CN101487016B - 禽流感疫苗及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种禽流感疫苗及其制备，尤其涉及禽流感疫苗制备中的重组质粒和重组病毒的制备。本发明提供一种重组基因及其制备方法，由杆状病毒囊膜蛋白gp64信号肽基因序列、禽流感病毒主要抗原基因HA序列和杆状病毒囊膜蛋白gp64跨膜域基因序列融合而成。本发明还提供上述重组基因与pBacPAK8质粒重组构建的重组质粒，以及含有上述重组基因的家蚕重组杆状病毒BmHA及其制备方法。上述含有重组基因的家蚕重组杆状病毒BmHA保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.2316。本发明还提供上述重组基因表达的蛋白。本发明提供的，上述家蚕重组杆状病毒BmHA和蛋白可用于制备动物禽流感疫苗。本方法适用于大规模生产，降低了成本，且产量高，所生产的动物禽流感疫苗应用价值大。
Description
技术领域
本发明涉及一种禽流感疫苗及其制备，尤其涉及禽流感疫苗制备中的重组质粒和重组病毒的制备。
背景技术
禽流感，是由禽甲型流感病毒某些亚型中的一些毒株引起的急性呼吸道传染病。动物禽流感大规模爆发，不仅给养殖户带来严重损失，也将会给国民经济带来重大损失，同时，也将会危害到人类的生存安全。
动物禽流感疫苗是预防与治疗动物禽流感一种行之有效的方法。
现有的疫苗是用鸡胚生产，生产商需要提前12个月订购鸡胚。病毒需要适应鸡胚后才能在鸡胚中生长，疫苗的生产周期较长。病毒在鸡胚的传代过程中病毒会发生变异，疫苗株与流行株之间的差异会降低疫苗的免疫保护效果。禽流感对鸡胚有易致病性，易于引起鸡胚的死亡。
欧洲医药委员会批准的人用流感疫苗，MDCK(犬肾细胞)生产的疫苗，但生产规模有限，目前仅够100万人使用剂量。
Treanor(2007)用灭活病毒裂解疫苗以90，45，15，7.5ugHA抗原肌肉注射免疫两次，18-64岁451人参与实验。实验结果表明，免疫诱导的抗体反应效果欠佳。
发明内容
本发明的目的是提供一种克服上述缺陷的动物禽流感疫苗。本发明的基因工程疫苗，利用家蚕杆状病毒表面展示技术和出芽的特点，产生带囊膜的伪病毒，由于家蚕杆状病毒宿主狭小，无论是在生产和使用上，它都具有比传统疫苗，安全性好，且利用家蚕生物反应器大量表达目的蛋白，生产成本低，产量高，易操作，适用于大规模的生产。
本发明的技术方案如下：
本发明提供一种重组基因，由杆状病毒囊膜蛋白gp64信号肽基因序列(SEQ ID NO：7所示)、禽流感病毒主要抗原基因HA序列(SEQ ID NO：8所示)和杆状病毒囊膜蛋白gp64跨膜域基因序列(SEQ ID NO：9所示)融合而成。
上述重组基因的制备方法：采用以SEQ ID NO：1与SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3与SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5与SEQ ID NO：6为引物进行PCR扩增的方法。
本发明还提供上述重组基因与pBacPAK8质粒重组构建的重组质粒。
上述重组质粒的制备方法，BamH I和Not I双酶切pBacPAK8质粒和BamH I和NotI双酶切权利要求1所述的重组基因进行重组。
本发明还提供含有上述重组基因的家蚕重组杆状病毒BmHA，该病毒保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名为家蚕核型多角体病毒(Bombyx morinucleopolyhedrovirus)，保藏日期为2007年12月28日，保藏编号为CGMCC No.2316。
上述家蚕重组杆状病毒BmHA的制备方法：
(1)取权利要求3所述的重组质粒和经Bsu36I酶切的病毒BmBacPAK6的DNA，加入无血清的培养基混匀制成pBacHA混合液；
(2)取Dosper，加入无血清的培养基，混匀制成Dosper混合液；
(3)将培养BmN细胞用无血清的培养基洗涤后，逐滴加入上述制备的pBacHA混合液和Dosper混合液，27℃培养；
(4)收取培养皿中的上清，感染BmN细胞，琼脂糖培养；
(5)挑取噬斑，分组感染BmN细胞，保存上清；
(6)感染的BmN细胞DNA用于Southern blot斑点杂交；
(7)取保存的斑点杂交中阳性克隆细胞的上清进行噬斑筛选；
(8)取噬斑筛选的阳性克隆细胞的上清感染家蚕细胞。
本发明还提供上述重组基因表达的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示。
上述蛋白的制备方法：
(1)将权利要求5所述的家蚕重组杆状病毒BmHA感染BmN细胞进行病毒扩增，
(2)针刺接种法接入家蚕五龄起蚕和蛹，
(3)收集表达的权利要求7所述蛋白。
本发明进一步提供上述家蚕重组杆状病毒BmHA在制备动物禽流感疫苗中的应用。
本发明还提供上述蛋白在制备动物禽流感疫苗中的应用。
本发明实现的技术效果如下：
利用家蚕幼虫、蛹作为生物反应器，家蚕杆状病毒表达***高效表达具有极高临床应用价值动物禽流感疫苗的方法。本方法适用于大规模生产，降低了成本，且产量高，所生产的动物禽流感疫苗应用价值大。
附图说明
图1：含重组基因SP-HA-TM的重组质粒pGEM-HA；
图2：含重组基因SP-HA-TM杆状病毒转移质粒pBacHA；
P：polyhedrin，多角体蛋白基因启动子；A：Polyhedin Poly A+signal，多角体蛋白基因聚腺苷酸化信号；M13ori：M13噬菌体复制起始点；Amp：氨苄青霉素基因；ori：pUC复制起始点。
具体实施方式
本发明所述的利用家蚕生物反应器动物禽流感疫苗的方法，是通过PCR的方法获得禽流感病毒主要抗原HA基因的重组基因，并在其5’和3’端分别引入BamH I和Not I酶切位点，与家蚕杆状病毒载体pBacPAK8相连接，连接产物与野生型家蚕杆状病毒BmBacPAK6在家蚕细胞中发生同源重组，通过空斑筛选，获得带重组基因SP-HA-TM的家蚕重组杆状病毒，人工接种家蚕幼虫、蛹，经5-7天后收集幼虫体液和蛹体，匀浆，进行离心，分离纯化，冷冻干燥，无菌条件下制成动物禽流感疫苗冻干粉实现的。
下面结合实施例详细阐述本发明的具体内容：
实验例1：重组基因SP-HA-TM的构建。
禽流感病毒主要抗原基因是HA基因，在HA基因的5’和3’端分别连接编码杆状病毒囊膜蛋白gp64的信号肽基因序列和编码杆状病毒囊膜蛋白gp64的跨膜域基因序列，构建重组基因。通过引物设计，在该重组基因的5’和3’端分别引入BamH I和Not I内切酶酶切位点。分别以杆状病毒AcNPV囊膜蛋白gp64的信号肽基因序列、禽流感病毒H5N1的HA基因序列和杆状病毒AcNPV囊膜蛋白gp64的跨膜域基因序列为模板设计3对引物，首先PCR扩增目的片段：gp64信号肽基因序列(sp)、HA基因和gp64跨膜域基因序列(tm)，然后利用各目的片段互为引物和模板构建重组基因SP-HA-TM。
引物设计如下：
Pspl(SEQ ID NO：1)：
5’TCGGATCCATGCTACTAGTAAATCAGTC3’
Psp2(SEQ ID NO：2)：
5’GTGTAACAGTAACGTTCTTTTCCGCAAAGGCAGAATGCGCCGC3’
Phal(SEQ ID NO：3)：
5’TAAAAGAACGTTACTGTTACTGTTACACATG3’
Pha2(SEQ ID NO：4)：
5’AATGCAAATTCTGCATTGTAACGAC3’
Ptml(SEQ ID NO：5)：
5’TCGTTACAATGCAGAATTTGCATTGGTGATACTGGGCTATCCAAAAAT3’
Ptm2(SEQ ID NO：6)：
5’AGGCGGCCGCTTACTTTCCAAGTCGGTTCAT3’。
(1)gp64信号肽基因序列(sp)的扩增
以gp64的DNA序列为模板，PCR反应参数设计为，94℃预变性3min，94℃变性30s，68℃复性延伸30s，30个循环，68℃延伸5min。
在一个无菌的0.5ml离心管中，混合下列组分：
10×PCR Buffer 10μl
25mmol MgCl2 8μl
2.5mmol dNTPs 8μl
Pspl 1μl
Psp2 1μl
模板 1μl
KOD-Plus DNA聚合酶 1μl
加无菌双蒸水至100μl。
各组分混匀后，放入PCR仪中，按上述反应参数设计30个循环。待反应结束后，电泳鉴定扩增片段，同时切胶回收扩增片段。
(2)gp64跨膜域基因序列(tm)的扩增
以gp64的DNA序列为模板，PCR反应参数设计为，94℃预变性3min，94℃变性30s，68℃复性延伸30s，30个循环，68℃延伸5min。
100ul的反应体系同上，所用引物为Ptml和Ptm2，各组分混匀后，放入PCR仪中，按上述反应参数设计30个循环。待反应结束后，电泳鉴定扩增片段，同时切胶回收目扩增片段。
(3)HA基因的扩增
以禽流感病毒H5N1HA基因为模板，PCR反应参数为94℃预变性3min，94℃变性30s，68℃复性延伸1min，30个循环，68℃延伸5min。
100ul的反应体系同上，所用引物为Phal和Pha2，各组分混匀后，放入PCR仪中，按上述反应参数设计30个循环。待反应结束后，电泳鉴定扩增片段，同时切胶回收目的片段。
(4)gp64信号肽sp基因与HA基因的融合
PCR反应参数为94℃预变性3min，94℃变性30s，68℃复性延伸1min，30个循环，68℃延伸5min。
在一个无菌的0.5ml离心管中，混合下列组分：
10×PCR Buffer 10μl
25mmol MgCl2 8μl
2.5mmol dNTPs 8μl
Pspl 1μl
Pha2 1μl
模板sp 1μl
模板HA 1ul
KOD-Plus DNA聚合酶 1μl
加无菌双蒸水至100μl。
各组分混匀后，放入PCR仪中，按上述反应参数设计30个循环。待反应结束后，电泳鉴定扩增片段，同时切胶回收扩增片段。
因为sp的下游引物Psp2在设计时加入了HA基因5’端的部分序列，所以PCR扩增出的sp片段3’端序列与HA基因5’端序列存在重叠，再次利用PCR方法就可以扩增出重组基因sp-HA序列。
(5)重组基因sp-HA与tm的融合，构建出重组基因sp-HA-tm
PCR反应参数为94℃预变性3min，94℃变性30s，68℃复性延伸1.5min，30个循环，68℃延伸5min。
在一个无菌的0.5ml离心管中，混合下列成分：
10×PCR Buffer 10μl
25mmol MgCl2 8μl
2.5mmol dNTPs 8μl
Pspl 1μl
Ptm2 1μl
模板sp-HA 1μl
模板tm 1ul
KOD-Plus DNA聚合酶 1μl
加无菌双蒸水至100μl。
各组分混匀后，放入PCR仪中，按上述反应参数设计30个循环。待反应 结束后，电泳鉴定扩增片段，同时切胶回收目的片段。
同上，因为tm的上游引物Ptml设计时加入了HA基因3’端的部分序列，所以PCR扩增出的tm片段5’端序列与HA基因3’端序列存在重叠，利用PCR方法就可以扩增出重组基因sp-HA-tm。
实验例2：克隆质粒pGEM-HA的构建
将PCR扩增出的重组基因sp-HA-tm连接到pGEM-T vector上：
上述组分混匀，25℃反应1h。
反应混合物转化至感受态细胞E.coli DH5α中，涂平板，于37℃培养，12-16小时后可出现菌落。挑取单菌落，提取质粒，进行酶切和测序，序列完全正确，得到质粒pGEM-HA。
实验例3：含重组基因SP-HA-TM的杆状病毒转移质粒pBacHA的获得
质粒pGEM-HA经BamH I和Not I双酶切，切下重组基因SP-HA-TM片段，克隆至经BamH I和Not I双酶切的质粒pBacPAK8中，使重组基因SP-HA-TM置于多角体蛋白(polyhedrin，ph)基因启动子控制之下，构建成重组转移质粒pBacHA，经酶切分析鉴定基因序列正确。
实验例4：含重组基因SP-HA-TM的家蚕重组杆状病毒BmHA的获得
取重组转移质粒pBacHA和经Bsu36I酶切线性化的病毒BmBacPAK6DNA，加入100ul无血清的TC-100培养基(GIBCOBRL公司)混匀制成pBacHA混合液。取6ul的Dosper(宝灵曼公司)，加入100ul无血清的TC-100培养基，混匀制成Dosper混合液。将事先培养在35mm平皿中的BmN细胞用无血清的TC-100培养基洗涤两次，逐滴加入上述制备的pBacHA混合液和Dosper混合液，27℃ 培养4-5天。收取上清进行第一轮噬斑筛选。取5ul上清感染35mm平皿中的BmN细胞，1小时后弃去上清加入等量混合的TC-100培养基和低熔点琼脂糖。4-5天后挑取噬斑，分组感染BmN细胞3-4天，保存上清，细胞用NaOH裂解用于Southern blot斑点杂交，以重组基因SP-HA-TM作模板用随机引物探针标记试剂盒(宝灵曼公司)标记探针，杂交方法按照《分子克隆》(科学出版社，1995)。取保存的斑点杂交中阳性克隆细胞的上清进行第二轮噬斑筛选。取阳性克隆细胞的上清感染家蚕细胞，以扩增得到大量的含重组基因SP-HA-TM的重组杆状病毒BmHA。该病毒能感染家蚕细胞，在显微镜下感染的家蚕细胞呈发病状。
实验例5：HA融合蛋白在家蚕5龄幼虫和蛹中的表达
将重组病毒BmHA以10MOI感染BmN细胞进行病毒扩增，按1×106PFU/条针刺接种法接入家蚕五龄起蚕或蛹，在感染5-7天后，采取蚕体或蛹体匀浆，经高速离心(12000rpm，30min)，取上清，测血淋巴中的HA活性，在感染的第6天，血淋巴中的HA活性达到6×104U/ml。高速离心后的上清加入等体积的2×蛋白质上样缓冲液(100MmTris.HCl，4％SDS，0.1％溴酚蓝，10％甘油)，100℃加热10min，取20ul进行SDS-PAGE分析。结果表明，重组病毒已表达HA融合蛋白。蛋白测序结果显示，其氨基酸序列如如SEQ ID NO：10所示。
实验例6：动物禽流感疫苗的获得
(1)从蚕蛹中分离纯化HA融合蛋白(动物禽流感疫苗)
a.取适量经BmHA感染的蚕蛹样品，在4℃下解冻后，与0.85％生理盐水适量混和，匀浆至浆液细致均匀即可；
b.将匀浆液加入500ml离心管中，配平，3000rpm离心20-60min，取上清，小心弃去油脂；
c.将3000rpm离心上清液倒入新500ml离心管中，配平，6000rpm离心20-60min，取上清，弃油脂；
d.6000rpm离心的上清液倒入50ml离心管，配平，12000rpm离心30-120min，取上清，弃油脂；
e.12000rpm离心上清液转入新的50ml离心管，配平，18000rpm离心30-120min，取上清，弃油脂；
f.18000rpm离心后的上清，在超净台上分装于灭菌的超离管中，平衡，35000rpm离心30-90min；
g.35000rpm离心后，取上清，进行超滤。
(2)超滤
使用中空纤维膜进行超滤。选择合适的中空纤维膜规格(截留分子量为750kD)，进行清洗后加样，用适量无菌超纯水超滤。
(3)动物禽流感疫苗生物活性鉴定
超滤后的样品进行测活，测活方法采用红细胞凝集试验。取24孔细胞培养板，在每一排的1到6孔(A1-A6)加250μl生理盐水(0.85％)后，加入250μl样品于第一孔，做倍比稀释，同时设置阴性对照孔，加入不含样品的液体做倍比稀释，再加入1％鸡红细胞悬液250μl至每一孔内，轻轻震荡培养板，于37℃孵育4小时后观察结果。
用Bradford法(考马斯亮蓝法)检测样品蛋白含量。
动物禽流感疫苗比活计算(mg/mL)公式如下：动物禽流感疫苗比活＝2n×4/样品浓度，n为发生红细胞凝集的孔数。该方法所获得的动物禽流感病毒比活可达20以上。
(4)保存及检测
比活较高的样品，无菌分装，-50℃冷冻干燥，制成动物禽流感疫苗冻干粉。同时，再鉴定冻干粉比活，取达到20以上者。12％SDS-PAGE电泳检测，在45kD处有目的蛋白的表达。
(5)疫苗效果
动物禽流感疫苗进行动物体中试验，皮下注射，注射剂量为0.1-50mg/kg，2-4周后检测抗体效价。
在4周龄鸡体内产生抗体，其保护抗体效价大于1：150，攻毒试验结果显示该疫苗能产生中和抗体并具有明显抵抗病毒的效果。安全药理结果显示该疫 苗对鸡的心血管、呼吸***、神经***、体温等无明显影响。长毒结果显示该疫苗对鸡无毒性。急毒结果显示该疫苗对鸡进行皮下注射，最大耐受剂量大于153mg/kg。致突变试验结果显示该疫苗无致突变性。
可见，该疫苗在动物体中能产生抗体，具有明显保护作用，无毒副作用，安评结果表明该疫苗安全有效。
SEQUENCE LISTING
<110>浙江中奇生物药业股份有限公司
<120>禽流感疫苗及其制备方法
<130>071437-I-CP-nzj
<150>2007101642157
<151>2007-09-30
<160>10
<170>PatentIn version3.5
<210>1
<211>28
<212>IDNA
<213>引物
<400>1
<210>2
<211>43
<212>IDNA
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<213>HA基因
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<212>IDNA
<213>gp64跨膜域基因
<400>9
<210>10
<211>393
<212>PRT
<213>重组蛋白
<400>10
Claims (6)
1.一种家蚕重组杆状病毒BmHA，该病毒保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.2316。
2.一种权利要求1所述家蚕重组杆状病毒BmHA的制备方法：
(1)通过PCR扩增的方法获得由杆状病毒囊膜蛋白gp64信号肽基因序列、禽流感病毒主要抗原基因HA序列和杆状病毒囊膜蛋白gp64跨膜域基因序列构建而成的重组基因；
(2)在步骤(1)所得重组基因的5’和3’端分别引入BamH I和Not I酶切位点后，连接到家蚕杆状病毒载体pBacPAK8，使重组基因置于多角体蛋白基因启动子控制之下，构建成重组质粒；
(3)取步骤(2)所得的重组质粒和经Bsu36I酶切的病毒BmBacPAK6的DNA，加入无血清的培养基混匀制成pBacHA混合液；
(4)取Dosper，加入无血清的培养基，混匀制成Dosper混合液；
(5)将培养BmN细胞用无血清的培养基洗涤后，逐滴加入上述制备的pBacHA混合液和Dosper混合液，27℃培养；
(6)收取培养皿中的上清，感染BmN细胞，琼脂糖培养；
(7)挑取噬斑，分组感染BmN细胞，保存上清；
(8)感染的BmN细胞DNA用于Southern blot斑点杂交；
(9)取保存的斑点杂交中阳性克隆细胞的上清进行噬斑筛选；
(10)取噬斑筛选的阳性克隆细胞的上清感染家蚕细胞。
3.一种权利要求1所述的家蚕重组杆状病毒BmHA表达的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示。
4.一种权利要求3所述蛋白的制备方法：
(1)将权利要求1所述的家蚕重组杆状病毒BmHA感染BmN细胞进行病毒扩增，
(2)针刺接种法接入家蚕五龄起蚕及蛹，
(3)收集表达的权利要求3所述蛋白。
5.一种权利要求1所述家蚕重组杆状病毒BmHA在制备动物禽流感疫苗中的应用。
6.一种权利要求3所述的蛋白在制备动物禽流感疫苗中的应用。
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