CN103376238B - 一种代谢信息获取方法及装置 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种代谢信息获取方法及装置，属于光学显微成像技术领域。所述方法通过构建低温环境快速固定待检样本；通过断层铣削技术与光学显微成像技术相结合，逐层铣削待检样本，同时通过光学显微成像技术获取待测样本的代谢信息。所述装置包括：光学显微成像模块、低温环境控制模块以及样品铣削模块相结合。本发明提供的代谢信息获取方法及装置，具有采集高效及运行成本低等优点，有利于大规模推广使用。

Description

一种代谢信息获取方法及装置

技术领域

本发明属于光学显微成像技术领域，特别涉及一种代谢信息获取方法及装置。

背景技术

功能代谢信息的监测是了解生物体内在机制以及相关疾病发展过程的重要手段。目前，生化分析技术、正电子发射层析术、功能磁共振、磁共振波谱以及光学成像等手段被广泛用于组织功能与代谢信息的测量。上述技术手段虽然能够得到活体组织的三维功能代谢信息，但受到技术手段的限制，这些技术的造价、运行成本以及技术复杂度均比较高，不利于推广与大规模使用。

光学成像方法是一种获取高分辨功能代谢信息相对经济的技术手段，但针对活体生物组织的连续测量，其受生物组织高吸收、高散射特性的影响，只能获取活体组织有限体积的功能代谢信息。如果要准确高分辨地获取生物组织的三维内在信息，特别是针对功能与代谢信息，需要在成像前对生物组织的结构和状态进行有效的固定，然后再对生物组织切片或铣削断面进行测量。机体死亡或组织离体后其功能代谢信息逐渐偏离活体状态。快速低温冷冻是固定组织功能代谢的主要手段之一。通过低温处理，可以停止生物组织内在的生化反应，避免组织离体后发生的自溶与酸化等过程，此外还可以显著增强生物分子的荧光特性，提升***探测灵敏度和信噪比。

传统的冰冻切片机切片时样品的温度在-20℃左右，在该温度下样品的生化反应是不能有效停止的，另外该温区冰晶对样品结构的损害比较严重，不利于功能代谢信息的准确获取。现有技术中，已有结合大型柜式低温冰冻切片机与光学显微镜方法，温度控制的区间为-30℃至-80℃。柜式冰冻切片机的设备成本也较高，在运行过程中压缩机等核心器件的震动显著不利于高精度成像。该方法针对低温介质快速低温固定的样品，需要先经历一个缓慢的梯度复温过程；但是该复温过程不仅耗时冗长，还可能造成生物样品结构的破裂以及功能代谢状态损坏。此外生物组织内冰晶形态的变化会影响光学成像***高分辨、高稳定地获取功能代谢信息。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种待检样本的三维结构及其功能代谢信息的获取方法和装置，能够避免温度波动对待检样本的结构及功能代谢信息的损害。

为解决上述技术问题，本发明提供了一种代谢信息获取方法，包括以下步骤：

通过液态低温介质固定待检样本，并维持所述待检样本处于稳定的低温状态；

保持所述待检样本断面高于所述液态低温介质的液面，通过光学显微成像方法，获取表征代谢信息的所述待检样本的断面图像；

将所述待检样本断面浸入所述液态低温介质中，通过机械铣削减小所述待检样本的厚度，重新获取铣削后的所述待检样本的断面图像。

进一步地，所述通过光学显微成像方法，获取表征代谢信息的所述待检样本的断面图像的步骤具体为：通过光致发光技术激发所述待检样本的生物分子的荧光特性，利用光学显微镜获取所述待检样本的生物分子的荧光现象的图像。

进一步地，所述液态低温介质的沸点低于-100℃。

进一步地，所述液态低温介质为液氮。

进一步地，所述待检样本断面高于或浸入所述液态低温介质的液面的步骤具体是通过调节所述液态低温介质的液面高度来实现。

本发明还提供了一种代谢信息获取装置，包括：低温环境控制模块、光学显微成像模块以及样品铣削模块；

所述低温环境控制模块包括：样本槽和液位调节单元；所述样本槽内承载有液态低温介质，待检样本通过所述液态低温介质固定在所述样板槽内，并维持所述待检样本处于稳定的低温状态；所述液位调节单元调节所述样本槽内的液态低温介质的液面高度；

所述光学显微成像模块包括：光源、波导、第一滤光片、显微镜、光学探测器以及图像采集单元；所述光源发出的入射光通过所述波导照射到所述待检样本的断面上；所述光学探测器依次通过所述第一滤光片以及所述显微镜获取断面的图像，并传输给所述图像采集单元；

所述样品铣削模块包括：机械铣削设备以及平移台；所述机械铣削设备置于所述平移台上方；所述样本槽置于所述平移台上。

进一步地，还包括：光耦合模块；所述光耦合模块包括：第二滤光片、二色镜和凸透镜；所述光源发出的入射光依次穿过所述第二滤光片、所述二色镜和所述凸透镜耦合到所述波导中。

进一步地，所述光学探测器为CCD相机或者CMOS相机；所述图像采集单元包括：图像采集卡和图形工作站；所述图像采集卡分别与所述光学探测器和所述图形工作站相连。

进一步地，所述光源为卤素灯或者LED灯或者汞灯发出的非相干光或者激光发出的相干光源。

进一步地，所述液位调节单元包括：浮子以及浮子导轨；所述浮子导轨设置在所述样本槽内侧壁上；所述浮子侧壁嵌于所述浮子导轨中，可沿所述浮子导轨运动。

本发明提供的代谢信息获取方法及装置，通过高分辨率的光学成像方法获取通过低温固定的大样本断面的结构及其荧光效应的图像，并通过高精度的图像采集单元处理得出待检样本的结构信息和功能代谢信息；通过样品铣削模块逐步铣削整个待检样本，同时获取每个断面的结构信息和代谢信息，从而获取完整的待检样本的三维结构及功能代谢信息；通过超低温的液态低温介质固定待检样本，从而完整地保持好待检样本生物组织的代谢过程及其结构；过程中，通过液态低温介质维持待检样本的超低温状态，从而为准确地获取待检样本的代谢及结构信息提供了良好保障。

附图说明

图1为本发明实施例提供的液位调节单元结构示意图；

图2为本发明实施例提供的光学显微成像模块的结构示意图；

图3为本发明实施例提供的代谢信息获取方法流程图；

其中，1-浮子，2-样本槽，3-浮子导轨，4-待检样本，5-光源，6-第二滤光片，7-二色镜，8-凸透镜，9-波导，10-第一滤光片，11-图像采集单元。

具体实施方式

本发明实施例提供的一种代谢信息获取方法，通过超低温的液态低温介质进行低温冷冻，快速固定待检样本的生物组织；应用生物组织分子的光致发光现象来获取待检样本生物组织的多功能代谢信息；以及，结合机械铣削技术获取大样本的整体三维功能代谢信息。

本发明实施例的代谢信息获取方法，包括如下步骤：

S1：通过液态低温介质固定待检样本，并维持待检样本处于稳定的低温状态。

为了准确地获取生物组织的内在信息，特别是功能与代谢信息，需要对生物组织的结构和状态进行有效的固定。机体死亡或组织离体后其功能代谢信息逐渐偏离活体状态，有效的组织固定与状态维持是稳定准确获取功能与代谢信息的关键之一。

快速低温冷冻方式是固定组织功能代谢的重要手段。通过低温处理，可以停止生物组织内在的生化反应，避免组织离体后发生的自溶与酸化等过程，此外还可以显著增强生物分子的荧光特性，提升***探测灵敏度和信噪比。

在不影响生物组织稳定性的前提下，低温快速固定的温度越低，生物组织内生化反应的速度越能及时得到遏制，组织内部的功能和代谢信息将会更加完整的固定。液态低温介质的温度越低，其对生物组织的固定效率越高。

液氮作为一种典型的液态低温介质广泛的用于降温、冷冻操作中；液氮是惰性的，无色，无嗅，无腐蚀性，不可燃，温度极低，用于生物组织的固定安全可靠且稳定性强。液氮的沸点为-196°C，汽化时大量收热，因此能够快速固定待检样本。

待检样本的代谢与功能信息通过观察手段获取，为了避免其他中间介质对观察的影响。本实施例中，待检样本曝露在空气中通过光学显微成像方法观察并记录功能和代谢信息。曝露在空气中的待检样本会出现持续吸热导致温度升高，进而影响到待检生物组织样本的固定。

待检样本的观察操作将延长待检样本在空气中的曝露时间，为了维持固定的待检样本的稳定性，通过液态低温介质持续冷冻待检样本，在其周围形成稳定的低温场，降低待检样本的吸热效率，从而维持待检样本的稳定性。

待检样本的快速固定通过液态低温介质接触吸热完成，为了避免形成低温场的液态低温介质与快速固定用液态低温介质出现物理不相容或者化学反应，造成待检样本的固定不稳甚至生物组织破坏；维持待检样本稳定的液态低温介质优选为快速固定用液态低温介质；此操作，维持待检样本稳定性的同时，也简化了整个获取代谢信息的流程，降低了运行成本。

优选的，液氮作为稳定的惰性液态低温介质，能够气化吸热，从而在待检样本的周围形成一个稳定的低温氮气屏障，鉴于液氮的持续吸热气化，低温氮气屏障也处于稳定状态，将很好地维持曝露在空气中的被观察断面的固定状态。同时，气态氮无色，且与空气相融，对于待检样本的观察不造成影响。

S2：保持待检样本断面高于液态低温介质的液面，通过光学显微成像方法，获取表征代谢信息的待检样本的断面图像。

在步骤S1中，通过液氮维持待检样本固定的稳定性；通过气化的低温氮气保证被观察的待检样本断面的稳定。为了进一步增强对断面的保护，可以将待检样本整体置于液态低温介质中，仅将被观察的部分曝露在空气中，在低温氮气屏障的基础上通过待检样本自身的温度梯度维持被观察断面的低温，将更好地保证被观察断面的稳定性。

本实施例中通过光学显微成像方法观察待检样本断面，并记录获取待检样本的功能代谢信息和组织结构信息。

光学成像方法是高分辨获取生物组织功能代谢信息的有效途径，通过测量生物组织吸收、散射以及荧光等相关信息，可以精细地表征组织结构、功能以及代谢状态。

本实施例中，将根据所要获取的代谢或者功能信息的类型需要，通过光源向待检样本投射不同波长的入射光，从而激发待检样本断面的生物组织的光致发光现象；通过光学显微镜以及相应的图像捕捉、记录和分析设备对生物组织发出的光进行分析，最后获取所要得到的功能代谢信息。

通过激发生物组织的光致发光现象来获取生物组织的功能代谢信息，操作简便，效率高，同时其运行的经济与技术成本相对于生化分析技术、正电子发射层析术、功能磁共振和磁共振波谱等手段较低，更利于广泛推广。

S3：将待检样本断面浸入液态低温介质中，通过机械铣削减小待检样本的厚度，重新获取铣削后的待检样本的断面图像。

为了获取待检样本的整体功能代谢信息和组织结构信息，需要将待检样本逐层铣削。根据不同待检样本的需要逐层铣削待检样本，配合光学显微成像观察，从而获取若干不同断面的功能代谢信息和组织结构信息，拼凑出整个待检样本的三维的功能代谢信息和组织结构信息。

生物组织的铣削通过机械铣削设备完成，根据不同的精度需要，可以选用不同类型的铣削设备。

鉴于机械铣削对于介质要求不高，在进行铣削操作时，待检样本可以浸入到液态低温介质中，进一步地缩短待检样本在空气中的时间，严格控制待检样本的吸热，维持其稳定性。

依次重复执行步骤S2和S3，在完成待检样本的断面观察之后，铣削待检样本，减小其厚度，形成另一个新的断面，再观察，直到将整个待检样本观察，铣削完毕，获取待检样本的完整的功能代谢信息和组织结构信息。

在执行待检样本的断面观察和铣削操作时，液态低温介质的液面分别位于断面之下和断面之上；通过液态低温介质吸收铣削过程产生的热量，同时严格缩短待检样本曝露在空气中的时间，对维持固定样本的稳定性具有积极意义。

为了实现上述方法，本发明实施例还提供了一种代谢信息获取装置，包括：光学显微成像模块、低温环境控制模块以及样品铣削模块；低温环境控制模块通过液态低温介质快速固定待检样本，并维持待检样本的低温环境；光学显微成像模块用于激发待检样本的光致发光现象，并捕捉、记录分析断面图像，从而获取功能代谢和组织结构信息；样品铣削模块用于逐层铣削待检样本，从而获取待检样本完整的三维功能代谢以及组织结构信息。

参见图2，光学显微成像模块包括：光源5、波导、第一滤光片10、显微镜11、光学探测器以及图像采集单元；光源5发出的入射光通过波导9照射到待检样本4的断面上；光学探测器依次通过显微镜以及第一滤光片10获取断面的图像并传输给图像采集单元处理。

光源5用于产生入射光，可以选用激光或者卤素灯或者LED灯或者汞灯发出的非相干光；鉴于不同的生物组织分子的荧光特性所需要入射光的激发波长不同，在入射光投射到断面之前先通过相匹配的滤光片，从而保证只留下需要的波长的光，避免了干扰，准确地获取所需要的代谢信息。

优选的，还可以根据观察需要选取各种波长的单光源，耦合投射到待检样本的断面上，从而增强荧光反应的强度，便于观察。

优选的，本实施例的装置还包括：光耦合模块；光耦合模块包括：第二滤光片6、二色镜7和凸透镜8；光源5发出的入射光依次穿过第二滤光片6、二色镜7和凸透镜8耦合到波导中，从而选出一种或者几中所需要的波长的入射光。

入射光投射到断面上激发光致发光现象，生物组织的光致发光现象发出的荧光信号由光学探测器通过显微镜捕捉并记录在图像采集单元中，以供后期分析使用。在荧光信号进入显微镜之前，通过第一滤光片10，去除干扰光信号。

为了保证捕捉的图像的高质量，优选的，光学探测器选用CCD相机或者CMOS相机。

匹配高分辨率的CCD相机或者CMOS相机，图像采集单元包括：图像采集卡和图形工作站。图像采集卡用于配合CCD相机或者CMOS相机捕捉高分辨率断面图像；并将存储的图像资料发送给图形工作站进行后期分析。通过专门的图形工作站能够高效地分析捕捉到的图像信息，进而得到功能代谢信息和组织结构信息。

样品铣削模块包括：机械铣削设备以及平移台；机械铣削设备置于平移台上方；样本槽置于平移台上。

机械铣削操作通过专门的机械铣削设备，在保证铣削精度的基础上，高效完成。为了便于铣削操作，还可以增设平移台，将待检样本置于平移台上，通过三维定位调节方便铣削操作。

参见图1和图2，低温环境控制模块包括：样本槽2和液位调节单元；样本槽2承载待检样本4；样本槽内承载有液态低温介质，待检样本4通过液态低温介质固定在样板槽2内，并维持待检样本4处于稳定的低温状态；液位调节单元调节样本槽2内的液态低温介质的液面高度，从而通过调节液态低温介质的液面高度保证待检样本在非观察操作时，浸入液态低温介质中，严格控制其吸热时间，维持固定的待检样本4的稳定。待检样本的快速固定以及低温的维持通过其内置的液态低温介质实现。为了实现本实施例方法步骤S3和S4中的液位调节，样本槽2内增设液位调节单元。液位调节单元包括：浮子1以及浮子导轨3，如图1所示；浮子导轨3设置在样本槽2内侧壁上；浮子1侧壁嵌于浮子导轨3中，可沿浮子导轨3运动。当需要调节液位高度时，调节浮子1沿浮子导轨3移动，调节浮子1浸入液态低温介质的体积即可。

实际操作中，液态低温介质会在空气中吸热气化损失，为了保证待检样本的低温环境，可以配套设置杜瓦和低温输液管道，实时向样本槽中补充损失的液态低温介质。

参见图3，本发明实施例提供的代谢信息获取的操作流程：利用液态低温介质与待检样本接触来实现待检样本原位状态的固定，大样本的固定往往还需要采取一些优化低温场扩散的措施或方法，从而避免固定不及时导致的组织功能代谢状态发生改变；将待检样本使用包埋剂包埋，随后包埋块被固定到样本槽底部；向待检样本槽中注入一定量的液态低温介质，并放置一段时间，以样本槽中低温介质液面不再沸腾且平稳处于所需高度为限。液态低温介质是整个***的低温源，距离待检样本断面的液面高度决定了待检样本断面面的温度，液面高度的控制精度决定了待检样本断面的温度波动幅度；平移台拖动样本槽将待检样本移动到成像位置的同时，液位调节单元将液态低温介质的液面调整到待检样本断面以下；依靠温度传感器或者其他物理量传感器探测待检样本槽内液面的高度，调节液面达到指定高度；光学成像模块获取待检样本断面荧光图像和结构图像并存储；平移台将待检样本移动到铣削位置的同时，液面调节装置将低温介质液面调节到待检样本断面以上一定高度；平移台配合铣削装置完成对待检样本厚度的减少。重复上述操作，直至待检样本被切削完毕。

下面以线粒体为例来说明本实施例的方法及装置。以获取生物组织能量代谢信息作为实施例。

通过获取线粒体能量供应链上两种辅酶物质NADH和FAD的荧光强度来得到表征能量代谢信息的氧化还原比率值Redox=FAD/(FAD+NADH)。

光源使用Thorlabs公司生产的M455L2,M365L2两款LED以及Olympus公司生产的卤素灯，其中LED分别用于提供FAD和NADH的激发光场，卤素灯与装有中心波长在550nm和630nm的滤光片的转轮配合提供绿光和红光照明，蓝光照明由M455L2提供。波导采用Edmundoptics生产的环形光波导。光学显微成像模块采用经典的显微成像光路，即显微镜与CCD相机配合的方式。显微镜和CCD相机配有相应的发射滤光片转轮。显微镜采用Olympus公司生产的SZX10型显微镜，物镜为DFPL0.75X-4型。CCD相机采用QImaging公司生产的Retiga4000型。平移台选自北光世纪的MRS300型。依据低温下生物待检样本硬度显著增加以及大待检样本的需求，选择铣削的方式来对大待检样本进行加工，具体采用Walter公司的炮塔铣床装配立式硬质合金铣刀来完成对大待检样本断面的加工。

待检样本槽采用夹层式设计，采用铝合金和发泡剂制备而成。低温介质采用液氮。待检样本槽上方采取密封措施防止周围环境中的水汽进入成像环境。成像过程中，液氮液面控制在待检样本断面以下1cm左右。待检样本断面的温度可控制在-165℃。铣削时，液面调节单元将液面调整到待检样本断面以上约5mm。液面高度监控由温度传感器或液面传感器实现。

所选铣刀直径为22mm，每次平移台上升的高度为1-500μm，待铣削后形成新的待检样本断面时，进入成像程序。显微镜变倍体设置为1倍，整个成像***的放大倍数为0.75，成像视场大小为2cmX2cm，分辨率为19μm。当视场缩小时或采用其他光学成像模式，则可获得亚微米水平的能量代谢信息。***获取一断面NADH和FAD荧光图像以及三波段反射光图像的时间需要1分钟，待检样本断面去除所需时间为2分钟。另外，相比于采用冰柜来实现温度控制，液氮为介质可以更高效低成本地构建更低温度的待检样本稳定维持环境，从而使得获取的代谢信息更加精确和灵敏。***对待检样本进行连续断面处理和断面成像，即可实现对整个大待检样本组织能量代谢信息的获取。

本发明实施例的方法通过超低温液态介质快速固定待检样本，完整地保留待检样本的功能代谢及组织结构信息；并通过液态低温介质在待检样本周围形成低温场，降低曝露在空气中的待检样本的吸热效率，维持待检样本的稳定性；通过调节液态低温介质的液面高度，在进行断面观察时降低液面高度，将断面曝露在空气中；在铣削操作时升高液面高度，将断面浸在液态低温介质中，隔绝空气，从而缩短待检样本的吸热时间，进一步的增强了固定的待检样本的稳定性；结合光学显微成像技术和机械切削技术完成待检样本的三维功能代谢信息和组织结构信息的获取。本发明实施例提供的配套装置，为上述方法的实现提供了装备基础，降低了运行成本，使本发明实施例的方法能够广泛推广。

最后所应说明的是，以上具体实施方式仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照实例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (8)

1.一种代谢信息获取方法，其特征在于，包括以下步骤：

通过液态低温介质固定待检样本，并维持所述待检样本处于稳定的低温状态；

保持所述待检样本断面高于所述液态低温介质的液面，通过光学显微成像方法，获取表征代谢信息的所述待检样本的断面图像；

将所述待检样本断面浸入所述液态低温介质中，通过机械铣削减小所述待检样本的厚度，重新获取铣削后的所述待检样本的断面图像；

其中，所述重新获取铣削后的所述待检样本的断面图像，是指在完成所述待检样本铣削后，将所述待检样本的断面移出所述低温介质后获取其断面图像；

所述通过光学显微成像方法，获取表征代谢信息的所述待检样本的断面图像的步骤具体为：通过光致发光技术激发所述待检样本的生物分子的荧光特性，利用光学显微镜获取所述待检样本的生物分子的荧光现象的图像；

所述低温介质停止待检样本生物组织内在的生化反应，避免组织离体后发生的自溶与酸化过程。

2.如权利要求1所述的代谢信息获取方法，其特征在于：所述液态低温介质的沸点低于-100℃。

3.如权利要求2所述的代谢信息获取方法，其特征在于：所述液态低温介质为液氮。

4.如权利要求1所述的代谢信息获取方法，其特征在于：所述待检样本断面高于或浸入所述液态低温介质的液面的步骤具体是通过调节所述液态低温介质的液面高度来实现。

5.一种代谢信息获取装置，其特征在于，包括：低温环境控制模块、光学显微成像模块以及样品铣削模块；

所述低温环境控制模块包括：样本槽和液位调节单元；所述样本槽内承载有液态低温介质，待检样本通过所述液态低温介质固定在所述样本槽内，并维持所述待检样本处于稳定的低温状态；所述液位调节单元调节所述样本槽内的液态低温介质的液面高度；

所述光学显微成像模块包括：光源、波导、第一滤光片、显微镜、光学探测器以及图像采集单元；所述光源发出的入射光通过所述波导照射到所述待检样本的断面上；所述光学探测器依次通过所述第一滤光片以及所述显微镜获取断面的图像，并传输给所述图像采集单元；

所述样品铣削模块包括：机械铣削设备以及平移台；所述机械铣削设备置于所述平移台上方；所述样本槽置于所述平移台上；

所述低温介质停止待检样本生物组织内在的生化反应，避免组织离体后发生的自溶与酸化过程。

6.如权利要求5所述的代谢信息获取装置，其特征在于，还包括：光耦合模块；所述光耦合模块包括：第二滤光片、二色镜和凸透镜；所述光源发出的入射光依次穿过所述第二滤光片、所述二色镜和所述凸透镜耦合到所述波导中。

7.如权利要求5所述的代谢信息获取装置，其特征在于：所述光学探测器为CCD相机或者CMOS相机；所述图像采集单元包括：图像采集卡和图形工作站；所述图像采集卡分别与所述光学探测器和所述图形工作站相连。

8.如权利要求5所述的代谢信息获取装置，其特征在于，所述液位调节单元包括：浮子以及浮子导轨；所述浮子导轨设置在所述样本槽内侧壁上；所述浮子侧壁嵌于所述浮子导轨中，可沿所述浮子导轨运动。