CN101392015B - 山茶种子中的三萜皂苷及其制备方法和医药用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药技术领域，提供了山茶种子中的三萜皂苷、及其制备方法和医药用途，如通式(1)中所示，其中R1为氢或羟基或酰氧基；R2为氢或酰氧基；R3为氢或酰氧基；R4为氢或酰氧基；R5为甲基或羟甲基或醛基或羧基或羧基甲酯；R6为氢或糖基；制备方法经脱脂、醇提取或水煎煮、大孔树脂脱糖脱色得粗总皂苷，再经开口ODS柱色谱和反复HPLC法分别制得山茶种子总皂苷和单体茶皂苷；本发明的山茶种子中的三萜皂苷类化合物具有胃粘膜保护、抗肿瘤、降血糖、降血脂等作用；用于制备保护胃粘膜、抗肿瘤、降血糖、降血脂的药物或保健食品。

Description

山茶种子中的三萜皂苷及其制备方法和医药用途

技术领域：

本发明属于医药技术领域，涉及山茶种子中的三萜皂苷及其制备方法和医药用途。

背景技术：

山茶Camellia sinensis是山茶科山茶属植物，在我国大面积栽培，是一种优良的经济作物。其嫩芽——茶叶的化学成分和生物活性有***的研究报道。据已有的研究资料表明茶的化学成分有600种之多，其中的有机化合物达500种以上。它们合成和转化的生化反应途径有着互相联系、互相制约的关系。其生物活性涉及：抗炎、抗过敏、抗氧化、清除自由基、降血糖、降血脂、胃肠促进、保肝、癌前损伤预防等多方面活性。

近年来，随着茶园种植业采取无性扦插繁殖，大量的山茶种子作为副产物亟待进一步合理开发利用。《本草纲目》记载：茶籽苦寒，有毒，治喘急痰嗽，去痰垢。在我们的前期研究中发现，茶种子中含有大量的皂苷类成分。茶种总皂苷是一种优良的表面活性剂，是新型化妆品和洗涤剂的原料。医疗方面有较好的保护胃粘膜、降血糖、降血脂、抗肿瘤、抗真菌、抗炎、抗过敏和抗血管扩张作用。山茶种子总皂苷的提取及利用其有效成分生产加工成制剂未有报道。

发明内容：

本发明的目的在于提供如通式(1)所示的山茶种子中的三萜皂苷类成分、及其制备方法和医药用途。

本发明提供了山茶种子中的三萜皂苷，其为如下通式(1)中所表示的齐墩果烷衍生物：

通式(1)

  乙酰基             惕铬酰基                  当归酰基                 肉桂酰基

通式(1)中，R1为氢或羟基或酰氧基；R2为氢或酰氧基(酰基种类包括乙酰基、当归酰基、惕铬酰基、肉桂酰基)；R3为氢或酰氧基(酰基种类包括乙酰基、当归酰基、惕铬酰基、肉桂酰基)；R4为氢或酰氧基(酰基种类包括乙酰基、当归酰基、惕铬酰基、肉桂酰基)；R5为甲基或羟甲基或醛基或羧基或羧基甲酯；R6为氢或糖基(包括葡萄糖醛酸基、***糖基、半乳糖基、葡萄糖基、木糖基及由它们组成的寡糖链)。

其中新化合物是：

本发明还提供了山茶种子中三萜皂苷的制备方法，其制备方法如下：

(1)取干燥山茶种子榨油后所得茶子饼，加入提取溶剂浸泡，药材与提取溶剂的比例为1∶5至1∶12，于50～100℃条件下加热0.5～3小时，提取1～4次，合并各次提取液浓缩至药材量的2～10倍体积；

(2)提取液经大孔树脂(HPD100或D101或AB-8等通用树脂)吸附，用0～30％的稀醇洗去杂质，再用40％～100％醇液洗脱得山茶种子粗总皂苷(含量50％～70％)；

(3)所得山茶种子粗总皂苷加少量水溶解，经开口ODS柱色谱，用0～30％稀醇洗去茶黄酮杂质，再用40％～90％醇液洗脱得山茶种子总皂苷(含量70％～95％)；

(4)所得山茶种子总皂苷经HPLC进一步分离纯化：反相键合硅胶为固定相(C-18，C-30，C-8等)，以甲醇-水(含0.05％冰醋酸)体积比30～80％或乙腈-水(含0.05冰醋酸)体积比20％～70％或甲醇-乙腈-水(含0.05％冰醋酸)体积比2∶50∶48～16∶20∶64为流动相，示差或紫外(190～220nm)检测器检测，得到通式(1)中所示各种类型三萜皂苷类成分。

本发明提供的山茶种子中三萜皂苷的制备方法，所述步骤(1)中的提取溶剂为水、甲醇、乙醇等，甲醇或乙醇的浓度为5％～95％；提取方法为煎煮法或加热回流提取法。

本发明提供的山茶种子中三萜皂苷的制备方法，所述步骤(3)中醇液为不同浓度的甲醇或乙醇。

本发明提供了山茶种子中三萜皂苷的医疗用途，如通式(1)中所示的山茶种子中的三萜皂苷类化合物具有胃粘膜保护、抗肿瘤、降血糖、降血脂等作用；可用于制备保护胃粘膜、抗肿瘤、降血糖、降血脂的药物或保健食品。

本发明的优点如下：

(1)本发明的制备方法所得山茶种子总皂苷收率高、纯度高；

(2)如上所示的32个化合物均为新化合物，是山茶种子的特有成分，可作为质量控制的指标；

(3)本发明所得单体茶皂苷收率高、纯度高，结构明确，可进行目标性结构修饰，以进一步开发利用；

(4)本发明所用原料为山茶种子榨油后的茶子饼，为工业废料，成本低、易得、有利于环保；

(5)制备方法简便、易行，污染少，适宜于工业生产；

(6)山茶种子总皂苷和单体茶皂苷生物活性多样、效果显著。

附图说明：

图1为茶皂苷T1的¹H NMR图谱。

图2为茶皂苷T1的¹³C NMR的图谱。

图3为茶皂苷T10的¹H NMR图谱。

图4为茶皂苷T10的¹³C NMR的图谱。

图5为茶皂苷T12的¹H NMR的图谱。

图6为茶皂苷T12的¹³C NMR的图谱。

图7为茶皂苷T20的¹H NMR的图谱。

图8为茶皂苷T20的¹³C NMR的图谱。

图9为茶皂苷T33的1H NMR的图谱。

图10为茶皂苷T33的¹³C NMR的图谱。

图11为茶皂苷T34的1H NMR的图谱。

图12为茶皂苷T34的¹³C NMR的图谱。

图13为茶皂苷T36的1H NMR的图谱。

图14为茶皂苷T36的¹³C NMR的图谱。

具体实施方式：

以下实施例对本发明作进一步详细的描述，本发明不受此限制。

实施例1

山茶总皂苷的制备

取干燥山茶种子榨油后所得茶子饼10kg，去除杂质、灰尘。

在中药提取罐中加入药材和10倍量的水，加热至80℃，提取两次，每次2小时，合并各次提取液浓缩至药材量的4倍体积。

提取液经大孔树脂吸附，用20％乙醇洗去杂质，再用90％乙醇洗脱得山茶种子粗总皂苷680克(含量60％)。

所得山茶种子粗总皂苷加5倍量水溶解，经开口ODS柱色谱(样品量∶填料1∶10)，用20％乙醇洗去茶黄酮杂质，再用85％乙醇洗脱得山茶种子总皂苷380克(含量85％)。

所得山茶种子总皂苷经反相HPLC(岛津L6A)进一步分离纯化：以ODS和C-30键合硅胶为固定相，分别以甲醇-水(含0.05％冰醋酸)体积比70∶30为流动相，乙腈-水(含0.05冰醋酸)体积比40∶60为流动相，甲醇-乙腈-水(含0.05％冰醋酸)体积比8∶32∶60为流动相反复分离，示差检测器检测，得到通式(1)中所示各种类型三萜皂苷类成分。

实施例2

山茶总皂苷的制备

(1)取干燥山茶种子榨油后所得茶子饼6kg，去除杂质、灰尘。

(2)在中药提取罐中加入药材和8倍量的95％乙醇，加热至80℃，提取两次，每次1.5小时，合并各次提取液浓缩至药材量的2倍体积。

(3)提取液经大孔树脂吸附，用30％乙醇洗去杂质，再用90％乙醇洗脱得山茶种子粗总皂苷770克(含量65％)。

(4)所得山茶种子粗总皂苷加4倍量水溶解，经开口ODS柱色谱(样品量∶填料1∶12)，用20％乙醇洗去茶黄酮杂质，再用90％乙醇洗脱得山茶种子总皂苷430克(含量87％)。

(5)所得山茶种子总皂苷经反相HPLC(岛津L6A)进一步分离纯化：以ODS和C-30键合硅胶为固定相，分别以甲醇-水(含0.1％冰醋酸)体积比65∶35为流动相，乙腈-水(含0.1冰醋酸)体积比33∶67为流动相，甲醇-乙腈-水(含0.05％冰醋酸)体积比4∶34∶62为流动相反复分离，示差检测器检测，得到通式(1)中所示各种类型三萜皂苷类成分。

实施例3

考察山茶种子总皂苷对S180荷瘤小鼠肿瘤生长的影响

实验动物：8周龄雄性ICR小鼠，平均体重20克。由浙江大学实验动物中心提供。

药物与瘤株：山茶种子总皂苷按照权利要求书2中描述的方法制备；环磷酰胺(CTX)，200mg/支，上海华联制药有限公司生产，S180腹水瘤小鼠为浙江大学动物实验中心提供。

S180腹水瘤细胞悬液的制备：无菌条件下操作，取接种10d的S180肉瘤腹水型荷瘤小鼠，消毒动物腹部皮肤，用5mL一次性无菌注射器穿入腹腔，吸取肿瘤细胞生长良好的腹水，所抽腹水放入无菌三角烧瓶内，放置于冰盒上。另取少量腹水进行细胞计数：用生理盐水稀释100倍，取稀释液0.9mL加台盼兰(0.2％台盼兰生理盐水溶液)0.1mL，混匀，用细胞计数法分析肿瘤细胞总数及死细胞数(紫或蓝色，活细胞数应＞95％)。腹水用生理盐水稀释，调整瘤细胞浓度为1×107/mL(整个操作在冰盒上进行，以此来保持肿瘤细胞的活性)。

昆明种小鼠移植S180肉瘤模型的建立：取体重20g左右的昆明种小鼠，每鼠0.2mL(肿瘤细胞数约为2×106个)接种于右前肢腋窝皮下，24h后称重，随机分成3组，分组情况为：荷瘤对照组，环磷酰胺(CTX)组，山茶种子皂苷组组。计算瘤重及其他相关指标。

荷瘤对照组：移植肿瘤后，每日灌服0.4mL生理盐水。环磷酰胺(CTX)组：每天1次，100mg/kg体重，腹腔注射，连续3d。山茶种子总皂苷剂量组：每天按100mg/kg体重灌服1次，连续10d。

指标的检测：给药10d后停止给药，停药次日处死小鼠，称取小鼠体重，解剖瘤体，称重。

实验结果：见表1

表1  山茶种子总皂苷对S180荷瘤小鼠肿瘤生长的影响

实施例4

采用MTT法和SRB法，对单体茶皂苷体外抗肿瘤活性进行测试

实验方法如下：

细胞培养：取对数生长期的人体肿瘤细胞，以内含10％(v/v)胎牛血清(fetal bovine serum)的RPMI-1640培养液稀释为5×104个/L的细胞悬浮液，接种于96孔板中，100μL/孔，置37℃、饱和湿度、5％CO2培养箱中培养24h。

添加试药：用少量DMSO溶解样品后，用含10％(v/v)胎牛血清的RPMI-1640培养液稀释为10，20，30，40，50μm/L浓度梯度的样品溶液，将上述含药培养液加入96孔板中，放置于与细胞培养相同条件的培养箱中培养48h。

结果测定：

采用MTT法测定MCF-7和HepG2瘤株实验结果。

采用SRB法测定K562和HL-60瘤株实验结果。

实验结果：见表2

表2  单体茶皂苷体外抗肿瘤活性测试结果

实施例5

考察山茶种总皂苷对糖负荷大鼠血糖的影响

实验动物：雄性Wistar大鼠，体重130～150g，购自日本KiwaLaboratory Animal Co.Ltd.(Wakayama)。动物恒温(23±2℃)饲养，饲料购自日本MF.Oriental Yeast Co.Ltd.(Tokyo)。实验前动物禁食20～24小时，自由取水。

实验方法：取130～150g的雄性Wistar大鼠，禁食20～24小时后，灌胃给与山茶种总皂苷，0.5小时后，灌胃给蔗糖(1.0g/kg)，0.5小时后，眼底取血，离心分离血浆后采用葡萄糖氧化酶法测定血糖水平。

实验结果：表3中给出了山茶种总皂苷对糖负荷大鼠血糖水平的影响，山茶种总皂苷在100～400mg/kg剂量能显著降低糖负荷大鼠血糖水平。

表3  山茶种总皂苷对糖负荷大鼠血糖的影响

Values represent the means±S.E.M.

For statistical analysis：one-way analysis of variance followed by Dunnett’s test

Significantly different from the control group，^*p＜0.05，^**p＜0.01.

实施例6

考察山茶种总皂苷对油负荷小鼠血浆中甘油三酯水平的影响

实验动物：雄性DDY小鼠，体重25～30g，购自日本Kiwa LaboratoryAnimal Co.Ltd.(Wakayama)。动物恒温(23±2℃)饲养，饲料购自日本MF.Oriental Yeast Co.Ltd.(Tokyo)。实验前动物禁食20～24小时，自由取水。

实验方法：取25～30g的雄性DDY小鼠，禁食20～24小时后，灌胃给与山茶种总皂苷，0.5小时后，灌胃给橄榄油(5mL/kg)，2小时后，眼底取血，离心分离血浆后采用WAKO试剂盒测定血浆中甘油三酯水平。

实验结果：表4中给出了山茶种总皂苷对油负荷小鼠血浆中甘油三酯水平的影响，山茶种总皂苷在400mg/kg剂量能显著降低油负荷小鼠血浆中甘油三酯水平。

表4  山茶种总皂苷对油负荷小鼠血浆中甘油三酯水平的影响

Values represent the means±S.E.M.

For statistical analysis：one-way analysis of variance followed by Dunnett’s test

Significantly different from the control group，^*p＜0.05，^**p＜0.01.

实施例7

考察山茶种总皂苷对乙醇诱导的胃粘膜损伤的影响

实验动物：雄性SD大鼠，体重230～250g，购自日本Kiwa LaboratoryAnimal Co.Ltd.(Wakayama)。动物恒温(23±2℃)饲养，饲料购自日本MF.Oriental Yeast Co.Ltd.(Tokyo)。实验前动物禁食24～26小时，自由取水。

实验方法：取230～250g的雄性SD大鼠，禁食24～26小时后，灌胃给与茶种总皂苷(5％的***胶混悬)，1小时后，灌胃给99.5％的乙醇(1.5mL)致胃粘膜损伤，1小时后，***麻醉处死。取出大鼠胃部，抽出内容物后，注射10mL 1.5％的***溶液固定胃壁，反复用清水冲洗后展平，计算机扫描计算胃粘膜损伤率。

实验结果：结果如表5所示，山茶种总皂苷在2.5～20mg/kg剂量能显著减少乙醇引起的胃粘膜损伤。

表5  山茶种总皂苷对乙醇诱导的胃粘膜损伤的影响

Values represent the means±S.E.M.

For statistical analysis：one-way analysis of variance followed by Dunnett’s test

Significantly different from the control group，^*p＜0.05，^**p＜0.01.

实施例8

考察山茶种总皂苷对吲哚美辛诱导的胃粘膜损伤的影响

实验动物：雄性SD大鼠，体重230～250g，购自日本Kiwa LaboratoryAnimal Co.Ltd.(Wakayama)。动物恒温(23±2℃)饲养，饲料购自日本MF.Oriental Yeast Co.Ltd.(Tokyo)。实验前动物禁食24～26小时，自由取水。

实验方法：取230～250g的雄性SD大鼠，禁食24～26小时后，灌胃给与山茶种总皂苷(5％的***胶混悬)，1小时后，灌胃给吲哚美辛(20mg/kg吲哚美辛溶于5％碳酸氢钠溶液，蒸馏水稀释后，加0.2M盐酸中和，1.5ml/rat)致胃粘膜损伤，4小时后，***麻醉处死。取出大鼠胃部，抽出内容物后，注射10mL 1.5％的***溶液固定胃壁，反复用清水冲洗后展平，扫描计算胃粘膜损伤率。

实验结果：实验结果如表6中所示，山茶种总皂苷在50～200mg/kg剂量能显著减少吲哚美辛引起的胃粘膜损伤。

表6  山茶种总皂苷对吲哚美辛诱导的胃粘膜损伤的影响

Values represent the means±S.E.M.

For statistical analysis：one-way analysis of variance followed by Dunnett’s test

Significantly different from the control group，^*p＜0.05，^**p＜0.01.

实施例9

考察分离得到的单体茶皂苷对乙醇诱导的胃粘膜损伤的保护作用。

实验动物和试验方法同实施例7.

实验结果：如表7中所示，部分单体茶皂苷在剂量为5mg/kg水平，能显著抑制乙醇诱导的胃粘膜损伤，其效果好于阳性对照药奥美拉唑和曲丙酸酯盐酸盐。

表7  单体茶皂苷对乙醇诱导的胃粘膜损伤的保护作用

Values represent the means±S.E.M.

For statistical analysis：one-way analysis of variance followed by Dunnett’s test

Significantly different from the control group，^*p＜0.05，^**p＜0.01.

实施例10  单体茶皂苷T1的结构确证

白色针晶(甲醇)，mp 219～220℃，Liebermann-Burchard反应阳性，Molish反应阳性。碱水解，检出有当归酸存在；酸水解，检测有葡萄糖醛酸，半乳糖，***糖和木糖存在。IR(KBr pellet)vmax 3453(OH)，1718(C＝O)，1649(C＝O)，1O78(C-O)cm-1。 ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{20}=+6.5(c2.5,\mathrm{MeOH}).$ Pos.FAB-MS m/z：1213[M+Na]⁺，Neg.FAB-MS m/z：1189[M-H]^-，1057[M-H-132]^-，925[M-H-2×132]^-，895[M-H-132-162]^-。HR FABMS m/z：1213.5627(calcd.1213.5618for C₅₇H₉₀O₂₆Na)。¹H-NMR，¹³C-NMR数据见表1，表2。¹H-NMR，¹³C-NMR见说明书附图1，图2。

实施例11  单体茶皂苷T10的结构确证

白色针晶(甲醇)，mp 220～221℃，Liebermann-Burchard反应阳性，Molish反应阳性。碱水解，检出有当归酸和乙酸存在；酸水解，检测有葡萄糖醛酸，半乳糖，***糖和木糖存在。IR(KBr pellet)v_max 3453(OH)，1731(C＝O)，1647(C＝O)，1080(C-O)cm^-1 ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{20}=-10.0(c2.4,\mathrm{MeOH}).$ Pos.FAB-MS m/z：1281[M+Na]⁺，Neg.FAB-MS m/z：1257[M-H]^-，1125[M-H-132]^-，963[M-H-132-162]^-。HR FABMS：1281.5886(calcd.1281.5880for C₆₁H₉₄O₂₇Na)。¹H-NMR，¹³C-NMR数据见表1，表2。¹H-NMR，¹³C-NMR，见说明书附图3，图4。

实施例12  单体茶皂苷T12的结构确证

白色针晶(甲醇)，mp 223～224℃，Liebermann-Burchard反应阳性，Molish反应阳性。碱水解，检出有当归酸存在；酸水解，检测有葡萄糖醛酸，半乳糖，***糖和木糖存在。IR(KBr pellet)v_max 3453(OH)，1741(C＝O)，1085(C-O)cm^-1。 ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{20}=+7.9(c2.0,\mathrm{MeOH}).$ Pos.FAB-MS m/z：1197[M+Na]⁺，Neg.FAB-MS m/z：1173[M-H]^-，1041[M-H-132]^-。HR FABMS：1197.5657(calcd.1197.5669 for C₅₇H₉₀O₂₅Na)。¹H-NMR，¹³C-NMR数据见表1，表2。¹H-NMR，¹³C-NMR见说明书附图5，图6。

表1  茶皂苷T1，T10，T12的¹³C-NMR数据

Ac＝acetyl，Ang＝angeloyl；Xyl：β-D-xylose；Ara：α-L-arabinose；GlcA：β-D-glucuronic acid；Glc：β-D-glucose；Gal：β-D-galactose；

表2茶皂苷T1，T10，T12的¹H-NMR数据

Ac＝acetyl，Ang＝angeloyl，

Xyl：β-D-xylose；Ara：α-L-arabinose；GlcA：β-D-glucuronic acid；Gal：β-D-glucose；Glc：β-D-galactose；

实施例13  单体茶皂苷T20的结构确证

白色粉末(甲醇)，mp 196～198℃，Liebermann-Burchard反应阳性，Molish反应阳性。碱水解，检出有惕铬酸和乙酸存在；酸水解，检测有葡萄糖醛酸，半乳糖，***糖和木糖存在。IR(KBr pellet)v_max 3453(OH)，1743(C＝O)，1085(C-O)cm^-1。 ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{20}=+10.9(c3.0,\mathrm{MeOH}).$ Pos.FAB-MS m/z：1253[M+Na]⁺，Neg.FAB-MS m/z：1229[M-H]^-，1097[M-H-132]^-，1067[M-H-162]^-，965[M-H-2×132]^-，803[M-H-2×132-162]^-。HR FABMS：1253.5573(calcd.1253.5567for C₅₉H₉₀O₂₇Na)。¹H-NMR，¹³C-NMR数据见表3，表4。¹H-NMR，¹³C-NMR见说明书附图7，图8。

实施例14  单体茶皂苷T33的结构确证

白色粉末(甲醇)，mp 217～218℃，Liebermann-Burchard反应阳性，Molish反应阳性。碱水解，检出有当归酸和乙酸存在；酸水解，检测有葡萄糖醛酸，半乳糖，***糖和木糖存在。IR(KBr pellet)v_max 3453(OH)，1718(C＝O)，1650(C＝O)，1080(C-O)cm^-1。 ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{20}=+25.1(c2.0,\mathrm{MeOH}).$ Pos.FAB-MS m/z：1283[M+Na]⁺，Neg.FAB-MS m/z：1259[M-H]^-，1127[M-H-132]^-，1097[M-H-162]^-，995[M-H-2×132]^-，965[M-H-132-162]^-。HRFABMS：1283.5682(calcd.1283.5673 for C₆₀H₉₂O₂₈Na)。¹H-NMR，¹³C-NMR数据见表3，表4。¹H-NMR，¹³C-NMR见说明书附图9，图10。

实施例15  单体茶皂苷T34的结构确证

白色粉末(甲醇)，mp 218～219℃，Liebermann-Burchard反应阳性，Molish反应阳性。碱水解，检出有当归酸存在；酸水解，检测有葡萄糖醛酸，半乳糖，***糖和木糖存在。IR(KBr pellet)v_max 3453(OH)，1717(C＝O)，1638(C＝O)，1080(C-O)cm^-1。 ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{20}=+10.0(c0.9,\mathrm{MeOH}).$ Pos.FAB-MS m/z：1225[M+Na]⁺，Neg.FAB-MS m/z：1201[M-H]^-，1069[M-H-132]^-，937[M-H-2×132]^-，907[M-H-132-162]^-。HR FABMS：1225.5613(calcd.125.5618 for C₅₈H₉₀O₂₆Na)。¹H-NMR，¹³C-NMR数据见表3，表4。¹H-NMR，¹³C-NMR见说明书附图11，图12。

实施例16  单体茶皂苷T36的结构确证

白色粉末(甲醇)，mp 225～226℃，Liebermann-Burchard反应阳性，Molish反应阳性。碱水解，检出有当归酸存在；酸水解，检测有葡萄糖醛酸，半乳糖，***糖和木糖存在。IR(KBr pellet)v_max 3453(OH)，1717(C＝O)，1638(C＝O)，1080(C-O)cm^-1。 ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{20}=-1.3(c1.0,\mathrm{MeOH}).$ Pos.FAB-MS m/z：1195[M+Na]⁺，Neg.FAB-MS m/z：1171[M-H]^-，1039[M-H-132]^-，907[M-H-2×132]^-，877[M-H-132-162]^-。HR FABMS：1195.5520(calcd.1195.5512 for C₅₇H₈₈O₂₅Na)。¹H-NMR，¹³C-NMR数据见表3，表4。¹H-NMR，¹³C-NMR见说明书附图13，图14。

表3  茶皂苷T20，T33，T34，T36的¹³C-NMR数据

Ac＝acetyl，Ang＝angeloyl；Xyl：β-D-xylose；Ara：α-L-arabinose；GlcA：β-D-glucuronic acid；Glc：β-D-glucose；Gal：β-D-galactose；

表4  茶皂苷T20，T33，T34，T36的¹H-NMR数据

Ac＝acetyl，Ang＝angeloyl，

Xyl：β-D-xylose；Ara：α-L-arabinose；GlcA：β-D-glucuronic acid；Gal：β-D-glucose；Glc：β-D-galactose；

Claims (2)

1.山茶种子中三萜皂苷的制备方法，其特征在于：

取干燥山茶种子榨油后所得茶子饼10kg，去除杂质、灰尘； 

在中药提取罐中加入药材和10倍量的水，加热至80℃，提取两次，每次2小时，合并各次提取液浓缩至药材量的4倍体积；

提取液经大孔树脂吸附，用20%乙醇洗去杂质，再用90%乙醇洗脱得山茶种子粗总皂苷680克，含量60%；

所得山茶种子粗总皂苷加5倍量水溶解，经开口ODS柱色谱，样品量：填料=1：10，用20%乙醇洗去茶黄酮杂质，再用85%乙醇洗脱得山茶种子总皂苷380克，含量85%； 

所得山茶种子总皂苷经反相HPLC，岛津L6A，进一步分离纯化：以ODS和C-30键合硅胶为固定相，分别以体积比70：30的含0.05%冰醋酸的甲醇-水为流动相、体积比40：60的含0.05%冰醋酸的乙腈-水为流动相、体积比8：32：60的含0.05%冰醋酸的甲醇-乙腈-水为流动相反复分离，示差检测器检测，得到通式（1）中所示各种类型三萜皂苷类成分，

 通式（1）中：R₁为氢或羟基或酰氧基；R₂为氢或酰基；R₃为氢或酰基；R₄为氢或酰基；R₅为甲基或羟甲基或醛基或羧基或羧基甲酯；R₆为氢或糖基；所述酰基为乙酰基、当归酰基、惕铬酰基或肉桂酰基；所述糖基为葡萄糖醛酸基、***糖基、半乳糖基、葡萄糖基、木糖基或它们组成的寡糖链基。

2.山茶种子中三萜皂苷的制备方法，其特征在于：

取干燥山茶种子榨油后所得茶子饼6kg，去除杂质、灰尘；

在中药提取罐中加入药材和8倍量的95%乙醇，加热至80℃，提取两次，每次1.5小时，合并各次提取液浓缩至药材量的2倍体积；

提取液经大孔树脂吸附，用30%乙醇洗去杂质，再用90%乙醇洗脱得山茶种子粗总皂苷770克，含量65%；

所得山茶种子粗总皂苷加4倍量水溶解，经开口ODS柱色谱，样品量：填料=1：12，用20%乙醇洗去茶黄酮杂质，再用90%乙醇洗脱得山茶种子总皂苷430克，含量87%；

所得山茶种子总皂苷经反相HPLC，岛津L6A，进一步分离纯化：以ODS和C-30键合硅胶为固定相，分别以体积比65：35的含0.1%冰醋酸的甲醇-水为流动相，体积比33：67的含0.1%冰醋酸的乙腈-水为流动相，体积比4：34：62的含0.05%冰醋酸的甲醇-乙腈-水为流动相反复分离，示差检测器检测，得到通式（1）中所示各种类型三萜皂苷类成分，

   通式（1）中：R₁为氢或羟基或酰氧基；R₂为氢或酰基；R₃为氢或酰基；R₄为氢或酰基；R₅为甲基或羟甲基或醛基或羧基或羧基甲酯；R₆为氢或糖基；所述酰基为乙酰基、当归酰基、惕铬酰基或肉桂酰基；所述糖基为葡萄糖醛酸基、***糖基、半乳糖基、葡萄糖基、木糖基或它们组成的寡糖链基。

Images