CN101501432A - 制备干燥的自由流动的疏水蛋白制剂的方法 - Google Patents
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Abstract
制备干燥的自由流动的稳定疏水蛋白制剂的方法,该方法通过在喷雾装置中喷雾和干燥疏水蛋白水溶液来进行,其任选地包含添加剂。
Description
发明概述
本发明涉及用于制备干燥的自由流动的稳定疏水蛋白制剂的改良方法,该方法通过在喷雾装置中喷射疏水蛋白的水溶液来进行。本发明还涉及通过该方法制备的疏水蛋白制剂,其包含所述疏水蛋白制剂。
分离疏水蛋白通常在水溶液状态下进行。在该状态下,疏水蛋白失活或被微生物分解,其储存和运输的成本可能很高。因此需要制备无水的疏水蛋白制剂,该制剂含有使其特定作用损失最小的浓缩形式的疏水蛋白。而且,这些制剂由粒度为50-600μm的具有良好表面的颗粒组成,以确保其在进一步的加工工业中与其他物质形成均一混合物或具有良好的应用性。
有多种喷雾方法可用于从含有酶的水性介质中去除水分。
在美国专利说明书4,617,272中,含有酶的介质被喷射到在流化床中加热的惰性颗粒上。
聚烯烃、聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯或聚苯乙烯被认为是合适的惰性颗粒。
该方法的一个缺点是由这些惰性颗粒产生的干燥酶粉不能用于食品和动物饲料工业。
根据经济专利DD 263790中描述的另一种方法,凝乳蛋白酶产品通过将蛋白酶水溶液喷射到位于流化床制粒机中的载体物质上来制备。所描述的载体物质为脱脂奶粉和/或含有糊精的物质。
尽管所得的产品具有良好的酶稳定性和可倾倒性,并且所用的载体物质也是生理上相容的,但该方法的缺点是必须使用相对于酶固体多达10倍量的载体物质。
EP522269描述了制备干燥的自由流动的稳定酶制剂的方法,该方法通过在喷雾装置中喷射酶的水溶液(如果适宜时可包含添加剂)来进行,其中所述酶溶液在0-50℃下采用相对于溶液中酶固体成分的5-60重量%的喷射辅料共同喷射,所述辅料包括疏水硅石和/或高级脂肪酸的金属盐,随后将通过该方法得到的载有喷射辅料的颗粒进行干燥。
因此本发明的目的是提出一种方法,使得疏水蛋白水溶液转化为干燥、稳定的疏水蛋白制剂,该制剂可用于进一步的加工工业。
现已发现,当疏水蛋白水溶液(如果适宜时可包含添加剂)采用相对于溶液中疏水蛋白固体成分的5-200重量%的喷射辅料(其包括一种或多种糖醇)共同喷射并将通过该方法得到的载有喷射辅料的颗粒干燥时,本文开头所定义的方法导致了特别合适的疏水蛋白制剂。
疏水蛋白是约100个AA的小蛋白,它是丝状真菌的特征,在其他有机体中不存在。最近,在天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)中发现了疏水蛋白样的蛋白,其被称为“chaplins”,同样具有高度的表面活性的特性。在水/空气界面上,chaplins可以聚集产生类淀粉样蛋白的原纤维(Classen等人,2003 Genes Dev 1714-1726;Elliot等人,2003,Genes Dev.17,1727-1740)。
疏水蛋白以不溶于水的形式分布于多种真菌结构的表面,例如气生菌丝、孢子、子实体。从子囊菌纲、半知菌纲和担子菌纲中能够分离出疏水蛋白的基因。某些真菌含有一种以上的疏水蛋白基因,例如裂褶菌(Schizophyllum commune)、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)和构巢曲霉(Aspergillus nidulans)。不同的疏水蛋白显然参与了真菌发育的不同阶段。这些疏水蛋白可能负责不同的功能(van Wetter等人,2000,Mol.Microbiol.,36,201-210;Kershaw等人,1998,Fungal Genet.Biol,1998,23,18-33)。
发明详述
本发明方法特别适合的疏水蛋白是具有通式(I)结构的多肽,
Xn-C1-X1-50-C2-X0-5-C3-Xp-C4-X1-100-C5-X1-50-C6-X0-5-C7-X1-50-C8-Xm (I)
其中X可以是20种天然存在的氨基酸(Phe、Leu、Ser、Tyr、Cys、Trp、Pro、His、Gln、Arg、Ile、Met、Thr、Asn、Lys、Val、Ala、Asp、Glu、Gly)中的任何一种,X旁边的下标表示氨基酸的数目,其中n和m是0-500之间的数字,优选15-300之间的数字,p为1-250之间的数字,优选1-100之间的数字,C为半胱氨酸、丙氨酸、丝氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸或苏氨酸,其中至少4个用C表示的残基为半胱氨酸,条件是至少一个缩写为Xn或Xm或Xp的肽序列是具有至少20个氨基酸长度的肽序列,其在天然状态下不与疏水蛋白相连,当其涂覆在玻璃表面时,造成接触角改变至少20度。
氨基酸C1至C8优选为半胱氨酸,但是它们也可以被其他有类似空间填充的氨基酸所替换,优选丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸或甘氨酸。然而,C1至C8位置至少有4个、优选至少5个、特别优选至少6个、尤其优选至少7个应当由半胱氨酸组成。根据本发明,半胱氨酸可以以还原形式存在于本发明的蛋白中,或者彼此形成二硫键。特别优选的是形成分子内的C-C桥,特别是具有至少1个、优选2个、特别优选3个以及非常特别优选4个分子内二硫键的那些。在用上述的有类似空间填充的氨基酸替换半胱氨酸时,这些C位置有利的是成对地替换可以彼此形成分子内二硫键的半胱氨酸。
如果在以X表示的位置上也采用半胱氨酸、丝氨酸、丙氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸或苏氨酸时,通式中各个C位置的编号也相应地改变。
特别有利的多肽是通式(II)所示的那些,
Xn-C1-X3-25-C2-X0-2-C3-X5-50-C4-X2-35-C5-X2-15-C6-X0-2-C7-X3-35-C8-Xm (II)
其中X可以是20种天然存在的氨基酸(Phe、Leu、Ser、Tyr、Cys、Trp、Pro、His、Gln、Arg、Ile、Met、Thr、Asn、Lys、Val、Ala、Asp、Glu、Gly)中的任何一种,X旁边的下标表示氨基酸的数目,其中n和m是2-300之间的数字,C为半胱氨酸、丙氨酸、丝氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸或苏氨酸,其中至少4个用C表示的残基为半胱氨酸,条件是至少一个缩写为Xn或Xm的肽序列是具有至少35个氨基酸长度的肽序列,其在天然状态下不与疏水蛋白相连,当其涂覆在玻璃表面时,造成接触角改变至少20度。
疏水蛋白的来源在这里没有影响。例如,疏水蛋白可以从例如微生物如细菌、酵母和真菌中分离。根据本发明,特别是通过遗传修饰的生物体获得的疏水蛋白是合适的。
可以添加到疏水蛋白水溶液中的合适添加剂是常规的添加剂,优选生理上可接受的物质。
这些物质包括多糖,例如纤维素化合物、果胶类和不同来源的淀粉类;形成膜的胶体类,例如明胶、酪蛋白或白蛋白;单糖或二糖,例如葡萄糖、果糖、乳糖或蔗糖;或植物产品,例如磨光麸皮(wheat grit bran)或豆粉。
此外,可以使用的添加剂有无机物质,例如碳酸钙、粘土、多种形式的沉淀或矿物硅石和硅酸盐,以及动物来源的产品,例如蛋壳粉。而且也可以使用其他添加剂如乳化剂、抗氧化剂或防腐剂。
所用添加剂的量通常为相对于疏水蛋白固体重量的5-200%,优选为20-200%。
本发明的方法可通过以下方案实施:
将喷射辅料与空气或惰性气体通过喷射一起引入喷雾装置中,该装置优选喷淋塔。喷射辅料的引入是在雾化单元上方便地进行。合适的喷淋塔对于本领域技术人员而言是已知的结构(例如参见K.Masters,SprayDrying Handbook,ISBN 0-582-06266-7)。
疏水蛋白水溶液可在压力下通过喷嘴引入载有喷射辅料的喷雾空间中。然而,也可以使疏水蛋白水溶液流到快速旋转的雾化盘上。雾化单元的设计对产品没有决定性的影响,也可以使用本领域技术人员熟知的其他雾化设备(例如参见Arthur H.Levebvre,Atomization and Sprays,ISBN0-89116-603-3)。
所形成的喷雾锥体区含有大量的微滴,其随后通过除去水分转化为干燥的疏水蛋白制剂。干燥可在喷雾结束后立即方便地进行。适合于该目的的是蒸发干燥,在此过程中水分在预热的空气或惰性气体气流的帮助下从微滴中除去。
对于干燥来说,特别优选的是流化床,其位于雾化单元的下方,或在雾化单元的区域内。流化床可作为喷淋塔的一个完整部分进行操作(例如Niro的FSD-技术或Anhydro的SBD技术),或者采用本领域技术人员已知的干燥技术如流化床喷雾制粒,对它的说明参见Hans Uhlemann和Lothar 的著作“Wirbelschicht-Sprühgranulation[流化床喷雾制粒]”,ISBN 3-540-66985-x。
对氧化特别敏感的疏水蛋白优选在喷雾和干燥的过程中使用惰性气体,例如氮气。
采用这种方法制备的疏水蛋白制剂的特征在于良好的稳定性和低残留的水分含量。通过Kari-Fischer滴定法测量,其残留水分相对于固体物质低于10%,优选低于7%,特别优选残留水分含量低于5%。
通过激光散射法测量的平均粒度为10μm-3mm,优选的平均粒度范围为100μm-1mm。特别的是,应当限制低于50μm大小的颗粒部分,因为这部分的细颗粒在操作时倾向于形成不必要的粉尘。特别优选的是大小低于50μm的颗粒部分低于5重量%。
干燥的疏水蛋白制剂的堆密度范围为50-1200kg/m3。对于在喷淋塔中进行的喷雾干燥法,优选的堆密度为80-400kg/m3,特别优选100-300kg/m3。在流化床喷雾制粒过程中,优选的堆积密度为500-1000kg/m3,特别优选600-800kg/m3。
被雾化的溶液的温度通常应当为0-150℃。在疏水蛋白易于热失活的情况下,优选采用0-80℃,对于热稳定的疏水蛋白,优选采用20-100℃。
合适的喷射辅料是糖醇。特别合适的糖醇为山梨醇、甘露醇和肌醇。此外,纤维素、淀粉和玉米淀粉是合适的干燥辅料。
喷射辅料的重量为相对于疏水蛋白固体重量的5-200%,优选20-200%,特别优选70-130%。
在喷射区域直接引入喷射辅料在很大程度上避免了由充满载体的流化床引起的颗粒的物理应力。
不使用喷射辅料也可以成功地制备本发明的疏水蛋白制剂。
该新方法在下述实施例中详细描述。
通用内容:
名称
疏水蛋白A:YaaD-DewA-His6
疏水蛋白B:40 AA Yaa D-DewA-His6
干燥物质含量:DS[重量%]
活性试验
使用重新溶解的喷雾干燥或喷雾制粒的疏水蛋白融合蛋白的涂覆性质来评价蛋白活性。优选地,分别在作为亲水表面和疏水表面模型的玻璃和Telfon上进行涂覆性质的评价。
标准涂覆实验
玻璃:
-疏水蛋白浓度:50mg/l
-玻璃板孵育过夜(温度:80℃),10mM Tris pH8
-涂覆后,用去矿质水清洗
-随后孵育10min/80℃/1% SDS
-用去矿质水清洗
Teflon:
-浓度:50mg/L
-Teflon板孵育过夜(温度:80℃),10mM Tris pH8
-涂覆后,用去矿质水清洗
-孵育10min/80℃/0.1%吐温20
-用去矿质水清洗
-随后孵育10min/80℃/1% SDS
-用去矿质水清洗
样品在空气中干燥,测定一滴5μl水滴的接触角(以度数表示)。例如,得到以下数值:
与-YaaD-DewA融合蛋白的混合物(对照:不含蛋白;--:YaaD-DewA-His6,100mg/l经纯化的融合伙伴蛋白):
发酵和后处理
将来自LB-Amp平板(100μg/ml氨苄西林)的表达YaaD-DewA-His6或40AA YaaD-DewA-His6的大肠杆菌菌株接种在1000ml双侧弯锥形瓶中的200ml复合培养基中(第一代预培养物)。该菌株在摇床上(do=2.5cm,n=200rpm)于37℃培养至OD600nm达到约3.5。此后另取4个1000ml的双侧弯锥形瓶(各加入200ml复合培养基),各自接种1ml的第一代预培养物,在摇床上(do=2.5cm,n=200rpm)于37℃进行培养(第二代预培养物)。当达到OD600nm>6后,从该第二代振荡培养物接种到装有复合培养基的预发酵罐。当达到OD600nm>9或OTR=80mmol/(l*h)后,接种至主发酵罐。在含有的复合成分非常少的无机培养基中用分批补料发酵方式进行主培养。在OD600nm>70时,用50μm IPTG诱导细胞。经过4-20h的诱导期后,终止发酵,将容器内的产物冷却至4℃。在发酵后,例如通过平板分离器(例如喷嘴分离器)或微孔过滤的方法,将细胞从发酵培养基中分离,并重新悬浮于去矿质水中。分离一次后通过平板分离器或微孔过滤再分离一次,重新悬浮的细胞用高压匀浆器在2000巴的压差下裂解。匀浆物用平板分离器(例如喷嘴分离器)分离,洗涤数次。所得浓缩物调节pH至12.5。在大约15分钟后,将pH降至9。被中和的含疏水蛋白的溶液通过管离心分离固体。根据SDS-PAGE分析,疏水蛋白存在于最后离心的上清液中。该上清液在下文中称为“疏水蛋白水溶液”。所述疏水蛋白水溶液的干物质含量通常为2-4重量%。该阶段用ELISA法测定的疏水蛋白浓度通常为4-35g/l。
实施例1
将28.6kg的甘露醇与866kg的疏水蛋白A水溶液(其固体含量为3.4重量%)混合搅拌。用Gerig Gr.0型双材料喷嘴将所述溶液以41kg/h的喷速同向喷射至1200kg/h的氮气中。喷淋塔直径为800mm,高12m。干燥气体的入口温度为161度。干燥气体的出口温度为80度。在滤器中发生沉积,其中共回收到31.7kg的干物质。有6.1kg的干物质被排出塔外。表1列出了重新溶解的含疏水蛋白的干物质在活性试验中所得的接触角。图1显示了重新溶解的干物质的蛋白质凝胶图。
实施例2
将2.4kg的甘露醇与109kg的疏水蛋白B水溶液(其固体含量为2.4重量%,疏水蛋白浓度4.5g/l)混合搅拌。用3mm的Niro双材料喷嘴将所述溶液以12.8kg/h的喷速同向喷至450kg/h的氮气中。喷淋塔(生产商Niro)直径为1200mm,圆柱高2650mm。圆锥部分高600mm。干燥气体的入口温度为163度。干燥气体的出口温度为79度。在旋风排出中共回收到4.1kg的干物质。在下游滤器排出中获得0.73kg干物质。表2列出了重新溶解的含疏水蛋白的干物质在活性试验中所得的接触角。图2显示了重新溶解的干物质的蛋白质凝胶图。
实施例3
将5.4kg硫酸钠与155kg的疏水蛋白A水溶液(其固体含量为3.4重量%,疏水蛋白含量31g/l)混合搅拌。用3mm的Niro双材料喷嘴将所述溶液以12.2kg/h的喷速同向喷至450kg/h的氮气中。喷淋塔(生产商Niro)直径为1200mm,圆柱高2650mm。圆锥部分高600mm。干燥气体的入口温度为165度。干燥气体的出口温度为84度。在旋风排出中共回收到5.5kg的干物质。
实施例4
将40g硫酸钠与2L的疏水蛋白B水溶液(其干物质含量为20g/l)混合搅拌。所述溶液用氮气作为干燥气体在Büchi实验室喷雾干燥器中干燥。气体的入口温度为160度。气体的出口温度为80度。在旋风排出中共回收到40g产物。表3列出了重新溶解的干物质所得的接触角。
实施例5
将40g麦芽糖糊精与2L的疏水蛋白B水溶液(其干物质含量为20g/l)混合搅拌。所述溶液用氮气作为干燥气体在Büchi实验室喷雾干燥器中干燥。气体的入口温度为160度。气体的出口温度为80度。在旋风排出中共回收到39g产物。表4列出了重新溶解的干物质所得的接触角。
实施例6
浓缩240kg疏水蛋白A水溶液(TS=3.4重量%,疏水蛋白浓度31g/l)。得到65kg的疏水蛋白A水溶液(固体含量为13重量%,疏水蛋白浓度117g/l)。用3mm的Niro双材料喷嘴将所述浓缩液以13.7kg/h的喷速喷至450kg/h的氮气中。喷淋塔(生产商Niro)直径为1200mm,圆柱高2650mm。圆锥部分高600mm。干燥气体的入口温度为165度。干燥气体的出口温度为84度。在旋风排出中,共回收到6.1kg的干物质。表5列出了重新溶解的含疏水蛋白的干物质在活性试验中所得的接触角。图3显示了重新溶解的干物质的蛋白质凝胶图。
实施例7
浓缩894kg疏水蛋白B水溶液(TS=2.4重量%,疏水蛋白浓度6.3g/l)。得到226kg浓缩的疏水蛋白B水溶液(TS=9.7%重量,疏水蛋白浓度35.4g/l)。将75kg该浓缩的疏水蛋白B水溶液(固体含量9.6%(疏水蛋白浓度约35.4g/l))在温度25度下用直径2mm的单材料喷嘴(Niro)以13.6kg/h的喷速同向喷至450kg/h的氮气中。喷淋塔(生产商Niro)直径为1200mm,圆柱高2650mm。圆锥部分高600mm。干燥气体的入口温度为168度。干燥气体的出口温度为84度。通过旋风,回收到5kg产物,滤器中获得1.2kg产物。喷雾干燥的物质的堆密度为100kg/m3,所得物质的纯度为45%,其定义为疏水蛋白相对于总蛋白浓度的%。表6列出了重新溶解的含疏水蛋白的干物质在活性试验中所得的接触角。图4显示了重新溶解的干物质的蛋白质凝胶图。
实施例8
浓缩921kg疏水蛋白A水溶液(TS=2.3重量%,疏水蛋白浓度18g/l)。得到241kg浓缩的疏水蛋白A水溶液(TS=9.6重量%,疏水蛋白浓度98.3g/l)。将该浓缩的疏水蛋白A水溶液引入首先载有已干燥的疏水蛋白A的喷雾流化床(d=150mm,A=0.177m2)中。浓缩的疏水蛋白A水溶液通过直径为2mm的双材料喷嘴进行喷射。
部分1:首先引入2kg实施例4中所得的疏水蛋白A。将所述浓缩的疏水蛋白A水溶液(=进料1)的喷速以1.8kg/h、2.5kg/h、3.3kg/h逐步增加。在产物3.3kg/h的喷速下,气体入口温度为138度,相关的干燥气流(空气)为75m3/h。在喷雾流化床的较低处的产物出口平均温度为69度。颗粒通过卸料螺旋持续排出。通过对排出物筛分和在颗粒切割器中适当研磨粗材料来控制粒度。从5.9kg的进料1中得到0.44kg干物质(样品1,图5)。
部分2:浓缩的疏水蛋白A水溶液(=进料2)以3.2kg/h的速率喷射至部分1中流化床中剩余的干物质上(1.5kg,起始材料的粒度<1.25mm)。气体入口平均温度为126度,相关的干燥气流(空气)为102m3/h。在喷雾流化床的较低处的产物出口平均温度为67度。颗粒通过卸料螺旋持续排出。通过对排出物筛分和在颗粒切割器中适当研磨粗材料来控制粒度。从21.3kg进料2中得到1.6kg干物质(样品2,图5)。
部分3:浓缩的疏水蛋白A水溶液(=进料3)以3.6kg/h的速率喷射至部分2中流化床中剩余的干物质上(1.3kg)。气体入口平均温度为143度,相关的干燥气流(空气)为102m3/h。在喷雾流化床的较低处的产物出口平均温度为67度。颗粒通过卸料螺旋持续排出。通过对排出物筛分和在颗粒切割器中适当研磨粗材料来控制粒度。从21.6kg进料3中得到1.6kg干物质(样品3,图5)。
部分4:浓缩的疏水蛋白A水溶液(=进料4)以4.1kg/h的速率喷射至部分3中流化床中剩余的干物质上(1.9kg,起始材料的粒度<1.6mm)。气体入口平均温度为147度,相关的干燥气流(空气)为100m3/h。在喷雾流化床的较低处的产物出口平均温度为66度。颗粒通过卸料螺旋持续排出。通过对排出物筛分和在颗粒切割器中适当研磨粗材料来控制粒度。从24.6kg进料4中得到1.9kg干物质(样品4,图5)。
部分5:浓缩的疏水蛋白A水溶液(=进料5)以4kg/h的速率喷射至部分4中流化床中剩余的干物质上(1.3kg,起始材料的粒度<1.4mm)。气体入口平均温度为146度,相关的干燥气流(空气)为99m3/h。在喷雾流化床的较低处的产物出口平均温度为67度。颗粒通过卸料螺旋持续排出。通过对排出物筛分和在颗粒切割器中适当研磨粗材料来控制粒度。从23kg进料5中得到1.7kg干物质(样品5,图5)。
部分6:浓缩的疏水蛋白A水溶液(=进料6)以3.5kg/h的速率喷射至部分5中流化床中剩余的干物质上(1.1kg,起始材料的粒度<1.25mm)。气体入口平均温度为142度,相关的干燥气流(空气)为101m3/h。在喷雾流化床的较低处的产物出口平均温度为71度。颗粒通过卸料螺旋持续排出。通过对排出物筛分和在颗粒切割器中适当研磨粗材料来控制粒度。从26.8kg进料6中得到2kg干物质(样品6,图5)。有效部分的堆密度为0.65kg/l。
部分7:浓缩的疏水蛋白A水溶液(=进料7)以3.7kg/h的速率喷射至部分6中流化床中剩余的干物质上(1.2kg,起始材料的粒度<1.25mm)。气体入口平均温度为141度,相关的干燥气流(空气)为99m3/h。在喷雾流化床的较低处的产物出口平均温度为72度。颗粒通过卸料螺旋持续排出。通过对排出物筛分和在颗粒切割器中适当研磨粗材料来控制粒度。从22.7kg进料7中得到1.7kg干物质(样品7,图5)。有效部分的堆密度为0.65kg/l。粒度在0.2-0.72mm之间的部分为98.9%。
除了采用该实施例的颗粒切割器以外,滚筒式磨或研磨机等也适合于研磨粗材料。
表7列出了重新溶解的含疏水蛋白的干物质在活性试验中所得的接触角。图5显示了重新溶解的干物质的蛋白质凝胶图。
实施例9
浓缩894kg疏水蛋白B水溶液(DS=2.4重量%,疏水蛋白浓度6.3g/l)。得到226kg浓缩的疏水蛋白B水溶液(DS=9.7重量%,疏水蛋白浓度35.4g/l)。
部分1:首先引入按照与实施例5类似的喷雾干燥方法得到的1kg含疏水蛋白B的干物质。气体入口温度为141度,相关的干燥气流(空气)为49m3/h。在喷雾流化床的较低处的产物出口平均温度为69度。颗粒通过卸料螺旋持续排出。通过对排出物筛分和在颗粒切割器中适当研磨粗材料来控制粒度。从5kg进料1中得到0.46kg干物质。
部分2:浓缩的疏水蛋白B水溶液(=进料2)以3.8kg/h的速率喷射至部分1中流化床中剩余的干物质上(0.87kg,粒度<0.8mm)。气体入口温度为139度,相关的干燥气流(空气)为99m3/h。在喷雾流化床的较低处的产物出口平均温度为67度。颗粒通过卸料螺旋持续排出。通过对排出物筛分和在颗粒切割器中适当研磨粗材料来控制粒度。从22.8kg进料2中得到2.1kg干物质。粒度<0.4mm的部分为约80%。
部分3:浓缩的疏水蛋白B水溶液(=进料3)以3.8kg/h的速率喷射至部分2中流化床中剩余的干物质上(0.87kg,粒度<0.8mm)。气体入口温度为140度,相关的干燥气流(空气)为102m3/h。在喷雾流化床的较低处的产物出口平均温度为69度。颗粒通过卸料螺旋持续排出。通过对排出物筛分和在颗粒切割器中适当研磨粗材料来控制粒度。从30.1kg进料3中得到2.78kg干物质。粒度在0.4-0.8mm之间的部分为80%。
部分4:浓缩的疏水蛋白B水溶液(=进料4)以3.5kg/h的速率喷射至部分3中流化床中剩余的干物质上(1.1kg,粒度<0.8mm)。气体入口温度为142度,相关的干燥气流(空气)为96m3/h。在喷雾流化床的较低处的产物出口平均温度为72度。颗粒通过卸料螺旋持续排出。通过对排出物筛分和在颗粒切割器中适当研磨粗材料来控制粒度。从25.9kg进料4中得到2.4kg干物质。粒度在0.4-0.8mm之间的部分为约80%。
部分5:浓缩的疏水蛋白B水溶液(=进料5)以3.4kg/h的速率喷射至部分4中流化床中剩余的干物质上(1.1kg,粒度<0.8mm)。气体入口温度为139度,相关的干燥气流(氮气)为99m3/h。在喷雾流化床的较低处的产物出口平均温度为72度。从26.6kg进料5中得到2.5kg干物质。颗粒通过卸料螺旋持续排出。通过对排出物筛分和在颗粒切割器中适当研磨粗材料来控制粒度。粒度在0.2-0.8mm之间的部分为约98%。
部分6:浓缩的疏水蛋白B水溶液(=进料6)以3.4kg/h的速率喷射至部分5中流化床中剩余的干物质上(1.1kg,粒度<0.8mm)。气体入口温度为142度,相关的干燥气流(氮气)为98m3/h。在喷雾流化床的较低处的产物出口平均温度为72度。从25.4kg进料6中得到2.4kg干物质。颗粒通过卸料螺旋持续排出。通过对排出物筛分和在颗粒切割器中适当研磨粗材料来控制粒度。粒度在0.2-0.8mm之间的部分为约91-95%。样品的堆密度为0.57kg/l。
部分7:浓缩的疏水蛋白B水溶液(=进料7)以3.4kg/h的速率喷射至部分6中流化床中剩余的干物质上(1.4kg,粒度<0.8mm)。气体入口温度为140度,相关的干燥气流(氮气)为100m3/h。在喷雾流化床的较低处的产物出口平均温度为72度。颗粒通过卸料螺旋持续排出。通过对排出物筛分和在颗粒切割器中适当研磨粗材料来控制粒度。从18.4kg进料7中得到1.8kg干物质。粒度在0.2-0.4mm之间的部分>0.64kg/l。
部分8:浓缩的疏水蛋白B水溶液(=进料8)以2.5-3kg/h的速率喷射至部分7中流化床中剩余的干物质上(1.2kg,粒度<0.8mm)。气体入口温度为120度,相关的干燥气流(氮气)为100m3/h。在喷雾流化床的较低处的产物出口平均温度为67度。颗粒通过卸料螺旋持续排出。通过对排出物筛分和在颗粒切割器中适当研磨粗材料来控制粒度。从21.5kg进料8中得到2.1kg干物质(图6)。粒度在0.2-0.4mm之间的部分的比例>70.5%。
部分9:浓缩的疏水蛋白B水溶液(=进料9)以4.1-4.4kg/h的速率喷射至部分8中流化床中剩余的干物质上(1.2kg,粒度<0.8mm)。气体入口温度为163度,相关的干燥气流(氮气)为97m3/h。在喷雾流化床的较低处的产物出口平均温度为77度。颗粒通过卸料螺旋持续排出。通过对排出物筛分和在颗粒切割器中适当研磨粗材料来控制粒度。从29.6kg进料9中得到2.8kg干物质。粒度在0.2-0.4mm之间的部分的比例为14.8%。
部分10:首先将1.3kg部分9中的粗材料与细颗粒(起始材料的粒度<0.8mm)一同引入。浓缩的疏水蛋白B水溶液(=进料10)的喷速在4.9-5.1kg/h之间变化。气体入口温度为181度,相关的干燥气流(氮气)为95m3/h。在喷雾流化床的较低处的产物出口平均温度为82度。颗粒通过卸料螺旋持续排出。通过对排出物筛分和在颗粒切割器中适当研磨粗材料来控制粒度。从43.1kg进料10中得到4.1kg干物质(样品10,图6)。粒度在0.2-0.4mm之间的部分的比例为12.6%。
表8列出了最终样品(样品10)重新溶解的含疏水蛋白的干物质在活性试验中所得的接触角。图6显示了重新溶解的干物质的蛋白质凝胶图。
表1:疏水蛋白A用甘露醇喷雾干燥后的接触角
玻璃 | Teflon | |
对照 | 20.5 | 108.2 |
实施例1 | 66.2 | 85.5 |
表2:疏水蛋白B用甘露醇喷雾干燥后的接触角
玻璃 | Teflon | |
对照 | 21.1 | 108.6 |
实施例2 | 68.3 | 78.2 |
表3:疏水蛋白A用硫酸钠喷雾干燥后的接触角
玻璃 | Teflon | |
对照 | 15 | 110.8 |
实施例4 | 64.9 | 86.3 |
表4:疏水蛋白A用麦芽糖糊精喷雾干燥后的接触角
玻璃 | Teflon | |
对照 | 15 | 110.8 |
实施例5 | 65.7 | 85.7 |
表5:无辅料的疏水蛋白A喷雾干燥后的接触角
玻璃 | Teflon | |
对照 | 15.5 | 107 |
实施例6 | 65.9 | 85.6 |
表6:无辅料的疏水蛋白B喷雾干燥后的接触角
玻璃 | Teflon | |
对照 | 32.8 | 96.2 |
实施例7 | 69.6 | 74.8 |
表7:无辅料的疏水蛋白A喷雾制粒后的接触角
实施例8 | 玻璃 | Teflon |
对照 | 13 | 97.8 |
部分1 | 60.7 | 75.9 |
部分2 | 62.2 | 81.2 |
部分3 | 60.5 | 81.9 |
部分4 | 60.9 | 62.5 |
部分5 | 58.9 | 70.1 |
部分6 | 60 | 72.5 |
部分7 | 59.3 | 72.9 |
表8:无辅料的疏水蛋白B喷雾制粒后的接触角
玻璃 | Teflon | |
对照 | 23.3 | 100.8 |
实施例9,最终样品,部分10 | 72.1 | 69.7 |
附图说明:
图1:实施例1的蛋白质凝胶图:4-12% Bis-Tris胶/MES缓冲液,左泳道:用甘露醇喷雾干燥后的疏水蛋白A,右泳道:分子量标记:预染的SDS-Page标准品,上样量/孔:15μg蛋白。
图2:实施例2的蛋白质凝胶图:
图3:实施例6的蛋白质凝胶图:
4-12% Bis-Tris胶/MES缓冲液,左泳道:分子量标记:预染的SDS-Page标准品,上样量/孔:15μg蛋白,右泳道:无辅料喷雾干燥后的疏水蛋白A。
图4:实施例7的蛋白质凝胶图:
4-12% Bis-Tris胶/MES缓冲液,左泳道:分子量标记:预染的SDS-Page标准品,上样量/孔:15μg蛋白,中间/右泳道:无辅料喷雾干燥后的疏水蛋白B。
图5:实施例8的蛋白质凝胶图:
4-12% Bis-Tris胶/MES缓冲液,最左泳道:分子量标记:预染的SDS-Page标准品,上样量/孔:15μg蛋白,其余泳道:疏水蛋白A无辅料喷雾制粒后的parDS1-7。
图6:实施例9的蛋白质凝胶图:
4-12% Bis-Tris胶/MES缓冲液,左泳道:分子量标记:预染的SDS-Page标准品,上样量/孔:15μg蛋白,右泳道:疏水蛋白B无辅料喷雾制粒后的样品10。
Claims (8)
1.制备干燥的自由流动的稳定疏水蛋白制剂的方法,该方法通过在喷雾装置中喷雾和干燥疏水蛋白溶液来进行,如果情况适宜时包含添加剂。
2.根据权利要求1的方法,其中所述疏水蛋白溶液与相对于溶液中疏水蛋白固体含量5-200重量%的有机或无机喷射辅料共同喷射,随后将通过此方法得到的载有喷射辅料的颗粒干燥。
3.根据权利要求1的制备颗粒形式的疏水蛋白制剂的方法,其中除喷雾装置外还使用流化床。
4.根据权利要求1的方法,其中一种或多种糖醇、纤维素或淀粉被用作喷射辅料。
5.根据权利要求1的方法,其中甘露醇被用作喷射辅料。
6.根据权利要求1的方法,其中在气体入口温度120-200℃下进行喷雾。
7.根据权利要求1的方法,其中在气体出口温度50-120℃下进行喷雾。
8.一种干燥的自由流动的稳定疏水蛋白制剂,其可根据权利要求1获得。
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