CN101412993A - 一种纳豆激酶固体发酵方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种纳豆激酶固体发酵方法。本发明采用自选纳豆激酶生产菌株加入鲜豆渣或干豆渣进行固体发酵，经灭菌-接种-发酵-干燥而成。发酵产物的纳豆激酶活性高，所用原料来源丰富、易取，提取工艺简便易行，节能环保。

Description

一种纳豆激酶固体发酵方法

技术领域

本发明属于微生物技术领域，涉及纳豆激酶高产菌株和纳豆激酶的固体发酵方法。

背景技术

纳豆激酶属于丝氨酸蛋白酶类，1987年日本学者须见洋行在纳豆中发现了这种与血栓溶解酶相类似的酶，将其命名为纳豆激酶(Nattokinase，NK)。纳豆激酶通过直接溶解人体内的血纤维蛋白，刺激静脉内皮细胞产生纤溶酶原，促进内源性t-PA的产生，从而有效地发挥溶栓效果。须见洋行后来证实，纳豆激酶经食用到血液内后在5-8小时的长时间内也很稳定，是一种安全、高效的具有纤溶活性的酶制剂。之后的很多研究相继证明了纳豆激酶可以用作针剂、口服用的溶栓治疗，亦可用于保健品，是很有潜力的溶栓制品。

纳豆激酶的生产方法主要以发酵为主，现行的发酵工艺有液体发酵和固体发酵，其中液体发酵使用的较多。最早的纳豆激酶液体发酵是用野生的纳豆菌，发酵产物中纳豆激酶的产量极低，提取工艺复杂，并且野生纳豆菌的性能很不稳定，对纳豆激酶的生产产量和成品质量影响很大。近些年来，不同的液体发酵方法多见报道，比如申请号为02116667的发明专利申请、申请号为02121352.6的发明专利申请、申请号为200610129353.7的发明专利申请、以及《纳豆激酶液态发酵工艺优化》和《纳豆菌B-12产纳豆激酶条件及酶学性质研究》等文章，分别介绍了不同的液体发酵制备纳豆激酶的方法，所用主要原料有大豆、玉米粉、酵母膏、大豆蛋白胨、多糖类物质、蛋白胨查氏琼脂、桑塔斯琼脂、牛肉浸汁琼脂、黄豆粉琼脂或葡萄糖酵母精琼脂等有机培养基，有些研究中还加入某些无机离子甚至中药。这些方法所用原料成本较高，酶活也都不很理想，现有报道液体发酵单位产纳豆激酶活性最高的实验室结果，其单位发酵酶活可以达到4300IU/mL。而现有固体发酵生产纳豆激酶的方法酶活在几百到两千IU/g不等，因此纳豆激酶实现大规模产业化生产受到一定的限制。

本发明的目的是针对上述纳豆激酶制备上的不足，提出一种采用自己筛选的纳豆激酶高产菌株，进行纳豆激酶固体发酵的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种纳豆激酶的固体发酵方法，采用自选纳豆激酶生产菌株dcfu001，以豆渣为培养基进行固体发酵，经灭菌—接种—发酵—干燥而成，所用豆渣可以是鲜豆渣或干豆渣。

本发明所用纳豆激酶生产菌株为从市售豆豉中筛选得到的高产菌株，经生理生化分析和16sRNA鉴定，确定为枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)，属于益生菌菌株，定名为dcfu001。该菌株于2008年9月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会的普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为2663。

本发明的目的通过以下技术方案达到：

1.dcfu001的分离和鉴定

1)分离：

选取市售豆豉为原料，按如下方法分离出不同产品中的纳豆激酶产生菌：取待分离样品10克，加入100mL灭菌水中，振荡，100℃沸水浴5分钟，静置片刻后取上层混浊液100μL，加入900μL灭菌水为10^-1，依次稀释到10^-3；同时制作LB平板。分别取10μL不同稀释度的溶液加到LB分离平板上，用玻璃刮铲涂布均匀，37℃倒置培养24小时，挑取单菌落进行两次划线培养。挑取LB平板上的单菌落点种在血纤维蛋白平板上，37℃培养18小时，测量溶解圈大小。最后取从5种产品中分离出的单菌落进行纤溶活性检测，获得2号菌株纤溶活性最高。

2)鉴定：

形态观察

在37℃培养24小时的LB平板上，2号菌株的菌落呈规则的圆形，边缘微有叶状齿，不透明。挑取单菌落，置载玻片上的生理盐水中，涂匀，风干后进行固定，经革兰氏染色后观察菌体形态。观察结果表明菌体呈短小杆状，长3.0-4.0μm，宽0.8-1.0μm，革兰氏阳性，染色均匀，可以形成芽孢，芽孢中生，椭圆形。

3)生理生化性质鉴定

参照伯杰氏细菌学鉴定手册对2号菌株的生理生化性质进行鉴定，结果如表1所示

表1.2号菌株的生理生化特征

4)16SrDNA分子测序鉴定

将2号菌株用细菌基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，然后利用16sRNA基因通用引物PCR扩增16sDNA；得到的PCR产物经DNA凝胶纯化试剂盒纯化，与pGM-T载体连接，转化DH5α感受态细胞；在含有抗生素、IPTG和X-gal的平板上挑取白色阳性克隆，LB液体培养后提取质粒DNA进行酶切鉴定；连接正确的阳性克隆送到宝生物工程(大连)有限公司进行16S rDNA测序。2号菌株的16S rDNA基因全序列测序结果(宝生物工程(大连)有限公司测定)如下：

GACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGGACAGAT

GGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGG

GTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATAC

CGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGC

TACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAAC

GGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCC

ACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAG

GGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAG

TGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGT

GCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCAC

GGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTG

TCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGAT

GTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAAC

TTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGC

GTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGT

AACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATAC

CCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTC

CGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTA

CGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGC

GGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGT

CTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCA

GAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTG

GGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTC

AGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGG

GGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCT

ACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCC

CACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGA

AGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTT

CCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACC

CGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTAGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGGGAC

AGATGATTGGGG(1470bp)。

将测得的2号菌株的16S rDNA的全基因序列与网上公布的16SrDNA碱基对序列进行比对，发现2号菌株的16S rDNA全基因序列与网上公布的枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌符合率均达到99％，与蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus ATCC 10987)符合率为94％，结合生理生化鉴定结果，判定2号菌株是为一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilus)。

综合上述形态观察、生理生化分析和分子测序鉴定的结果，表明2号菌是一株芽孢杆菌(Bacillus)，将其命名为dcfu001。

2.纳豆激酶的发酵：

1)灭菌：每500mL三角瓶加鲜豆渣培养基80-120g，121℃高压灭菌20min。

2)接种：接种了菌种dcfu001的LB斜面于37℃恒温培养箱，培养24h后，即为斜面菌种，在装有20mL液体LB种子培养基的250mL三角瓶中，接种一环斜面菌种，经37℃恒温摇床150转/min培养18h，得到种子培养液，每瓶灭菌后的培养基接种6-8mL种子培养液。

3)发酵：接种后的培养基入35℃恒温培养箱培养，间时拍打，使其均匀生长，发酵时间为72h，得到发酵产物。

4)干燥：将发酵产物冷冻干燥约24h即可。

3.纳豆激酶的提取和活性测定：

1)纳豆激酶的提取

将冷冻干燥后的发酵产物粉碎，取1克加入0.9％生理盐水5-10mL，混匀，4℃冰箱浸提4h以上，4500转/min离心20min，上清液即为固体发酵粗酶溶液(NK粗酶液)。

2)纤维蛋白平板法测定纳豆激酶活性：

纤维蛋白平板的制备：取溶化的1％琼脂7.5mL，50℃水浴保温5分钟后，加入100BP/mL凝血酶225μL，混匀，50℃水浴保温；5分钟后量取7.5mL牛纤维蛋白原溶液(3.6mg/mL)，倒入保温的凝血酶—琼脂溶液中，迅速混匀，倒入直径9cm的培养皿中，待凝。

标准曲线的绘制：取尿激酶标准品用无菌生理盐水稀释成20、40、60、80和100IU/mL。各取10μL点样于纤维蛋白平板，于37℃保温18h后，测定纤维蛋白平板上溶解圈的直径，取三次试验的平均直径计算溶解圈面积。以尿激酶活性(IU/mL)为横坐标，溶解圈面积为纵坐标，得到尿激酶标准曲线。

纳豆激酶活性测定：用微量加样器移取适量(5μL～10μL)NK粗酶溶液，点种于纤维蛋白平板上，做好标记，37℃保温18h，测量纤维蛋白平板上溶解圈的直径，计算溶解圈面积。与标准曲线对比，计算酶活力的大小，计算结果单位发酵平均酶活达5000IU/g以上，是现有固体发酵方法单位酶活的2-5倍。

4.纳豆激酶的分离纯化

1)过硫酸铵分级沉淀(初步浓缩、纯化)

在磁力搅拌下，向装有NK粗酶液的三角瓶中，缓慢加入研磨过的(NH₄)₂SO₄，至饱和度为25％，4℃冰箱中净置过夜，12000转/min离心20min，收集上清液，以便除去部分杂蛋白；按照同样的方法，向收集的上清液中继续加入研磨过的(NH₄)₂SO₄，至饱和度为75％，4℃冰箱中净置过夜，12000转/min离心20min，收集沉淀。

2)透析(除去初步纯化过程中的(NH₄)₂SO₄)

将上一步收集到的沉淀，用0.01M pH7.4的PBS溶解，装入透析袋，并置于含有0.01M pH7.4 PBS溶液的烧杯中，4℃冰箱透析除(NH₄)₂SO₄，期间不断更换PBS缓冲液，并静置过夜，以便彻底除盐。

3)Sephadex G-100层析纯化

取溶胀吸水后的Sephadex G-100装柱，注意防止柱床中留气泡的产生，以及由于装柱过程中凝胶沉淀速度不一致出现的断层现象；将透析后的NK溶液缓慢加入Sephadex G-100层析柱后，立即收集洗脱液，并控制流速，每5-10min收集一管，并按照洗脱顺序编号备用，直至用考马斯亮兰G-250洗脱液中检测不到蛋白质为止。

5.纳豆激酶的电泳分析

SDS-PAGE(检测纯化的效果)：分别将上述Sephadex G-100层析纯化后的洗脱液(每管约3mL)置于透析袋中，聚乙二醇10000浓缩10倍后，用纤维蛋白平板检测其纤溶酶活性，选出高活性样品5、6、7、8号，采用Tris-甘氨酸电泳***进行SDS-PAGE(12％分离胶和5％浓缩胶)，取电泳样品10μL，加样品缓冲液10μL(含100mmol/L Tris-HCl，pH6.8，10％巯基乙醇，4％SDS，0.01％溴酚蓝，20％甘油)，沸水浴3-5min使蛋白变性，即为SDS-PAGE电泳样品，电泳加样量为10μL。将分子量标准用同样方法进行处理。然后用25mA稳流电泳，约2h结束电泳，取下胶片，并在考马斯亮兰染色液(含45％甲醇，45％水，10％乙酸，0.25％考马斯亮兰)中染色1h，后用脱色液(含45％甲醇，45％水，10％乙酸)脱色至蛋白条带清晰可见(见附图)。结果如附图所示，泳道1为蛋白分子量标准，泳道2、3、4、5分别为Sephadex G-100层析纯化时收集的编号为5、6、8、7的样品，泳道6为过硫酸铵浓缩并透析后，未经层析纯化的样品。由附图可知，纳豆激酶的分子量约为33kD，这与文献中纳豆激酶分子量为28-36kD相符。

在我国，豆制品是人们的主要食品之一，全国每年的豆制品加工量相当大，豆腐、豆乳等大豆制品生产中，最大的副产品就是鲜豆渣，一般每加工1吨大豆可产生2吨鲜豆渣，据不完全统计，国内仅大豆食品行业每年就有2000吨鲜豆渣产生，总量占全豆干重的16-25％，是一种非常可观的资源。国外基本上是将豆渣干燥处理作饲料。由于鲜豆渣的含水量很高，干燥加工费用很高，国内的鲜豆渣部分被作为低价饲料，还有很多被废弃掉了，利用率很低，不仅造成很大的浪费，而且一些厂家还要为废弃豆渣而支付费用。本技术方案将豆渣用来制备纳豆激酶，使大量的鲜豆渣资源得到更好的利用，并大大提高了豆渣加工的附加值，同时为纳豆激酶的产业化生产提供了一种很好的方法。

本技术方案中的纳豆激酶高产菌株dcfu001是自选菌株，单位发酵酶活高达5000IU/g以上，远远高于现有报道的单位发酵酶活水平。将自选菌株dcfu001以豆渣为培养基进行纳豆激酶的生产，取得了高酶活的理想效果，尤其是以鲜豆渣作培养基是一种新的方法，到目前为止还未见有同类报道。

本技术方案的主要优势是采用了自选的纳豆激酶高产菌株dcfu001，以豆渣为培养基，尤其是以鲜豆渣作培养基进行固体发酵，获得了高纳豆激酶活性的发酵产物。本技术方案的原料来源丰富易取，成本低，无环境污染，在没有增加任何工艺复杂性的前提下，所产纳豆激酶的单位发酵酶活显著高于现有水平，为纳豆激酶产业化生产提供了技术支持。

具体实施方式

实施例1：

将接种了dcfu001的LB斜面于37℃恒温培养箱培养24h后，即为斜面菌种；在装有20mL LB液体培养基的250mL三角瓶中，接种一环斜面菌种，于37℃恒温摇床150转/min培养14h，得到种子培养液；

500mL三角瓶加入80g鲜豆渣，121℃灭菌15min，接入6mL纳豆芽孢杆菌dcfu001种子培养液，35℃恒温培养48h，间时拍打，使其均匀生长；发酵结束后，将发酵产物冷冻干燥并粉碎，测得纳豆激酶活性为5495.96IU/g。

实施例2：

将接种了dcfu001的LB斜面于37℃恒温培养箱培养24h后，即为斜面菌种；在装有20mL LB液体培养基的250ml三角瓶中，接种一环斜面菌种，于37℃恒温摇床150r/min培养14h，得到种子培养液；

500mL三角瓶加入20g干豆渣(使最终含水量的质量百分数为80％)水，121℃灭菌15min，接入6mL纳豆芽孢杆菌dcfu001种子培养液，35℃恒温培养48h，使其均匀生长；发酵结束后，将发酵产物冷冻干燥并粉碎，测得纳豆激酶活性为5311.72IU/g，单位发酵产NK活性与鲜豆渣发酵无显著差异。

SEQUENCE LISTING

<110>河南省科学院生物研究所有限责任公司

<120>一种纳豆激酶固体发酵方法

<130>

<160>1

<170>PatentIn version 3.4

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<211>1470

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<400>1

Claims (2)

1、一种纳豆激酶固体发酵方法，其特征在于采用自选纳豆激酶生产菌株，以豆渣为培养基进行固体发酵，经灭菌—接种—发酵—干燥而成。

2、关于权利要求一的一种纳豆激酶固体发酵方法，其特征在于所用菌株为自选纳豆激酶生产菌株dcfu001。

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