)，置37℃水浴20min；向反应混合中加入10μL 10％SDS，5μL 20mg/ml蛋白酶K，置37℃水浴20min；加1mL裂解吸附液(3M GuSCN、2％TritonX-100)和1mg核壳型磁性微粒，室温孵育5min；置于磁分离架上，磁液分离后去除上清液；700μL 70％乙醇洗涤两次；100μL灭菌水洗脱，得到1ug大肠杆菌基因组DNA。
Claims (10)
1.一种核/壳型磁性微粒制品，其特征在于该微粒制品的内核是磁性金属纳米晶或是磁性金属和磁性金属氧化物纳米晶的混合物，外壳是氧化硅；所述的微粒粒径在0.05～5μm，核/壳型磁性微粒中内核的磁性纳米粒子的个数为5～500个。
2.一种核/壳型磁性微粒制品的制备方法，其特征在于该方法包括下列步骤：
(1)制备磁性氧化物纳米粒子：铁盐与碱溶液混和反应后，加入水搅拌，完成粒子的结晶反应；再将结晶粒子通过外磁场或离心分离，用蒸馏水清洗杂质，制得的磁性氧化物纳米粒子的粒径在3～10nm；
(2)将洗涤后的磁性氧化物纳米粒子直接分散在醇和水的混合溶剂中，在氨水的碱性条件下PH 9～14，通过正硅酸甲酯、正硅酸乙酯或正硅酸丁酯水解反应，进行第一次氧化硅包覆，经过有机硅源包覆的磁性氧化物纳米粒子的表面有介孔结构的氧化硅包覆薄层，通过外磁场或离心分离，用蒸馏水清洗杂质；
(3)将完成第一次氧化硅包覆的磁性氧化物纳米粒子水溶胶用氢气、水合肼、硼氢化钾或硼氢化钠的一种或多种进行还原，得到以氧化硅第一次包覆的、金属纳米晶为核的核/壳型磁性复合粒子，通过外磁场或离心分离，用蒸馏水清洗杂质；
(4)将完成氧化硅第一次包覆和还原反应的磁性复合粒子分散在SiO2的水溶胶液中搅拌，用0.5mol/L醋酸、盐酸、硫酸，调节溶液pH值到6～10，搅拌混合溶液2～20小时，完成磁性复合粒子的再次氧化硅包覆，通过外磁场或离心分离，用蒸馏水清洗杂质，得到粒径在0.05～5μm范围的以金属纳米晶为核的氧化硅包覆的核/壳型磁性微粒；
(5)步骤(4)得到的核/壳型磁性微粒用带有氨基、巯基、环氧基、酯基和烯烃基基团的硅烷化试剂进行表面修饰，得到表面带有不同官能团的氧化硅包覆、以金属纳米晶为核的核/壳型磁性微粒制品。
3.根据权利要求2所述的一种核/壳型磁性微粒制品的制备方法，其特征在于步骤(5)制得以金属纳米晶为核的氧化硅包覆的核/壳型磁性微粒的粒径为0.05～5.0μm，每个微粒包覆有5～500个磁性纳米晶。
4.根据权利要求2所述的一种核/壳型磁性微粒制品的制备方法，其特征在于步骤(1)所述磁性氧化物纳米粒子为Fe(1-x)MxFe2O4，其中M为Fe，Co，Ni，Zn或Mn。
5.据权利要求2所述的一种核/壳型磁性微粒制品的制备方法，其特征在于步骤(2)有机硅源包覆时，磁性氧化物纳米粒子的浓度为0.01～0.15mol/L，有机硅的浓度为0.01～1.0mol/L，有机硅为正硅酸甲酯、正硅酸乙酯或正硅酸丁酯；醇和水的混合溶剂中，醇为甲醇、乙醇、乙二醇、丙醇、丙二醇、丙三醇、异丙醇或丁醇，混合溶剂中醇的体积百分含量40％～98％，水的体积百分含量2％～60％；步骤(2)氨水在反应体系中的浓度为0.2～1.5mol/L，用量为混合溶剂质量百分比浓度25％～28％；在100～2000rpm的速度下搅拌反应2～20小时。
6.根据权利要求2所述的一种核/壳型磁性微粒制品的制备方法，其特征在于步骤(3)所述的磁性纳米晶核中的磁性金属纳米晶为由Fe粒子、Co粒子或Ni粒子。
7.根据权利要求2所述的一种核/壳型磁性微粒制品的制备方法，其特征在于步骤(3)还原剂的用量与磁性氧化物纳米粒子的摩尔比为0.1～5，还原反应时间为1～24小时。
8.根据权利要求2所述的一种核/壳型磁性微粒制品的制备方法，其特征在于步骤(4)所述的无机硅源包覆时，SiO2水溶液的浓度为0.05～3mol/L，调节pH值用0.5mol/L醋酸、盐酸或硫酸，pH值为6～10，搅拌速度为100～2000rpm，反应时间2～20小时。
9.根据权利要求2所述的一种核/壳型磁性微粒制品的制备方法，其特征在于步骤(5)所述的硅烷化试剂修饰，硅烷化试剂为带有氨基、巯基、环氧基、酯基或烯烃基基团的硅烷化试剂。
10.一种如权利要求1所述的一种核/壳型磁性微粒制品在生物分离中的应用，其特征在于用于核酸的分离纯化领域。
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