CN101484471A - 抗-nkg2a抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本文描述了适合于人治疗的抗－NKG2A抗体，包括鼠抗－NKG2A抗体Z270的人化形式，以及用于产生和使用所述抗体的相关方法和材料。还描述了示例性的互补决定区(CDR)序列和在所述抗体的框架区(FR)和/或CDR中任选的氨基酸回复突变的位点。

Description

抗-NKG2A抗体及其用途
发明领域
本发明涉及抗-NKG2A抗体，特别是鼠抗-NKG2A抗体Z270的人化形式，以及生产和使用所述抗体的方法。
发明背景
CD94/NKG2A是发现于NK，NKT和T细胞的亚组的细胞毒性抑制受体，其限制它们杀伤表达CD94/NKG2A-配体HLA-E的细胞(见例如，WO99/28748)。抑制CD94/NKG2A的抗体可能提高肿瘤特异性淋巴细胞抗肿瘤细胞的溶胞活性。因此，在癌症患者中抑制CD94/NKG2A而不杀死CD94/NKG2A-表达细胞的治疗性抗体可能能够控制肿瘤生长。另外，某些淋巴瘤例如，NK-淋巴瘤，特征为CD94/NKG2A表达。在所述患者中，靶向和杀死CD94/NKG2A-表达细胞的治疗性抗体可能能够根除肿瘤细胞。抗-NKG2A抗体也已经被建议用于治疗自身免疫或炎性疾病(见例如，US20030095965A1，WO2006070286)。
多种抗CD94/NKG2A抗体已在本领域中描述。例如，Sivori等人(Eur J Immunol 1996；26：2487-92)提到鼠抗-NKG2A抗体Z270；Carretero等人(Eur J Immunol 1997；27：563-7)描述鼠抗-NKG2A抗体Z199(现在可商业获得于Beckman Coulter，Inc.，产品号IM2750，USA)；Vance等人(J Exp Med 1999；190：1801-12)提到鼠抗-NKG2-抗体20D5(现在可商业获得于BD Biosciences Pharmingen，目录号550518，USA)；和美国专利申请公开20030095965描述了鼠抗体3S9，其据称结合于NKG2A，NKG2C和NKG2E。
目前可获得的抗-CD94/NKG2A抗体是非人源的，由于它们的免疫原性，这使得它们不适于大多数在人中的治疗应用。虽然可获得简单的人化方法例如，CDR-移植，个别的人化方法典型地需要获得最佳的人化变体，使免疫原性最小化，同时充分保持或提高功能性质。相应地，需要适于治疗人患者的抗-CD94/NKG2A抗体。
发明概述
本发明提供了抗-NKG2A抗体，以及包含所述抗体的组合物，和生产和使用所述抗体的方法。在一个实施方式中，抗体是鼠抗-NKG2A抗体Z270的人化形式，本文命名为“humZ270”。在另一实施方式中，抗体是具有与Z270基本上同一的可变重链(VH)和/或可变轻链(VL)区的抗-NKG2A抗体的人化形式。
提供了示例性的互补决定区(CDR)残基和/或用于在框架区(FR)和/或所述抗体中的氨基酸取代的位点，以生产具有改善性质的抗体，所述改善性质例如，更低的免疫原性，改善的抗原结合或其他功能性质，和/或改善的物理化学性质例如，更好的稳定性。在一个方面，本发明提供了人化抗体，其中Kabat CDR的至少一部分与人接纳体(acceptor)序列的相应部分同一。在一个实施方式中，人接纳体框架序列不包含任何氨基酸取代或回复突变。在另一实施方式中，人框架序列包含至少一个氨基酸取代。所述示例性氨基酸取代的kabat位点包括VH区的框架区中的5、66、67、69、71、73和75，VL区的框架区中的46和48，CDR-H2中的60、63、64和65。
在其他方面，本发明提供了药物组合物，其包含所述抗体和载体，还提供了免疫缀合物，其包含缀合于细胞毒性或可检测试剂的所述抗体。
在其他方面，本发明提供了编码所述抗体的核酸和载体，以及包含所述核酸和/或载体的宿主细胞。还提供了通过培养所述宿主细胞生产抗-NKG2A抗体的重组方法，以生产核酸。
在其他方面，本发明提供了制备的物品，其包含容器，所述容器包含所述抗-NKG2A抗体和指示使用者治疗患者中的病症例如癌症或病毒疾病的说明书。任选地，物品可包含另一容器，所述容易包含另一试剂，其中说明书指示使用者利用抗体与该试剂联合治疗病症。
本发明还提供了将所述抗-NKG2A抗体用于治疗患者中的病症的方法，所述病症例如癌症，病毒性疾病，炎性病症或自身免疫病症，任选地，与另一抗癌症，抗病毒性疾病试剂，或抗炎性试剂联合。
附图描述
图1显示了具有选择的种系V-和J-片段的Z270VL和Z270VH，和示例性的humZ270VL1(SEQ ID NO：4)和humZ270VH1(SEQ ID NO：5)序列与根据Kabat模式的氨基酸残基编号(Kabat等人，1991，Sequences of Proteins of Immunological Interest，5th Ed.Public HealthService，National Institutes of Health，Bethesda，MD.)的比对。mask残基在kabat模式中遮蔽；CDR残基在kabat模式中显示为粗体；小鼠/种系差异在VKI_02/JK4(SEQ ID NO：9)和VH1_18/JH6(SEQ ID NO：10)序列中遮蔽；并且潜在的回复突变残基在humZ270VH/VL序列中遮蔽。在VL中鉴定的潜在回复突变是L46F和I48V。在重链中鉴定的潜在回复突变是V5Q、M69L、T71V、T73K和T75S。还已知的是产生的humZ270VL共有序列(“humZ270VL1 cons；”SEQ ID NO：6)和humZ270VH1共有序列(“humZ270VH1 cons；”SEQ ID NO：7)。在humZ270VL1 cons中，位点46的氨基酸是L或F，位点48的氨基酸是I或V。在humZ270VH1 cons，位点5的氨基酸是V或Q；位点69的氨基酸是M或L；位点71的氨基酸是T或V；位点73的氨基酸是T或K；和/或位点75的氨基酸是T或S。在另一humZ270VH1，humZ270VH1cons2(SEQ ID NO：8)中，位点5的氨基酸是V或Q；位点60的氨基酸是S或A；位点63的氨基酸是L或F；位点64的氨基酸是Q或K；位点65的氨基酸是G或D；位点66的氨基酸是R或K；位点71的氨基酸是T或V；位点73的氨基酸是T或K；和/或位点75的氨基酸是T或S。
图2显示了根据kabat定义的示例性humZ270抗体的CDR。相对于鼠Z270CDR的这些差异以黑体显示。
图3A-H显示了实施例中提到的质粒。(A)用于TA克隆的pMD19-T载体图谱。(B)用于瞬时表达的pJSV002克隆载体图谱。(C)轻链***具有鼠kappa恒定区的pJSV002。(D)包含鼠IgG1恒定区的pJSV002-mIgG1变体。(E)包含Z270重链可变区和IgG1重链恒定区的pJSV002-mIgG1Z270H1。(F)包含轻链可变区和人kappa链恒定区的pJSV002-hKappa Z270L11。(G)pJSV002-IgG4-S241P。(H)pJSV002-IgG4-S241P Z270H1。
图4显示了源于或基于Z270的不同序列，(A)to(J)，分别为SEQID NOS：14-23。细节见实施例2-5。
图5显示了用于表达人化Z270重链的载体的示例性设计。
图6显示了用于表达人化Z270轻链的载体的示例性设计。
图7显示了用于在HEK293细胞中瞬时表达人化Z270抗体的方法的示例性概括。
图8显示了确定humZ270对抗原的结合亲和性的示例性Biacore测定。
图9显示了嵌合Z270(A)和humZ270VL1/VH1(B)的亲和性确定。
图10显示了具有在轻链或重链的不同回复突变的humZ270VL1/VH1的亲和性确定，嵌合Z270用作对照。
图11显示了鼠Z270kabat CDR H1-H3的标准CDR-移植入VH1_18/JH6重链接纳体框架的策略，不具有(humZ270H3)或具有(humZ270VH4)回复突变。
图12显示了在不同人接纳体序列中的humZ270VH构建体的比对，所有都具有部分人片段的CDR-H2。
图13显示了humZ270变体VL1/VH1和VH3-VH8的Biacore亲和性评价的结果，所有都根据hZ270VL1/VH1的KD标准化。
图14显示了用于丙氨酸扫描突变以鉴定Z270VL和VH片段中的关键互补位残基的选择的残基。
图15显示了Z270VH丙氨酸突变体的Biacore亲和评价的结果，根据嵌合Z270的结合标准化。
图16显示了Z270VL丙氨酸突变体的Biacore亲和评价的结果，根据嵌合Z270的结合标准化。
图17利用流式细胞术显示了多种重组Z270变体与稳定过表达CD94/NKG2A或CD94/NKG2C的Ba/F3细胞的结合。
图18显示了评价重组Z270、嵌合Z270、humZ270VL1/VH1和Z199诱导51Cr-labeled LCL 721.221-Cw3细胞被CD94/NKG2A+NKL细胞杀伤的能力的测定结果，显示出humZ270VL1/VH1在诱导杀伤中更有效。
图19显示humZ270VL1/VH1以浓度依赖模式(菱形)有效地结合Ba/F3-CD94/NKG2A细胞。然而，当用HLA-E四聚物预培养细胞时，防止了humZ270VL1/VH1结合Ba/F3-CD94/NKG2A细胞(正方形)。
图20显示了humZ270VL1/VH1和具有在VH的V5Q突变的humZ270变体的两种不同制剂结合CD94/NKG2A-表达细胞，但不结合CD94/NKG2C-表达细胞，然而V5Q-变体稍稍更不有效。
定义
本文中术语“抗体”以最广泛的意义使用，特别地包括全长单克隆抗体，多克隆抗体，多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，和抗体片段，只要它们显示出期望的生物活性。与抗体生产相关的多种技术提供于，例如，Harlow，等人，
Figure A200780024805D0008153656QIETU
Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，(1988).)。
“抗体片段”包含全长抗体的一部分，优选其抗体结合或可变区。抗体片段的例子包括Fab、Fab′、F(ab)2、F(ab’)2、F(ab)3、Fv(典型地抗体单臂的VL和VH区)、单链Fv(scFv)、dsFv、Fd片段(典型地VH和CH1区)和dAb(典型地VH区)片段；VH、VL、VhH和V-NAR区；小抗体(minibody)、二抗体(diabody)、三抗体(triabody)、四抗体(tetrabody)和kappa体(kappa body)(见例如I11等人，Protein Eng 1997；10：949-57)；骆驼IgG；IgNAR；和从抗体片段形成的多特异性抗体片段，和一种或多种分离的CDR或功能性互补位，其中分离的CDR或抗原结合残基或多肽可联合或连接在一起以形成功能性抗体片段。多种类型的抗体片段已经描述或综述于，例如Holliger and Hudson，NatBiotechnol 2005；23，1126-1136；WO2005040219，以及公开的美国专利申请20050238646和20020161201。
如本文所用，术语“抗体衍生物”包含全长抗体或抗体片段，优选至少包含其抗原结合或可变区，其中一种或多种氨基酸被化学修饰，例如通过烷化，PEG化，酰化，形成酯或形成酰胺等等，例如，用于将抗体与第二分子连接。这包括但不限于PEG化抗体，半胱氨酸-PEG化抗体，及其变体。
“免疫缀合物”包含与第二试剂，例如细胞毒性剂，可检测试剂等，联合或连接的抗体衍生物。
“人化”抗体是人/非人嵌合抗体，其包含源于非人免疫球蛋白的最小序列。在极大程度上，人化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体超变区的残基被来自非人物种，例如小鼠，大鼠，兔，或非人灵长类动物，的具有期望特异性，亲和性和能力的的超变区残基(供体抗体)取代。在一些例子中，人免疫球蛋白的框架区(FR)残基被相应的非人残基取代。而且，人化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中未发现的残基。产生这些修饰以进一步改善抗体性能。通常，人化抗体将包含基本上所有的至少一种，典型两种，可变区，其中所有或基本上所有超变环对应于非人免疫球蛋白的的超变环，并且所有或基本上所有FR残基是人免疫球蛋白序列的FR残基。人化抗体还可任选包含至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，典型人免疫球蛋白的该部分。进一步的细节见例如，Jones等人，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann等人，Nature332：323-329(1988)；and Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992)，WO92/02190，美国专利申请20060073137，和美国专利6,750,325，6,632,927，6,639,055，6,548,640，6,407,213，6,180,370，6,054,297，5,929,212，5,895,205，5,886,152，5,877,293，5,869,619，5,821,337，5,821,123，5,770,196，5,777,085，5,766,886，5,714,350，5,693,762，5,693,761，5,530,101，5,585,089，和5,225,539。
术语“超变区”当在本文中使用时指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。超变区一般包含来自“互补决定区”或“CDR”(轻链可变区中残基24-34(L1)，50-56(L2)和89-97(L3)，以及重链可变区中的31-35(H1)，50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等人1991，上文)的氨基酸残基和/或来自“超变环”(轻链可变区中的残基26-32(L1)，50-52(L2)和91-96(L3)，以及重链可变区中的26-32(H1)，53-55(H2)和96-101(H3)，Chothia and Lesk，J.Mol.Biol1987；196：901-917)的残基。典型地，在此区域的氨基酸残基的编号是通过描述于Kabat等人上文的方法实施。本文中的短语例如“Kabat位点”，“利用Kabat编号”，“如Kabat中的可变区编号”和“根据Kabat”指重链可变区或轻链可变区的编号***。利用Kabat编号***，肽的实际的线性氨基酸序列可包含更少或另外的对应于缩短或***可变区FR或CDR的氨基酸。例如，重链可变区可包括在CDR H2的残基52之后的单个氨基酸***(根据Kabat的残基52a)，以及在重链FR残基82之后***的残基(例如，根据Kabat，残基82a、82b和82c等)。通过将抗体序列与“标准”kabat编号序列的同源区比对，可确定给定抗体的残基的Kabat编号。除非有另外的提示或与上下文相反，本文描述的VL或VH序列的所有氨基酸残基的位点是根据kabat。
“框架区”或”FR”残基是本文定义的CDR之外的VH或VL残基。
多肽的“变体”指具有与参考多肽，典型地为天然或“亲本”多肽，基本上同一的氨基酸序列的多肽。多肽变体可具有在天然氨基酸序列的某些位点的一个或多个氨基酸取代，缺失，和/或***。
“保守”氨基酸取代是其中用具有具有类似物理化学性质的侧链的氨基酸残基取代氨基酸残基。具有类似侧链的氨基酸残基的家族是本领域已知的，并且包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸，精氨酸，组氨酸)，具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸，谷氨酸)，具有不带电极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，半胱氨酸，色氨酸)，具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸)，具有β-支侧链的氨基酸(例如，苏氨酸，缬氨酸，异亮氨酸)和具有芳香侧链的氨基酸(例如，酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，组氨酸)。
上下文中术语两个氨基酸序列的“基本上同一”意味着，当最佳比对时，例如通过利用缺省缺口权重(default gap weight)的程序GAP或BESTFIT，序列共享至少大约50％，至少大约60％，至少大约70％，至少大约80％，至少大约90％，至少大约95％，至少大约98％，或至少大约99％的序列同一性。在一个实施方式中，不同一的残基位点通过保守氨基酸取代而区分。序列同一性典型地利用序列分析软件而测量。利用对不同取代，缺失和其他修饰，包括保守氨基酸取代的类似性的测量，蛋白分析软件使类似序列匹配。例如，公众可获得的GCG软件包含例如“Gap”和“BestFit”的程序，其可与缺省参数一起使用以确定密切相关的多肽，例如来自生物体的不同物种之间的同源多肽之间，或野生型蛋白和其突变体之间，的序列同源性或序列同一性。见例如，GCG 6.1版。还可利用FASTA或ClustalW，应用缺省或推荐参数，而比较多肽序列。在GCG 6.1版中的程序，FASTA(例如，FASTA2和FASTA3)，提供了查询和检索序列之间的最佳重叠区的比对和序列同一性百分比(Pearson，Methods Enzymol.1990；183：63-98；Pearson，Methods Mol.Biol.2000；132：185-219)。当将序列与包含大量来自不同生物体的序列的数据库比较时，或当推论其时，另一优选的算法是计算机程序BLAST，特别是blastp，其利用缺省参数。见例如，Altschul等人，J.Mol.Biol.1990；215：403-410；Altschul等人，Nucleic AcidsRes.1997；25：3389-402(1997)；每种引入本文作为参考。在两种基本上同一的氨基酸序列中的“相应的”氨基酸位点是通过本文提到的任何蛋白质分析软件，典型地利用缺省参数，比对的那些。
具有参考抗体(例如，Z270)的“生物学特性”的抗体是具有该抗体的使其区别于结合相同抗原(例如，NKG2A)的其他抗体的一种或多种生物学特性的抗体。例如，具有Z270的生物学特性的抗体可阻断NKG2A的活化，和/或与Z270在结合NKG2A的细胞外区中交叉竞争。
NKG2A(OMMIM161555，其全文引入本文作为参考)是NKG2组转录物的成员(Houchins，等人(1991)J.Exp.Med.173：1017-1020)。NKG2A被7个外显子编码，横跨25kb，显示出一些差异剪接。NKG2A是在NK细胞，α/βT细胞，γ/δT细胞，和NKT细胞亚组表面发现的抑制性受体。类似于抑制性KIR受体，它在细胞质区中具有ITIM。如本文所用，“NKG2A”指NKG2A基因或编码蛋白的任何变体，衍生物或同种型。还包括与野生型，全长NKG2A共享一种或多种生物学性质或功能，并且共享至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高核苷酸或氨基酸同一性的任何核酸或蛋白序列。人NKG2A包含在3个区中的233个氨基酸，具有包含残基1-70的细胞质区，包含残基71-93的跨膜区域，和包含残基94-233的细胞外区域，具有下述序列：
MDNQGVIYSDLNLPPNPKRQQRKPKGNKSSILATEQEITYAELNLQKASQDFQGNDKTYHCKDLPSAPEKLIVGILGIICLILMASVVTIVVIPSTLIQRHNNSSLNTRTQKARHCGHCPEEWITYSNSCYYIGKERRTWEESLLACTSKNSSLLSIDNEEEMKFLSIISPSSWIGVFRNSSHHPWVTMNGLAFKHEIKDSDNAELNCAVLQVNRLKSAQCGSSIIYHCKHKL(SEQID NO：11)
NKG2C(OMIM602891，其全文引入本文作为参考)和NKG2E(OMIM602892，其全文引入本文作为参考)是NKG2组转录物的两种其他成员(Gilenke，等人(1998)Immunogenetics 48：163-173)。NKG2C和NKG2E是发现于NK细胞表面的活化受体。
HLA-E(OMIM143010，其全文引入本文作为参考)是非经典的MHC分子，其在细胞表面表达，并且通过源于其他MHC1类分子的信号序列的肽的结合而被调节。HLA-E结合自然杀伤(NK)细胞和一些T细胞，与CD94/NKG2A，CD94/NKG2B，和CD94/NKG2C特异性结合(见例如，Braud等人(1998)Nature 391：795-799，其全文引入本文作为参考)。HLA-E的表面表达足以保护靶细胞免于被CD94/NKG2A+NK，T，或NKT细胞克隆溶解。如本文所用的，“HLA-E”指HLA-E基因或编码蛋白的任何变体，衍生物，或同种型。还包括与野生型，全长HLA-E共享一种或多种生物学性质或功能，并且共享至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的核苷酸或氨基酸同一性的任何核酸或蛋白序列。
当被置于与另一核酸序列的功能关系中时，核酸为“可操纵连接”。例如，前序列或分泌前导序列可操纵连接于多肽的DNA，如果它表达为参与多肽分泌的前蛋白；启动子或增强子可操纵连接于编码序列，如果它影响序列的转录；或者核糖体结合位点可操纵连接于编码序列，如果它的安置促进了翻译。一般地，“可操纵连接”表示被连接的DNA序列是邻接的，并且在分泌前导序列的例子中，邻接并且位于阅读相中。然而，增强子不必须是邻接的。通过在方便的限制性位点连接而完成连接。如果所述位点不存在，则根据通常的实践使用合成的寡核苷酸接合物(adaptor)或连接物(linker)。
“分离的”分子是为组合物中的主要种类的分子，其中根据其属于的分子种类发现它(即，其组成组合物中至少大约50％的分子类型，典型地组成组合物中至少大约70％，至少大约80％，至少大约90％，至少大约95％，或更多的分子种类，例如，肽)。通常，在组合物中所有存在的肽种类的情况下，或至少在建议用途的情况中基本上活性的肽种类，抗体分子的组合物将显示出对于抗体分子98％、98％或99％的同源性。
在本发明的上下文中，“治疗”指预防，减轻，控制，治愈或减少疾病或病症的一种或多种症状或临床相关表现，除非上下文有相反指示。例如，没有疾病或病症的症状或临床相关表现被鉴定的患者的“治疗”是预防性的治疗，然而，已被鉴定为具有疾病或病症的症状或临床相关表现的患者的“治疗”通常不构成预防性治疗。
发明详述
本发明涉及结合NKG2A的抗体。在一个方面，抗体是抗体Z270的人化形式，其是特异性结合NKG2A但不特异性结合人NKG2C或NKG2E的鼠单克隆抗体。Z270可阻断人CD94/NKG2A的功能，并且特异性诱导以浓度依赖模式的CD94/NKG2A-限制的淋巴细胞的细胞杀伤。
本发明提供了，例如，humZ270变体，其中VH CDR的至少一部分，例如CDR-H2与人VH接纳体序列的相应部分是同一的，由此降低了人化抗体的免疫原性。令人惊讶的是，所述人化形式在增强CD94/NKG2A-表达的细胞毒性淋巴细胞的细胞毒性中比Z270的鼠或嵌合形式更有效。在其他方面，本发明提供了具有包含对应于鼠抗体Z270的某些抗原结合残基的CDR的抗体，和人框架序列。这些和其他方面在下面部分和实施例中更详细地描述。
人化抗-NKG2A抗体
人化非人抗体的方法在本领域中已经进行了描述。一般地，在人化方法中，编码鼠抗体的相互作用区域的核苷酸可克隆入编码人IgG的cDNA-载体中，这样使得产生了由含有鼠CDR的人IgG骨架组成的嵌合抗体。所述嵌合抗体可显示出与原始鼠抗体相比更低的亲和性，更低的稳定性，或其他不期望的特点，并且还可以是免疫原性的。因此，嵌合Ab中的个别氨基酸可能需要最优化以获得用于治疗性应用于人中的高质量的功能性mAb。
典型地，人化抗体具有从非人来源引入的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基经常表示为“进口”残基，其典型地来自“进口”可变区。人化可以基本上按照Winter及其合作者的方法通过用超变区序列替换人“接纳体”抗体的相应序列而实施(Jones等人，Nature，321：522-525(1986)；Riechmann等人，Nature，332：323-327(1988)；Verhoeyen等人，Science，239：1534-1536(1988))。相应地，所述“人化”抗体是嵌合抗体(美国专利No.4,816,567)，其中基本上小于完整的人可变区已被来自非人物种的相应序列取代。实践中，人化抗体典型地是人抗体，其中一些超变区残基和可能地一些FR残基被来自啮齿动物抗体的类似位点的残基取代。
产生人化抗体的另一方法描述于美国专利申请公开2003/0017534，其中人化抗体和抗体制剂从转基因非人动物中生产。非人动物被遗传工程化以包含一种或多种人化免疫球蛋白基因座，其能够在转基因非人动物中进行基因重排和基因转化以产生多样化的人化免疫球蛋白。
用于产生人化抗体的人可变区的选择，轻链的和重链的，对于降低抗原性是非常重要的。根据所谓的“最佳适合”方法，啮齿动物抗体可变区序列相对于已知的人可变区序列库或人种系序列库进行筛选。最接近啮齿动物的人序列可然后接受为用于人化抗体的人框架区(Sims等人，J.Immunol.1993；151：2296 et seq.；Chothia等人，Chothia andLesk，J.Mol.Biol 1987；196：901-917)。另一方法使用源于特定亚组的轻或重链的所有人抗体的共有序列的特定框架区。相同的框架可用于几种不同的人化抗体(Carter等人，PNAS USA，1992；89：4285 et seq.；Presta等人，J Immunol 1993；151：2623 et seq.)。设计为降低抗体分子在人患者中的免疫原性的其他方法包括镶饰抗体(veneeredantibodies)(见例如，美国专利6,797,492和美国专利申请公开20020034765和20040253645)和已通过T-细胞表位分析和移除而修饰的抗体(见例如，美国专利申请公开20030153043和美国专利No.5,712,120)。
抗体人化为具有保持对于抗原的高亲和性和其他优良生物学性质也是重要的。为达到这个目标，根据优选的方法，通过利用亲本和人化序列的三维模型分析亲本序列和多种概念上的(conceptual)人化产品的方法，制备了人化抗体。三维免疫球蛋白模型通常是可获得的，并且对于本领域技术人员是熟悉的。阐明和显示选择的候选免疫球蛋白序列的可能的三维构型结构的计算机程序是可获得的。检查这些显示允许分析残基在候选免疫球蛋白序列的机能中的可能的作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。以此方式，FR残基可从受体和进口序列中被选择并组合，以使获得期望的抗体特性，例如对靶抗原的提高的亲和性。通常，超变区残基直接和最实质性地涉及对抗原结合的影响。
下面的实施例1描述了结合NKG2A的示例性人化抗-NKG2A抗体的设计，并且该分析至少部分上例示于图1。如图1所示，在本发明的一种humZ270中，CDR-H2的C-末端部分(对应于Kabat残基61-65)与人接纳体序列的相应部分是同一的。而且，如图例中所述，一种humZ270VL序列(SEQ ID NO：4)可任选地包含在所示的FR残基L46和I48中的一个或两个中的突变，并且一种humZ270VH序列(SEQ ID NO：5)可任选包含在所示的FR残基V5，M69，T71，T73和T75中的一个或多个中的突变，氨基酸编号根据Kabat。表1描述了包含在humZ270VH和humZ270VL FR序列中示例性的人到鼠回复突变的示例性humZ270VL和humZ270VH变体，以及FR突变的示例性组合。在表1和本文别处，氨基酸位点根据Kabat设计，其中在humZ270VH区中的氨基酸V5，M69，T71，T73，和T75对应于SEQ IDNO：5，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8或本文描述的其他示例性humZ270VH序列的V5，M70，T72，T74，和T76。
表1
在天然或共有的humZ270VL(SEQ ID NO：4或6)和/或humZ270VH(SEQ ID NO：5，7，或8)序列中包含示例性FR回复突变的humZ270VL和humZ270VH变体。
 
humZ270VL变体 humZ270VH变体
无L46FI48VL46F和I48V 无V5QM69LT71VT73KT75SV5Q和M69LV5Q和T71VV5Q和T73KV5Q和T75SM69L和T71VM69L和T73KM69L和T75ST71V和T73KT71V和T75ST73K和T75SV5Q，T73K和T75S
 
V5Q，T71V和T75SV5Q，T71V和T73KV5Q，M69L和T75SV5Q，M69L和T73KV5Q，M69L和T71VT71V，T73K和T75SM69L，T73K和T75SM69L，T71V和T75S，M69L，T71V和T73K，V5Q，M69L，T71V和T73K，V5Q，M69L，T71V和T75S，V5Q，M69L，T73K和T75S，V5Q，T71V，T73K和T75S，M69L，T71V，T73K和T75S，V5Q，M69L，T71V，T73K和T75S
相应地，本发明提供了Z270杂交瘤生产的抗-NKG2A抗体的人化形式，以及与Z270共享生物学特性和/或基本的序列同一性的非人抗体的人化形式。在另一实施方式中，其单克隆抗体或片段或衍生物能够结合非人灵长类动物NKG2A。
本文的人化抗体包含并入人VH和VL区的非人超变区或CDR残基。
在一个方面，本发明提供了包含在人接纳体框架中的来自鼠抗体Z270的CDR的抗原结合残基的人化抗体，其中CDR-H2的至少6个C末端氨基酸残基与人接纳体序列相同。所述人化抗体可比原始鼠Z270抗体或其嵌合形式在例如，增强CD94/NKG2A-表达细胞毒性淋巴细胞，例如NK-细胞，NK T细胞，α/βT-细胞和/或γ/δT-细胞，或CD94/NKG2A-表达细胞毒性淋巴细胞群体，的细胞毒性中更有效。
本发明典型的抗体包含抗原结合残基，其对应于包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：5的残基D52、D54、R94、F99、T(100C)，和W(100F)的Z270CDR-H2和CDR-H3，或为其部分，其已经在实施例中显示为对于抗原结合是关键的。任选地，抗体还包含VH残基N35、Y53、E56、D98、V(100A)和L(100D)。
在另一方面，人化抗体包含对应于SEQ ID NO：5的残基31-35的CDR-H1序列，和对应于SEQ ID NO：5的残基95-102的CDR-H3序列，其中CDR-H2序列包含SEQ ID NO：5的残基50-59。在所述人化抗体中，VH区可具有与SEQ ID NO：5，例如50％或更高的序列同一性，例如至少60％，至少70％，或至少75％的序列同一性。具有所述序列的示例性人化VH区在实施例和下面进行描述。
在一个实施方式中，在所述人化抗体中，VH区的位点5的氨基酸可以是V或Q；VH区的位点69的氨基酸可以是M或L；VH区的位点71的氨基酸可以是T或V；VH区的位点73的氨基酸可以是T或K；和/或VH区的位点75的氨基酸可以是T或S。在独立的实施方式中，VH区包含V5或Q5，M69或L69，T71或V71，T73，或K71，和/或T75或S75残基。在另一实施方式中，位点69的氨基酸是L。在另一附加或替代的实施方式中，位点71的氨基酸是V。
人化抗体可包含来自人接纳体序列的VH人接纳体框架，选自例如，VH1_18，VH5_a，VH5_51，VH1_f和VH1_46，并且J-片段是JH6，例如，VH1_18，VH5_a，VH5_51或VH1_f，或本领域中已知的其他人种系VH框架序列。在一个实施方式中，VH片段是VH1_18。在一个特定实施方式中，VH区包含SEQ ID NO：8的序列。在另一特定实施方式中，VH区包含SEQ ID NO：7的序列。例如，VH区可包含SEQID NO：5的序列。
VL区人接纳体序列可以是例如，VKI_O2/JK4。在一个特定实施方式中，VL区包含SEQ ID NO：4。
在一个方面，本发明的人化抗体包含CDR-H2，其包含由通过适当FR序列连接于由SEQ ID NO：2的残基95-102组成的CDR-H3的SEQID NO：2的残基50-59组成的鼠部分。
如本文所述，在一个实施方式中，人化抗体在VH区中不包含FR取代。在另一实施方式中，人化抗体包含在选自利用根据Kabat的可变区编号***的5、69、71、73和75的一个或多个位点的VH区FR取代。在另一实施方式中，人化抗体包含在5，69，71，73和75中的两个或更多个位点的VH区FR取代；并且在其他实施方式中，在三，四，或所有的所述位点。在单独和独立的实施方式中，人化抗体包含在选自5，69，71，73和75的一个位点的VH区FR取代。在其他单独和独立实施方式中，人化抗体包含在位点5和69，或5和71，或5和73，或5和75，或69和71，或69和73，或69和75，或71和73，或71和75，或73和75，或5、69和71，或5、69和73，或5、69和75，或69、71和73，或69、71和75，或71、73和75，或5、69、71和73，或5、69、71和75，或5、71、73和75，或69、71、73和75，或5、69、71、73和75的VH区FR取代。更少而不是更多的框架取代可使免疫原性最小化，但对于一些应用来说结合效能可能是重要的考虑。因此，优选的取代是回复突变，即，用在非人供体FR相应位点的氨基酸取代在人FR的某位点的氨基酸的突变。由此，在单独和独立的实施方式中，在位点5的VH区氨基酸取代是V5Q，在位点69的氨基酸取代是M69L，在位点71的氨基酸取代是T71V，在位点73的氨基酸取代是T73K，并且在位点75的氨基酸取代是T75S。在特定实施方式中，人化抗体包含位点71的V和/或位点69的L。
本文的人化抗体还包含并入人VL区的非人超变区残基。在一个实施方式中，人化抗体不包含在VL区的FR取代。在另一实施方式中，人化抗体包含在利用根据Kabat的可变区编号***的位点46和48的之一的VL区FR取代。在另一实施方式中，人化抗体同时包含位点46和48的VL区FR取代。优选的取代是回复突变，即，用非人供体FR的相应位点的氨基酸取代人FR某位点的氨基酸的突变。由此，在单独和独立的实施方式中，位点46的VL氨基酸取代是L46F，并且位点48的VL区氨基酸取代是I48V。
示例性人化抗体包含VH区，所述VH区包含对应于SEQ ID NOS：5或7的残基31-35的CDR-H1序列，对应于SEQ ID NOS：5或7的残基50-66的CDR-H2序列，对应于SEQ ID NOS：5或7的残基95-102的CDR-H3序列。人化抗体可进一步在VH区中包含Kabat位点5的氨基酸，其为V或Q，在kabat位点69的氨基酸，其为M或L，在Kabat位点71的氨基酸，其为T或V，在kabat位点73的氨基酸，其为T或K，和/或在kabat位点75的氨基酸，其为T或S。在一个实施方式中，VH区包含在选自5，69，71，73，和75的至少一个kabat位点的框架区取代，例如，对应于表1所示任一VH FR取代，或其组合。在一个实施方式中，VH区包含SEQ ID NO：7的序列。在另一实施方式中，VH区包含SEQ ID NO：5的序列。
一种示例性人化抗体还可或替代地包含VL区，所述VL区包含对应于SEQ ID NO：4的残基24-34的CDR-L1序列，对应于SEQ ID NO：4的残基50-56的CDR-L2序列，和对应于SEQ ID NO：4的残基89-97的CDR-L3序列。人化抗体可进一步包含在kabat位点46的氨基酸，其为L或F，和/或在kabat位点48的氨基酸，其为I或V。在一个实施方式中，VL区包含在选自46和48的至少一个kabat位点的框架区取代，例如，对应于表1所示任一VL FR取代，或其组合。在一个实施方式中，VL区包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列。在另一实施方式中，VL区包含SEQ ID NO：6的序列。
在另一方面，本发明提供了结合人NKG2A的人化抗体，所述抗体包含VH区，所述VH区包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列，任选具有在kabat位点5、69、71、73和/或75的一个或多个FR取代。任选的FR取代可选自例如，V5Q、M69L、T71V、T73K和/或T75S，及其任何组合。所述人化抗体还可或替代地包含VL区，所述VL区包含SEQID NO：4的氨基酸序列，任选具有在kabat位点46和/或48的一个或多个FR取代。任选的FR取代可选自例如，L46F和/或I48V。
任选地，在特定方面，VH区包含一个或多个CDR残基的氨基酸修饰，例如，其中所述修饰基本上维持或改善了抗体的亲和性。例如，抗体变体可在上述VH CDR序列中具有一，二，三，或从一到约七个氨基酸取代。
在一个特定方面，不同于非人供体VH CDR的对应位点的氨基酸的人化抗体VH CDR中的氨基酸可被取代以改善人化抗体的结合性质和/或稳定性。例如，一个或多个这些氨基酸可用以取代非人供体VHCDR对应位点的氨基酸。在一个实施方式中，变体抗体包含在根据kabat的选自60、63、64和65(对应于SEQ ID NO：5或7的位点61、64、65、和66)的一个或多个位点的CDRH2取代。在单独和独立的实施方式中，抗体变体包含在选自60、63、64和65的一个位点的CDRH2氨基酸取代。在其他单独和独立实施方式中，抗体变体包含在位点60和63，或60和64，或60和65，或63和64，或63和65，或64和65，或60、63和64，或60、63和65，或60、64和65，或63、64和65，或60、63、64和65的CDRH2氨基酸取代。优选的取代是回复突变，即，用非人供体CDR的对应位点的氨基酸取代人化CDR中的某位点的氨基酸的突变。由此，在单独和独立的实施方式中，位点60的CDRH2氨基酸取代是A60S，位点63的氨基酸取代是L63F，位点64的氨基酸取代是Q64K，并且位点65的氨基酸取代是G65D。在抗体变体包含一个或多个CDRH2氨基酸取代A60S，L63F，Q64K，和G65D的方面，抗体变体包含在根据kabat的位点66和67的VH FR氨基酸取代，任选与上述一个或多个VH FR取代联合。优选，氨基酸取代是R66K和V67A。例如，在一个实施方式中，抗体变体包含VH区，所述VH区包含对应于SEQ ID NO：5的残基31-35的CDR-H1序列，对应于SEQ ID NO：5的残基50-66的CDR-H2序列，和对应于SEQID NO：5的残基95-102的CDR-H2序列，具有A60S，L63F，Q64K，G65D，R66K和V67A“回复突变”，任选与另外的氨基酸修饰联合。
在另一特定方面，本发明提供了结合人NKG2A的人化抗体，所述抗体包含VH区，所述VH区包含并入人VH区的非人CDR残基，所述VH区包含对应于SEQ ID NO：8的残基31-35的CDR-H1序列，对应于SEQ ID NO：8的残基50-66的CDR-H2序列，和对应于SEQID NO：8的残基95-102的CDR-H3序列，其中在kabat位点63、64、65、66和67分别是F、K、D、K、A。在一个实施方式中，VH区包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列。在另一实施方式中，kabat位点60的残基是A。在另一实施方式中，kabat位点60的残基是S，并且人化抗体包含Z270的CDR-H1，-H2和H3序列，在相邻于CDR-H2的C-末端的两个氨基酸具有FR回复突变。如本文所述，在本部分描述的人化抗体可进一步包含在其他残基的FR回复突变，例如，在kabat位点5、69、71、73和/或75。
在另一方面，本发明提供了人化抗体，其中在VH区中的kabat CDR都源于鼠Z270VH(SEQ ID NO：2)，还包含S60A、F63L、K64Q和/或D65G突变。在一个实施方式中，人化抗体包含所有的突变S60A、F63L、K64Q和/或D65G。
例如，除上述VH区CDR之外，人化抗体还可包含VL区，所述VL区包含对应于SEQ ID NO：6的残基24-34的CDR-L1序列，对应于SEQ ID NO：6的残基50-56的CDR-L2序列，和对应于SEQ IDNO：6的残基89-97的CDR-L3序列。在一个实施方式中，人化抗体的VL区包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列。在另一实施方式中，人化抗体的VL区包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列。任选地，所述人化抗体包含一个或多个VL CDR残基的氨基酸修饰，例如，其中所述修饰基本上维持或改善抗体的亲和性。例如，抗体变体可具有在上述VLCDR序列中的一，二，三或从一到约七个氨基酸取代。
本申请还预期了结合抗-NKG2A的亲和性成熟的抗体，包含改善人化抗体对抗原的亲和性的另外的CDR或FR突变。制备所述亲和性成熟的抗体的方法是本领域中已知的。亲本抗体可以是人化抗体，例如，分别地，包含SEQ ID NOS：4和5的VL/VH序列的抗体(任选具有本文所述一个或多个CDRH2和/或FR取代)，或包含SEQ ID NOS：6和7的共有序列的抗体。亲和性成熟的抗体优选以相当于或优于鼠Z270的亲和性结合NKG2A，例如，从至少大约一，大约二，或大约四倍到大约100倍或大约1000倍提高的亲和性，例如，如利用下述结合测定法所评定的。
在另一方面，本发明提供了包含VH区的人化抗体，所述VH区具有与Z270，humZ270，humZ270cons，和/或humZ270cons2的VH区(分别为SEQ ID NOS：2，5，7，和8)至少大约50％，至少大约70％，至少大约80％的序列同一性(例如，至少大约85％、90％、95％、97％或更高的同一性)。在另一特定方面，本发明提供了结合NKG2A的人化抗体，包含VH区，所述VH区包含并入人VH区的非人CDR残基，其中所述VH区至少大约50％同一于humZ270VH1(SEQ ID NO：5)。在一个实施方式中，VH区至少90％同一于SEQ ID NO：5。例如，人化抗体可包含对应于SEQ ID NO：5的残基31-35的CDR-H1序列，对应于SEQ ID NO：5的残基50-66的CDR-H2序列，和对应于SEQID NO：5的残基95-102的CDR-H3序列。人化抗体还可或替代地在VH区包含kabat位点5的V或Q，在kabat位点69的M或L，在kabat位点71的T或V，在Kabat位点73的T或K，和在kabat位点75的T或S。
在另一方面，本发明提供了还可或替代地包含VL区的抗体分子，所述VL区具有与Z270，humZ270，和/或humZ270cons的VL区(分别为SEQ ID NOS：1，4，和6)至少大约50％，至少大约70％，或至少大约80％的序列同一性(例如，至少大约85％、90％、95％、97％或更高的同一性)。在另一特定方面，本发明提供了结合NKG2A的人化抗体，包含VL区，所述VL区包含并入人VL区的非人CDR残基，其中VL区至少50％同一于SEQ ID NO：4。在一个实施方式中，VL区至少90％同一于SEQ ID NO：4。例如，人化抗体可包含对应于SEQID NO：4的残基24-34的CDR-L1序列，对应于SEQ ID NO：4的残基50-56的CDR-L2序列，和对应于SEQ ID NO：4的残基89-97的CDR-L3序列。人化抗体还可或替代地在VL区包含在kabat位点46的L或F和/或在kabat位点48的I或V。
在另一方面，本发明提供了特异性结合NKG2A的分离的人化抗体，其包含(a)Z270VL(SEQ ID NO：1)，humZ270VL(SEQ ID NO：4)，或humZ270VL cons(SEQ ID NO：6)的CDR-L1，CDR-L2，和/或CDR-L3序列，或(b)Z270VH(SEQ ID NO：2)，humZ270(SEQ ID NO：5)，humZ270 cons(SEQ ID NO：7)，或humZ270cons2(SEQ ID NO：8)的CDR-H1，CDR-H2，和/或CDR-H3序列。在另一方面，本发明提供了抗体分子，其包含至少全套的来自Z270，humZ270，或humZ270cons的VH CDR，其中6个C-末端氨基酸同一于人接纳体序列的6个C-末端氨基酸。在一个特定的方面，本发明提供了抗体分子，其包含Z270，humZ270，或humZ270 cons的CDR-H1，CDR-H2(或其N-末端部分)，和CDR-H3，以及Z270，humZ270，或humZ270cons的CDR-L1，CDR-L2，和CDR-L3中的至少一些。在一个更特别的方面，本发明提供了抗体分子，其中所述抗体分子包含Z270，humZ270，或humZ270 cons的CDR-L1，CDR-L2，和CDR-L3，CDR-H1，CDR-H2，和CDR-H3，其中通过适当的FR序列，CDR-L1连接于CDR-L2，CDR-L2连接于CDR-L3，CDR-H1连接于CDR-H2，并且CDR-H2连接于CDR-H3。
在一个特定的方面，本发明提供了抗体分子，其基本上包含humZ270，humZ270 cons，或humZ270 cons2的所有的VH和/或VL区。
根据本发明的人化抗-NKG2A抗体可包含任何包含本文所述humZ270VH的全长或部分重链(HC)，和/或任何包含humZ270VH的全长或部分HC可与任何本文所述humZ270VL组合，并且测试产生的抗体或片段的抗原结合，在CD94/NKG2A-表达细胞上的功能效果，和/或免疫原性。
预期了几种形式的人化抗体。例如，人化抗体可以是抗体片段，例如Fab或本文描述的其他类型的片段。或者，人化抗体可以是全长或完整的抗体，例如全长或完整的IgG1或IgG4抗体。在一个实施方式中，人化抗体是全长IgG4抗体或其片段。
在一个方面，本发明提供了人化抗体，其特征在于：a)特异性结合NKG2A；b)不特异性结合Fc受体；和c)当结合人NK细胞上的NKG2A时，当所述靶细胞接触所述NK细胞时，导致所述NK细胞溶解靶细胞表面上具有HLA-E的靶人细胞。在一个实施方式中，人化抗体包含小鼠或人IgG1恒定区，其已被修饰以预防结合Fc受体，或人IgG4恒定区。所述抗体，以及不结合Fc受体的抗体片段，在期望活化NK细胞的用途中是特别有用的(例如，癌症，感染性疾病)，而不导致NK细胞自身的衰竭，如可能被抗体依赖细胞毒性介导的那样，并且可表示为“非衰竭”抗体。
在另一方面，人化抗体包含结合Fc受体的小鼠或人IgG1恒定区，或已被修饰以结合Fc受体或提高与Fc受体的结合的人IgG1，2，3或4恒定区，或人IgG4恒定区。在另一实施方式中，单克隆抗体或其片段连接于对抗体连接的细胞为毒性的部分。所述抗体在期望衰竭NK细胞的应用中是特别有用的，在某些应用例如NK-LDGL(粒状淋巴细胞的NK-类型淋巴细胞增殖疾病，或称为NK-LGL)中是有用的，并且可称为“衰竭”抗体。
为人化抗体的重组生产，人化VH和VL区，或其变体形式，可根据标准重组方法克隆入编码来自人抗体的全长或截短恒定区的表达载体中(见例如，Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，1989)。结果是转染的细胞系，其表达和分泌感兴趣的人化抗体分子，包含选择的VH和VL区和恒定区。编码人抗体的恒定区的cDNA序列是已知的。获自例如，GenBank的示例性的cDNA序列如下所示，其每种全部引入本文作为参考：
人IgG1恒定重链区：GenBank登录号：J00228；
人IgG2恒定重链区：GenBank登录号：J00230；
人IgG3恒定重链区：GenBank登录号：X04646；
人IgG4恒定重链区：GenBank登录号：K01316；和
人kappa轻链恒定区：GenBank登录号：J00241。
如果期望，人化抗体的类型还可通过已知方法“转换”。例如，初始产生为IgM分子的抗体可以是转换为IgG抗体的类型。类型转换技术也可用于将IgG亚类转化为另一种，例如，从IgG1到IgG2。由此，可通过同种型转换为例如，用于多种治疗用途的IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgD，IgA，IgE，或IgM抗体，改变本发明的抗体的效应物功能。
恒定区还可根据已知方法修饰。例如，在IgG4恒定区中，残基S241可突变为脯氨酸(P)残基以允许在铰链中完整二硫键形成(见例如，Angal等人，Mol Immunol.1993；30：105-8)。
抗体片段
本发明的人化抗体可制备为抗体片段，或抗体片段可从人化全长抗体中制备。
已经开发了用于生产人化抗体的抗体片段的多种技术。通常地，这些片段通过全长抗体的蛋白水解消化而获得(见例如，Morimoto等人，Journal of Biochemical and Biophysical Methods，24：107-117(1992)；和Brennan等人，Science，229：81(1985))。然而，现在这些片段可被重组宿主细胞直接产生。或者，Fab′-SH片段可直接从大肠杆菌中回收，并且化学偶联以形成F(ab′)2片段(Carter等人，Bio/Technology，10：163-167(1992))。根据另一方法，F(ab′)2可直接从重组宿主细胞培养物中分离。用于产生抗体片段的另外技术对于熟练技术人员是明显的。在其他实施方式中，选择的抗体是单链Fv片段(scFv)。见WO1993/16185；U.S.专利号5,571,894；和U.S.专利号5,587,458。抗体片段还可以是“线性抗体”，例如，如U.S.专利号5,641,870中描述的那样。所述线性抗体片段可以是单特异性或双特异性的。
双特异性抗体是对至少两种不同表位具有结合特异性的抗体。产生双特异性抗体的方法是本领域中已知的，并且传统产生全长双特异性抗体通常是基于两种免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中两种链具有不同的特异性(Millstein等人，Nature，305：537-539(1983))。在根据本发明的双特异性抗体中，至少一个结合表位位于NKG2A蛋白上。抗-NKG2A结合“臂”可以与结合淋巴细胞上的引发分子的“臂”组合，所述淋巴细胞上的引发分子例如T细胞受体分子(例如，CD2或CD3)，或IgG的Fc受体(Fcγ-R)，例如Fc-γ-RI(CD64)，Fc-γ-RII(CD32)和Fc-γ-RIII(CD16)，以使得将细胞防御机能集中到NKG2A-表达细胞。双特异性抗体还可用于将细胞毒性剂定位于表达NKG2A的细胞。这些抗体具有NKG2A-结合臂和结合细胞毒性剂(例如，皂草素，抗-干扰素-α，长春花生物碱，蓖麻毒素A链，甲氨蝶呤，或放射性同位素半抗原)的臂。双特异性抗体可制备为全长抗体或抗体片段(例如，F(ab′)2双特异性抗体)。预期了具有超过两价的抗体。例如，可制备三特异性抗体。utt等人，J.Immunol，147：60(1991)。
本发明典型的抗体，抗体片段和多特异性抗体包含CDR-H2和CDR-H3的部分，所述部分包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：5的残基D52，D54，R94，F99，T(100C)，和W(100F)，其已显示对于抗原结合是关键的(见实施例)。任选地，人化抗体片段和多特异性抗体还包含Z270重链残基N35，Y53，E56，D98，V(100A)，和L(100D)。在一个方面，本法明的人化抗体片段或多特异性抗体包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：5的CDR-H2的残基50-59和CDR-H3的残基95-102。在一个实施方式中，人化抗体片段或多特异性抗体不包含Z270CDR-L1，CDR-L2，和CDR-L3中的一种，两种，或全部。在一个附加或替代的实施方式中，抗体片段或多特异性抗体不包含Z270CDR-H1。
抗体衍生物
本发明范围内的抗体衍生物包括缀合或共价结合第二试剂的人化抗体。
例如，在一个方面，本发明提供了包含缀合或共价结合细胞毒性剂的人化抗体的免疫缀合物。如本文使用的术语“细胞毒性剂”是能够杀伤在细胞表面具有NKG2A受体的细胞的分子。具有细胞毒性或细胞抑制作用的任何类型的部分可与本抗体缀合，以形成本发明的细胞毒性缀合物，并且抑制或杀伤特异性NK受体表达细胞，包括治疗性放射性同位素，毒性蛋白，毒性小分子，例如药物，毒素，免疫调节物，激素，激素拮抗剂，酶，寡核苷酸，酶抑制剂，治疗性放射性核素，血管生成抑制剂，化疗药物，长春花生物碱，蒽环类抗生素，表叶毒素，紫杉烷类(taxanes)，抗代谢物，烷化剂，抗生素，COX-2抑制剂，SN-38，抗有丝***剂，抗血管生成和细胞凋亡试剂，特别是阿霉素，甲氨蝶呤，紫杉醇，CPT-11，喜树碱类(camptothecans)，氮芥，吉西他滨，烷基磺酸盐，亚硝基脲，三氮烯，叶酸类似物，嘧啶类似物，嘌呤类似物，铂配位化合物，假单胞菌外毒素，蓖麻毒素，相思豆毒素，5-氟尿苷(5-fluorouridine)，核糖核酸酶(RNase)，DNase I，葡萄球菌肠毒素-A，美洲商陆抗病毒蛋白，白树毒素，白喉毒素，假单胞菌外毒素，和假单胞菌内毒素和其他(见例如，Remington’sPharmaceutical Sciences，19th Ed.(Mack Publishing Co.1995)；Goodmanand Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics(McGraw Hill，2001)；Pastan等人(1986)Cell 47：641；Goldenberg(1994)CancerJournal for Clinicians 44：43；U.S.专利号.6,077,499；其全文引入本文作为参考)。将理解毒素可以是动物，植物，真菌或微生物来源，或可通过化学合成重新产生。
在另一实施方式中，用放射活性同位素衍生化抗体，例如治疗性放射性核素或适于检测目的的放射性核素。可使用任何大量的适合的放射活性同位素，包括但不限于，I-131，铟-111，镥-171，铋-212，铋-213，砹-211，铜-62，铜-64，铜-67，钇-90，碘-125，碘-131，磷-32，磷-33，钪-47，银-111，镓-67，镨-142，钐-153，铽-161，镝-166，钬-166，铼-186，铼-188，铼-189，铅-212，镭-223，锕-225，铁-59，硒-75，砷-77，锶-89，钼-99，铑-105，钯-109，镨-143，钷-149，铒-169，铱-194，金-198，金-199，和铅-211。通常，放射性核素优选具有对于Auger发射器20到6,000keV范围的衰变能，优选在60到299keV范围，对于β发射器100-2500keV，对于α发射器4,000-6,000keV。还优选的是产生α-粒子地充分衰变的放射性核素。
在其他实施方式中，第二试剂是可检测部分，其可以是可定量或定性观察或测量的任何分子。在本发明的缀合抗体中有用的可检测标记的例子是放射性同位素，荧光染料，或互补结合对的成员，例如下列的任何一种的成员：抗原/抗体(NKG2A抗体之外)，凝集素/碳水化合物；抗生物素蛋白/生物素；受体/配体；或分子印记聚合物/印记分子***。
例如，第二试剂还可或替代地为聚合物，目的为提高人化抗体的循环半衰期。将所述聚合物附着于肽的示例性聚合物和方法例示于例如，U.S.专利号4,766,106；4,179,337；4,495,285；和4,609,546。另外的例示性聚合物包括聚氧乙烯化多元醇和聚乙二醇(PEG)部分(例如，全长抗体或抗体片段可缀合于一个或多个PEG分子，所述PEG分子具有具有大约1,000到大约40,000的分子量，例如在大约2000到大约20000之间，例如，大约3000-12000)。
利用大量可获得方法中的任一种，可将细胞毒性剂或其他化合物直接或间接连接于抗体。例如，通过利用交联剂例如N-琥珀酰基3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)形成二硫键，或通过在抗体Fc区的碳水化合物部分，可将试剂附着在还原抗体成分的铰链区(见例如，Yu等人(1994)Int.J.Cancer 56：244；Wong，Chemistry of ProteinConjugation and Cross-linking(CRC Press 1991)；Upeslacis等人，＂Modification of Antibodies by Chemical Methods，＂in Monoclonalantibodies：principles and applications，Birch等人(eds.)，pages 187-230(Wiley-Liss，Inc.1995)；Price，＂Production and Characterization ofSynthetic Peptide-Derived Antibodies，＂in Monoclonal antibodies：Production，engineering and clinical application，Ritter等人(eds.)，pages60-84(Cambridge University Press 1995)，Cattel等人(1989)Chemistrytoday 7：51-58，Delprino等人(1993)J.Pharm.Sci 82：699-704；Arpicco等人(1997)Bioconjugate Chernistry 8：3；Reisfeld等人(1989)Antihody，Immunicon.Radiopharrn.2：217；每种的全文引入本文作为参考)。
或者，例如，通过重组技术或肽合成，可制备包含抗-NKG2A抗体和第二(细胞毒性或其他)多肽试剂的融合蛋白。
结合测定
本发明提供了结合人NKG2A的抗体，特别是Z270杂交瘤产生的抗-NKG2A抗体的人化形式。
多种测定中的任何一种可用于评价抗体与人NKG2A的结合。基于ELISAs，放射免疫测定，Western印迹，BIACORE，和其他竞争测定等的方案适于应用，并且是本领域中熟知的。
例如，可利用简单的结合测定，其中测试抗体在靶蛋白或表位(例如，NKG2A或其部分)存在下培养，洗脱未结合的抗体，并且利用例如，放射标记，物理方法例如质谱法，或利用例如细胞荧光测定分析(例如FACScan)检测的直接或间接荧光标记，而评价结合抗体的存在。所述方法是本领域技术人员熟知的。超过利用对照，非特异性抗体观察到的量的结合量显示抗体特异性结合于靶标。
在所述测定中，测试抗体结合靶细胞或人NKG2A的能力可与对照蛋白(阴性)结合相同靶标的能力进行比较，所述对照蛋白例如，针对结构不相关抗原产生的抗体，或非Ig肽或蛋白。利用任何适当的测定具有25％、50％、100％、200％、1000％或更高的相对于对照蛋白的改善的亲和性的结合靶细胞或NKG2A的抗体或片段被称为“特异性结合”或“特异性作用于”靶标，并且优选用于下述治疗方法中。测试抗体影响(阳性)对照抗体对抗NKG2A，例如Z270，或其衍生物，的结合的能力也可被评价。
人化抗-NKG2A抗体可以结合或不结合人NKG2C，可以结合或不结合人NKG2E，或可以结合或不结合人NKG2C和E中的任一。在一个特别的实施方式中，单克隆抗体或不结合其他人NKG2受体，特别是活化受体NKG2C或NKG2E。本发明抗体的NKG2C和NKG2E-结合性质可以与上述测定类似的测定进行评价，所述类似的测定简单地将NKG2A换成感兴趣的分子。
在一个方面，本发明提供了与Z270共享生物特性和/或基本的序列同一性的非人抗体的人化形式。一种示例性的生物特性是与Z270表位，即Z270抗体结合的NKG2A的细胞外区，的结合。为筛选结合Z270表位的抗体，可实施常规的交叉阻断测定，例如Antibodies，ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Ed Harlow and DavidLane(1988)中描述的那些。
在一种示例性的交叉阻断或竞争测定中，)Z270(对照)抗体和测试抗体被混合(或预吸附)并且应用于包含NKG2A的样品。在某种实施方式中，在应用到包含NKG2A样品之前，以不同量的测试抗体(例如，1:10或1:100)预混合对照抗体一段时间。在其他实施方式中，对照和不同量的测试抗体可在暴露于抗原/靶标样品过程中简单地混合。只要可以辨别来自游离抗体的结合(例如，通过利用分离或清洗技术以清除未结合抗体)并且辨别对照抗体和测试抗体(例如，通过利用物种-或同种型-特异性第二抗体，通过用可检测标记特异性标记对照抗体，或通过利用物理方法例如质谱法以辨别不同化合物)，可以确定测试抗体是否降低了对照抗体与抗原的结合，显示出测试抗体与对照基本上识别相同的表位。在此测定中，在完全不相关抗体的存在下的(标记)对照抗体的结合是对照高值。通过用未标记对照抗体培养标记(阳性)对照抗体(Z270)获得对照低值，其中将发生竞争并且降低标记抗体的结合。
在一种测试测定中，在测试抗体存在下标记抗体反应性的显著降低指示了识别相同表位的测试抗体，即，与标记对照抗体“交叉反应”的抗体。以对照：测试抗体或化合物在大约1:10到大约1:100之间的任何比例降低至少50％或更优选70％的标记对照与抗原/靶标的结合的任何测试抗体或化合物被认为是与对照结合基本上相同的表位或决定簇的抗体或化合物。优选，所述测试抗体或化合物将降低至少90％的对照与抗原/靶标的结合。然而，降低任何可测量程度的对照抗体或化合物的结合的任何化合物或抗体可用于本发明。
类似的交叉阻断测定也可用于评价测试(人化)抗体是否通过将Z270替换为HLA-E的适当形式而影响人NKG2A的天然配体，HLA-E，与NKG2A的结合。例如，为确定人化抗-NKG2A抗体制剂是否降低或阻断CD94/NKG2A与HLA-E的相互作用，可实施下述测试：表达CD94/NKG2A的细胞系，例如Ba/F3-CD94/NKG2A，NKL或NK92，在具有逐渐增加浓度的测试抗-NKG2A抗体的情况下在冰上培养30分钟。细胞然后与PE-标记的HLA-E四聚物在冰上培养30分钟，再次清洗，并且通过标准方法在流式细胞仪上(FACScalibur，BecktonDickinson)分析HLA-E四聚物结合。在不存在测试抗体时，HLA-E四聚物结合细胞。在阻断CD94/NKG2A与HLA-E的结合的抗体制剂存在时，HLA-E四聚物与细胞的结合降低，并且所述mAbs被指定为“阻断抗体”。
在本发明的一些方面，例如，当不期望杀伤NK G2A-表达细胞时，本发明的人化抗体优选不显示出与Fc受体的基本上特异性的结合。所述抗体可包含已知不结合Fc受体的多种重链的恒定区。一种所述例子是IgG4恒定区。或者，不包含恒定区的抗体片段，例如，Fab或F(ab’)2片段，可用于避免Fc受体结合。可根据本领域已知方法评价Fc受体结合，包括例如在BIACORE测定中测试抗体与Fc受体蛋白的结合。任何其他抗体类型也可使用，其中Fc部分被修饰以最小化或消除与Fc受体的结合(见例如，WO03101485，其公开内容引入本文作为参考)。评价Fc受体结合的测定，例如基于细胞的测定，是本领域已知的，并且描述于例如，WO03101485。
细胞毒性测定
如果抗-NKG2A抗体降低或阻断CD94/NKG2A与HLA-E的相互作用，它可提高CD94/NKG2A-限制淋巴细胞的细胞毒性。这可通过典型的细胞毒性测定而评价，其例子在下面进行描述。
可利用例如，表达CD94/NKG2A的NKL细胞和表达HLA-E的靶细胞，以标准的4小时体外细胞毒性测定，测试抗体降低CD94/NKG2A-介导的信号传导的能力。所述NKL细胞不有效地杀伤表达HLA-E的靶标，因为CD94/NKG2A识别HLA-E，导致防止淋巴细胞-介导的细胞溶解的抑制性信号传导的起始和传播。如例如Coligan等人，eds.，Current Protocols in Immunology，Greene Publishing Assoc.and WileyInterscience，N.Y.，(1992，1993)所述，可通过本领域熟知的标准方法实施所述体外细胞毒性测定。在添加NKL细胞之前用51Cr标记靶细胞，然后杀伤被评估为从细胞到培养基的51Cr释放的比例，作为杀伤的结果。添加防止CD94/NKG2A免于结合HLA-E的抗体导致了预防通过CD94/NKG2A的抑制性信号传导的起始和传播。因此，添加所述试剂导致了靶细胞的淋巴细胞-介导的杀伤的提高。由此这一步骤鉴定了，通过例如阻断配体结合，预防CD94/NKG2A-诱导的阴性信号传导的试剂。在一个特别的51Cr-释放细胞毒性测定中，CD94/NKG2A-表达NKL效应细胞可杀伤HLA-E阴性LCL721.221靶细胞，但杀伤更少的良好的HLA-E-表达LCL 721.221-Cw3对照细胞。与之对照，缺少CD94/NKG2A的YTS效应细胞有效的杀伤两种细胞。因此，NKL效应细胞更不有效地杀伤HLA-E+ LCL721.221-Cw3细胞，由于通过CD94/NKG2A的HLA-E-诱导的抑制性信号传导。当NKL细胞与根据本发明的阻断抗-CD94/NKG2A抗体在所述51Cr-释放细胞毒性测定中预培养时，HLA-E-表达LCL721.221-Cw3细胞以抗体浓度依赖模式被更有效地杀伤。
本发明的抗体的抑制性或增强性活性也可以任一多种其他方式进行评价，例如，通过其对于细胞内游离钙的作用，如例如Sivori等人，J.Exp.Med.1997；186：1129-1136中所述，其引入本文作为参考。如Sivori等人，J.Exp.Med.1997；186：1129-1136；Vitale等人，J.Exp.Med.1998；187：2065-2072；Pessino等人J.Exp.Med.1998；188：953-960；Neri等人Clin.Diag.Lab.Immun.2001；8：1131-1135；Pende等人J.Exp.Med.1999；190：1505-1516中所公开的，每种的全文引入本文作为参考，也可利用基于细胞的细胞毒性测定，例如，评价抗体刺激NK细胞以杀伤靶细胞例如P815，K562细胞或适当的肿瘤细胞的能力的测量铬释放或其他参数，评价NK，T，或NKT的细胞活性。
在一个实施方式中，抗体制剂导致CD94/NKG2A-限制淋巴细胞的细胞毒性的至少10％的增加，优选NK细胞毒性至少40％或50％增加，或更优选NK细胞毒性至少70％增加。
细胞毒性淋巴细胞的活性也可利用细胞因子释放测定而评价，其中NK细胞用抗体培养，以刺激NK细胞的细胞因子产生(例如IFN-y和TNF-α产生)。在一个示例性方案中，通过培养4天之后用流式细胞术的细胞表面和细胞质内染色和分析，评价IFN-y从PBMC的产生。简短地，布雷菲德菌素(Brefeldin)A((Sigma Aldrich))以5μg/ml的终浓度在培养的最后4小时添加。然后在透化(IntraPrepTM；Beckman Coulter)和用PE-抗-IFN-y或PE-IgG1(Pharmingen)染色之前用抗-CD3和抗-CD56mAb培养细胞。利用ELISA在上清液中测量从多克隆活化NK细胞的GM-CSF和IFN-y的产生(GM-CSF：DuoSet Elisa，R&D Systems，Minneapolis，MN，IFN-：OptElA set，Pharmingen)。
在一个特别方面，本发明提供了抗体，所述抗体比原始的，非人化抗体和/或其嵌合形式更能够，或更有效于，提高CD94/NKG2A-限制淋巴细胞的细胞毒性，增强CD94/NKG2A-限制淋巴细胞的细胞毒性活性，或降低或抑制CD94/NKG2A-介导的信号传导。所述抗体可，例如，比原始的，非人化抗体或其嵌合形式至少2％，至少5％，至少10％，至少15％，或至少20％更有能力或更有效。
重组方法
本发明也提供了编码本文所述抗-NKG2A抗体的分离的核酸，以及包含所述核酸的载体和宿主细胞。还提供了利用重组技术生产所述抗-NKG2A抗体的方法，所述重组技术例如，培养包含所述核酸或载体的适当的宿主细胞，使得核酸被表达并且人化抗体被产生。培养之前，宿主细胞可，例如，用包含编码可变重链区的核酸的载体和包含编码可变轻链区的核酸的载体共转染。另外，抗体可利用已知技术从宿主细胞培养物中回收和/或纯化。有用的载体，宿主细胞，和技术在下面和实施例中进一步描述。另外，表达人化抗-NKG2A抗体的策略在图4-6中进行了概述。
通常，为重组生产抗体，编码它的核酸被分离和***可复制的载体，以进一步克隆(DNA的扩增)或表达，典型地可操纵地连接于一种或多种表达控制元件。利用常规程序(例如，通过利用能够特异性结合编码抗体的重和轻链的基因的寡核苷酸探针)，编码单克隆抗体的DNA被容易地分离和测序。许多载体是已知的和可获得的。载体成分通常包括但不限于下述的一种或多种：信号序列，复制起点，一种或多种标记基因，增强子元件，启动子，和转录-终止序列。
信号序列成分
本发明的抗-NKG2A抗体不仅可直接重组生产，而且可作为具有异源多肽的融合多肽重组生产，所述异源多肽优选是信号序列或在成熟蛋白或多肽的N-末端具有特异剪切位点的其他多肽。优选的异源信号序列是宿主细胞识别和加工的序列(即，通过信号肽酶切除)。见例如，实施例2中用于表达抗NKG2A抗体例如人化Z270抗体的人化重和/或轻链的示例性信号序列。
对于不识别和加工天然抗-NKG2A抗体信号序列的原核宿主细胞，信号序列被原核信号序列代替，所述原核信号序列选自，例如，碱磷酸酯酶，青霉素酶，1pp，或热稳定肠毒素II前导序列。对于酵母分泌，天然信号序列可被例如酵母转化酶前导序列，α因子引导序列(包括酵母和克鲁维酵母α因子引导序列)，酸-磷酸酯酶前导序列，白色念珠菌(C.albicans)葡糖淀粉酶前导序列，或WO 1990/13646描述的信号所代替。在哺乳动物细胞表达中，哺乳动物信号序列以及病毒分泌前导序列，例如，单纯疱疹gD信号，是可利用的。
所述前导区的DNA在阅读框内与编码抗-NKG2A抗体的DNA连接。
复制起点成分
表达和克隆载体都包含了使得载体能够在一种或多种选择的宿主细胞中复制的核酸序列。通常，在克隆载体中，这种序列是使得载体能够独立于宿主染色体DNA复制的序列，并且包括了复制起点或自主复制序列。所述序列对于多种细菌，酵母和病毒是熟知的。来自质粒pBR322的复制起点对于大多数革兰氏阴性细菌是适合的，2μ质粒起点对于酵母是适合的，并且多种病毒起点(SV40，多元瘤，腺病毒，VSV，EBV，或BPV)对于在哺乳动物细胞中的克隆载体是有用的。通常，复制起点成分对于哺乳动物表达载体是不需要的(SV40起点可典型地使用，仅仅因为它包含了早期启动子)。
选择基因成分
表达和克隆载体可包含选择基因，也称为可选择标记。典型的选择基因编码蛋白，所述蛋白(a)赋予对抗生素或其他毒素的抗性，例如，氨比西林，新霉素，甲氨蝶呤，或四环素，(b)补充营养缺陷，或(c)提供从复合培养基中不可获得的关键营养，例如，编码对于杆菌的D-丙氨酸消旋酶的基因。
选择方案的一个例子利用了抑制宿主细胞生长的药物。用外源基因成功转化的这些细胞产生了赋予药物抗性的蛋白，并因此在选择体系中存活。所述显性选择的例子利用药物新霉素，霉酚酸和潮霉素。
对于哺乳动物细胞适当的可选择标记的另一例子是使得能够鉴定能够吸收编码抗-NKG2A抗体的核酸细胞的那些标记，例如，DHFR，胸苷激酶，金属硫因-I和II，优选灵长类金属硫因基因，腺苷(aderosine)脱氨酶，鸟氨酸脱羧酶等。
例如，用DHFR选择基因转化的细胞首先通过在包含甲氨蝶呤(Mtx)，一种DHFR的竞争性拮抗剂，的培养基中培养所有转化体而鉴定。当应用野生型DHFR时，一种适当的宿主细胞是缺乏DHFR活性的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系。
或者，通过在包含用于可选择标记的选择试剂的培养基中生长可选择用编码抗-NKG2A抗体，野生型DHFR蛋白，和另一可选择标记例如氨基糖苷3′-磷酸转移酶(APH)转化或共转化的宿主细胞(特别是包含内源DHFR的野生型宿主)，所述选择试剂例如氨基糖苷抗生素，如卡那霉素，新霉素，或G418。见美国专利号：4,965,199。
用于酵母的适当的选择基因是存在于酵母质粒YRp7中的trp1基因(Stinchcomb等人，Nature，282：39(1979))。trp1基因提供了用于缺乏在色氨酸中生长的能力的酵母突变株例如，ATCC No.44076或PEP4-1.Jones，Genetics，85：12(1977)，的选择标记。酵母宿主细胞基因组中trp1损害的存在然后提供了通过在不存在色氨酸时生长而检测转化的有效环境。类似地，Leu2-缺陷酵母株(ATCC20,622或38,626)被含有Leu2基因的已知质粒补充。
另外，源于1.6-μm环形质粒pKD1的载体可用于转化克鲁维酵母。或者，报道了用于K.lactis的大规模生产重组小牛凝乳酶的表达***(Van den Berg，Bio/Technology，8：135(1990)。也公开了用于通过克鲁维酵母的工业菌株分泌成熟的重组人血清白蛋白的适当的多拷贝表达载体。Fleer等人，Bio/Technolog，9：968-975(1991)。
启动子成分
表达和克隆载体通常包含被宿主生物体识别并且可操纵地连接于编码抗-NKG2A抗体的核酸的启动子。适于与原核宿主应用的启动子包括phoA启动子，β-内酰胺酶和乳糖启动子***，碱磷酸酯酶，色氨酸(trp)启动子***，和杂合启动子，例如tac启动子。然而，其他已知的细菌启动子是适合的。用于细菌***的启动子还将包含与编码抗-NKG2A抗体的DNA可操纵连接的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。
已知多种用于真核细胞的启动子序列。实际上所有的真核基因具有位于转录起始位点上游大约25到30个碱基的位置的富含AT区。在许多基因转录起始上游70到80个碱基位置发现的另一序列是CNCAAT区，其中N可以是任何核苷酸。在大多数真核基因的3′末端是AATAAA序列，其可能是用于向编码序列的3′末端添加聚-A尾的信号。所有这些序列适于***真核表达载体。与酵母宿主一起使用的适当的启动序列的例子是3-磷酸甘油酸激酶或其他糖酵解酶启动子，所述其他糖酵解酶例如，烯醇酶，甘油醛-3-磷酸脱氢酶，己糖激酶，丙酮酸脱羧酶，磷酸果糖激酶，葡萄糖-6-磷酸异构酶，3-磷酸甘油酸变位酶，丙酮酸激酶，丙糖磷酸异构酶，磷酸葡萄糖异构酶，和葡萄糖激酶。
其他酵母启动子，其为具有被生长条件控制转录的附加优点的可诱导启动子，是醇脱氢酶2，异细胞色素C(isocytochrome C)，酸磷酸酯酶，与氮代谢相关的降解酶，金属硫因，甘油醛-3-磷酸脱氢酶，和负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子区域。用于酵母表达的适合的载体和启动子进一步描述于EP73657。酵母增强子也与酵母启动子一起有利地利用。
从哺乳动物宿主细胞的载体的抗-NKG2A抗体转录被，例如，获自病毒基因组的启动子控制，所述病毒例如多瘤病毒，禽痘病毒，腺病毒(例如腺病毒2)，牛***瘤病毒，禽肉瘤病毒，巨细胞病毒(CMV)，逆转录病毒，乙型肝炎病毒，并且最优选猿猴病毒40(SV40)，异源哺乳动物启动子，例如，肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子，和热休克启动子，只要所述启动子与宿主细胞***兼容即可。
SV40病毒的早期和晚期启动子便利地获得为SV40限制片段，其也包含SV40病毒复制起点。人巨细胞病毒的立即早期启动子便利地获得为HindIII E限制片段。利用牛***瘤病毒作为载体在哺乳动物宿主中表达DNA的***公开于美国专利号：4,419,446中。这种***的修饰描述于美国专利号4,601,978中。还可见Reyes等人，Nature，297：598-601(1982)关于人β-干扰素cDNA在来自单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子控制下在小鼠细胞中的表达。或者，劳氏肉瘤病毒长末端重复序列可用作启动子。
增强子元件成分
高等真核细胞的编码本发明的抗-NKG2A抗体的DNA的转录通常通过***增强子序列到载体中而增加。现在已知许多来自哺乳动物基因(球蛋白，弹性蛋白酶，白蛋白，α-胎蛋白和胰岛素)的增强子序列。然而，典型地，将利用来自真核细胞病毒的增强子。实例包括在复制起点晚侧(late side)的SV40增强子(100-270bp)，巨细胞病毒早期启动子增强子，复制起点晚侧的多瘤病毒增强子，和腺病毒启动子。还可见Yaniv，Nature，297：17-18(1982)关于用于活化真核启动子的增强元件。增强子可剪接入载体中编码抗-NKG2A抗体序列的5′或3′位点，但优选位于启动子的5′位点。
转录终止成分
用于真核宿主细胞(例如，酵母，真菌，昆虫，植物，动物，人，或来自其他多细胞生物的有核细胞)的表达载体将也包含终止转录和稳定mRNA必需的序列。所述序列通常可获自真核或病毒DNAs或cDNAs的未翻译区域的5′末端，有时获自3′末端。这些区域包含转录为在编码抗-NKG2A抗体的mRNA的未翻译部分中的聚腺苷酸化片段的核苷酸片段。一种有用的转录终止成分是牛生长激素聚腺苷酸化区域。见WO 1994/11026和其中公开的表达载体。
宿主细胞的选择和转化
本文中用于在载体中克隆或表达DNA适当的宿主细胞是原核生物，酵母，或上述高等真核细胞。为这一目的的适当的原核生物包括真细菌，例如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物，例如，肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，例如埃希氏菌属(Escherichia)，如大肠埃希氏菌(E.coli)，肠杆菌属(Enterobacter)，欧文氏菌属(Erwinia)，克雷伯氏菌属(Klebsiella)，变形杆菌属(Proteus)，沙门氏菌属(Salmonella)，如，鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)，沙雷氏菌属(Serratia)，如，粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)，和志贺氏菌属(Shigella)，以及芽孢杆菌属(Bacilli)，如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)(如，公开于1989年4月12日出版的DD266,710中的地衣芽孢杆菌41P)，假单胞菌属(Pseudomonas)，例如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)，和链霉菌属(Streptomyces)。优选的大肠埃希氏菌克隆宿主是大肠埃希氏菌294(ATCC31,446)，然而其他的菌株例如大肠埃希氏菌B，大肠埃希氏菌X1776(ATCC 31,537)，和大肠埃希氏菌W3110(ATCC 27,325)是适合的。这些实例是例示性的而不是限制性的。
除了原核生物之外，真核微生物例如丝状真菌或酵母是用于编码抗-NKG2A抗体载体的适当的克隆或表达宿主。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，或普通面包师的酵母，是在低级真核宿主微生物中最通常使用的。然而，大量的其他属，种，和株通常是可获得并且在本文中是有用的，例如，裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)；克鲁维酵母(Kluyveromyces)宿主例如，乳酸克鲁维酵母(K.lactis)，脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC 12,424)，K.bulgaricus(ATCC 16,045)，K.wickeramii(ATCC 24,178)，K.waltii(ATCC 56,500)，K.drosophilarum(ATCC 36,906)，K.thermotolerans和马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)；耶氏酵母属(yarrowia)(EP 402,226)；巴斯德毕赤酵母(EP 183,070)；念珠菌属；里氏木霉(Trichoderma reesia)(EP244,234)；粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)；许旺酵母属(Schwanniomyces)例如西方许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)；和丝状真菌(filamentous fungi)例如，脉孢菌属(Neurospora)，青霉属(Penicillium)，弯颈霉属(Tolypocladium)和曲霉属(Aspergillus)宿主例如，构巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger)。
用于糖基化抗-NKG2A抗体表达的适合的宿主细胞是源于多细胞生物。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了来自宿主的多种杆状病毒株和变体和相应的许可的昆虫宿主细胞，所述宿主例如草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(蠋(caterpillar))，埃及斑蚊(Aedes aegypti)(蚊(mosquito))，白纹伊蚊(Aedes albopictus)(蚊(mosquito))，黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)(果蝇(fruitfly))和家蚕(Bombyx mori)。用于转染的多种病毒株是公众可获得的，例如苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica NPV)的L-1变体和家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori NPV)的Bm-5株，并且所述病毒可用作根据本发明的此处的病毒，特别是用于草地贪夜蛾细胞的转染。
棉花，玉米，土豆，大豆，矮牵牛花，西红柿，和烟草的植物细胞培养物也可用作宿主。
然而，对脊椎动物细胞具有最大的兴趣，并且脊椎动物细胞在培养物(组织培养物)中的繁殖已成为常规方法。有用的哺乳动物宿主细胞系的实例是用SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚肾(HEK)系(为在悬浮培养物中生长的亚克隆的293或293细胞，Graham等人，J.Gen Virol.，36：59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCCCCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：4216(1980)，包括DG44(Urlaub等人，Som.Celland Mol.Gen.，12：555-566(1986))和DP12细胞系)；小鼠支持细胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.，23：243-251(1980))；猴肾细胞(CV1 ATCCCCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人***细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；buffalo大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCCCCL51)；TRI细胞(Mather等人，Annals N.Y.Acad.Sci.，383：44-68(1982))；MRC5细胞；FS4细胞；和人肝细胞瘤系(Hep G2)。
宿主细胞用上述用于抗-NKG2A抗体生产的表达或克隆载体转化，并且在改良为适于诱导启动子，选择转化体，或扩增编码期望序列的基因的普通营养培养基中培养。
培养宿主细胞
用于生产本发明的抗-NKG2A抗体的宿主细胞可在多种培养基中培养。商业上可获得的培养基例如Ham′s F10(Sigma)，最小必需培养基((MEM)，(Sigma)，RPMI-1640(Sigma)，FreeStyleTM(Cibco)和Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium((DMEM)，Sigma)适于培养宿主细胞。另外，例如，任何描述于Ham等人，Meth.Enz.58：44(1979)；Barnes等人，Anal.Biochem.，102：255(1980)；美国专利号4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO1990/03430；WO1987/00195；或U.S.Pat.Re.30,985中的培养基可用作宿主细胞的培养基。任何这些培养基可根据需要补充激素和/或其他生长因子(例如胰岛素，转铁蛋白，或表皮生长因子)，盐(例如氯化钠，钙，镁，和磷酸盐)，缓冲剂(例如HEPES)，核苷酸(例如腺苷和胸苷)，抗生素(例如GENTAMYCIN.TM.药物)，痕量元素(定义为通常以微摩尔范围的终浓度存在的无机化合物)，和葡萄糖或等价能量源。任何其他必需补充物也可以本领域技术人员已知的适当浓度包括在内。培养条件，例如温度，PH等是选择用于表达的宿主细胞先前使用的那些，并且对于本领域普通技术人员是明显的。
抗-NKG2A抗体的纯化
当利用重组技术时，抗体可在细胞内或在周质空间中产生，或直接分泌到培养基中。如果抗体细胞内产生，作为第一步骤，例如通过离心或超滤，除去微粒碎片，其为宿主细胞或裂解片段。Carter等人，Bio/Technology，10：163-167(1992)描述了分离分泌到大肠埃希氏菌的周质空间中的抗体的方法。简短地说，在醋酸钠(pH3.5)，EDTA，和苯甲磺酰氟(PMSF)的存在下将细胞体解冻超过大约30分钟。细胞碎片可通过离心除去。当抗体分泌到培养基中时，来自所述表达***的上清液通常利用商业上可获得的蛋白浓缩滤器而首次浓缩，所述滤器例如，AMICONTM or MILLIPORE PELLICONTM超滤单元。蛋白酶抑制剂例如苯甲磺酰氟(PMSF)可包括在任何前述步骤中以抑制蛋白水解，并且可包括抗生素以防止外来污染物的生长。
可利用例如羟磷灰石色谱法，凝胶电泳，透析，和亲和层析，纯化从细胞中制备的抗体组合物，亲和层析是优选的纯化技术。蛋白A作为亲和配体的适应性依赖于存在于抗体中的任何免疫球蛋白Fc区的种类和同种型。蛋白A可用于纯化基于人γ1，γ，或γ4重链的抗体(Lindmark等人，J.Immunol.Meth.，62：1-13(1983))。对于所有小鼠同种型和人y3，推荐蛋白G(Guss等人，EMBO J.，5：15671575(1986))。亲和配体附着的基质最经常是琼脂糖，但是其他的基质是可利用的。机械稳定的基质例如可控孔度玻璃或聚(苯乙烯联乙烯)苯比利用琼脂糖允许更快的流率和更短的加工时间。当抗体包含CH3区时，BAKERBOND ABXTM树脂(J.T.Baker，Phillipsburg，N.J.)对于纯化是有用的。蛋白纯化的其他技术例如在离子交换柱上分级分离，乙醇沉淀，逆相HPLC，在硅石上的色谱法，在肝素SEPHAROSETM上的色谱法，在阴离子或阳离子交换树脂(例如聚天冬氨酸柱)上的色谱法，层析聚焦，SDS-PAGE，和铵-硫酸盐沉淀，根据待回收的抗体也是可利用的。
对于Z270或其人化形式的示例性的基于蛋白A的纯化方法描述于实施例6。
药物制剂
在一个实施方式中，本发明提供了包含本文所述的抗体和一种或多种载体的药物组合物。
相应地，本发明的一个目标是提供包含以1mg/ml到500mg/ml的浓度存在的所述抗体的药物制剂，其中所述制剂具有从2.0到10.0的PH。制剂可进一步包含缓冲体系，防腐剂，张度剂，螯合剂，稳定剂和表面活性剂。在一个实施方式中，药物制剂是水制剂，即包含水的制剂。所述制剂典型地是溶液或悬浮液。在一个进一步的实施方式中，药物制剂是水溶液。术语“水制剂”定义为包含至少50％w/w的水的制剂。同样地，术语“水溶液”定义为包含至少50％w/w的水的溶液，术语“水悬浮液”定义为包含至少50％w/w的水的悬浮液。
在另一实施方式中，药物制剂是冷冻干燥的制剂，内科医生或患者在使用前将溶剂和/或稀释液加入到其中。
在另一实施方式中，药物制剂是先前没有进行任何溶解的备用的干燥制剂(例如，冷冻干燥或喷雾干燥)。
在一个进一步的方面，药物制剂包含所述抗体和缓冲剂的水溶液，其中抗体以1mg/ml或更高的浓度存在，并且其中所述制剂具有大约2.0到大约10.0的PH。
在另一实施方式中，制剂的PH的范围选自：大约2.0到大约10.0，大约3.0到大约9.0，大约4.0到大约8.5，大约5.0到大约8.0，以及大约5.5到大约7.5。
在一个进一步的实施方式中，缓冲剂选自：醋酸钠，碳酸钠，柠檬酸盐，双甘氨肽，组氨酸，甘氨酸，赖氨酸，精氨酸，磷酸二氢钠，磷酸氢二钠，磷酸钠，和三(羟甲基)-氨基甲烷，N-二(羟乙基)甘氨酸，tricine，苹果酸，琥珀酸盐，马来酸，富马酸，酒石酸，天冬氨酸或其混合物。这些特定缓冲剂中的每种组成了本发明的一个可选实施方式。
在一个进一步的实施方式中，制剂进一步包含药学上可接受的防腐剂。防腐剂可选自例如，苯酚，邻甲酚，间甲酚，对甲酚，对羟基苯甲酸甲酯，对羟基苯甲酸丙酯，2-苯氧基乙醇，对羟基苯甲酸丁酯，2-苯基乙醇，苯甲醇，氯丁醇，和硫柳汞(thiomerosal)，溴硝丙二醇，苯甲酸，imidurea，氯己啶，脱氢乙酸钠，氯化甲酚，对羟基苯甲酸乙酯，苯索氯铵，氯酚醚(chlorphenesine)(3-对氯苯氧基丙-1，2-二醇)，或其混合物。防腐剂可，例如，以0.1mg/ml到20mg/ml，0.1mg/ml到5mg/ml，5mg/ml到10mg/ml，或10mg/ml到20mg/ml的浓度存在。这些特定防腐剂中的每种组成了本发明的一个可选实施方式。防腐剂在药物组合物中的应用对于熟练技术人员是熟知的。方便的参考可参见Remington：The Science and Practice of Pharmacy，19th edition，1995。
在一个进一步的实施方式中，制剂进一步包含等渗剂。等渗剂可以，例如，选自：盐(例如，氯化钠)，糖或糖醇，氨基酸(例如，L-甘氨酸，L-组氨酸，精氨酸，赖氨酸，异亮氨酸，天冬氨酸，色氨酸，苏氨酸)，醛醇(例如，甘油，1，2-丙二醇，1，3-丙二醇，1，3-丁二醇)，聚乙二醇(例如，PEG400)，或其混合物。可利用任何糖例如单-，二-或聚糖，或水溶葡聚糖，包括例如果糖，葡萄糖，甘露糖，山梨糖，木糖，麦芽糖，乳糖，蔗糖，海藻糖，右旋糖苷，普鲁兰多糖(pullulan)，糊精，环式糊精，可溶淀粉，羟乙基淀粉和羧甲基纤维素-Na。在一个实施方式中，糖添加剂是蔗糖。糖醇定义为具有至少一个--OH基团的C4-C8烃，并且包括例如，甘露醇，山梨醇，纤维醇，半乳糖醇，己六醇，木糖醇，和阿糖醇。在一个实施方式中，糖醇添加剂是甘露醇。上述糖或糖醇可独立使用或联合使用。对于用量没有固定的限制，只要糖或糖醇在液体制剂中可溶并且不会不利地影响利用本发明方法获得的稳定效果即可。糖或糖醇浓度可以，例如，在大约1mg/ml到大约150mg/ml之间。等渗剂可以例如，1mg/ml到50mg/ml，1mg/ml到7mg/ml，8mg/ml到24mg/ml，或25mg/ml到50mg/ml的浓度存在。这些特定等渗剂中的每种构成了本发明的一个可选实施方式。等渗剂在药物组合物中的应用是熟练技术人员熟知的。方便的参考可参见Remington：The Science and Practice of Pharmacy，19th edition，1995。
在一个进一步的实施方式中，制剂可包含螯合剂。螯合剂可，例如，选自乙烯二胺四乙酸(EDTA)，柠檬酸，和天冬氨酸的盐，或其混合物。螯合剂可，例如，以0.1mg/ml到5mg/ml，0.1mg/ml到2mg/ml，或2mg/ml到5mg/ml的浓度存在。这些特定螯合剂中的每种构成了本发明的一个可选实施方式。螯合剂在药物组合物中的应用是熟练技术人员熟知的。方便的参考可参见Remington：The Science andPractice of Pharmacy，19th edition，1995。
在本发明的一个进一步的实施方式中，制剂进一步包含稳定剂。稳定剂在药物组合物中的应用是熟练技术人员熟知的。方便的参考可参见Remington：The Science and Practice of Pharmacy，19th edition，1995。更特别地，本发明的组合物可以是稳定化的液体药物组合物，其治疗活性成分包括在液体药物制剂的储存过程中可能显示出聚集形成的多肽。“聚集形成”意指多肽分子之间的物理反应，其导致寡聚体的形成，其可保持可溶的或从溶液中沉淀的大的可见聚集物。“在储存过程中”意指液体药物组合物或制剂一旦制备，不立刻给予受试者。而是，制备之后，它被包装用以储存，以液体形式，以冷冻状态，或以干燥形式用以后来重建为液体形式或其他适于给予受试者的形式。“干燥形式”意指通过冷冻干燥(即，冻干，见例如，Williams and Polli(1984)J.Parenteral Sci.Technol.38：48-59)，喷雾干燥(见，Masters(1991)inSpray-Drying Handbook(5th ed；Longman Scientific and Technical，Essez，U.K.)，pp.491-676；Broadhead等人(1992)Drug Devel.Ind.Pharm.18：1169-1206；and Mumenthaler等人(1994)Pharm.Res.11：12-20)，或空气干燥(Carpenter and Crowe(1988)Cryobiology 25：459-470；and Roser(1991)Biopharm.4：47-53)，而干燥液体药物组合物或制剂。在液体药物组合物储存过程中多肽的聚集形成可不利地影响多肽的生物学活性，导致药物组合物的治疗效能的损失。而且，聚集形成可导致其他问题，例如当利用输注***给予包含多肽的药物组合物时，管类，膜，或泵的堵塞。
本发明的药物组合物可进一步包含一定量氨基酸基料，所述量足以降低在组合物储存过程中多肽的聚集形成。“氨基酸基料”意指一种氨基酸或氨基酸的组合，其中任何给定的氨基酸以游离基形式或以盐形式存在。当利用氨基酸组合时，所有氨基酸可以游离基形式存在，所有可以盐形式存在，或一些可以游离基形式存在，而其他的以盐形式存在。在一个实施方式中，用于制备本发明组合物的氨基酸是携带了带电侧链的那些，例如精氨酸，赖氨酸，天冬氨酸，和谷氨酸。特定氨基酸(例如，甲硫氨酸，组氨酸，咪唑，精氨酸，赖氨酸，异亮氨酸，天冬氨酸，色氨酸，苏氨酸及其混合物)的任何立体异构体(即，L，D，或其混合物)或这些立体异构体的组合，可存在于本发明的药物组合物中，只要特定的氨基酸以游离基形式或盐形式存在即可。在一个实施方式中，使用L-立体异构体。本发明的组合物还可用这些氨基酸的类似物进行制剂。“氨基酸类似物”意指天然存在的氨基酸的衍生物，其带来降低在本发明的液体药物组合物储存过程中多肽的聚集形成的期望效果。适当的精氨酸类似物包括例如，氨基胍，鸟氨酸和N-单乙基L-精氨酸，适当的甲硫氨酸类似物包括乙硫氨酸，丁硫氨酸，并且适当的半胱氨酸类似物包括S-甲基-L半胱氨酸。对于其他氨基酸，氨基酸类似物以自由基形式或盐形式引入组合物中。在本法明的一个进一步的实施方式中，氨基酸或氨基酸类似物以足以防止或延迟蛋白的聚集的浓度使用。
在本发明的一个进一步实施方式中，甲硫氨酸(或其他含硫氨基酸或氨基酸类似物)可被添加，以当作用为治疗剂的多肽为包含至少一个易于进行所述氧化的甲硫氨酸残基的多肽时，抑制甲硫氨酸残基氧化为甲硫氨酸亚砜。“抑制”意指随着时间甲硫氨酸氧化种类的最小聚集。抑制甲硫氨酸氧化导致多肽更大地保持在其正确分子形式中。可使用甲硫氨酸的任何立体异构体(L或D)或其组合。添加的量应该是足以抑制甲硫氨酸残基使得甲硫氨酸亚砜的量可接受调节作用。典型地，这表示组合物包含不超过大约10％到大约30％的甲硫氨酸亚砜。通常，这可通过添加甲硫氨酸使得添加到甲硫氨酸残基的甲硫氨酸的比例范围为大约1:1到大约1000:1例如10:1到大约100:1而获得。
在一个进一步的实施方式中，制剂进一步包含选自高分子量聚合物或低分子化合物的稳定剂。在本发明的一个进一步的实施方式中，稳定剂选自聚乙二醇(例如，PEG3350)，聚乙烯醇(PVA)，聚乙烯吡咯烷酮，羧基/羟基纤维素或其衍生物(例如，HPC，HPC-SL，HPC-L和HPMC)，环糊精，含硫物质如单硫甘油，硫代乙醇酸和2-甲基硫代乙醇，和不同的盐(例如，氯化钠)。这些特定稳定剂中的每种构成了本发明的一个可选实施方式。
药物组合物还可包含附加的稳定剂，其进一步增强了其中的治疗活性多肽的稳定性。本发明特别感兴趣的稳定剂包括但不限于甲硫氨酸和EDTA，其保护多肽免于甲硫氨酸氧化，和非离子表面活性剂，其保护多肽免于与冷冻融化或机械剪切相关的聚集。
在一个进一步的实施方式中，制剂进一步包含表面活性剂。表面活性剂可，例如，选自去污剂，乙氧基化蓖麻油，聚乙二醇化甘油酯，乙酰基化单甘油酯，失水山梨糖醇脂肪酸酯，聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物(例如，poloxamers如
Figure A200780024805D00431
 F68，poloxamer 188和407，Triton X-100)，聚氧乙烯失水山梨糖醇脂肪酸酯，聚氧乙烯和聚乙烯衍生物例如烷基化和烷氧基化衍生物(tweens，例如，Tween-20，Tween-40，Tween-80和Brij-35)，单酸甘油酯或其乙氧基化衍生物，甘油二酯或其聚氧乙烯衍生物，醇，甘油，外源凝集素和磷脂(例如，磷脂酰丝氨酸，磷脂酰胆碱，磷脂酰乙醇胺，磷脂酰纤维醇，二磷脂酰甘油和鞘磷脂)，磷脂衍生物(例如，二棕榈酰磷脂酸)和溶血磷脂(例如，棕榈酰溶血磷脂酰-L-丝氨酸和乙醇胺，胆碱，丝氨酸或苏氨酸的1-酰基-sn-甘油基-3-磷酸酯)和溶血磷脂酰和磷脂酰胆碱的烷基，烷氧基(烷基酯)，烷氧基(烷基醚)-衍生物，例如，溶血磷脂酰胆碱，二棕榈酰磷脂酰胆碱的月桂酰和肉豆蔻酰衍生物，和极性端基(polar head group)的修饰物，即胆碱，乙醇胺，磷脂酸，丝氨酸，苏氨酸，甘油，纤维醇，和带正电DODAC，DOTMA，DCP，BISHOP，溶血磷脂酰丝氨酸和溶血磷脂酰苏氨酸，和甘油基磷脂(例如，脑磷脂)，甘油基糖脂(例如，吡喃半乳糖苷(galactopyransoide))，鞘糖脂(例如，神经酰胺，神经节苷脂)，十二烷基磷酸胆碱，母鸡鸡蛋溶血卵磷脂，羧链孢酸衍生物(例如，牛磺酸二氢羧链孢酸钠(sodium tauro-dihydrofusidate)等)，C6-C12的长链脂肪酸和其盐(例如，油酸和辛酸)，酰基肉毒碱和衍生物，赖氨酸，精氨酸或组氨酸的Nα-酰基化衍生物，或赖氨酸或精氨酸的侧链酰基化衍生物，包含赖氨酸，精氨酸或组氨酸和一个中性或酸性氨基酸的任何组合的二肽的Nα-酰基化衍生物，包含一个中性氨基酸和两个带电氨基酸的任何组合的三肽的Nα-酰基化衍生物，DSS(多库酯钠，CAS登记号[577-11-7])，多库酯钙，CAS登记号[128-49-4])，多库酯钾，CAS登记号[7491-09-0])，SDS(十二烷基硫酸钠或月桂基硫酸钠)，辛酸钠，胆酸或其衍生物，胆汁酸和其盐和甘氨酸或牛磺酸缀合物，熊去氧胆酸，胆酸钠，脱氧胆酸钠，牛磺胆酸钠，甘胆酸钠，N-十六烷基-N，N-二甲基-3-氨-1-丙烷磺酸盐，阴离子(烷基-芳基-磺酸盐)单价表面活性剂，两性离子表面活性剂(例如，N-烷基-N，N-二甲基氨-1-丙烷磺酸盐，3-胆酰胺-1-丙基二甲基氨-1-丙烷磺酸盐，阳离子表面活性剂(季铵基)(例如，鲸蜡基-三甲基溴化铵，氯化鲸蜡基吡啶)，非离子表面活性剂(例如，十二烷基β-D-吡喃葡萄糖苷)，poloxamines(例如，Tetronic’s)，其是源于连续添加氧化丙烯和氧化乙烯到1，2-乙二胺的四功能嵌段共聚物，或者表面活性剂可选自咪唑啉衍生物，或其混合物。这些特定表面活性剂中的每种构成了本发明的一个可选的实施方式。
表面活性剂在药物组合物中的应用是熟练技术人员熟知的。方便的参考可参见Remington：The Science and Practice of Pharmacy，19thedition，1995。
在一个进一步的实施方式中，制剂进一步包含蛋白酶抑制剂例如EDTA(乙烯二胺四乙酸)和苄甲脒HCL，但是也可使用其他的商业上可获得的蛋白酶抑制剂。蛋白酶抑制剂的利用在包含蛋白酶的酶原的药物组合物中是特别有用的，以抑制自身催化。
其他成分也可存在于本发明的肽药物制剂中。所述附加成分可包括湿润剂，乳化剂，抗氧化剂，填充剂，张力改良剂，螯合剂，金属离子，油质媒介，蛋白(例如，人血清白蛋白，胶质或蛋白)和两性离子(例如，氨基酸例如甜菜碱，牛磺酸，精氨酸，甘氨酸，赖氨酸和组氨酸)。所述附加成分当然不应不利地影响本发明药物制剂的总的稳定性。
根据本发明包含抗体的药物组合物可在几个位点给予需要所述治疗的患者，例如，在局部位点，例如，皮肤和粘膜位点，在旁路吸收的位点，例如，在动脉，静脉，心脏内给药，和在涉及吸收的位点，例如，在皮肤内，皮肤下，肌肉内或在腹部内给药。
根据本发明的药物组合物的给药可通过几种给药途径，例如，皮下，肌肉内，腹膜内，静脉内，舌，舌下，口腔，嘴内，口服，胃内，肠内，鼻内，肺内，例如，通过细支气管和海马槽或其组合，表皮，真皮，经皮，***，直肠，眼睛，例如通过结膜，输尿管，和肠胃外给予需要所述治疗的患者。
本发明的组合物可以几种剂量形式给药，例如，以溶液，悬浮液，乳剂，微乳剂，多乳剂，泡沫剂，软膏(salves)，贴剂，硬膏剂(plasters)，油膏剂(ointments)，片剂，包衣片剂，冲洗剂，胶囊，例如，硬胶质胶囊和软胶质胶囊，栓剂，直肠胶囊，滴剂，凝胶，喷雾剂，粉末剂，气溶胶，吸入剂，滴眼剂，眼油膏，眼冲洗剂，***栓剂，***环，***油膏，注射液，原位转化溶液，例如原位凝胶化，原位设置，原位沉淀，原位结晶化，输注溶液，植入物。
本发明的组合物可进一步复合为，或附着于，例如，通过共价，疏水和静电相互作用，药物载体，药物递送***和高级药物递送***以进一步增强抗体的稳定性，提高生物可利用度，提高溶解性，降低不利效应，获得本领域熟练技术人员熟知的时间治疗，并且提高患者顺从或其任何组合。载体，药物递送***和高级药物递送***的例子包括但不限于聚合物，例如纤维素和衍生物，多糖，例如右旋糖苷和衍生物，淀粉和衍生物，聚(乙烯醇)，丙烯酸酯和甲基丙烯酸聚合物，聚乳酸和聚乙醇酸和其嵌段共聚物，聚乙二醇，载体蛋白，例如白蛋白，凝胶，例如，热凝胶***，例如本领域熟知的嵌段共聚***，微胶粒，脂质体，微球体，纳米微粒，液晶和其分散体，L2相和其分散体，这是脂质-水***中相行为的领域中熟练技术人员熟知的，聚合微胶粒，多乳剂，自身乳化，自身微乳化，环式糊精和其衍生物，和dendrimers。
本发明的组合物在用于肺给予抗体的固体，半固体，粉末和溶液制剂中是有用的，所述给药利用例如计量剂量吸入器，干燥粉末吸入器和喷雾器，所有都是本领域熟练技术人员熟知的装置。
本发明的组合物在控释，持续释放，延长释放，延迟释放，和缓释药物递送***的制剂中也是有用的。更特别地，但不限于，组合物在肠胃外控释和持续释放***(两种***都导致给药量的许多倍的降低)的制剂中是有用的，这是本领域熟练技术人员熟知的。甚至更优选的是皮下给药的控释和持续释放***。不限制本发明的范围，有用的控释***和组合物的例子是水凝胶，油质凝胶，液晶，聚合微胶粒，微球，纳米颗粒。
产生对于本发明的组合物有用的控释***的方法包括但不限于，结晶化，浓缩，共结晶化，沉淀，共沉淀，乳化，分散，高压均化，胶囊化，喷雾干燥，微胶囊化，凝聚，相分离，溶剂蒸发以产生微球，挤压和超临界液体方法。一般的参考可参见Handbook of PharmaceuticalControlled Release(Wise，D.L.，ed.Marcel Dekker，New York，2000)和Drug and the Pharmaceutical Sciences vol.99：Protein Formulation andDelivery(MacNally，E.J.，ed.Marcel Dekker，New York，2000)。
可通过用注射器，任选类钢笔注射器，皮下，肌肉内，腹膜内或静脉内注射而实施肠胃外给药。或者，肠胃外给药可通过输注泵而实施。进一步的选择是可以是用于给予鼻或肺喷雾形式的抗体化合物的溶液或悬浮液的组合物。作为仍然进一步的选择，包含本发明抗体的药物组合物也可调整为经皮给药，例如通过无针注射或从贴片，任选电离子透入贴片，或透粘膜，例如口腔，给药。
抗体可在媒介中作为溶液，悬浮液或干燥粉末利用适于肺给药的任何已知类型的装置通过肺途径给药。这些的例子包含但不限于三种普通类型的用于肺给药的气溶胶，并且可包括喷射或超声喷雾器，计量剂量吸入器，或干燥粉末吸入器(Cf.Yu J，Chien YW.Pulmonary drugdelivery：Physiologic and mechanistic aspects.Crit Rev Ther Drug CarrSys 14(4)(1997)395-453)。
基于标准化的测试方法，粒子的空气动力学直径(da)定义为单位密度的参考标准球形颗粒的几何当量直径(1g/cm3)。在最简单的情况中，对于球形颗粒，da与参考直径(d)的关系为如下述的密度比例的平方根函数：
d a = ρ ρ a d
对于非球颗粒存在这种关系的修正(cf.Edwards DA，Ben-Jebria A，Langer R.Recent advances in pulmonary drug delivery using large，porousinhaled particles.J Appl Physiol 84(2)(1998)379-385)。术语“NMAD”和“MMEAD”被很好地描述并且是本领域已知的(cf.Edwards DA，Ben-Jebria A，Langer R and represents a measure of the median value ofan aerodynamic particle size distribution.Recent advances in pulmonarydrug delivery using large，porous inhaled particles.J Appl Physiol 84(2)(1998)379-385)。质量中值空气动力学直径(MMAD)和质量中值有效空气动力学直径(MMEAD)可互换使用，是统计学参数，并且根据经验地描述了与它们沉积在肺中的潜能有关而与实际形状，大小，或密度无关的气溶胶颗粒的大小(cf.Edwards DA，Ben-Jebria A，Langer R.Recent advances in pulmonary drug delivery using large，porous inhaledparticles.J Appl Physiol 84(2)(1998)379-385)。MMAD通常从用撞击器(impactors)，一种测量空气中颗粒惯性行为的仪器，的测量中计算。
在一个进一步的实施方式中，可通过任何已知的气溶胶化技术气溶胶化制剂，例如喷雾法，以获得小于10μm的气溶胶颗粒MMAD，更优选在1-5μm之间，并且最优选1-3μm之间。优选的颗粒大小是基于递送药物到深肺的最有效大小，在深肺中蛋白被最佳地吸收(cf.Edwards DA，Ben-Jebria A，Langer A，Recent advances in pulmonary drugdelivery using large，porous inhaled particles.J Appl Physiol 84(2)(1998)379-385)。
包含抗体的肺制剂的深肺沉积可通过利用吸入技术的改进而进一步最优化，例如，但不限于：缓慢吸入流动(slow inhalation flow)(例如，30L/分钟)，呼吸保持和定时刺激。
术语“稳定化的制剂”指具有提高的物理稳定性，提高的化学稳定性或提高的物理和化学稳定性的制剂。
本文所用的术语蛋白制剂的“物理稳定性”指蛋白形成蛋白的无生物活性和/或不溶聚集体的倾向，作为蛋白暴露于热-机械压力和/或与不稳定化的界面和表面，例如疏水表面和界面，的结果。水蛋白制剂的物理稳定性通过在将填充入适当容器(例如，药液筒或管形瓶)中的制剂在不同温度暴露于机械/物理压力(例如，搅动)不同时间段之后目测和/或浊度测量。制剂的目测在具有黑暗背景的尖锐聚焦灯中进行。制剂的浊度用目测评分表征，所述目测评分将浊度分级为例如0到3的尺度(不显示浊度的制剂对应于目测评分0，在日光下显示出目测浊度的制剂对应于目测评分3)。制剂是根据蛋白聚集的分级的物理不稳定的，当它显示出在日光下的目测浊度时。或者，制剂的浊度可通过熟练技术人员熟知的简单的浊度测量而评价。水蛋白制剂的物理稳定性还可通过利用分光镜试剂或探针评价蛋白的构象状态。探针优选是优先结合蛋白的非天然构象体的小分子。蛋白结构的小分子分光镜探针的一个例子是硫黄素T。硫黄素T是广泛应用于淀粉样蛋白小纤维的荧光染料。在小纤维存在下，并且也许还有其他蛋白构型，硫黄素T当与小纤维蛋白形式结合时在大约450nm产生新的最大激发，并且在大约482nm产生增强的发射。未结合的硫黄素T在该波长基本上是非荧光的。
其他小分子可用作蛋白结构从天然到非天然状态的改变的探针。例如优先结合蛋白的暴露的疏水贴片的“疏水贴片”探针。疏水贴片通常隐藏在天然状态的蛋白的三级结构中，但当蛋白开始不折叠或变性时成为暴露的。这些小分子，分光镜探针的例子是芳香的，疏水染料，例如蒽类(antrhacene)，吖啶类(acridine)，菲咯啉类等。其他分光镜探针是金属氨基酸复合物，例如疏水氨基酸的钴金属复合物，例如，苯基丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，甲硫氨酸，和缬氨酸等。
本文所用的术语蛋白制剂的“化学稳定性”指蛋白结构中的化学共价改变，其导致形成与天然蛋白结构相比具有潜在更小的生物能和/或潜在提高的免疫原性质的化学降解产物。可根据天然蛋白的类型和性质以及蛋白暴露的环境形成多种化学降解产物。化学降解的消除最可能不能避免，并且提高量的化学降解产物通常在储存和蛋白制剂的利用过程中可见，如本领域熟练技术人员熟知的。大多数蛋白倾向于脱酰胺，在该过程中谷氨酰或天冬氨酰残基的侧链氨基被水解以形成游离羧酸。其他降解途径涉及形成高分子量的转化产物，其中两种或更多种蛋白分子通过转酰胺和二硫键相互作用而相互共价连接，导致形成共价结合的二聚体，寡聚体和多聚体降解产物(Stability of ProteinPharmaceuticals，Ahern.T.J.& Manning M.C.，Plenum Press，New York1992)。氧化(例如甲硫氨酸残基的)可被提及为化学降解的另一变体。蛋白制剂的化学稳定性可通过在暴露于不同环境条件后在不同时间点测量化学降解产物的量而评价(降解产物的形成通常可通过例如提高温度而增加)。每种独立降解产物的量通常通过根据分子大小和/或电荷利用多种色谱法技术(例如，SEC-HPLC和/或RP-HPLC)分离降解产物而确定。
因此，如上所述，“稳定化的制剂”指具有提高的物理稳定性，提高的化学稳定性或提高的物理和化学稳定性的制剂。通常，制剂必须在使用和储存过程中(按照推荐的使用和储存条件)稳定直到到达产品有效期。
在本发明的一个实施方式中，包含抗体的药物制剂在超过6周的使用中，和超过3年的储存中保持稳定。
在本发明的另一实施方式中，包含抗体的药物制剂在超过4周的使用中和超过3年的储存中保持稳定。
在本发明的另一实施方式中，包含抗体的药物制剂在超过4周的使用中和超过2年的储存中保持稳定。
在本发明的一个更进一步的实施方式中，包含抗体的药物制剂在超过2周的使用中和超过2年的储存中保持稳定。
还可通过调查其他已经发展的治疗性单克隆抗体的经验确定适当的抗体制剂。几种单克隆抗体已经显示出在临床环境下是有效的，例如Rituxan(Rituximab)，Herceptin(Trastuzumab)Xolair(Omalizumab)，Bexxar(Tositumomab)，Campath(Alemtuzumab)，Zevalin，Oncolym并且类似制剂可与本发明抗体一起使用。例如，单克隆抗体可以在100mg(10mL)或500mg(50mL)一次使用的管形瓶中10mg/mL的浓度提供，制剂为以9.0mg/mL氯化钠，7.35mg/mL柠檬酸钠二水合物，0.7mg/mL聚山梨醇酯80，和注射用无菌水IV给予。PH调整到6.5。在另一实施方式中，抗体以包含大约20mM柠檬酸钠，大约150mMNaCl，PH为大约6.0的制剂提供。
治疗应用
还提供了利用本文所述的抗-NKG2A抗体治疗患者的方法。在一个实施方式中，本发明提供了本文所述的抗体用于制备用于给予人患者的药物组合物的用途。典型地，患者患有癌症，病毒性疾病，炎性病症，或自身免疫病症，或有患有这些疾病的风险。或者，本发明的抗体用于改善患者中的骨髓移植。
例如，在一个方面，本发明提供了增强CD94/NKG2A-限制的淋巴细胞在有此需要的患者中的活性，包括步骤：给予所述患者人或人化抗-NKG2A抗体，所述抗体降低或防止HLA-E介导的CD94/NKG2A受体的活化。在一个实施方式中，方法涉及提高所述淋巴细胞在患者中的活性，所述患者具有疾病，在所述疾病中提高的NK、T和/或NKT细胞活性是有益的，其涉及，影响对NK、T或NKT细胞溶解的细胞易感性或由其引起，或其由不充分的NK、T或NKT细胞活性引起或表征，例如癌症，感染性疾病或免疫病症。
更特别地，本发明的方法和组合物用于治疗多种癌症和其他增殖性疾病，包括但不限于：癌症，包括膀胱癌，乳腺癌，结肠癌，肾癌，肝癌，肺癌，卵巢癌，***癌，胰腺癌，胃癌，子宫癌，甲状腺癌和皮肤癌，包括鳞状细胞癌；淋巴系造血肿瘤，包括白血病，急性淋巴细胞性白血病，慢性淋巴细胞性白血病，急性成淋巴细胞性白血病，B-细胞淋巴瘤，T-细胞淋巴瘤，何杰金淋巴瘤，非-何杰金淋巴瘤，毛细胞淋巴瘤和Burketts淋巴瘤，和多发性骨髓瘤：骨髓系造血肿瘤，包括急性和慢性骨髓性白血病，前髓细胞性白血病，和骨髓异常增生综合征；间充质源肿瘤，包括纤维肉瘤和横纹肌肉瘤(rhabdomyoscarcoma)；其他肿瘤，包括黑素瘤，***瘤，畸胎癌，成神经细胞瘤和神经胶质瘤；中枢和周围神经***的肿瘤，包括星细胞瘤，成神经细胞瘤，神经胶质瘤和神经鞘瘤；间充质源肿瘤，包括纤维肉瘤，横纹肌肉瘤(rhabdomyoscarcoma)和骨肉瘤；和其他肿瘤，包括黑素瘤，着色性干皮病(xeroderma pigmentosum)，角化棘皮瘤，***瘤，甲状腺滤泡性癌和畸胎癌。
根据本发明可被治疗的特定病症包括淋巴系造血肿瘤，例如T-细胞和B-细胞肿瘤，包括但不限于T-细胞病症例如T-前淋巴细胞性白血病(T-PLL)，包括小细胞和脑形细胞类型；优选T细胞类型的大粒状淋巴细胞白血病(LGL)；Sezary综合征(SS)；成人T-细胞白血病淋巴瘤(ATLL)；T-NHL肝脾淋巴瘤；外周/后-胸腺T细胞淋巴瘤(多形和免疫母细胞亚型)；血管免疫母细胞T-细胞淋巴瘤；血管中心性(angiocentric)(鼻)T-细胞淋巴瘤；退行发育的(Ki 1+)大细胞淋巴瘤；肠T-细胞淋巴瘤；T-成淋巴细胞的；淋巴瘤/白血病(T-Lbly/T-ALL)，多发性骨髓瘤。
其他的增生性病症也可根据本发明治疗，包括例如，增生，纤维症(特别是肺部的，还有其他类型的纤维症，例如肾纤维症)，血管发生，牛皮癣，动脉硬化症和血管中的平滑肌增生，例如器官狭窄或血管成形术之后的再狭窄。
在一个特别方面，本发明的抗体用于治疗粒状淋巴细胞的NK-类型的淋巴增生性疾病；或称为NK-LGL)，指由NK细胞或NK-样细胞的克隆扩增引起的一类增生性病症，所述NK-样细胞即显示出表面抗原表达的特征性组合(例如，CD3-，CD56+，CD16+等；见例如，Loughran(1993)Blood 82：1)的大粒状淋巴细胞。这些病症之下的细胞增殖可具有可变效果，从在一些患者中可见的温和症状到称为NK-LDGL白血病的攻击性，经常致命的形式的疾病。这类病症的症状可包括发烧，温和的嗜中性白血球减少症，血小板减少症，贫血症，淋巴细胞增多，脾肿大，肝肿大，***病，骨髓渗透，和其他(见例如，Zambello等人(2003)Blood 102：1797；Loughran(1993)Blood 82：1；Epling-Burnette等人(2004)Blood-2003-02-400)。
基于CD94/NKG2A抗体的治疗还可用于治疗或防止感染性疾病，优选包括任何由病毒，细菌，原生动物，霉菌或真菌引起的感染。所述病毒感染性生物体包括但不限于，甲型肝炎，乙型肝炎，丙型肝炎，流感，水痘，腺病毒，1型单纯疱疹(HSV-1)，2型单纯疱疹(HSV-2)，牛瘟，鼻病毒，艾柯病毒，轮状病毒，呼吸道合胞病毒，***瘤病毒，***瘤病毒，巨细胞病毒，echinovirus，虫媒病毒，huntavirus，柯萨奇病毒，腮腺炎病毒，麻疹病毒，风疹病毒，脊髓灰质炎病毒和1型和2型人免疫缺陷病毒(HIV-1，HIV-2)。细菌构成了另一优选类的感染性生物体，包括但不限于下述：葡萄球菌属(Staphylococcus)；链球菌属(Streptococcus)，包括化脓链球菌(S.pyogenes)；Enterococcl；芽孢杆菌属(Bacillus)，包括炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)，和乳酸杆菌属(Lactobacillus)；李斯特菌属(Listeria)；白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)；加德纳氏菌属(Gardnerella)包括***加德纳氏菌G.vaginalis；诺卡式菌属(Nocardia)；链霉菌属(Streptomyces)；普通高温放线菌(Thermoactinomyces vulgaris)；Treponerna；弯曲杆菌属(Camplyobacter)，假单胞菌属(Pseudomonas)包括铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)；军团菌属(Legionella)；奈瑟球菌属(Neisseria)包括淋病奈瑟球菌(N.gonorrhoeae)和脑膜炎奈瑟球菌(N.meningitides)；黄杆菌属(Flavobacterium)包括脑膜脓毒性黄杆菌(F.meningosepticum)和气味黄杆菌(F.odoraturn)；布鲁氏菌属(Brucella)；包特菌属(Bordetella)包括百日咳包特菌(B.pertussis)和支气管炎包特菌(B.bronchiseptica)；埃希氏菌属(Escherichia)包括大肠埃希氏菌(E.coli)，克雷伯氏菌属(Klebsiella)；肠杆菌属(Enterobacter)，沙雷氏菌属(Serratia)包括粘质沙雷氏菌(S.marcescens)和液化沙雷氏菌(S.liquefaciens)；爱德华氏菌属(Edwardsiella)；变形杆菌属(Proteus)包括奇异变形菌(P.mirabilis)和普通变形菌(P.vulgaris)；链杆菌属(Streptobacillus)；立克次氏体科(Rickettsiaceae)包括R.fickettsfi，衣原体(Chlamydia)包括鹦鹉热衣原体(C.psittaci)和砂眼衣原体(C.trachornatis)；分枝杆菌属(Mycobacterium)包括结核分枝杆菌(M.tuberculosis)，胞内分枝杆菌(M.intracellulare)，M.folluiturn，M.laprae，鸟分枝杆菌(M.avium)，牛分枝杆菌(M.bovis)，非洲分枝杆菌(M.africanum)，堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)，胞内分枝杆菌(M.intracellulare)，和鼠麻风分枝杆菌(M.lepraernurium)；和诺卡氏菌属(Nocardia)。原生动物可包括但不限于，利什曼原虫(leishmania)，kokzidioa，和锥体虫(trypanosoma)。寄生虫包括但不限于衣原体和立克次氏体。感染性疾病的完整名单可在疾病控制中心(CDC)的国家感染性疾病中心(NCID)的网址上找到(全球网(www)地址cdc.gov/ncidod/diseases/)，其名单引入本文作为参考。所有这些疾病是利用本发明的抑制性抗-CD94/NKG2A抗体治疗的候选者。
在另一方面，抗-NKG2A抗体用于靶向和杀伤在例如患有特征为癌细胞上的CD94/NKG2A表达的癌症的患者中的NKG2A-表达细胞，所述癌症例如NK-淋巴瘤。在一个实施方式中，给予包含人化抗体和细胞毒性剂的免疫缀合体的形式的人化抗体。
在另一方面，抗-NKG2A抗体用于治疗或预防自身免疫或炎性病症。可利用本方法治疗的示例性的自身免疫病症包括，尤其是，溶血性贫血，恶性贫血，结节性多动脉炎，全身性红斑狼疮(systemic lupuserythernatosus)，Wegener′s肉芽肿病，自身免疫性肝炎，Behcet′s疾病，Crohn′s疾病，原发性胆汁性肝硬化，硬皮病，溃疡性结肠炎，Sjogren′s综合征，1型糖尿病，葡萄膜炎，Graves′疾病，阿尔茨海默病，甲状腺炎，心肌炎，风湿热，硬皮病，强直性脊柱炎，类风湿性关节炎，血管球性肾炎，结节病，皮肌炎，肌无力，多肌炎，Guillain-Barré综合征，多发性硬化症，秃头症，天庖疮/类天庖疮，大疱性类天疱疮，Hashimoto′s甲状腺炎，牛皮癣，和白癜风。
可被这些方法治疗的炎性病症的例子包括但不限于，肾上腺炎，齿槽炎，胆囊胆管炎，阑尾炎，***炎，睑炎，支气管炎，粘液囊炎，心脏炎，蜂窝织炎，子***，胆囊炎，声带炎，耳蜗炎，大肠炎，结膜炎，膀胱炎，皮炎，憩室炎，脑炎，心内膜炎，食道炎，咽鼓管炎，纤维组织炎，毛囊炎，胃炎，肠胃炎，齿龈炎，舌炎，肝脾炎，角膜炎，内耳炎，喉炎，***炎，乳腺炎，中耳炎，脑膜炎，子宫炎，粘膜炎，心肌炎，肌炎，鼓膜炎，肾炎，神经炎，***，骨软骨炎，耳炎，心包炎，腱鞘炎，腹膜炎，咽炎，静脉炎，急性骨髓灰白质炎，***炎，牙髓炎，视网膜炎，鼻炎，输卵管炎，巩膜炎，巩膜脉络膜炎，阴囊炎，窦炎，脊椎炎，脂肪组织炎，口炎(stornatitis)，滑膜炎，咽鼓管炎，腱炎，扁桃腺炎，尿道炎和***炎。
还显示了NK细胞同种异体反应性地杀伤树突状细胞改善了造血细胞在骨髓移植中的移植(L.Ruggeri等人，Science，2002，295：2097-2100)。因此，在另一实施方式中，本发明提供了改善造血细胞在患者中的移植的方法，包括给予所述患者包含活性抗体的本发明的组合物的步骤。移植体对抗宿主的疾病的发生率和严重性的降低，移植体存活的延长，或移植体治疗的疾病(例如，造血性癌症)的症状的降低或消除中的任何一种证明了移植的改善。这种方法优选用于白血病的治疗。
组合
许多治疗剂对于治疗癌症是有用的。本发明的抗体组合物和方法因此还可与任何其他通常用于治疗特定疾病，特别是肿瘤，癌症，或患者显示出的其他疾病或病症，的方法组合。只要特定的治疗方法不已知自身损害患者的病症，并且不显著地抵消基于抗-CD94/NKG2A抗体的治疗即可，其与本发明的组合是预期的。
与实体肿瘤治疗相关，本发明可用于与经典方法组合，例如，外科手术，放射治疗，化疗，等。本发明因此提供了组合疗法，其中根据本发明的抗-CD94/NKG2A抗体在外科手术或放射治疗同时，之前，或之后使用；或在另一抗癌症试剂给予同时，之前，或之后给予。可以确信外科手术，放射治疗或抗癌症试剂与本发明组合物的活性试剂组合对癌症施加了有利的组合作用。
示例性抗癌症试剂包括化疗试剂，激素试剂，抗-血管生成试剂，抗-转移试剂，抗-癌症抗体(例如，Rituximab)，针对抑制剂KIR-分子的抗体，生长因子抑制剂，细胞凋亡促进化合物，细胞因子和其他免疫调节试剂，与毒素或放射核素缀合的肿瘤靶向试剂，干扰DNA复制，有丝***和染色体分离的化合物，和中断多核苷酸前体的合成和保真度的试剂。
对于自身免疫或炎性病症，已知对于一种或多种类型的自身免疫或炎性病症，或自身免疫或炎性病症的任何症状有效的任何其他化合物，包括尤其是，免疫抑制剂，例如，咪唑硫嘌呤(例如，Imuran)，chiorambucil(例如，Leukeran)，环磷酰胺(例如，Cytoxan)，环孢霉素(例如，Sandimmune，Neoral)，甲氨蝶呤(例如，Rheumatrex)，皮质类固醇，强的松(例如，Deltasone，Meticorten)，Etanercept(例如，Enbrel)，infliximab(例如Remicade)，TNF抑制剂，FK-506，雷帕霉素(raparnycin)，霉酚酸酯(mycophenolate mofetil)，来氟米特(leflunomide)，抗-淋巴细胞球蛋白，脱氧精胍菌素(deoxyspergualin)或OKT。
免疫调节化合物的优选例子包括细胞因子。其他例子包括具有效果的化合物，优选效果为活化或增强NK细胞活性，或诱导或支持NK细胞增殖。在包含本发明试剂的组合物同时，之前或之后给予的其他化合物是附加化合物(例如，抗-催吐药和止痛剂)和抗病毒试剂。
如本领域普通技术人员理解的，抗癌症试剂的适当剂量大约为已用于临床治疗的那些，其中抗癌症试剂单独给予或与其他试剂组合给予。剂量将很可能根据待治疗的病症而改变。给予治疗的内科医师将能够确定对于个别受试者的适当剂量。
制备的物品
在本发明的另一实施方式中，提供了包含对于上述病症的治疗有用的材料的制备的物品。例如，制备的物品可包括包含本文所述的抗体与指导使用者用有效量的抗体治疗哺乳动物中的病症，例如癌症或病毒性疾病，的说明。在一个优选实施方式中，哺乳动物是人类。制备物品典型地包含容器，和在容器上或与容器关联的标记或包装说明书。适当的容器包括，例如，瓶子，管形瓶，注射器等。容器可从多种材料形成，例如玻璃，或塑料。容器包含对于治疗病症有效的组合物，并且可具有无菌入口(例如，容器可以是具有可被皮下注射针刺穿的塞子的静脉溶液包或管形瓶)。组合物中至少一种活性试剂是本文的人化抗-NKG2A抗体，或包含所述人化抗体的抗体衍生物(例如，免疫缀合物)。标记或包装说明显示了组合物用于治疗选择的病症，例如癌症或病毒性疾病。
而且，制备的物品可包含(a)具有包含在其中的组合物的第一容器，其中组合物包含本文所述抗体，和(b)具有包含在其中的组合物的第二容器，其中组合物包含第一抗体之外的治疗剂。在本发明的这一实施方式中的制备的物品可进一步包含包装说明，其显示第一和第二组合物可组合用于治疗癌症或病毒性疾病。所述治疗剂可以是先前部分所述的附加治疗(例如，化疗剂，抗-血管生成试剂，抗-激素化合物，心脏保护剂，和/或哺乳动物免疫功能调节剂，包括细胞因子)。或者，或另外地，制备物品可进一步包含第二(或第三)容器，其包含药学上可接受的缓冲剂，例如细菌抑制注射用水(BWFI)，磷酸盐缓冲盐，Ringer′s溶液和葡萄糖溶液。可进一步包含其他从商业和使用者立场期望的材料，包括其他缓冲剂，稀释液，过滤器，针，和注射器。给药
如上所述，几种单克隆抗体已经显示出在临床环境下是有效的(例如，Rituxan(Rituximab)和其他)，并且类似的给药方案(即，剂量和/或给药计划)可用于本发明的抗体。给药的方案和剂量可根据用于这些产品的已知方法确定，例如利用生产者的说明。例如，抗体制剂可以在100mg(10mL)或500mg(50mL)一次使用的管形瓶中10mg/mL的浓度提供。对于本发明抗体的示例性的适当剂量范围可以是大约10mg/m2到500mg/m2。注射抗-NKG2A抗体的量和计划，例如，使细胞饱和24小时，48小时，72小时或一周或一个月，可考虑抗体的亲和性和其药物动力学参数而确定。然而，应理解这些计划是示例性的，抗体的最佳计划和方案和耐受性必须在临床实验中确定。
非治疗应用
本发明的抗体(例如，人化抗-NKG2A抗体)还具有非治疗应用。
例如，抗体可用作亲和纯化试剂。在这种方法中，抗体固定在固相上例如，SEPHADEXTM树脂或滤纸，利用本领域熟知的方法。固定的抗体与待纯化的包含NKG2A蛋白(或其片段)的样品接触，并且然后用适当的溶剂清洗支持物，所述溶剂将基本上除去样品中除了NKG2A蛋白之外的所有物质，NKG2A蛋白与固定抗体结合。最后，用另一适当的溶剂清洗支持物，例如，甘氨酸缓冲液，PH5.0，其将NKG2A蛋白从抗体中释放出来。
抗-NKG2A抗体还可用于诊断性测定NKG2A蛋白，例如，检测其在特定细胞，组织，或血清中的表达。
对于诊断性应用，抗体典型地用可检测部分标记。可分组入下述类别的多种标记是可用的：
(a)放射性同位素，例如35S，14C，125I，3H，和131I。利用例如Current Protocols in Immunology，Volumes 1 and 2，Coligen等人，Ed.Wiley-Interscience，New York，N.Y.，Pubs.(1991)所述的技术，可用放射性同位素标记抗体，并且可利用闪烁计数测量放射活性。
(b)荧光标记例如稀土螯合剂(铕螯合剂)或荧光素及其衍生物，罗丹明及其衍生物，丹磺酰(dansyl)，丽丝胺(Lissamine)，藻红蛋白和德克萨斯红(Texas Red)是可用的。这些荧光标记可利用例如上述免疫学通用方法与抗体缀合。可利用荧光计定量荧光。
(c)多种酶-底物标记是可用的，并且美国专利号4,275,149提供了这些中的一些的综述。酶通常催化可利用多种技术测量的发色底物的化学改变。例如，酶可催化底物中的颜色改变，其可分光光度地测量。或者，酶可改变底物的荧光或化学发光。定量荧光改变的技术如上所述。化学发光底物通过化学反应成为电子激发的，并且可然后发射可被测量的光(例如，利用化学发光器)或提供能量给荧光接纳体。酶标记的例子包括萤光素酶(例如，萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶；美国专利号4,737,456)，萤光素，2，3-二氢二氮杂萘二酮类，苹果酸盐脱氢酶，尿素酶，过氧化物酶例如辣根过氧化物酶(HRPO)，碱磷酸酶，β-半乳糖苷酶，葡萄糖淀粉酶，溶菌酶，糖氧化酶(例如，葡萄糖氧化酶，半乳糖氧化酶，和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)，杂环氧化酶(例如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)，乳过氧化物酶，微过氧化物酶，等。将酶与抗体缀合的技术描述于O′Sullivan等人，“Methods for the Preparation ofEnzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay，”inMethods in Enzym.(Ed.，J.Langone & H.Van Vunakis)，Academic Press，New York，73：147-166(1981)。
酶-底物组合的例子包括，例如：
(i)过氧化氢作为底物的辣根过氧化物酶(HRPO)，其中过氧化氢氧化染料前体(例如，邻苯二胺(OPD)或3，3′，5，5′-四甲基对二氨基联苯盐酸盐(TMB))；
(ii)对-硝苯基磷酸酯作为发色底物的碱磷酸酶(AP)；和
(iii)具有发色底物的β-D-半乳糖苷酶(β-D-Gal)(例如，对硝苯基-β-D-半乳糖苷酶)或荧光底物4-甲基
Figure A200780024805D0057154851QIETU
形基(umbelliferyl)-对-β-半乳糖苷酶。
多种其他酶-底物组合对于本领域熟练技术人员是可获得的。对于关于这些的普通综述，见美国专利号4,275,149和4,318,980。
有时，标记间接与抗体缀合。熟练技术人员将了解获得其的多种技术。例如，抗体可与生物素缀合，并且上述三大类标记可与抗生物素蛋白缀合，或反之亦然。生物素选择性地结合抗生物素蛋白，并且由此，标记可与抗体以间接方式缀合。或者，为获得标记与抗体的间接缀合，抗体与小半抗原(例如，地高辛)缀合并且一种上述不同类型的标记与抗-半抗原抗体缀合(例如，抗-地高辛抗体)。由此，可获得标记与抗体的间接缀合。
在本发明的另一实施方式中，抗-NKG2A抗体不需要标记，并且可利用结合NKG2A抗体的标记的二抗检测其存在。
本发明的抗体可用于任何已知的测定方法中，例如竞争结合测定，直接和间接三明治测定，和免疫沉淀测定。Zola，Monoclonal Antibodies：A Manual of Techniques，pp.147-158(CRC Press，Inc.1987)。
对于免疫组织化学，例如，肿瘤样品可以是新鲜的或冷冻的，或可包埋于石蜡中并且用防腐剂例如***固定。
抗体还可用于体内诊断性测定。通常地，抗体用放射性核素或可通过例如核磁共振或本领域已知的其他方法检测的非放射活性指示剂标记。优选，标记是放射性标记，例如，125I，131I，67Cu，99mTc，or111In。标记的抗体给予宿主，优选通过血流，并且标记抗体在宿主中的存在和定位被测定。这种成像技术适当地用于检测肿瘤，肿瘤分类，和***中。放射性同位素与蛋白通过任何手段缀合，包括金属-螯合化合物或乳过氧化物酶，或用于碘酸化的iodogen技术。
为方便起见，本发明的抗体可以试剂盒提供，即组合了预定量的试剂和实施诊断性测定的说明的包装。当抗体标记了酶时，试剂盒将包括底物和酶需要的辅因子(例如，提供可检测发色团或荧光团的底物前体)。另外，可包括其他添加剂例如稳定剂，缓冲剂(例如，block缓冲剂或裂解缓冲剂)等。不同试剂的相对量可以广泛地改变以提供本质上使测定的灵敏度最优化的溶液中试剂的浓度。特别地，试剂可提供为干燥粉末，通常为冷冻干燥的，包括赋形剂，当溶解时，其将提供具有适当浓度的试剂溶液。
保藏
Z270杂交瘤于2005年12月22日保藏在the Collection Nationale deCulture de Microorganismes，Institute Pasteur，25，Rue du Docteur Roux，F-75725Paris，France，保藏号I-3549。
实施例
本发明的进一步的细节通过下述非限制性实施例例示。
实施例1-亲本humZ270VL和humZ270VH序列的选择
本实施例描述了亲本humZ270VL和humZ270VH序列以及变体h270VL和humZ270VH序列的任选的回复突变的选择。
如实施例2所述，Z270杂交瘤被克隆，来自其的相应抗体的Z270VH和VL链序列确定为：
Z270VL：DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASENIYSYLAWYQQKQGKSPQFLVYNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGSYYCQHHYGTPRTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO：1)，在kabat位点108具有任选的精氨酸(R)残基。
Z270VH：QVQLQQPGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTSYWMNWVKQRPEQGLQWIGRIDPYDSETHYSQKFKDKAILTVDKSSSTAYMRLSSLTSEDSAVYYCARGGYDFDVGTLYWFFDVWGAGTTVTVS(SEQ ID NO：2)，具有任选的C-末端丝氨酸(S)残基。
第二轻链，Z270VL-NB，也被鉴定。然而，这是普通的骨髓瘤轻链。
Z270VL-NB：NIVMTQSPKSMSMSVGERVTLTCKASENVVTYVSWYQQKPEQSPKLLIYGASNRYTGVPDRFTGSGSATDFTLTISSVQAEDLADYHCGQGYSYPYTFGGGTKLEIKRA(SEQ ID NO：3)，具有在kabat位点108的任选的精氨酸(R)残基，和在kabat位点109的任选的丙氨酸(A)残基。
从鼠Z270序列的分析中，根据kabats定义的CDR确定为：
CDR-L1：RASENIYSYLA(SEQ ID NO：1的残基24-34)
CDR-L2：NAKTLAE(SEQ ID NO：1的残基50-56)
CDR-L3：QHHYGTPRT(SEQ ID NO：1的残基89-97)
CDR-H1：SYWMN(SEQ ID NO：2的残基31-35)
CDR-H2：RIDPYDSETHYSQKFKD(SEQ ID NO：2的残基50-66)
CDR-H3：GGYDFDVGTLYWFFDV(SEQ ID NO：2的残基95-102)。
利用MOE(分子操作环境；可获自www.chemcomp.com)用来自Protein Database Bank(PDB)的结构模板：1OPG和1XF4了建立3D蛋白结构模型。PDB描述于Berman等人(Nucl Acids Res 2000；28：235-242)，并且可获自www.rcsb.org/pdb。基于在PDB数据库中201抗体-抗原复合体的统计学分析，互补位中的最可能的残基确定为：
Z270VL：SEQ ID NO：1的残基24-34，49-56，89-97
Z270VH：SEQ ID NO：2的残基23-35，49-58，93-102。
利用MOE，鉴定了与互补位相互作用(疏水，氢结合，或电荷)的残基，并且组合的残基组(互补位+相互作用的残基)作为Z270的掩蔽(mask)。
用Z270VL和Z270VH搜索种系V数据库(V-库；可获自vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)返回了下列潜在框架模板(E值在括号中给出)：
重链：VH1_46(2e-036)，VH1_f(2e-035)，VH1_02(3e-035)，VH1_18(4e-035)，VH1_03(6e-035)；和
轻链：VKI_O2(1e-039)，VKI_O12(1e-039)，VKI_L12(9e-038)，VKI_L8(9e-038)，VKI_A20(9e-038)。
用掩蔽(mask)搜索种系数据库返回了下列潜在框架模板(E值在括号中给出)：
重链：VH5_a(4e-013)，VH5_51(3e-011)VH1_f(1e-010)，VH1_18(2e-010)，VH1_46(4e-010)；和
轻链：VKI_L9(2e-012)，VKI_O2(3e-012)，VKI_O12(3e-012)，VKI_L24(2e-011)，VKI_A20(2e-011)。
人工检查比对和命中(hits)之后，VH1_18和VKI_O2选作人骨架。JH6和JK4选作种系J-片段。
现在用下列规则设计人化：
·掩蔽(mask)之外的残基作为人的。
·掩蔽(mask)之内和kabat CDR之内的残基作为鼠的。
·掩蔽(mask)之内和kabat CDR之外小鼠/种系共有的残基作为共有序列。
·掩蔽(mask)之内和kabat CDR之外小鼠/种系差异的残基易于进行潜在的回复突变。
对于Z270VL和Z270VH的分析例示于图1，其中掩蔽(mask)残基是在kabat模式中遮蔽的那些；CDR残基在kabat模式中显示为粗体；并且小鼠/种系差异在VKI_02/JK4和VH1_18/JH6序列中被遮蔽。Z270VL和humZ270VL1，和humZ270VL1 cons可任选包含在kabat位点108的精氨酸(R)残基。
给出了具有如人的潜在回复突变残基的获得的序列，humZ270VL1和humZ270VH1。
根据kabat定义的人化Z270抗体的CDR显示于图2。对于humZ270CDR，仅仅CDR-H2序列与对应的鼠CDR的CDR-H2不同，在4个位点有差异。然而，在效果上，这表示kabat CDR-H2残基60-65与人接纳体序列同一，提供了更人化的分子和更少免疫原性的风险。在图2中，差异以粗体文本显示。
实施例 2-Z270 IgG1VH和VL区的克隆
本实施例描述了鼠Z270 VH和VL区的克隆和测序。
为总RNA提取的Z270杂交瘤细胞培养。Z270杂交瘤培养于添加了10％ FCS(Biochrom Cat#S0115)的RPMI 1640(Hyclone Cat#SH30011.04)。为总RNA提取，收获5×106到1×107细胞。
抗体生产的Z270杂交瘤细胞培养。为Z270mAb的生产采取了一周分批培养策略。培养基是具有10％ FCS的RPMI 1640。每7天收获上清液。在CL-1000烧瓶(INTEGRA Biosciences，Item No.90005，LotNo.08541150)的培养室中的起始细胞密度是2×106细胞/ml。培养过程中，有规律地检查细胞密度和存活性。在CL-1000烧瓶中培养3天之后，密度超过1×107并且存活率为大约85％。在接下来的4天中，细胞密度在1.5-2.5×107细胞/ml之间变动，并且存活率逐渐降低到60-70％。在第7天收集上清液，并且利用还原的SDS-PAGE用定量对照(A-TNP 20050118 2mg/ml)估计抗体浓度。
Z270总RNA提取。根据生产者的说明利用TRIZOL reagentInvitrogen，Cat.No.15596-026实施。
5’-RACE(cDNA末端的快速扩增)。调整了来自Clontech生产的SMARTTM RACE cDNA扩增试剂盒产品，目录号634914，的生产者说明的方案，使用下列设计的基因特异性引物(GSPs)：
用于扩增IgG1重链可变区的GSP1
Race引物重：5’-GCCAGTGGATAGACAGATGG-3’(SEQ ID NO：12)
用于扩增IgG1 Kappa链可变区的GSP2
Race引物kappa：5’-GATGGATACAGTTGGTGCAGC-3’(SEQ IDNO：13)。
第一链cDNA合成，RACE，和在1.5％琼脂糖凝胶上分析得到的样品之后，RACE DNA带被切除，并且用Gel纯化试剂盒进行纯化(QIAGEN QIAquick Cat#28706)，然后利用DNA连接试剂盒(Cat#D6022，来自TAKARA)2.0版通过TA克隆克隆入pMD-19(图3A)。阳性克隆被送出进行DNA测序。
如图4A-D所示，对具有同一的序列的轻链和重链的几种克隆进行测序(粗体文本显示信号肽序列)：
Z270 VL cDNA：(SEQ ID NO：14)
Z270 VL蛋白(SEQ ID NO：15)
Z270 VH cDNA(SEQ ID NO：16)
Z270 VH蛋白(SEQ ID NO：17)。
实施例3-鼠IgG1轻链和重链克隆入pJSV002
为测试抗体亲和性和利用它为阳性对照，Z270抗体轻链和重链***pJSV002作为鼠抗体IgG1。pJSV002是瞬时表达载体，其可与HEK293 6E细胞组合用于Z270瞬时表达(图3B)。
Z270VL和IgG1恒定区克隆入pJSV002的EcoRI和Nhe I位点。得到的质粒显示于图3C。在两末端都具有EcoRI和Nhe I(大写字母)的***序列显示于图4E(SEQ ID NO：18)。
H1可变区和IgG1恒定区克隆入pJSV002-mIgG1-变体(图3D)的EcoRI和Nhe I位点.。pJSV002-mIgG1-变体包含鼠IgG1重链恒定区(图3E)。***的序列在EcoRI和Nhe I(gctagc)位点之间，限制性位点和鼠IgG1恒定区以小写字母显示，其显示于图4F(SEQ ID NO：19)。
实施例4-用于嵌合Z270抗体的质粒构建体
为测试抗体亲和性并利用其作为阳性对照，鼠Z270抗体轻链和重链***pJSV002作为人嵌合抗体IgG4 S241P。抗体包含鼠可变区和的人IgG4恒定区，其具有在重链中的S241P突变。
为表达嵌合Z270抗体(chimZ270)，Z270VL序列和人轻链(kappa)恒定区***pJSV002的EcoR I和BamH I位点(图3F)。使用图4G所示的序列，其中大写字母表示限制性位点(SEQ ID NO：20)。
Z270VH和人重链恒定区***pJSV002-IgG4-S241P的EcoR I和Nhe I位点(图3G和3H)。使用图4H显示的序列，其具有在Eco RI和Nhe I(gctagc)位点之间的实际***序列，其中大写字母表示限制性位点(SEQ ID NO：21)。
实施例5-人化Z270的表达
根据实施例1所述的Z270人化策略，Z270轻链CDR移植入VKI_02/JK4模板以制备humZ270VL1。图4I中显示的序列产生于合成EcoRI和KasI位点之间的序列并将其***pJSV002-hKappaC(在pJSV002中具有人kappa恒定区)，CDR-编码序列为大写字母并且限制性位点为粗体文本(SEQ ID NO：22)。
对于重链的人化，Z270重链CDR(任选具有最优化的CDR-H2)移植入VH1_18/JK6模板以制备humZ270VH1。EcoRI和NheI之间的序列被合成并且克隆入pJSV002-hIgG4 S241P(pJSV002中的人IgG4S241P恒定区，图3G)，其具有大写字母的CDR-编码序列和粗体文本的限制性位点(图4J，SEQ ID NO：23)。
突变构建体同样地克隆入具有相应的IgG4 S241P恒定区和人kappa链恒定区的pJSV002，其具有在humZ270VL和humZ270VH的每种中的框架回复突变的下列组合：
humZ270VL：Wt(即，没有回复突变)，L46F，I48V，L46F_I48VhumZ270VH：Wt(即，没有回复突变)，V5Q，M69L，T71V，T73K，T75S，V5Q_M69L，V5Q_T71V，V5Q_T73K，V5Q_T75S，M69L_T71V，M69L_T73K，M69L_T75S，T71V_T73K，T71V_T75S，T73K_T75S，V5Q_M69L_T71V_T73K_T75S，M69L_T71V_T73K_T75S，V5Q_T71V_T73K_T75S，V5Q_M69L_T73K_T75S，V5Q_M69L_T71V_T75S，V5Q_M69L_T71V_T73K，T71V_T73K_T75S，M69L_T73K_T75S，M69L_T71V_T75S，M69L_T71V_T73K，V5Q_T73K_T75S，V5Q_T71V_T75S，V5Q_T71V_T73K，V5Q_M69L_T75S，V5Q_M69L_T73K，V5Q_M69L_T71V。一种用于重链(HC)的示例性载体设计例示于图5，并且图6中提供了用于轻链(LC)的一种示例性载体设计。
利用293 fectin将质粒转染入HEK293 6E以瞬时表达。材料：细胞：HEK293 6E(293-6E)生长于对数生长期(0.8到1.2×106细胞/ml)。培养培养基：FreeStyleTM(Cat.No.12338-018，来自Gibco)；25μg/mlGeneticin 418(Cat.No.10131-019，来自Gibco)；0.1％ pluronic F-68(Cat.No.24040-032，来自Gibco)。转染培养基：Opti-MEM(Cat.No.51985-026，来自Gibco)；293fectin(Cat.No.12347019，来自Invitrogen)。质粒DNA：感兴趣的纯化质粒DNA(见上)。
细胞计数和接种。转染前两天，为获得7.5×106细胞的必要体积转移入125ml烧瓶，并且添加新鲜Freestyle培养基直至30ml(终细胞密度应该为0.25×106细胞/ml)。两天之后(转染之日)，细胞密度应该在1到1.2×106细胞/ml之间。或者，转染前一天，为获得1.5×107细胞的必要体积转移入125ml烧瓶，并且添加新鲜Freestyle培养基直至30ml(终细胞密度应该为0.50×106细胞/ml)。24h后(转染之日)，细胞密度应该在0.9到1.2×106细胞/ml之间。
293fectin-DNA复合物制备。为制备DNA溶液，在1ml Opti-MEM的总体积中稀释30μg DNA。为制备293fectin溶液，在960μl Opti-MEM中稀释40μl。5分钟之后，在室温下培养，混合293fectin溶液和DNA溶液，并且然后在室温下培养25分钟。细胞然后用2ml 293fectin-DNA混合物转染，并且在37℃下在包含5％ CO2的潮湿培养器(orbitalshaker)中培养4到6天。图7概述了在HEK293细胞例如HEK693 6E细胞中瞬时表达的一般程序。
实施例6-IgG1从Z270杂交瘤培养物的纯化
通过以流率1.0ml/min将样品添加到平衡于3M NaCl 50mM TrispH8.5的HiTrap蛋白A HP(1ml)柱并利用25mM柠檬酸，4.5mM柠檬酸钠PH3.0洗脱抗体，从Z270杂交瘤细胞培养物液中纯化IgG1 Z270抗体。
实施例7-抗体定量和亲和性确定
包含轻链的质粒和相等的重链表达构建体成对混合，并且质粒用于转染HEK6E细胞。然后收集培养培养基上清液。
为定量小鼠IgG1(或IgG4)抗体数量，用山羊聚抗小鼠IgG1(或IgG4)Fc特异性捕获抗体包被ELISA板。应用了抗体表达上清液，然后应用HRP-山羊聚小鼠kapa或Fab第二抗体。应用HRP底物，并且在OD450检测转化。
为分析人化Z270抗体的抗原结合，使用了图8中例示的下列Biacore测定。抗原-捕获抗体固定在Biacore芯片上。应用抗原和培养上清液。分析上率和离率以计算亲和性。
实施例8-Z270的嵌合，人化和回复突变变体的Biacore分析
材料和方法
根据实施例4和5描述的方法生产了在VKI_O2/JK4轻链和VH1_18/JH6重链接纳体框架中的嵌合Z270和humZ270。嵌合Z270，humZ270和回复突变变体的抗原-结合性质在Biacore T100(BiacoreAB，Uppsala，Sweden)上分析。以单链NKG2A-CD94-mFc构建体形式的抗原利用1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)通过胺基共价固定在传感器CM5芯片(Biacore AB，Uppsala，Sweden)上。固定水平目标是300RU。Z270抗体变体在运行缓冲液HBS-EP(10mM HEPES pH7.4，150mM NaCl，3mM EDTA，0.005％(v/v)Tween-20)中稀释为浓度系列(0.157，0.313，0.625，1.25，2.5nM)。所有样品然后以流率40ul/分钟注射到固定抗原上2分钟。接下来，为抗体分解分析，运行缓冲液以40ul/分钟注射3分钟。每个流程之后，再生缓冲液(10mM NaOH，500mM NaCl)被注射(30秒，10ul/分钟)以使剩余抗体完全从抗原上剥离。用Biacore T100评价软件评价数据。
结果
humZ270的亲和性测定为67pM。这种KD值高于嵌合Z270(50pM)(图9和表2)。回复突变在VKI_O2/JK4轻链和VH1_18/JH6重链接纳体框架引入到humZ270基本上不提高它的亲和性(图10)。
表2
          嵌合Z270                         humZ270
ka(l/Ms)  kd(l/s)   KD(M)      Chi2(RU2) ka(l/Ms)  Kd(l/s)   KD(M)       Chi2(RU2)
7.970E+6  3.972E-4  4.983E-11  0.0968    7.492E+6  4.982E-4  6.650E-11   0.044
实施例9-具有全长CDR-H2的humZ270的产生
在图11所示的另一策略中，研究了全长kabat CDR(包括全长CDR-H2)是否导致在VKI_O2/JK4轻链和VH1_18/JH6重链接纳体框架中的humZ270的提高的亲和性。humZ270VH3(SEQ ID NO：24)是根据CDR定义的差异中直接得出的，基本上产生了kabat CDR-移植人化Z270抗体。humZ270VH4(SEQ ID NO：25)是根据观察到K38，Q46，W47，I48，G49，Y59，Q61，K62，K66和A67邻近S60，F63，K64，D65侧链而得出的，产生了具有R38K，E46Q，M48I，R66K，和V67A回复突变的CDR-移植人化Z270抗体。
实施例10-在其他人接纳体框架中的humZ270的产生
产生了具有不同人重链接纳体框架序列的大量不同的人化构建体以探索框架选择。
图12显示了制备的不同人化Z270VH构建体的比对。humZ270VH5(SEQ ID NO：26)是基于VH5_a，humZ270VH6(SEQ ID NO：27)是基于VH5_51，humZ270VH7(SEQ ID NO：28)是基于VH1_f，并且humZ270VH8(SEQ ID NO：29)是基于VH1_46，所有都具有JH6J-片段。所有人化构建体的kabat CDR-H2的6个C-末端氨基酸残基与人接纳体框架同一。
利用比对程序VectorNTI，获得了下列的humZ270VH1和humZ270VH5，-6，-7，和-8之间的序列同一性：78，2％(VH1 vs.VH5)，79，0％(VH1 vs.VH6)，88，7％(VH1 vs.VH7)，和96，0％(VH1 vs.VH8)。
实施例11-不同humZ270变体的Biacore分析
huZ270变体的亲和性，所有都包含humZ270VL序列，但具有应用于VH序列人化的不同策略，被分析。
材料和方法
使用了Biacore T100(Biacore AB，Uppsala，Sweden)。CD94/NKG2A抗原以单链NKG2A-CD94-mFc构建体的形式使用，利用1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)通过胺基共价固定在传感器CM5芯片(Biacore AB，Uppsala，Sweden)上。固定水平目标是300RU。humZ270抗体变体在运行缓冲液HBS-EP中稀释为浓度系列(0.157，0.313，0.625，1.25，2.5nM)。所有样品然后以流率40ul/分钟注射到固定抗原上2分钟。接下来，为抗体分解分析，运行缓冲液以40ul/分钟注射3分钟。每个流程之后，再生缓冲液(10mM NaOH，500mM NaCl)被注射(40秒，10ul/分钟)以使剩余抗体完全从抗原上剥离。用Biacore T100评价软件评价数据。每种变体的KD值除以具有humZ270VH1重链的huZ270的KD值以获得相对的KD倍数改变。
结果和结论
结果显示于图13，其中每种变体的KD值根据具有humZ270VH1重链的huZ270的KD值而被标准化，以获得KD的相对改变。如图13所示，在CDR-移植变体(VH3，VH4)和在CDR-H2片段包含更少鼠残基的humZ270变体(humZ270VL1/VH1)之间没有显著区别。在不同人接纳体框架中的”人化-CDR-H2”之间没有基本的差别。由于更人化的humZ270抗体具有对于在人患者中的免疫原性反应的低风险性的益处，人化-CDR-H2变体例如VH1，VH5，VH6和VH7可因为相对于标准CDR-移植humZ270抗体具有显著更低的亲和性，和具有更低可能的宿主免疫反应，而被选择用于治疗性应用。
实施例12-Z270VL和VH中关键残基的鉴定
为鉴定Z270的互补位，在鼠抗体的CDR上进行了丙氨酸扫描突变。下列氨基酸被选择用于丙氨酸突变(图14)：
Z270VL：R24A，S26A，E27A，N28A，Y30A，S31A，N50A，K52A，T53A，E56A，Y92A，T94A
Z270VH：K23A，S25A，T28A，T30A，S31A，N35A，D52A，Y53A，D54A，S55A，E56A，R94A，D98A，F99A，D100A，V(100A)A，T(100C)A，L(100D)A，W(100F)A，D101A。
材料和方法
丙氨酸突变体的抗原结合性质在Biacore T100(Biacore AB，Uppsala，Sweden)上分析。以sc-NKG2A-CD94-mFc形式的抗原利用1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)通过胺基共价固定于传感器CM5芯片(Biacore AB，Uppsala，Sweden)上。固定水平目标是300RU。纯化的Z270丙氨酸突变体在运行缓冲液HBS-EP中稀释为0.75nM或1.5nM。所有样品然后以流率10ul/分钟注射到固定抗原上2分钟。接下来，运行缓冲液为抗体结合稳定性分析以10ul/分钟注射1分钟。每个流程之后，再生缓冲液(10mM NaOH，500mM NaCl)被注射(35秒，10ul/分钟)以使剩余抗体完全从抗原上剥离。用Biacore T100评价软件评价数据。每种变体的相对结合通过将获自Biacore的它的结合水平(RU)除以chimZ270的结合水平而计算。
结果和结论
如图15所示，Z270VH丙氨酸突变体D52A，D54A，F99A，T(100C)A，和W(100F)A完全丧失了它们的抗原结合特性。重链突变体R94保留了大约20％的抗原结合特性。重链突变体N35A，Y53A，E56A，D98A，V(100A)A，和L(100D)A的相对结合水平在40-70％之间(图1)。相应地，在Z270重链CDR-H2和CDR-H3中的氨基酸D52，D54，R94，F99，T(100C)，and W(100F)是识别抗原的关键残基。同时，在重链中的氨基酸N35，Y53，E56，D98，V(100A)，和L(100D)适度地影响抗原结合。令人感兴趣的是，所有的Z270轻链丙氨酸突变体保持了与嵌合Z270相当的抗原结合特性(图16)。因此，在Z270轻链中没有氨基酸显著地对抗原识别产生贡献。
实施例13-humZ270特异性结合表达CD94/NKG2A的细胞
通过分析在HEK293中产生的野生型Z270(recZ270)，具有人IgG4的嵌合Z270(chimZ270)或人化Z270(humZ270VL1/VH1)与稳定地过表达CD94/NKG2A或CD94/NKG2C的Ba/F3的结合，在流式细胞术中测试humZ270结合CD94/NKG2A的强度和特异性。为此目的，用在包含2％ FCS的组织培养培养基中的不同浓度的Z270变体在冰上培养Ba/F3-CD94/NKG2A和-C细胞至少30分钟。接下来，清洗细胞，并且细胞再次在具有APC缀合第二Ab’s的类似培养基中在冰上培养至少30分钟。用冰冷PBS清洗两次之后，利用BD Biosciences FACSarray显现mAb’s与细胞的结合。
如图17所示，所有的Z270变体以剂量依赖模式结合Ba/F3-CD94/NKG2A细胞，但不以剂量依赖模式结合Ba/F3-CD94/NKG2C细胞。因此，所有的变体特异性结合NKG2A，humZ270以与chimZ270类似的效率结合NKG2A，然而recZ270稍稍更有效地结合。
实施例14-humZ270诱导HLA-E+靶细胞被CD94/NKG2A-表达NKL细胞杀伤
研究了recZ270，chimZ270，humZ270VL1/VH1和Z199诱导51Cr-标记LCL 721.221-Cw3细胞被CD94/NKG2A+NKL细胞杀伤的能力。在此测定中，在不同浓度的抗-NKG2A mAb’s存在或不存在时，在包含5％ CO2的湿化培养器中在37℃培养51Cr-标记的LCL 721.221-Cw3靶细胞(HLA-E+)与NKL细胞4小时(E:T比例＝6:1)。通过测量在组织培养培养基中51Cr的量而分析靶细胞的杀伤，其在杀伤时被靶细胞释放。
在图18中，显示了逐渐增加浓度的抗-NKG2A抗体诱导了LCL721.221-Cw3细胞被NKL细胞的杀伤。Z199，chimZ270和recZ270都是同样有效的，但是humZ270诱导了LCL 721.221-Cw3细胞被NKL细胞更高的杀伤。因此，humZ270可有效阻断CD94/NKG2A在CD94/NKG2A-表达细胞毒性淋巴细胞，例如NK-细胞，NKT-细胞，α/βT-细胞和γ/δ T-细胞亚群，上的抑制功能，并且比测试的其他重组变体更有效。
实施例15-humZ270是一种竞争性的CD94/NKG2A拮抗剂
为测试humZ270VL1/VH1是否防止配体(即，HLA-E)结合CD94/NKG2A，我们分析了humZ270是否能防止HLA-E四聚物与CD94/NKG2A过表达Ba/F3细胞(Ba/F3-CD94/NKG2A)的结合。为此，Ba/F3-CD94/NKG2A1)与不同浓度的humZ270一起培养或2)首先与饱和浓度的HLA-E四聚物(4.7μg/ml)一起培养，然后与不同浓度的humZ270一起培养。所有的培养在包含2％ FCS的组织培养培养基中在冰上进行。接下来，细胞用特异于小鼠Ab’s的APC-缀合的第二抗体培养，并且利用BD Biosciences FACSarray通过流式细胞术分析。
如图19所示，humZ270以浓度依赖模式(菱形)有效地结合Ba/F3-CD94/NKG2A细胞。然而，当细胞用HLA-E四聚物预培养时，防止了humZ270结合Ba/F3-CD94/NKG2A细胞。因此，HumZ270和HLA-E结合CD94/NKG2A上重叠的表位。因此，在NK-细胞毒性测定中humZ270的CD94/NKG2A-抑制效果很可能是防止HLA-E通过CD94/NKG2A诱导对于细胞毒性淋巴细胞的阴性信号的能力的结果。同样地，humZ270可被认为是竞争性的CD94/NKG2A拮抗剂。
实施例16-humZ270特异性结合CD94/NKG2A
在流式细胞术中测试了humZ270VL1/VH1和多种具有在可变轻链(VL)或可变重链(VH)区的回复突变的humZ270VL1/VH1变体结合CD94/NKG2A的特异性和效率。为此，用humZ270-L46F(VL)，humZ270-I48V(VL)，humZ270-L46F/I48V(VL)，humZ270-V5Q(VH)，humZ270-M69L(VH)，humZ270-T71V(VH)，humZ270-T73K(VH)，humZ270-T75S(VH)，humZ270-V5Q/M69L/T71V/T73K/T75S(VH)，humZ270-M69L/T71V/T73K/T75S(VH)或不具有回复突变的两个不同批的humZ270VL1/VH1(“DK”and“CHN”)培养Ba/F3-CD94/NKG2A细胞。为此目的，在包含2％ FCS的组织培养培养基中用不同浓度的humZ270变体在冰上培养Ba/F3-CD94/NKG2A或-C细胞至少30分钟。细胞然后被清洗，并且在具有特异于人抗体的APC缀合第二抗体的类似培养基中在冰上再次培养至少30分钟。用冰冷的PBS清洗两次之后，用BD Biosciences FACSarray显现第二抗体与细胞的结合。
所有变体特异性结合CD94/NKG2A，但不特异性结合CD94/NKG2C。所有变体以类似效率结合CD94/NKG2A，除了包含V5Q(VL)突变的变体之外，其稍稍更不有效地结合(见图20)。
示例性实施方式
下列段落描述了本发明的示例性实施方式。
1.特异性结合NKG2A的抗体，所述抗体包含来自鼠抗体Z270的互补决定区(CDR)的抗原结合残基和人接纳体框架序列，其中CDR-H2的至少6个C-末端氨基酸残基与可变重链(VH)人接纳体序列的相同。
2.实施方式1的抗体，其比包含鼠抗体Z270可变轻链(VL)和VH序列的抗体在增强CD94/NKG2A-表达细胞毒性淋巴细胞的细胞毒性活性中更有效。
3.实施方式1的抗体，其比包含鼠抗体Z270可变轻链(VL)和VH序列的抗体在中和在细胞毒性淋巴细胞表面表达的CD94/NKG2A受体的抑制性活性中更有效。
4.实施方式1的抗体，其比包含鼠抗体Z270可变轻链(VL)和VH序列的抗体在降低CD94/NKG2A-介导的抑制CD94/NKG2A-表达细胞毒性淋巴细胞的细胞毒性活性中更有效。
5.实施方式1的抗体，其比包含鼠抗体Z270可变轻链(VL)和VH序列的抗体在诱导Cw3-表达靶细胞被CD94/NKG2A-表达细胞毒性淋巴细胞杀伤中更有效。
6.实施方式2-5任一项的抗体，其中CD94/NKG2A-表达细胞毒性淋巴细胞是NK细胞、NKT细胞、α/β T-细胞或γ/δ T-细胞。
7.实施方式6的抗体，其中CD94/NKG2A-表达细胞毒性淋巴细胞是NK细胞。
8.实施方式1-7任一项的抗体，其中抗体VH区包含来自鼠抗体Z270的VH CDR的残基D52、D54、F99、T(100C)和W(100F)。
9.实施方式8的抗体，其中抗体VH区进一步包含来自鼠抗体Z270的VH CDR的残基N35、Y53、E56、D98、V(100A)和L(100D)。
10.实施方式1-9任一项的抗体，所述抗体包含对应于SEQ IDNO：5的残基31-35的CDR-H1，和对应于SEQ ID NO：5的残基95-102的CDR-H3，其中CDR-H2包含SEQ ID NO：5的残基50-59。
11.实施方式1-10任一项的抗体，其中VH区人接纳体框架具有与SEQ ID NO：5的70％或更高的序列同一性。
12.实施方式1-11任一项的抗体，其中VH人接纳体框架的VH片段是VH1_18、VH5a、VH5_51、VH1_f或VH1_46，并且J-片段是JH6。
13.实施方式12的抗体，其中VH片段是VH1_18、VH5_a、VH5_51或VH1_f。
14.实施方式13的抗体，其中VH片段是VH1_18。
15.实施方式1-14任一项的抗体，其中VH区人接纳体序列没有任何回复突变。
16.实施方式1-14任一项的抗体，其中
(a)VH区的位点5的氨基酸是V或Q；
(b)VH区的位点69的氨基酸是M或L；
(c)VH区的位点71的氨基酸是T或V；
(d)VH区的位点73的氨基酸是T或K；或
(e)VH区的位点75的氨基酸是T或S。
17.实施方式16的抗体，其中位点69的氨基酸是L。
18.实施方式16的抗体，其中位点71的氨基酸是V。
19.实施方式1-15任一项的抗体，其中VH区包含SEQ ID NO：5的序列。
20.实施方式1-19任一项的抗体，所述抗体包含对应于SEQ IDNO：4的残基24-34的CDR-L1，对应于SEQ ID NO：4的残基50-56的CDR-L2，和对应于SEQ ID NO：4的残基89-97的CDR-L3。
21.实施方式20的抗体，其中VL区人接纳体序列没有任何回复突变。
22.实施方式20-21任一项的抗体，其中VL区人接纳体框架是来自VKI_O2/JK4。
23.实施方式20-22任一项的抗体，其中VL区人接纳体框架包含SEQ ID NO：4。
24.特异性结合NKG2A的人化抗体或抗体片段，其包含
(a)对应于SEQ ID NO：4的残基24-34的CDR-L1；
(b)对应于SEQ ID NO：4的残基50-56的CDR-L2；
(c)对应于SEQ ID NO：4的残基89-97的CDR-L3；
(d)对应于SEQ ID NO：5的残基31-35的CDR-H1；
(e)对应于SEQ ID NO：5的残基95-102的CDR-H3；和
(f)包含SEQ ID NO：5的残基50-59的CDR-H2；和
(g)人接纳体框架序列；
其中CDR-H2中的残基60-65来自VH人接纳体序列，并且
其中人化抗体比包含对应于SEQ ID NO：1的可变轻链(VL)序列和对应于SEQ ID NO：2的VH序列的抗体在增强CD94/NKG2A-表达NK细胞的细胞毒性活性中更有效。
25.结合人NKG2A的人化抗体，所述抗体包含VH区，所述VH区包含非人CDR残基和人VH接纳体框架，所述VH区包含对应于SEQID NO：5的残基31-35的CDR-H1，对应于SEQ ID NO：5的残基50-65的CDR-H2，和对应于SEQ ID NO：5的残基95-102的CDR-H3。
26.实施方式25的人化抗体，其中人VH接纳体框架不包含任何回复突变。
27.实施方式25的人化抗体，其中VH区的kabat位点5的氨基酸是V或Q。
28.实施方式25的人化抗体，其中VH区的kabat位点69的氨基酸是M或L。
29.实施方式25的人化抗体，其中VH区的kabat位点71的氨基酸是T或V。
30.实施方式25的人化抗体，其中VH区的kabat位点73的氨基酸是T或K。
31.实施方式25的人化抗体，其中VH区的kabat位点75的氨基酸是T或S。
32.实施方式25的人化抗体，其中VH区包含在至少一个选自5、69、71、73和75的kabat位点的框架区取代。
33.实施方式32的人化抗体，其中VH区包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列，其具有根据下列选择中任一个的框架取代：
(a)无
(b)V5Q
(c)M69L
(d)T71V
(e)T73K
(f)T75S
(g)V5Q和M69L
(h)V5Q和T71V
(i)V5Q和T73K
(j)V5Q和T75S
(k)M69L和T71V
(l)M69L和T73K
(m)M69L和T75S
(n)T71V和T73K
(o)T71V和T75S
(p)T73K和T75S
(q)V5Q、T73K和T75S
(r)V5Q、T71V和T75S
(s)V5Q、T71V和T73K
(t)V5Q、M69L和T75S
(u)V5Q、M69L和T73K
(v)V5Q、M69L和T71V
(w)T71V、T73K和T75S
(x)M69L、T73K和T75S
(y)M69L、T71V和T75S，
(z)M69L、T71V和T73K，
(aa)V5Q、M69L、T71V和T73K，
(bb)V5Q、M69L、T71V和T75S，
(cc)V5Q、M69L、T73K和T75S，
(dd)V5Q、T71V、T73K和T75S，
(ee)M69L、T71V、T73K和T75S，和
(ff)V5Q、M69L、T71V、T73K和T75S。
34.实施方式25-32任一项的人化抗体，其包含VL区，所述VL区包含并入人VL接纳体框架的非人CDR残基，所述VL区包含对应于SEQ ID NO：4的残基24-34的CDR-L1，对应于SEQ ID NO：4的残基50-65的CDR-L2，和对应于SEQ ID NO：4的残基89-97的CDR-L3。
35.实施方式34的人化抗体，其中人VL接纳体框架不包含任何回复突变。
36.实施方式34的人化抗体，其中VL区的kabat位点46的氨基酸是L或F。
37.实施方式34的人化抗体，其中VL区的kabat位点48的氨基酸是I或V。
38.实施方式34的人化抗体，其中VL区包含在至少一个选自46和48的kabat位点的框架区取代。
39.实施方式38的人化抗体，其中VL区包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列，其具有根据任一下列选择的框架取代：
(a)无
(b)L46F
(c)I48V
(d)L46和I48V。
40.结合人NKG2A的人化抗体，所述抗体包含VH区，所述VH区包含并入人VH区的非人CDR残基，所述VH区包含在SEQ ID NO：7的至少一个选自5、69、71、73和75的kabat位点的框架区取代。
41.实施方式40的人化抗体，其包含V5Q取代。
42.实施方式40的人化抗体，其包含M69L取代。
43.实施方式40的人化抗体，其包含T71V取代。
44.实施方式40的人化抗体，其包含T73K取代。
45.实施方式40的人化抗体，其包含T75S取代。
46.实施方式40的人化抗体，其包含VL区，所述VL区包含并入人VL区的非人CDR残基，所述VL区包含在SEQ ID NO：6中至少一个选自46和48的kabat位点的框架区取代。
47.实施方式40的人化抗体，其包含L46F取代。
48.实施方式40的人化抗体，其包含I48V取代。
49.实施方式40-48任一项的人化抗体，其包含对应于SEQ IDNO：5的残基31-35的CDR-H1，对应于SEQ ID NO：5的残基50-66的CDR-H2，和对应于SEQ ID NO：5的残基95-102的CDR-H3。
50.实施方式40-49任一项的人化抗体，其包含VH区，所述VH区包含SEQ ID NO：7的序列。
51.实施方式40-50任一项的人化抗体，其包含对应于SEQ IDNO：6的残基24-34的CDR-L1，对应于SEQ ID NO：6的残基50-56的CDR-L2，和对应于SEQ ID NO：6的残基89-97的CDR-L3。
52.实施方式40-52任一项的人化抗体，其包含VL区，所述VL区包含SEQ ID NO：6的序列。
53.结合人NKG2A的人化抗体，所述抗体包含VH区，所述VH区包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列，任选具有在kabat位点5、69、71、73和/或75的一个或更多个FR取代。
54.实施方式53的人化抗体，其中任选的FR取代是V5Q、M69L、T71V、T73K和/或T75S。
55.实施方式52的人化抗体，其进一步包含VL区，所述VL区包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列，任选具有在kabat位点46和/或48的一个或更多个FR取代。
56.实施方式55的人化抗体，其中任选的FR取代是L46F和/或I48V。
57.结合NKG2A的人化抗体，其包含VH区，所述VH区包含并入人VH区的非人CDR残基，其中VH区至少50％同一于SEQ ID NO：5。
58.实施方式46的人化抗体，其中VH区至少90％同一于SEQ IDNO：5。
59.实施方式57和58任一项的人化抗体，其包含对应于SEQ IDNO：5的残基31-35的CDR-H1，对应于SEQ ID NO：5的残基50-66的CDR-H2，和对应于SEQ ID NO：5的残基95-102的CDR-H3。
60.实施方式57-59任一项的人化抗体，其在VH区包含在kabat位点5的V或Q，在kabat位点69的M或L，在kabat位点71的T或V，在kabat位点73的T或K，和在kabat位点75的T或S。
61.实施方式57-60任一项的人化抗体，其包含VL区，所述VL区包含并入人VL区的非人CDR残基，其中所述VL区至少50％同一于SEQ ID NO：4。
62.实施方式57-61任一项的人化抗体，其包含至少90％同一于SEQ ID NO：4的VL区。
63.实施方式57-62任一项的人化抗体，其包含对应于SEQ IDNO：4的残基24-34的CDR-L1序列，对应于SEQ ID NO：4的残基50-56的CDR-L2序列，和对应于SEQ ID NO：4的残基89-97的CDR-L3序列。
64.实施方式57-63任一项的人化抗体，其包含在kabat位点46的L或F，和/或在kabat位点48的I或V。
65.结合人NKG2A的人化抗体，所述抗体包含VH区，所述VH区包含并入人VH区的非人CDR残基，所述VH区包含对应于SEQ IDNO：8的残基31-35的CDR-H1，对应于SEQ ID NO：8的残基50-66的CDR-H2，和对应于SEQ ID NO：8的残基95-102的CDR-H3，其中在kabat位点63、64、65、66和67的氨基酸分别是F、K、D、K、A。
66.实施方式65的人化抗体，其中在kabat位点60的氨基酸是A。
67.实施方式65和66任一项的人化抗体，其中VH区包含SEQ IDNO：8的氨基酸序列。
68.实施方式65-67任一项的人化抗体，其进一步包含VL区，所述VL区包含对应于SEQ ID NO：6的残基24-34的CDR-L1，对应于SEQ ID NO：6的残基50-56的CDR-L2，和对应于SEQ ID NO：6的残基89-97的CDR-L3。
69.实施方式65-68任一项的人化抗体，其中VL区包含SEQ IDNO：6的氨基酸序列。
70.Z270杂交瘤产生的抗-NKG2A抗体的人化形式。
71.实施方式1-70任一项的抗体，其是多特异性抗体或抗体片段。
72.实施方式71的抗体，其是抗体片段，选自Fab、Fab′、F(ab)2、F(ab’)2、F(ab)3、Fv、单链Fv、dsFv、Fd片段、dAb片段、小抗体(minibody)、二抗体(diabody)、三抗体(triabody)、四抗体(tetrabody)、kappa体(kappabody)；骆驼IgG；IgNAR；和多特异性抗体片段。
73.实施方式72的抗体，其是双特异性抗体。
74.实施方式1-70任一项的抗体，其是全长IgG4抗体或其片段。
75.实施方式74的抗体，其中重链恒定区包含S241P突变。
76.编码任一前述实施方式的抗体的分离的核酸。
77.包含实施方式76的核酸的载体。
78.包含实施方式76的载体的宿主细胞。
79.生产抗体的方法，所述方法包括培养实施方式78的宿主细胞使得核酸被表达并且抗体被生产。
80.实施方式79的方法，其进一步包括从宿主细胞培养物中回收抗体。
81.实施方式79的方法，其中在培养之前，用包含编码可变重链区的核酸的载体和包含编码可变轻链区的核酸的载体共转染宿主细胞。
82.免疫缀合物，其包含根据实施方式1-75任一项的抗体和第二试剂。
83.实施方式82的免疫缀合物，其中第二试剂是细胞毒性剂。
84.实施方式82的免疫缀合物，其中第二试剂是PEG-分子。
85.药物组合物，其包含实施方式1-75任一项的抗体或实施方式82-84任一项的免疫缀合物和载体。
86.实施方式74的药物组合物，其包含选自柠檬酸盐、磷酸盐及其组合的缓冲剂，具有从大约6.0到大约7.5的PH。
87.制备的物品，其包含容器，所述容器包含实施方式1-75任一项的抗体，和指导使用者以有效量的抗体治疗哺乳动物中的病症的说明书，所述病症选自癌症、病毒性疾病、炎性病症和自身免疫病症。
88.实施方式87的物品，其中哺乳动物是人。
89.用于中和在人患者的细胞毒性淋巴细胞表面上表达的CD94/NKG2A受体的抑制性活性的实施方式1-75任一项的抗体。
90.用于降低CD94/NKG2A-介导的抑制人患者中的CD94/NKG2A-表达细胞毒性淋巴细胞的细胞毒性活性的实施方式1-75任一项的抗体。
91.用于增强人患者中CD94/NKG2A-表达细胞毒性淋巴细胞的细胞毒性活性的实施方式1-75任一项的抗体。
92.用于诱导在人患者中Cw3-表达靶细胞被CD94/NKG2A-表达细胞毒性淋巴细胞杀伤的实施方式1-75任一项的抗体。
93.实施方式89-92任一项的抗体，其中CD94/NKG2A-表达细胞毒性淋巴细胞是NK细胞、NKT细胞、α/β T-细胞或γ/δ T-细胞。
94.治疗患有病症的人患者的方法，所述病症选自癌症、病毒性疾病、炎性病症和自身免疫病症，所述方法包括给予实施方式85-86任一项的药物组合物。
95.实施方式1-75任一项的抗体用于制备药物的用途，所述药物用于给予患有病症的人患者，所述病症选自癌症、病毒性疾病、炎性病症和自身免疫病症。
96.用于治疗患有病症的人患者的实施方式1-75任一项的抗体，所述病症选自癌症、病毒性疾病、炎性病症和自身免疫病症。
97.实施方式89-96任一项的方法、用途或抗体，其中患者患有鳞状细胞癌，白血病，急性淋巴细胞性白血病，急性成淋巴细胞性白血病，B-细胞淋巴瘤，T-细胞淋巴瘤，何杰金淋巴瘤，非-何杰金淋巴瘤，毛细胞淋巴瘤，Burketts淋巴瘤，多发性骨髓瘤，急性或慢性骨髓性白血病，前髓细胞性白血病，纤维肉瘤，横纹肌肉瘤(rhabdomyoscarcoma)；黑素瘤，***瘤，畸胎癌，成神经细胞瘤，神经胶质瘤，星细胞瘤，成神经细胞瘤，神经胶质瘤，神经鞘瘤；纤维肉瘤，横纹肌肉瘤(rhabdomyoscarcoma)，骨肉瘤，黑素瘤，着色性干皮病(xeroderma pigmentosum)，角化棘皮瘤，***瘤，甲状腺滤泡性癌，畸胎癌，膀胱、乳腺、结肠、肾、肝、肺、卵巢、***、胰腺、胃、子宫、甲状腺或皮肤的其他癌，淋巴系的其他造血肿瘤，骨髓系的其他造血肿瘤，间充质源的其他肿瘤，中枢或周围神经***的其他肿瘤，或间充质源的其他肿瘤。
98.根据实施方式97的用途，其中患者患有多发性骨髓瘤、非-何杰金淋巴瘤或急性骨髓性淋巴瘤。
在此引证的所有参考文献，包括公开文献，专利申请和专利引入本文作为参考，如同分别和特别表明每篇文献引入本文作为参考并且全文引入本文一样。
本文使用的所有标题和亚标题仅仅是为了方便，不应解释为以任何方式限制本发明。
上述元件以所有可能变化的任何组合因此包括在本发明中，除非另外指明或另外明显与上下文矛盾。
除非在上下文中另外特意地指明或明显与上下文矛盾，本文的术语“或”以“和/或”的宽泛的含义使用，并且相应地，同时对其中该术语应该被解释为排除“这或那”的含义的买施方式或方面隐含地提供支持。
如描述本发明的上下文所使用的术语“一”和“所述”和类似对象应被解释为覆盖单数和复数，除非本文另外指明或与上下文明显矛盾。
本文的数值范围的陈述仅仅意图作为分别提及每个落入范围的单独值的速记方法，除非本文另外指明，并且每个单独值引入说明书如同其分别在本文引用一样。除非另外陈述，本文提供的所有精确值代表相应的大概数值(例如，根据特定因素或测量提供的所有精确示例性数值可被认为也提供了相应的大概的测量值，适当地用“大约”修饰)。
本文所述的所有方法可以任何适当的顺序实施，除非本文另外指明或与上下文明显矛盾。
任何和所有实施例或本文提供的示例性语言(例如，“例如“)的使用仅仅意图更好地阐明本发明，除非另外指明不对本发明的范围施加限制。说明书不应解释为指明了对于本发明实践关键的任何元件，除非明确陈述。
本文专利文献的引证和引入仅仅为了方便，不反映所述专利文献的有效性，可专利性和/或可实施性的任何观点。
本发明关于一种成分或多种成分使用术语例如“包含”，“具有”，“包括”或“含有”的任何方面或实施方式中的描述意图对本发明的类似方面或实施方式提供支持，所述方面或实施方式“由一种特定成分或多种特定成分组成”，“基本上由一种特定成分或多种特定成分组成”，或“基本上包含一种特定成分或多种特定成分”，除非另外指明或明显与上下文矛盾(例如，本文中组合物描述为包含特定成分应该理解为也描述了由该组分组成的组合物，除非另外指明或明显与上下文矛盾)。
本发明包括专利法最大程度允许的本文中的方面或权利要求中所述的主题的所有修饰或等同物。
序列表
<110>Novo Nordisk A/S
<120>抗-NKG2A抗体及其用途
<130>7448.204-WO
<160>29
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>107
<212>PRT
<213>小家鼠
<400>1
Figure A200780024805D00811
Figure A200780024805D00821
<210>2
<211>124
<212>PRT
<213>小家鼠
<400>2
Figure A200780024805D00831
<210>3
<211>107
<212>PRT
<213>小家鼠
<400>3
Figure A200780024805D00832
Figure A200780024805D00841
<210>4
<211>107
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>人化序列
<400>4
<210>5
<211>124
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>人化序列
<400>5
Figure A200780024805D00861
Figure A200780024805D00871
<210>6
<211>107
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>人化序列
<220>
<221>不确定的
<222>(46)..(46)
<223>Xaa是L或F
<220>
<221>不确定的
<222>(48)..(48)
<223>Xaa是I或V
<400>6
Figure A200780024805D00872
Figure A200780024805D00881
<210>7
<211>124
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>人化序列
<220>
<221>不确定的
<222>(5)..(5)
<223>Xaa是V或Q
<220>
<221>不确定的
<222>(70)..(70)
<223>Kabat位点69；Xaa是M或L
<220>
<221>不确定的
<223>Kabat位点71；Xaa是T或V
<220>
<221>不确定的
<222>(74)..(74)
<223>Kabat位点73；Xaa是T或K
<220>
<221>不确定的
<222>(76)..(76)
<223>Kabat位点75；Xaa是T或S
<400>7
Figure A200780024805D00891
Figure A200780024805D00901
<210>8
<211>124
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>人化序列
<220>
<221>不确定的
<222>(5)..(5)
<223>Xaa是V或Q
<220>
<221>不确定的
<222>(61)..(61)
<223>Kabat位点60；Xaa是S或A
<220>
<221>不确定的
<222>(64)..(64)
<223>Kabat位点63；Xaa是L或F
<220>
<221>不确定的
<222>(65)..(65)
<223>Kabat位点64；Xaa是Q或K
<220>
<221>不确定的
<222>(66)..(66)
<223>Kabat位点65；Xaa是G或D
<220>
<221>不确定的
<222>(67)..(67)
<223>Kabat位点66；Xaa是R或K
<220>
<221>不确定的
<222>(68)..(68)
<223>Kabat位点67；Xaa是V或A
<220>
<221>不确定的
<222>(70)..(70)
<223>Kabat位点69；Xaa是M或L
<220>
<221>不确定的
<222>(72)..(72)
<223>Kabat位点71；Xaa是T或V
<220>
<221>不确定的
<222>(74)..(74)
<223>Kabat位点73；Xaa是T或K
<220>
<221>不确定的
<222>(76)..(76)
<223>Kabat位点75；Xaa是T或S
<400>8
Figure A200780024805D00931
<210>9
<211>107
<212>PRT
<213>智人
<400>9
Figure A200780024805D00941
<210>10
<211>117
<212>PRT
<213>智人
<400>10
Figure A200780024805D00952
<210>11
<211>233
<212>PRT
<213>智人
<400>11
Figure A200780024805D00962
Figure A200780024805D00971
Figure A200780024805D00981
<210>12
<211>20
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物
<400>12
Figure A200780024805D00982
<210>13
<211>21
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物
<400>13
<210>14
<211>381
<212>DNA
<213>小家鼠
<400>14
Figure A200780024805D00992
<210>15
<211>127
<212>PRT
<213>小家鼠
<400>15
Figure A200780024805D01001
<210>16
<211>432
<212>DNA
<213>小家鼠
<400>16
Figure A200780024805D01011
<210>17
<211>144
<212>PRT
<213>小家鼠
<400>17
Figure A200780024805D01031
<210>18
<211>723
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>嵌合序列
<400>18
Figure A200780024805D01032
<210>19
<211>1419
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>嵌合序列
<400>19
Figure A200780024805D01042
Figure A200780024805D01051
<210>20
<211>723
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>嵌合序列
<400>20
Figure A200780024805D01071
<210>21
<211>1434
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>嵌合序列
<400>21
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<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>人化序列
<400>22
Figure A200780024805D01091
Figure A200780024805D01101
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<211>1428
<212>DNA
<213>人工
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<223>人化序列
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Figure A200780024805D01102
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<212>PRT
<213>人工
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<223>人化序列
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Figure A200780024805D01121
Figure A200780024805D01131
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<211>124
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<220>
<223>人化序列
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<220>
<223>人化序列
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Figure A200780024805D01151
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<211>124
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>人化序列
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Figure A200780024805D01161
Figure A200780024805D01171
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<223>人化序列
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Figure A200780024805D01181
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<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>人化序列
<400>29
Figure A200780024805D01182
Figure A200780024805D01191

Claims (15)

1.特异性结合NKG2A的抗体，所述抗体包含来自鼠抗体Z270的互补决定区(CDR)的抗原结合残基和人接纳体框架序列，其中CDR-H2的至少6个C-末端氨基酸残基与可变重链(VH)区人接纳体序列的相同。
2.权利要求1的抗体，其比包含鼠抗体Z270可变轻链(VL)(SEQ ID NO：1)和VH(SEQ ID NO：2)序列的抗体在增强CD94/NKG2A-表达细胞毒性淋巴细胞的细胞毒性活性中更有效。
3.权利要求1-2任一项的抗体，所述抗体包含对应于SEQ IDNO：5的残基31-35的CDR-H1，和对应于SEQ ID NO：5的残基95-102的CDR-H3，其中CDR-H2包含SEQ ID NO：5的残基50-59。
4.权利要求1-3任一项的抗体，其中
(a)VH区的位点5的氨基酸是V或Q；
(b)VH区的位点69的氨基酸是M或L；
(c)VH区的位点71的氨基酸是T或V；
(d)VH区的位点73的氨基酸是T或K；或
(e)VH区的位点75的氨基酸是T或S。
5.权利要求1-4任一项的抗体，其中VH区人接纳体框架序列没有任何回复突变。
6.权利要求1-5任一项的抗体，其中VH区包含SEQ ID NO：5的序列。
7.权利要求1-6任一项的抗体，所述抗体包含对应于SEQ IDNO：4的残基24-34的CDR-L1，对应于SEQ ID NO：4的残基50-56的CDR-L2，和对应于SEQ ID NO：4的残基89-97的CDR-L3。
8.权利要求1-7任一项的抗体，其中VL区人接纳体框架包含SEQ ID NO：4。
9.特异性结合NKG2A的抗体，所述抗体包含
(a)对应于SEQ ID NO：4的残基24-34的CDR-L1；
(b)对应于SEQ ID NO：4的残基50-56的CDR-L2；
(c)对应于SEQ ID NO：4的残基89-97的CDR-L3；
(d)对应于SEQ ID NO：5的残基31-35的CDR-H1；
(e)对应于SEQ ID NO：5的残基95-102的CDR-H3；
(f)包含SEQ ID NO：5的残基50-59的CDR-H2；
(g)人接纳体框架序列；
其中CDR-H2中的残基60-65来自VH人接纳体序列，并且
其中人化抗体比包含对应于SEQ ID NO：1的可变轻链(VL)序列和对应于SEQ ID NO：2的VH序列的抗体在增强CD94/NKG2A-表达NK细胞的细胞毒性活性中更有效。
10.特异性结合NKG2A的抗体，所述抗体包含VH区，所述VH区包含非人CDR残基和人VH接纳体框架序列，所述VH区包含对应于SEQ ID NO：5的残基31-35的CDR-H1，对应于SEQ ID NO：5的残基50-65的CDR-H2，和对应于SEQ ID NO：5的残基95-102的CDR-H3。
11.权利要求1-10任一项的抗体，其是IgG4抗体。
12.权利要求1-11任一项的抗体，其是抗体片段或多特异性抗体。
13.产生抗-NKG2A抗体的方法，所述方法包括培养包含编码权利要求1-12任一项的抗-NKG2A抗体的核酸的宿主，使得核酸被表达并且产生抗体。
14.药物组合物，所述组合物包含权利要求1-12任一项的抗体和药学上可接受的载体。
15.治疗患有选自癌症、病毒性疾病、炎性病症和自身免疫病症的病症的人患者的方法，所述方法包括给予权利要求14的药物组合物。
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