CN101477241B - 一种显微光学扫描层析成像装置 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种三维光学显微成像装置，旨在提供一种显微光学扫描层析成像方法，通过精密机械加工技术将大型样品逐行逐层切片，并在机械加工的同时对切片进行扫描成像，以此获取样品完整的断层图像数据集。该***包括机械加工模块，成像模块和数据采集模块；机械加工模块用于实现对样品的扫描式切片，成像模块用于对刀具刀刃附近的样品成像，数据采集模块用于实现对样品的成像扫描和记录。上述三个模块协调工作，实现显微光学扫描层析成像装置的功能。本发明采用切片和成像同步的模式，整个过程自动化程度极高，不存在不同层之间图片配准难的问题，整个数据获取的效率很高。

Description

一种显微光学扫描层析成像装置

技术领域

本发明涉及一种光学显微成像技术，更具体的说，涉及一种结合了精密机械加工技术，以获取样品连续断层图片为目标的三维光学显微成像装置。

背景技术

光学显微镜是最重要的显微成像技术，它是利用光学原理把人眼所不能分辨的微小物体放大成像，以供人们提取微细结构信息的光学仪器。早在公元前1世纪，人们就已发现通过球形透明物体去观察微小物体时可以使其放大成像。1590年，荷兰和意大利的眼镜制造者已经造出类似显微镜的放大仪器。17世纪中叶，英国的R.胡克和荷兰的A.van列文胡克都对显微镜的发展做出了卓越的贡献，开始了现代显微镜发展之路。直至今日，虽然电镜等超精密显微技术已经成熟，但光学显微镜仍然生机勃勃，不断有新的创新，比如多光子显微镜、共聚焦显微镜、相衬显微镜、暗场显微镜、全内反显微镜等等，其中，部分技术甚至突破了传统的光学成像极限。

光学显微镜是观察10^-1～10²μm尺度微小物体和结构的首选工具，它具有成本低、易操作、活体成像等诸多有点，但光镜技术有三个极限问题。第一个问题是光学成像的分辨极限，常称为“阿贝极限”，对于可见光成像，这个值为200nm。第二个问题是高分辨率时的视场极限，也就是说越是想看小的目标，视场越小。第三个问题是成像深度极限，对于高分辨光学成像，存在一个1mm的“软极限”，如共聚焦显微镜的穿透深度只有大约0.5mm。以上三个极限限制了光学显微镜的应用范围，因此，不断有人希望改进光学显微镜。

考虑到成像视场和成像深度的限制，无法单独使用光学显微镜对一个较大三维样品的内部进行完整成像，这丧失了一块很大的应用领域，包括胚胎发育研究、数字化小动物脏器、脑图谱获取等。通常的改进做法是，利用切片技术解决成像深度极限，用机械扫描解决成像视场极限，也诞生了一大批“三维显微镜”方法。其中，最常见的方法是先将样品切片，再制片，最后放置在带有扫描机构的光学显微镜上成像，如此往复，对整个样品进行成像。此外，还有切片后对已样品上表面进行扫描成像的方法。

上述常见的“三维显微镜”技术用低廉的成本实现了对较大三维样品的完整成像，但仍然存在一些问题。第一个问题是过程繁琐，切片和成像的过程很难实现自动化。第二个问题是层与层之间的数据很难配准，在海量数据条件下更加严重。第三个问题是效率低，用持续数月的时间来完成一次成像也不足为奇。因此，如果能找到一种自动化的方法，在切片的同时对样品进行成像，即可解决上述问题。

发明内容

本发明旨在提供一种显微光学扫描层析成像方法，通过精密机械加工技术将大型样品逐行逐层切片，并在机械加工的同时对切片进行扫描成像，以此获取样品完整的断层图像数据集。

为实现上述技术，本发明实现了一种显微光学扫描层析成像装置，其特征在于，该***包括机械加工模块，成像模块和数据采集模块；所述机械加工模块用于实现对样品的扫描式切片，成像模块用于对刀具刀刃附近的样品成像，数据采集模块用于实现对样品的成像扫描和记录。

所述机械加工模块，包括数控三维移动平台、刀具和刀具连接、加工槽、加工液循环装置、移动平台驱动器和控制电脑；所述数控三维移动平台底部固定在防震工作台面上，由三个一维直线移动平台沿竖直方向层叠，在所述移动平台驱动器和所述控制电脑的控制下，三维移动平台分别实现左右即X轴向、前后即Y轴向和升降即Z轴向三个正交方向的运动；所述数控三维移动平台上还安装一个垂直工作台，它与所述防震工作台面牢固固定，能够承载重物；所述防震工作台的需要根据加工精度和三维移动平台的工作条件选择，可以为普通金属台、光学隔震台、大理石隔震平台，以及各种特种隔震平台。样品固定在所述加工槽中，加工槽底部固定在所述三维移动平台顶部，加工槽中盛放加工液，加工槽底部设置两个通孔，用于排空加工液和接收净化后的加工液；所述刀具由刀体和刀柄组成，所述刀体固定在刀柄上，而刀柄通过所述刀具连接固定在所述垂直工作台上，所述刀柄中设计第二通孔，所述第二通孔底部出口位于所述刀刃上方，第二通孔顶部出口用作所述加工液循环装置的取水口，所述刀具刀刃宽度大于成像模块的视场大小，刀刃方向平行于所述Y方向，刀背与水平面的夹角α为锐角；所述加工液循环装置通过微型水泵驱动，从所述刀柄上的取水口吸取加工液，在完成一次过滤后，通过所述加工液回流口送回加工槽中；所述刀具与所述样品发生相对运动，X方向的运动实现切片，Y方向的位移实现逐行扫描，Z方向的运动实现逐层扫描。切片时，因为所述刀具的运动和所述加工液循环装置的泵吸作用，会在在所述刀具刀体的上方产生稳定的水流场，压迫切片产生的样品薄片紧贴刀背滑动，越靠近刀刃，这种滑动运动越稳定。

所述成像模块，包括一台显微镜照明器，以及反射镜、物镜、光源、光阑、滤光片、分束镜；所述显微镜照明器通过特制支架固定在所述垂直工作台上，使照明和成像光路均平行于XZ平面；所述显微镜照明器包括连接光源、CCD、目镜镜筒的标准固定接口，所述滤光片、光阑、分束镜放置在该显微镜照明器中；所述物镜固定在所述垂直工作台上，其光轴垂直于所述刀具刀背平面，并处于所述显微镜照明器的照明和成像平面上，与X轴的夹角为β，满足关系式α+β＝90°；物镜成像焦平面几乎与刀背平面重合，焦点落在靠近刀刃的位置；所述反射镜固定在所述垂直工作台上，其镜面垂直于XZ平面，与XY平面的夹角为γ＝45°+β/2，反射镜将照明光反射到所述物镜，将成像光反射进所述照明器中；所述光源产生的照明光经过所述光阑后成为一个片状光束，在所述照明器内部分束镜的反射下沿Z方向落射到所述反射镜上，再由反射镜将光束沿光轴方向射入所述物镜中，实现对所述样品的照明；所述样品经照明后沿原路返回的后向散射光用来成像，一部分光会透过所述分束镜，并最后在所述显微镜照明器上方形成像平面；显微镜照明器可以为各大显微镜厂商的定型产品，也可以用开架的光学元器件代替，但需要另外为所述光源和所述CCD相机单独定制支架。所述光源可以为汞灯、卤素灯、金属卤化物灯、激光器这样的常见光源。配置不同的光源，可以实现不同的白光成像、荧光成像等不同成像方法。所述物镜为浸液物镜，具体选择与加工液类型和成像需求有关。

所述数据采集模块，包括线扫描CCD相机、视频记录卡和图形工作站；所述扫描CCD相机的传感器位于所述显微镜照明器的成像平面上，用于数据采集；所述线扫描CCD相机通过数据线与所述视频记录卡相连，视频记录卡安装在所述图形工作站中；在所述视频记录卡配套软件的控制下，线扫描CCD相机采集到的图片可以永久被保存在图形工作站硬盘中。所述线扫描CCD相机通过信号线与所述数控三维移动平台同步，线扫描CCD相机的每一次曝光需要等待所述数控三维移动平台发出的触发信号。

当所述机械加工模块、成像模块、数据采集模块协调工作时，即可扫描式地对一个完整样品进行断层层析成像。

作为更加优化的技术方案，所述刀具刀背与水平面的夹角α为30°～45°。

作为一种优选的技术方案，所述CCD相机为线扫描，某一时刻，仅对扫描线处的样品薄片成像，该扫描线与XZ平面垂直，并经过物镜成像焦点。

本发明不限制样品的大小，它仅受水槽尺寸限制，而水槽大小受三维移动平台承载能力的限制。本发明不限制获取数据的精度。Z方向的精度和三维移动平台有关，Y方向的精度与显微成像模块的配置有关，而X方向的精度与上述两个因素都有关系，可以根据具体的精度要求选择配置。

在较低的精度要求下(比如＞100μm时)，对样品材料属性、刀具选择均无特殊限制。但对于微米级和亚微米级切片与成像，必须使用材质均匀的样品，并配置特制的金刚石刀具。

本发明采用切片和成像同步的模式，整个过程自动化程度极高，不存在不同层之间图片配准难的问题，整个数据获取的效率很高。因此，本发明是对传统的切片后扫描成像方法的重大改进。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。

图1是本发明机械加工模块的组成示意图。

图2是本发明成像原理图。

图3是本发明成像模块的光路图。

图4是本发明扫描方式示意图。

具体实施方式

机械加工模块如图1所示。

所有组成部分均固定或间接连接在防震工作台1以及垂直工作台2上。防震工作台面要保持水平，垂直工作台上布置了大量安装孔用来固定仪器和元器件。防震工作台和垂直工作台一般是一体化设计，材质相同。数控三维移动平台3的底座固定在防震工作台上，由三个一维直线移动平台组成，它们沿竖直方向层叠，在移动平台驱动器和控制电脑的控制下，各自实现左右(X)、前后(Y)和升降(Z)三个正交方向的运动。在这里XY平面即水平面，Z为竖直方向，成为整个***的坐标系。

在数控三维移动平台顶端固定了一块安装板4，上面布置了大量螺孔，安装板表面要求平整，保证安装上去元器件的坐标准确。加工槽5底部平整，通过螺丝固定在安装板上。样品11通过夹具或者特制强力胶固定在样品台上，样品台再通过螺丝固定在加工槽底部中央。加工槽中盛放水、油等加工液14，液面高度以没过样品顶部5～10mm为宜。加工槽底部设置两个通孔，一个用于排放加工液12，另一个作为所述加工液循环装置的回流口13，除这两个通孔以外，加工槽绝对不允许有漏孔。在不影响走刀的前提下，加工槽容积应尽量设计得小一些，并采用铝合金等轻质材料制作，以减少数控三维移动平台的总负载。

刀具由刀体7和刀柄6组成，刀体固定在刀柄上，而刀柄通过刀具连接8固定在垂直工作台上。刀具连接的作用是给刀具一个牢固的垂直安装面，可以设计为一个多维调节装置，对于高精密加工非常必要。刀体一般较小，刀柄一般通过焊接或者铆接固定刀体。刀柄中设计一个通孔，孔底部出口10位于刀刃上方，为加工液循环装置的取水口，孔顶部出口9用于插接塑料软管。

加工液循环装置通过微型水泵15驱动，从刀柄上的取水口16吸取加工液，在完成一次过滤后，将加工液通过加工槽下方的回流口13送回加工槽中。整个水路的水管可以是普通塑料软管，如果考虑过滤器回流的通畅性，可以将17处的管道设计为大口径橡皮管。加工液循环装置的作用有两个，第一是净化回收利用加工液，维持加工槽内水位平衡，第二是在取水口16附近产生必要的水流。在所述三维移动平台开始运动前，应先注入加工液，再开启加工液循环装置并等待片刻，直至液面稳定。加工槽内液面是否稳定直接影响精密加工的精度。

通过上述配置，在数控程序的控制下，刀具与样品发生相对运动，X方向的运动实现切片，Y方向的位移实现逐行扫描，Z方向的运动实现逐层扫描。图4解释了对一个样品进行逐行逐层扫描的过程。一般情况下，切片的宽度ΔY要小于显微成像的视场宽度，而刀具7刀刃的宽度W要大于ΔY。根据ΔY，在样品同一层中，可以分成若干个样品条带34，进一步分为已加工表面30和未加工表面20。切片时，因为所述刀具的运动和所述加工液循环装置的泵吸作用，会在在所述刀具刀体的上方产生稳定的水流场，压迫切片产生的样品薄片29紧贴刀背滑动。越靠近刀刃，这种滑动运动越稳定；越远离刀刃，样品薄片运动将不受控制。

图3为成像模块和机械加工模块的偶联部分，它是本专利的核心部分。图中，样品11和刀具7在X方向上发生相对位移，实现刀具对样品顶层部分的切片，切片厚度ΔZ由三维移动平台在Z方向上步进有关。切片时，待切片的样品部分28逐渐被刀具切割脱离，成为薄片29，因为所述水流场作用，样品会贴在刀具背面滑动。这时，刀具可以看成是一个“载玻片”，承载了一块样品薄片，而物镜18靠近这个载玻片到合适位置成像。结合图4，由于是线采集，成像的区域是一条线，称为扫描线32，它离切割线31越近越好。这里，刀背与水平面的夹角α控制在30°～45°，物镜光轴垂直于刀具刀背平面，与X轴的夹角为β见图2，因此有关系式α+β＝90°。成像时，照明光26从物镜中射出，被物镜汇聚在扫描线附近，产生后向散射光，这些光只有部分27原路返回进入物镜镜头。所以，也只有当α+β＝90°时，成像的效率最高。

由图3的物镜向外延伸，将过渡到图2，即本发明的成像光路图。成像光路的主体部分是一个被虚线框住的显微镜照明器，它可以为各大显微镜厂商的定型产品，也可以用开架的光学元器件代替。当使用直接采购的显微镜照明器时，它将为光源21、CCD20、目镜镜筒25等提供标准固定接口(连接时可能需要添加额外的连接器件)。同时，在该照明器中可以放置滤光片、光阑23、分束镜22等光学元器件。显微镜照明器通过特制支架固定在工作台的垂直工作台上，而且要保证照明和成像光路均平行于XZ平面。

所述光源21可以为汞灯、卤素灯、金属卤化物灯、激光器这样的常见光源。所述反射镜21独立固定在垂直工作台上，镜面垂直于XZ平面，与XY平面的夹角为γ＝45°+β/2。反射镜将照明光反射到物镜18，也将成像光反射进所述照明器中。

通过上述配置，照明光由所述光源21产生，经过所述光阑23后成为一个片状光束，在所述照明器内部分束镜22的反射下沿Z方向落射到所述反射镜21上，再由反射镜将光束沿光轴方向射入所述物镜18中，实现对所述样品的照明。成像光原路返回回到物镜中，透过分束镜22，并最后在照明器上方形成像平面。CCD相机20的传感器位于这个成像平面上，实现数据采集。在成像过程中，照明光在光阑23、分束镜22和物镜18处会发生损失，成像光在分束镜22和24处会发生损失。

所述CCD相机为线扫描，某一时刻，仅对扫描线32处的样品薄片成像，该扫描线与XZ平面垂直，并经过物镜成像焦点。CCD相机通过数据线与所述图像记录卡相连，视频记录卡安装在所述图形工作站中。在视频记录卡配套软件的控制下，CCD相机采集到的图片最后被保存在图形工作站硬盘中。CCD相机、视频记录卡的传输协议必须一致，它们与图形工作站的速度必须匹配，否则会丢失数据。

另外，CCD相机必须通过一根信号线与所述三维移动平台同步，CCD相机的每一次曝光需要等待三维移动平台发出的触发信号。这里提出两个要求，一是三维移动平台必须能够产生与运动状态耦合的触发信号，二是CCD相机可以由外部信号触发拍照。当所述机械加工模块、成像模块、数据采集模块协调工作时，即可扫描式地对一个完整样品进行断层层析成像。

样品大小与刀具宽度和成像视场无关，仅受水槽尺寸限制，而水槽大小受三维移动平台承载能力的限制。Y方向的成像精度与成像模块的分辨力有关，Z方向的精度和三维移动平台有关，而X方向的成像精度与上述两个因素都有关系，可以根据具体的精度要求选择配置。本发明在较低的精度要求下，比如＞50μm时，对样品、刀具均无特殊限制，但对于微米级和亚微米级切片与成像，必须使用材质均匀的样品，并配置特制的金刚石刀具。

具体实施例

下面给出的示例在树脂包埋的生物组织上实现亚微米级切片和成像。

示例采用一套组合的大理石工作台，垂直工作台也为大理石材质，与平台一体。三维移动平台采用加拿大Aerotech公司生产的系列精密移动平台组合而成，第一级为X方向上的空气轴承移动平台，第二级为Z方向上的升降台，第三级为Y方向上的静压导轨平移台，三套一维移动平台均达到了100nm的编程精度。刀具选用是瑞士安东麦耶尔公司生产的系列金刚石刀具，金刚石刀刃角度为40°，其刀刃长度为3mm，刀柄用螺钉固定在刀具连接上，而刀具连接牢固固定在大理石垂直工作台上。加工液循环装置中的水泵采用深圳市精密微型齿轮泵有限公司生产的微型齿轮泵，额定电压为直流24V，最大排量10mL；过滤器为普通家用饮水机过滤器。加工液为普通去离子水，样品为树脂包埋的小昆虫。

成像模块的所有光学主件均来自日本Olympus公司，夹具和平移台等配件来自北京赛凡光电公司。其中，显微镜照明器来自BX61系列荧光显微镜，光源采用高寿命的金属卤化物灯，物镜采用复消色差40X水镜。

CCD采用加拿大Dalsa公司的系列线CCD，像素达到4096，色深10bit。视频记录卡为加拿大Matrox公司的Solios系列，并使用配套的控制软件。图形工作站使用HPxw6200，内存达到2GByte，硬盘空间1TByte。

用本发明中的方法对所述树脂样本(尺寸为1×1×2cm)进行扫描切片，薄片宽度为0.5mm，厚度为0.5μm，因此每层至少要20次进刀才能切完，整个样品会被切成4万层。

先连接***，打开除水泵之外的所有电源。在样本槽中加水至没过样本1cm，调整物镜直到观察到清晰的刀刃图像，再将刀刃调节到偏离视场中心20μm的刀背上。用三维移动平台的控制软件将刀具移动到起始对刀位置，保证第一次进刀时刀具在Y方向刚好切到样品。然后开启水泵，等待水位稳定，如水位变化太大，补充或排掉差额部分。运行控制三维移动平台运行的G语言程序，开始加工样本。在该程序中已设置好切片宽度(0.5mm)，切片厚度(0.5μm)，X方向行程(20mm)和每一层的进刀数(22，多余的2个为了确保安全)。

***完全开动以后，样本随平台沿X方向运动，刀具固定不动。刀具完成一个X方向的相对进刀(刀具为静止)，再退回该次进刀起始位置，Y移动平台紧接着由内向外偏移0.5mm，继续下一次进刀，即逐行切片。22次进刀之后，这一层的样本将被切完，刀具回到该层起始坐标。接着，Z移动平台上升0.5μm，继续下一层的切片，以此循环往复，逐层切片。加工过程产生的样本残渣会被加工液循环装置抽走并过滤回收，保证加工槽中加工液的清洁。

成像与切片同步。在视频记录卡配套软件的控制下，每一次进刀将产生大量数据，保存在计算机的主存中，同时，计算机用另一个进程将主存中的数据压缩保存到计算机硬盘中，保存格式为JPEG。

Claims (3)

1.一种显微光学扫描层析成像装置，其特征在于，该***包括机械加工模块，成像模块和数据采集模块，所述机械加工模块用于实现对样品的扫描式切片，成像模块用于对刀具刀刃附近的样品成像，数据采集模块用于实现对样品的成像结果的采集和记录；

所述机械加工模块，包括数控三维移动平台、刀具和刀具连接、加工槽、加工液循环装置、移动平台驱动器和控制电脑；所述数控三维移动平台底部固定在防震工作台面上，由三个一维直线移动平台沿竖直方向层叠，在所述移动平台驱动器和所述控制电脑的控制下，三维移动平台分别实现左右X轴向、前后Y轴向和升降Z轴向三个正交方向的运动；所述数控三维移动平台上还安装一个垂直工作台，它与所述防震工作台面牢固固定，能够承载重物；样品固定在所述加工槽中，加工槽底部固定在所述三维移动平台顶部，加工槽中盛放加工液，加工槽底部设置两个通孔，用于排空加工液和接收净化后的加工液；所述刀具由刀体和刀柄组成，所述刀体固定在刀柄上，而刀柄通过所述刀具连接固定在所述垂直工作台上，所述刀柄中设计第二通孔，所述第二通孔底部出口位于所述刀刃上方，通孔顶部出口用作所述加工液循环装置的取水口，所述刀具刀刃宽度大于成像模块的视场大小，刀刃方向平行于所述Y轴方向，刀背与水平面的夹角为α，α为锐角；所述加工液循环装置通过微型水泵驱动，从所述刀柄上的取水口吸取加工液，在完成一次过滤后，通过所述加工液回流口送回加工槽中；

所述成像模块，包括一台显微镜照明器，以及反射镜、物镜、光源、光阑、滤光片、分束镜；所述显微镜照明器通过支架固定在所述垂直工作台上，使照明和成像光路均平行于XZ平面；所述显微镜照明器包括连接光源、CCD、目镜镜筒的标准固定接口，所述滤光片、光阑、分束镜放置在该显微镜照明器中；所述物镜固定在所述垂直工作台上，其光轴垂直于所述刀具刀背平面，并处于所述显微镜照明器的照明和成像平面上，与X轴的夹角为β，满足关系式α+β＝90°；物镜成像焦平面几乎与刀背平面重合，焦点落在靠近刀刃的位置；所述反射镜固定在所述垂直工作台上，其镜面垂直于XZ平面，与XY平面的夹角为γ＝45°+β/2，反射镜将照明光反射到所述物镜，将成像光反射进所述照明器中；所述光源产生的照明光经过所述光阑后成为一个片状光束，在所述照明器内部分束镜的反射下沿Z方向落射到所述反射镜上，再由反射镜将光束沿光轴方向射入所述物镜中，实现对所述样品的照明；所述样品经照明后沿原路返回的后向散射光用来成像，一部分光会透过所述分束镜，并最后在所述显微镜照明器上方形成像平面；

所述数据采集模块，包括线扫描CCD相机、视频记录卡和图形工作站；所述线扫描CCD相机的传感器位于所述显微镜照明器的成像平面上，用于数据采集；所述线扫描CCD相机通过数据线与所述视频记录卡相连，视频记录卡安装在所述图形工作站中；所述线扫描CCD相机通过信号线与所述数控三维移动平台同步，线扫描CCD相机的每一次曝光需要等待所述数控三维移动平台发出的触发信号。

2.根据权利要求1所述的显微光学扫描层析成像装置，其特征在于，所述刀具刀背与水平面的夹角α为30°～45°。

3.根据权利要求1或2所述的显微光学扫描层析成像装置，其特征在于，所述CCD相机为线扫描，某一时刻，仅对扫描线处的样品薄片成像，该扫描线与XZ平面垂直，并经过物镜成像焦点。

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