CN112921027A

CN112921027A - 利用固定化提高纳豆激酶热稳定性的方法

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Publication number: CN112921027A
Application number: CN202110389394.4A
Authority: CN
Inventors: 叶延欣; 李蕾蕾; 谢朝晖; 洪军
Original assignee: Henan University of Urban Construction
Current assignee: Henan University of Urban Construction
Priority date: 2021-04-12
Filing date: 2021-04-12
Publication date: 2021-06-08

Abstract

本发明是采用固定化的方法提高纳豆激酶热稳定性，为解决现有纳豆激酶活性不稳定，酶分子容易失活的问题提供一种有效的解决途径，包括测定海藻酸钠浓度对包埋纳豆激酶的影响、测定CaCl₂溶液浓度对包埋纳豆激酶的影响、测定聚乙二醇缩水甘油醚浓度对包埋纳豆激酶的影响，选取海藻酸钠浓度、CaCl₂浓度、聚乙二醇缩水甘油醚浓度进行三因素三水平正交试验，然后用温度测试纳豆激酶的活性对比，最终实现以海藻酸钠为载体，采用海藻酸钠包埋和新型环氧交联剂乙二醇缩水甘油醚交联联合法固定纳豆激酶，提高其热稳定性的方法有较好的效果。

Description

利用固定化提高纳豆激酶热稳定性的方法

技术领域

本发明涉及生物纳豆激酶稳定性技术领域，具体的是利用固定化提高纳豆激酶热稳定性的方法。

背景技术

纳豆激酶(NK)是近几年来预防心脑血管疾病方面的一个知名产品。纳豆激酶类的保健品可以预防中风、脑血栓、脑梗。血栓是血液在心血管***血管内面剥落处或修补处的表面所形成的小块，会使血液流速变慢，甚至会使血块沉积在血管壁使血管堵塞引发中风等脑血管疾病。纳豆激酶具有双向溶解血栓的作用，溶栓力强劲、快速、作用持久。纳豆激酶可以预防冠心病。另外，纳豆激酶还可以保护血管，促使血液中过剩的脂肪排出体外，避免动脉硬化等疾病的发生，从而保证人体为心脑提供充足的血氧含量，避免疾病的发生。

与目前市场上的其他溶栓制剂相比，优势在于：

1.纳豆激酶分子量小、口服效果好、溶栓活性高、作用持续时间长，是一款新型的口服类溶栓药物。

2.纳豆激酶溶栓与其他溶栓制剂不同，NK无抗原呈递性，半衰期长，不会导致人体发生出血的危险，同时，纳豆激酶的原材料价格低廉，容易被消费者所接受。这正是目前临床药剂所普遍缺失的特点，因此有望被开发为一种市场竞争能力强的新型溶栓药剂。

3.纳豆激酶与其它的药物相比，具有生产成本低，安全性好的特点，最为重要的是没有副作用。因此，其市场开发潜力巨大。

4.纳豆激酶除上述优点以外，还具有降低血压，抑制血小板凝集的作用，从而避免形成血栓。因此，在预防高血压和动脉硬化方面有重要的作用和开发前景。

纳豆激酶的最适温度约为50℃；当温度达到60℃时，酶分子迅速失活；在40℃时，保温30min对酶活没有太大的影响；另外，反复冻融对纳豆激酶影响不大。

由于纳豆激酶在温度超过60℃以后，会完全丧失活性并产生白色沉淀，对于大规模生产纳豆激酶来说，提高其热稳定性是亟待解决的问题之一。到目前为止，对于提高纳豆激酶热稳定性的研究主要是通过定点突变或重组技术来提高NK的热稳定性，采用酶固定化提高纳豆激酶热稳定性的研究仍相对欠缺。

海藻酸钠是一种天然多糖，因其具有粘性和安全性，所以广泛应用于食品工业和医药领域，同时海藻酸钠可以作为多种物质的包埋材料，不会对所包埋的物质造成空间结构和活力的影响。因此，以海藻酸钠为主要成分固定化纳豆激酶提高其热稳定性，降低用酶成本具有非常重要意义。

本发明采用海藻酸钠包埋和新型环氧交联剂乙二醇缩水甘油醚交联联合法固定纳豆激酶，通过单因素试验和正交试验法共同确定纳豆激酶的固定化方案，以提高纳豆激酶的热稳定性。

发明内容

针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明提供利用固定化提高纳豆激酶热稳定性及活性对比的方法，有效解决了现有纳豆激酶活性不稳定，酶分子容易失活的问题。

利用固定化提高所述纳豆激酶热稳定性的方法，其特征在于，包括以下步骤：

①测定海藻酸钠浓度对包埋纳豆激酶的影响：

将10mL不同浓度的海藻酸钠溶液1.2％、1.4％、1.6％、1.8％分别与1mL的纳豆激酶溶液混合均匀以后，用2.5mL的注射器打入0.3％的CaCl₂溶液中，待凝固成光滑小球后，静置30min后，用纱布过滤取出小球，用相同浓度的CaCl₂溶液继续固定30min，滤出小球，之后用蒸馏水洗涤三次，再用滤纸将表面水分吸干，放入4℃冰箱备用；

②测定CaCl₂溶液浓度对包埋纳豆激酶的影响：

将10mL浓度为1.6％的海藻酸钠溶液与1mL的纳豆激酶溶液混合均匀以后，用2.5mL的注射器分别打入浓度为0.2％、0.3％、0.4％、0.5％CaCl₂溶液中，待凝固成光滑小球后，静置30min后，用纱布过滤取出小球，用相同浓度的CaCl₂溶液继续固定30min，滤出小球，之后用蒸馏水洗涤三次，再用滤纸将表面水分吸干，放入4℃冰箱备用；

③测定聚乙二醇缩水甘油醚浓度对包埋纳豆激酶的影响：

向之前固定好的光滑小球加入不同浓度的聚乙二醇缩水甘油醚0.1％、0.2％、0.3％、0.4％，在25℃的条件下震荡交联1h；用纱布过滤取出小球后，蒸馏水洗涤三次，再用滤纸将表面水分吸干，放入4℃冰箱备用；

将包埋好的光滑小球放入装有20mL 0.9％的生理盐水中，超声破碎5min，之后按照纳豆激酶活力测定的方法测定包埋后纳豆激酶的酶活；

④经上述①-③单因素步骤之后，选取海藻酸钠浓度、CaCl₂浓度、聚乙二醇缩水甘油醚浓度进行三因素三水平正交试验。

优选的，用温度测试纳豆激酶的活性对比，包括以下步骤：

ⅰ、温度对纳豆激酶活性的影响：

分别取纳豆激酶发酵液3mL，放入不同温度40、45、50、55、60、65、70、75、80℃水浴锅中，水浴10min，按照酶活测定的方法测定纳豆激酶的酶活；

ⅱ、温度对被包埋的纳豆激酶活力的影响：

分别取包埋效果最佳的光滑小球，放入不同温度40、45、50、55、60、65、70、75、80℃水浴锅中，水浴10min，超声破碎处理5min，之后按照纳豆激酶活力测定的方法测定纳豆激酶的酶活；

ⅲ、比较游离酶和固定化酶的酶活。

附图说明

图1为本发明纳豆激酶的活性和蛋白浓度测定中考马斯亮蓝标标准曲线示意图。

图2为本发明纳豆激酶的活性和蛋白浓度测定中尿激酶标准曲线示意图。

图3为本发明接种量对固体发酵产酶的影响示意图。

图4为本发明发酵时间对固体发酵产酶的影响示意图。

图5为本发明后熟时间对固体发酵产酶的影响示意图。

图6为本发明破碎程度对固体发酵产酶的影响示意图。

图7为本发明温度对纳豆激酶活性影响的示意图。

图8为本发明利用固定化提高纳豆激酶热稳定性中海藻酸钠浓度对包埋纳豆激酶影响的结果示意图。

图9为本发明利用固定化提高纳豆激酶热稳定性中CaCl₂溶液浓度对包埋纳豆激酶影响的结果示意图。

图10为本发明利用固定化提高纳豆激酶热稳定性中聚乙二醇缩水甘油醚浓度对包埋纳豆激酶影响的结果示意图。

图11为本发明温度对包埋纳豆激酶活性影响的示意图。

具体实施方式

有关本发明的前述及其他技术内容、特点与功效，在以下配合参考附图1至图11对实施例的详细说明中，将可清楚的呈现。以下实施例中所提到的内容，均是以说明书附图为参考。

下面将参照附图描述本发明的各示例性的实施例。

一、材料与仪器

1、准备实验材料与试剂：

(1)、菌种

由实验室保存的枯草芽孢杆菌。

(2)、主要化学用品

本发明所做实验所用的主要化学药品如下表1所述。

表1主要化学药品

(3)主要溶液

①0.9％生理盐水：称取9.0gNaCl粉末溶于1000mL的蒸馏水中，搅拌至溶解，常温放置备用。

②巴比妥钠缓冲液：将2.06g的巴比妥钠溶解于100mL的蒸馏水中，于1mol/L的HCl按照2：1的比例混合以后，就可以得到pH为7.8的巴比妥钠缓冲液。

③纤维蛋白原溶液：准确称取7.2mg的纤维蛋白原，将其溶于10mLpH为7.8的巴比妥钠缓冲液中，配制成水溶性纤维蛋白原溶液。

④凝血酶溶液：准确称取1mg酶活力为1000U/mL的凝血酶，用50mL pH为7.8的巴比妥钠缓冲液稀释50倍，即成为20U/mL。

⑤酶反应终止液：称取14.97g无水乙酸钠和8.95g三氯乙酸溶解于500mL蒸馏水中，搅拌溶解以后，4℃冰箱保存备用。

⑥0.55M碳酸钠溶液：称取3.85gNa₂CO₃溶于500mL蒸馏水中，4℃保存备用。

2、主要仪器设备。

表2主要仪器设备

二、实验方法。

纳豆激酶的制备方法。

菌种的活化与培养。

1、培养基的配置。

(1)种子液培养基(LB)：以配制1L为例，应在950mL蒸馏水中加入10g胰蛋白胨，5g酵母浸粉，10gNaCl。用5mol/L的NaOH调pH至7.0，用蒸馏水定容至1L。

(2)牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，琼脂20g，蒸馏水1L，pH7.2-7.4。

2、菌种活化。

将由实验室保存的枯草芽孢杆菌转接到牛肉膏蛋白胨培养基中，于培养箱中37℃培养24h。

3、种子液的制备

接一环活化后的枯草芽孢杆菌到装有50mL LB培养液的锥形瓶中，37℃150r/min培养24h作为发酵所需的种子培养液。

4、纳豆激酶固体发酵

(1)纳豆激酶固体发酵单因素实验

①纳豆固体发酵最佳接种量

分别称取黄豆20g，洗净，用多于黄豆体积3倍的清水浸泡过夜。121℃高压灭菌蒸煮30min，自然冷却后，接上种子培养液，接种量分别为4％、6％、8％和10％。放置培养箱中37℃培养24h；4℃冰箱后熟24h；分别测定酶活。

②纳豆固体发酵最佳时间

分别称取黄豆20g，洗净，用多于黄豆体积3倍的清水浸泡过夜。121℃高压灭菌蒸煮30min，自然冷却后，接6％种子液，37℃培养16h、24h、32h和40h，4℃冰箱后熟24h；分别测定样品酶活。

③纳豆固体发酵最佳后熟时间

分别称取黄豆20g，洗净，用多于黄豆体积3倍的清水浸泡过夜。121℃高压灭菌蒸煮30min，自然冷却后，接6％种子液，放置培养箱中37℃培养24h；4℃冰箱后熟12h、24h、36h和48h；分别测定样品酶活。

④纳豆固体发酵最佳破碎程度

分别称取黄豆20g，洗净，用多于黄豆体积3倍的清水浸泡过夜，之后除去多余的水分，分别切成1瓣、2瓣、4瓣、6瓣；121℃高压灭菌蒸煮30min，自然冷却后，接6％种子液，放置培养箱中37℃培养24h；4℃冰箱后熟24h；分别测定酶活。

(2)纳豆激酶固体发酵多因素正交实验

经过上述单因素实验，本次实验选取了发酵时间(A)、破碎程度(B)、接种量(C)进行三因素三水平正交试验。

表3正交实验设计表

5、纳豆固体发酵粗酶液的提取

在纳豆固体发酵结束以后，在发酵好的纳豆中加入纳豆体积5倍的0.9％的生理盐水，在37℃条件下150r/min浸提1h，4500r/min冷冻离心20min，上清液即为纳豆激酶粗酶液。

温度对纳豆激酶活性的影响

分别取发酵液3mL，放入不同温度(40、45、50、55、60、65、70、75、80℃)水浴锅中，水浴10min，按照酶活测定的方法测定纳豆激酶的酶活。

纳豆激酶粗酶液分离纯化

盐析法分离纯化

选择硫酸铵分段盐析的方法进行分离纯化。硫酸铵分段盐析的分离纯化pH范围广，温度对实验基本没有影响，并且价格合理经济。

把硫酸铵粉末按照20％的饱和度加入到提取的纳豆激酶粗酶液中，搅拌溶解以后，放置4℃冰箱保存过夜，10000r/min冷冻离心30min，弃去沉淀，收集离心后的上清液再一次加入硫酸铵粉末至40％的饱和度，搅拌至硫酸铵完全溶解后4℃冰箱保存过夜，10000r/min离心30min，弃去沉淀，保留上清液。

纳豆激酶酶活力的测定

采用纤维蛋白降解实验对纳豆激酶的酶活力进行测定，具体操作步骤如下：

(1)取1mL分离纯化后的纳豆激酶酶液加入5mL pH为7.8的巴比妥钠缓冲液中，置于37℃水浴锅中保温5min。

(2)分别加入20μL配置好的的纤维蛋白原溶液和凝血酶溶液，立即混匀后，继续保温10min。

(3)加入1mL的酶反应终止液，使酶终止反应。

(4)将上述反应液混合均匀以后，10000r/min冷冻离心5min。

(5)离心完成后，用移液枪取上清液0.5mL加入1mL碳酸钠溶液和0.25mL福林酚试剂的试管中均匀混合以后，置于37℃水浴锅中保温30min，测量660nm处的吸光值。

纳豆激酶的活性和蛋白浓度测定的方法

实验所有标准曲线制作

(1)尿激酶标准曲线的制作

通常测定纳豆激酶的活性都需要以尿激酶的活力来进行对照。所以，需要建立尿激酶标准曲线来进行酶活力的测定。

将尿激酶标准品用pH为7.8的巴比妥钠缓冲液依次稀释成200U/mL、400U/mL、600U/mL、800U/mL和1000U/mL的浓度，之后按照上述纳豆激酶酶活力的测定方法测定尿激酶的活性，用Excel绘制尿激酶标准曲线。

(2)蛋白浓度标准曲线的制作

用考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度。以牛血清白蛋白为标准蛋白，取3个平行处理的平均值。

①考马斯亮蓝G250的配制：

取考马斯亮蓝G250 100mg溶于50mL 95％乙醇中，加入100mL 85％(W/V)磷酸，用蒸馏水稀释至1000mL。

②标准蛋白质溶液：

用0.2mol/L pH7.0磷酸缓冲液(PBS)将牛血清蛋白粉末配制成为1mg/mL标准蛋白质溶液。

③磷酸盐缓冲液：

用蒸馏水将KH₂PO₄2.12g和K₂HPO₄ 5.56g分别溶解，混合后定容至200mL，配成0.2mol/L pH7.0的磷酸缓冲液。

取7支试管，按下表4进行平行操作，每个浓度做3个平行实验，向每支试管中加入一定量的标准蛋白溶液和考马斯亮蓝后，迅速摇匀，在20min内以1号管为空白对照，在595nm处测定吸光值。

表4试剂配制表

利用固定化提高所述纳豆激酶热稳定性的方法

(1)海藻酸钠包埋纳豆激酶的单因素实验

①海藻酸钠浓度对包埋纳豆激酶的影响

将10mL不同浓度的海藻酸钠溶液(1.2％、1.4％、1.6％、1.8％)与1mL的纳豆激酶溶液混合均匀以后，用2.5mL的注射器打入0.3％的CaCl₂溶液中，待凝固成光滑小球后，静置30min后，用纱布过滤取出小球，用相同浓度的CaCl₂溶液继续固定30min，滤出小球，之后用蒸馏水洗涤三次，再用滤纸将表面水分吸干，放入4℃冰箱备用。

②CaCl₂溶液浓度对包埋纳豆激酶的影响

将10mL浓度为1.6％的海藻酸钠溶液与1mL的纳豆激酶溶液混合均匀以后，用2.5mL的注射器分别打入浓度为0.2％、0.3％、0.4％、0.5％CaCl₂溶液中，待凝固成光滑小球后，静置30min后，用纱布过滤取出小球，用相同浓度的CaCl₂溶液继续固定30min，滤出小球，之后用蒸馏水洗涤三次，再用滤纸将表面水分吸干，放入4℃冰箱备用。

③聚乙二醇缩水甘油醚浓度对包埋纳豆激酶的影响

向之前固定好的光滑小球加入不同浓度的聚乙二醇缩水甘油醚(0.1％、0.2％、0.3％、0.4％)，在25℃的条件下震荡交联1h；用纱布过滤取出小球后，蒸馏水洗涤三次，再用滤纸将表面水分吸干，放入4℃冰箱备用。

将包埋好的光滑小球放入装有20mL 0.9％的生理盐水中，超声破碎5min，之后按照上述纳豆激酶活力测定的方法测定包埋后纳豆激酶的酶活。

(2)正交实验设计

经上述单因素实验，本实验选取了海藻酸钠浓度(A)、CaCl₂浓度(B)、聚乙二醇缩水甘油醚浓度(C)进行三因素三水平正交试验。

表5正交实验设计表

温度对被包埋的纳豆激酶活力的影响

分别取包埋效果最佳的光滑小球，放入不同温度(40、45、50、55、60、65、70、75、80℃)水浴锅中，水浴10min，超声破碎处理5min，之后按照上述纳豆激酶活力测定的方法测定纳豆激酶的酶活，比较游离酶和固定化酶的酶活。

结果与分析

标准曲线的建立

考马斯亮蓝标准曲线如说明书附图1所示。

以牛血清蛋白溶液为标准溶液测定蛋白含量与吸光度的关系如图，横坐标为OD595 nm，纵坐标为标准蛋白浓度，方程是y＝0.7588x+0.016R2＝0.9959。

样品分析：将分离纯化后的纳豆激酶酶液进行适当的稀释以后，取0.5mL酶液与考马斯亮蓝试剂混合均匀，在20min内，测定其在595nm处的吸光值，依据标准曲线就可以计算稀释液中蛋白质的含量，然后就可根据稀释倍数计算出各酶液中所含蛋白质的含量。

尿激酶标准曲线：

如说明书附图2所示：

尿激酶在OD660处的直线方程为y＝5943.3x-738.44R2＝0.9985，有线性相关性，可以用来计算纳豆激酶的酶活。

纳豆激酶固体发酵单因素实验结果

1、纳豆激酶固体发酵最佳接种量。

说明书附图3所示为接种量对固体发酵产酶的影响。

从说明书附图3可知：当接种量为6％时，纳豆激酶的酶活较高，为673.064U/mL。当接种量过大时，可能会出现由于微生物生长过于旺盛而导致的快速消耗营养物质的情况，并且会出现缺氧的现象，不利于菌体的生长，纳豆激酶的含量也会降低；当接种量较小时，则不能使菌液均匀分布到大豆表面，影响最后的纳豆激酶产量。因此，选择6％为最佳的接种量。

2、纳豆激酶固体发酵最佳时间。

说明书附图4为发酵时间对固体发酵产酶的影响。

从说明书附图4可知：固体发酵时间达到24h时，纳豆激酶的酶活为577.971U/mL达到最大。继续增加发酵时间酶活力反而下降，因为发酵时间超过24h后，纳豆激酶的含量在逐渐减少，原因可能是由于发酵时间过长而导致有害物质的不断积累，从而使纳豆激酶的产量不断下降，所以固体发酵最佳时间为24h。

3、纳豆激酶固体发酵最佳后熟时间。

说明书附图5为后熟时间对固体发酵产酶的影响。

从说明书附图5可知：当后熟时间为24h时，是最大酶活，为560.141U/mL，所以不需要继续延长后熟时间。后熟时间过长则会导致纳豆激酶酶活下降，拉丝效果降低，氨味加重，并且会使纳豆的含水量降低。

4、纳豆激酶固体发酵最佳破碎程度。

说明书附图6为破碎程度对固体发酵产酶的影响。

从说明书附图6可知：破碎程度为2瓣时，为固体发酵的最大酶活，酶活力达到560.141U/mL，因此纳豆固体发酵的最佳破碎程度为2瓣。

纳豆激酶固体发酵正交实验结果。

表6正交实验直观分析表

从表6中看出，不同因素及水平相互组合的各个实验组之间酶活力有较大的差距，其中实验8(A₃B₂C₂)产酶达到了最大值，为667.12U/mL；通过对正交实验进行的直观分析显示，各个因素对酶活力的影响大小依次为A﹥B﹥C，最佳纳豆发酵工艺组合为A₃B₂C₂，其纳豆激酶的产量基本稳定在679.34U/mL，产酶量明显得到了提高。

温度对纳豆激酶活性影响的结果：

从说明书附图7可以看出纳豆激酶的活性随温度的升高而逐渐降低，40、45℃对纳豆激酶的影响相对较小，50℃时下降明显，并且具有一半的活性，当温度达到60℃时，活性完全丧失，并产生白色沉淀，说明白色沉淀就是纳豆激酶在高温下因变性而产生的。由此说明，纳豆激酶在60℃时半衰期衰减到最低。

固定化剂对纳豆激酶热稳定性的单因素实验的结果：

海藻酸钠浓度对包埋纳豆激酶影响的结果：

从说明书附图8可以看出，当海藻酸钠的浓度为1.4％时达到了最大回收率23.3％，纳豆激酶酶活为690.93U/mL，所以选择1.4％海藻酸钠浓度为最佳。如果海藻酸钠浓度过高则会使黏度增加，超声波无法使酶释放完全；如若海藻酸钠浓度小，则会使纳豆激酶不能被包埋完全，从而影响回收率。

CaCl₂溶液浓度对包埋纳豆激酶影响的结果：

如说明书附图9所示，当CaCl₂浓度为0.4％时，酶活回收率最大，为24％，酶活为702.780U/mL，所以，选择0.4％CaCl₂为最佳。如若CaCl₂溶液浓度过大，可能会使被包埋物质受到破坏，无法达到包埋目的；若CaCl₂溶液浓度过小，可能会使纳豆激酶无法完全被包埋，同样无法达到包埋目的。

聚乙二醇缩水甘油醚浓度对包埋纳豆激酶影响的结果：

如说明书附图10所示，当聚乙二醇缩水甘油醚的浓度为0.3％时，为最大包埋率38.1％，同时纳豆激酶酶活为661.177U/mL，因聚乙二醇缩水甘油醚的浓度不宜过高，没有继续增加其浓度的必要,所以选择0.3％聚乙二醇缩水甘油醚为包埋最佳单因素。

正交实验结果

表7固定化包埋正交实验直观分析表

由表7可知，影响纳豆激酶酶活回收率的因素按其影响大小的排序为：聚乙二醇缩水甘油醚浓度﹥CaCl₂溶液浓度﹥海藻酸钠浓度，并且聚乙二醇缩水甘油醚浓度对纳豆激酶酶活回收率的影响是最大的。由正交实验的结果可知：海藻酸钠的浓度为1.8％，CaCl₂溶液浓度为0.5％，聚乙二醇缩水甘油醚浓度为0.2％，为包埋纳豆激酶的最佳条件(A₃B₃C₁)。

采用上述的优化方案，结合最佳的包埋条件进行包埋，重复进行3次试验，取平均值后，纳豆激酶的回收率基本稳定在35.2％左右。

温度对包埋后的纳豆激酶活性影响的结果

从说明书附图11可以看出包埋后的纳豆激酶的活性和游离的纳豆激酶活性一样随温度的升高而逐渐降低，在40-45℃之间对纳豆激酶酶活力的影响相对较小，在大于50℃游离的纳豆激酶酶活力急剧下降，且在60℃时完全丧失。而经过固定化的纳豆激酶活性也下降较明显，但仍具有初始一半的活性，当温度达到70℃时活性才完全丧失。由此说明，与未包埋的游离纳豆激酶酶活相比，包埋后的纳豆激酶具有了较好的耐热性能，提升了酶的热稳定性，进而延长了酶半衰期的时间，并保持较高的酶活力。因此，采用海藻酸钠包埋和新型环氧交联剂乙二醇缩水甘油醚交联联合法固定纳豆激酶，提高其热稳定性的方法有较好的效果。

结论：

1)纳豆激酶固体发酵工艺优化

为得到拉丝效果好、颜色黄亮、纳豆激酶含量高的纳豆，实验以普通黄豆为原料，研究并优化了纳豆固体发酵工艺，并且以纳豆激酶活性为指标，研究接种量、发酵时间、后熟时间、破碎程度对纳豆激酶活性的影响。

在单因素的基础上，通过正交实验设计对纳豆激酶固体发酵进行优化，并对正交实验结果进行直观分析，结果表明：各个因素对酶活力的影响大小依次为发酵时间﹥破碎程度﹥接种量，最佳发酵工艺组合为发酵时间24h，破碎程度2瓣，接种量6％，其纳豆激酶的酶活力基本稳定在679.34U/mL，产酶量得到显著提高。

2)固定化提高纳豆激酶热稳定性

为了提高纳豆激酶的热稳定性，以海藻酸钠为载体，采用海藻酸钠包埋和新型环氧交联剂乙二醇缩水甘油醚交联联合法固定纳豆激酶，研究海藻酸钠浓度、CaCl₂溶液浓度、聚乙二醇缩水甘油醚浓度，通过单因素试验和正交试验法共同确定纳豆激酶的固定化方案。以纳豆激酶的活性为指标，在不同的温度下测定纳豆激酶的活力，得到最佳的提高方法。

结果表明：影响纳豆激酶酶活回收率的因素按其影响大小的排序为：聚乙二醇缩水甘油醚浓度﹥CaCl₂溶液浓度﹥海藻酸钠浓度；海藻酸钠的浓度为1.8％，CaCl₂溶液浓度为0.5％，聚乙二醇缩水甘油醚浓度为0.2％，为包埋纳豆激酶的最佳条件。并且包埋后的纳豆激酶其活性与未包埋的游离纳豆激酶酶活相比，半衰期有所提高。因此，以海藻酸钠为载体，采用海藻酸钠包埋和新型环氧交联剂乙二醇缩水甘油醚交联联合法固定纳豆激酶，提高其热稳定性的方法有较好的效果。

Claims

1.利用固定化提高所述纳豆激酶热稳定性的方法，其特征在于，包括以下步骤：

①测定海藻酸钠浓度对包埋纳豆激酶的影响：

将10mL不同浓度的海藻酸钠溶液1.2%、1.4%、1.6%、1.8%分别与1mL的纳豆激酶溶液混合均匀以后，用2.5mL的注射器打入0.3%的CaCl₂溶液中，待凝固成光滑小球后，静置30min后，用纱布过滤取出小球，用相同浓度的CaCl₂溶液继续固定30min，滤出小球，之后用蒸馏水洗涤三次，再用滤纸将表面水分吸干，放入4℃冰箱备用；

②测定CaCl₂溶液浓度对包埋纳豆激酶的影响：

将10mL浓度为1.6%的海藻酸钠溶液与1mL的纳豆激酶溶液混合均匀以后，用2.5mL的注射器分别打入浓度为0.2%、0.3%、0.4%、0.5% CaCl₂溶液中，待凝固成光滑小球后，静置30min后，用纱布过滤取出小球，用相同浓度的CaCl₂溶液继续固定30min，滤出小球，之后用蒸馏水洗涤三次，再用滤纸将表面水分吸干，放入4℃冰箱备用；

③测定聚乙二醇缩水甘油醚浓度对包埋纳豆激酶的影响：

向之前固定好的光滑小球加入不同浓度的聚乙二醇缩水甘油醚0.1%、0.2%、0.3%、0.4%，在25℃的条件下震荡交联1h；用纱布过滤取出小球后，蒸馏水洗涤三次，再用滤纸将表面水分吸干，放入4℃冰箱备用；

将包埋好的光滑小球放入装有20mL 0.9%的生理盐水中，超声破碎5min，之后按照纳豆激酶活力测定的方法测定包埋后纳豆激酶的酶活；

2.根据权利要求1所述利用固定化提高所述纳豆激酶热稳定性的方法，其特征在于，用温度测试纳豆激酶的活性对比，包括以下步骤：

ⅰ、温度对纳豆激酶活性的影响：

ⅱ、温度对被包埋的纳豆激酶活力的影响：

ⅲ、比较游离酶和固定化酶的酶活。