CN101374946B - 用于在组织相容性不匹配的移植中抑制有害的免疫反应的组合物和方法 - Google Patents

用于在组织相容性不匹配的移植中抑制有害的免疫反应的组合物和方法 Download PDF

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Abstract

公开了基于细胞的组合物和它们用于在与移植供体组织相容性不匹配的移植接受者中抑制有害免疫反应如移植物抗宿主疾病或移植的组织的排斥的方法。所述组合物和方法利用产后衍生的细胞，例如来自胎盘或脐带的细胞。

Description

用于在组织相容性不匹配的移植中抑制有害的免疫反应的组 合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2005年12月16日提交的美国临时专利申请号NO.60/751,395的权益，通过引用将其内容完整地合并在此。
发明领域
本发明涉及移植免疫学领域。特别是，本发明涉及来自产后组织的细胞，其具有抑制组织相容性不匹配的供体和接受者之间组织移植中的有害免疫反应的能力，以及利用这种产后组织衍生的细胞来避免排斥和防止移植接受者中的移植物抗宿主疾病的方法。
发明背景
在整个说明书中引用了各种公开物，包括专利、公开的申请、技术文献和学术论文。这些公开物的每一种通过引用将其全部内容合并在此。
组织移植被指明用于治疗各种疾病、病理和外伤性损伤。虽然每年进行了数千例移植，仅在美国就有几乎90,000人发现他们自己处在组织和器官的各种移植等待名单中。加剧可用的移植组织的短缺的是对移植供体和移植接受者之间兼容性(compatibility)的强烈需求。
移植供体和接受者的兼容性主要起源于主要组织相容性复合体(MHC)，其编码在细胞表面表达的糖蛋白。在人类中称为人类白细胞抗原(HLA)的这些糖蛋白在免疫***区分自身和非自身的能力方面起到重要的作用。(Thorsby E et al.(2004)TransplantProc.36(2Suppl):16S-21S)。存在着三种主要的HLA分子分类，HLA-A、HLA-B和HLA-DR，其中的一组被称为单体型。(Bradley B(1991)Immunol Lett 29:55-59；和Schreuder GM etal.(1999)Tissue Antigens,54:490-437)。在人类中，从每个亲本获得一个单体型。
每一组的HLA分子是高度多态性的。(Turner D(2004)Vox Sang.87Suppl1:87-90)。因而，甚至在同胞(sibling)之中也存在着HLA表达的高度变异性。(Jeras M(2002)Transpl.Immunol.10:205-14)。HLA表达的这种高度变异性对于移植目的是成问题的，在移植供体和接受者之间的任何HLA不匹配将会促成移植的组织的排斥。(Petersdorf EW(2004)Curr.Op.Hematol.11:386-391)。
来自于HLA不匹配的另一个难题是移植物抗宿主疾病(GVHD)。一般在移植的组织含有可以攻击移植宿主的组织的免疫活性细胞的情况下发生GVHD。就此来说，骨髓移植(BMT)和造血干细胞移植(HSCT)是特别成问题的，因为它们一般包含并可以产生免疫活性细胞。(Iwasaki T(2004)Clin.Med.Res.2:243-252).
BMT和HSCT被指明用于各种血液疾病和免疫失调，而HSCT越来越成为优选的方法。然而，对于HSCT患者的存活和总体健康状态的障碍之一是GVHD和相关的并发症。(Morishima Y et al.(2002)Blood.99:4200-4206)。HLA兼容性在移植物衰竭或存活、以及移植接受者是否处于发生GVHD的风险中起到重要作用。(Davies SM(2000)Blood 96:4096-41002；和Dickinson AM et al.(2005)Curr.Opin.Immunol.17:517-525).
为了避免GVHD和移植的组织的排斥，移植接受者必需承受终生的免疫抑制治疗方式。许多抗排斥药物在移植患者中引起严重的副作用，它们的免疫抑制效果可能使患者易感于机会性的感染和某些癌症。因而，组织移植方面显著的改进将是提供一种方式来抑制移植接受者中的有害免疫反应例如GVHD和移植的组织的排斥，具有相比传统方法更低严重度的副作用和并发症，并且没有传统方法的全身性免疫抑制。
发明概述
本发明的一个方面特征在于在与移植供体组织相容性不匹配的移植接受者中抑制有害免疫反应的方法。所述方法包括以有效抑制所述有害免疫反应的数量向移植接受者施用细胞组合物，其中所述细胞组合物包含药学上可接受的载体和来自基本上没有血液的人类产后组织的产后衍生的细胞，所述细胞能够在培养中自我更新和扩增(self-renewaland expansion in culture)，其中所述细胞需要L－缬氨酸 用于生长并且能够在含有约5％到至少约20％的氧气的空气(atmosphere)中生长，其中所述细胞包括至少一种以下的特征：(a)在培养中至少约40次加倍(doublings)的潜力；(b)在包被的或未包被的组织培养器皿上附着和扩增，其中包被的组织培养器皿包含明胶、层粘连蛋白、胶原、聚鸟氨酸、玻连蛋白或纤连蛋白的包被；(c)产生组织因子、波形蛋白和α-平滑肌肌动蛋白的至少一种；(d)产生CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α、PD-L2和HLA–A、B、C的至少一种；(e)如通过流式细胞术检测的，不产生CD31、CD34、CD45、CD80、CD86、CD117、CD141、CD178、B7-H2、HLA-G和HLA-DR、DP、DQ的至少一种；(g)表达白细胞介素8；浆膜蛋白1(reticulon 1)；趋化因子(C-X-C基序)配体1(黑素瘤生长刺激活性，α)；趋化因子(C-X-C基序)配体6(粒细胞趋化性蛋白质2)(chemokine(C-X-C motif)ligand 6(granulocyte chemotactic protein 2))；趋化因子(C-X-C基序)配体3；以及肿瘤坏死因子，α-诱导的蛋白3的至少一种；(g)表达C-型(钙依赖性，碳水化合物-识别结构域)凝集素超家族成员2(活化诱导的)；肾母细胞瘤1(Wilmstumor 1)；醛脱氢酶1家族成员A2；和肾素；氧化的低密度脂蛋白(凝集素-样)受体1；智人(Homo sapiens)，克隆IMAGE:4179671，mRNA，部分cds；蛋白激酶C，zeta；推定的蛋白质DKFZp564F013；在卵巢癌1中下调的(downregulated in ovarian cancer 1)；智人mRNA；和cDNA DKFZp547K1113(来自克隆DKFZp547K1113)的至少一种；(h)相对于作为成纤维细胞、间质干细胞或髂嵴骨髓细胞(iliac crest bone marrow cell)的人类细胞，以下至少一种的基因的表达被降低：短体态同源框2(short stature homeobox 2)；热激27kDa蛋白2；趋化因子(C-X-C基序)配体12(基质细胞衍生的因子1)；弹性蛋白(瓣膜上主动脉狭窄(supravalvular aortic stenosis)，Williams-Beuren综合征)；智人mRNA；cDNADKFZp586M2022(来自克隆DKFZp586M2022)；间充质同源框2(生长延滞-特异性同源框)(mesenchyme homeobox 2(growth arrest-specific homeobox))；sine oculis同源框同源物1(果蝇)；晶状体蛋白(crystallin)，αB；形态发生蛋白2的散乱相关的活化物(dishevelled associated activator of morphogenesis 2)；DKFZP586B2420蛋白质；类似于neuralin 1的(similar to neuralin 1)；tetranectin(血纤蛋白溶酶原结合蛋白)；src同源三(SH3) 和半胱氨酸富含结构域(src homology three(SH3)and cysteine richdomain)；B细胞转位基因1，抗增殖(B-cell translocation gene 1,anti-proliferative)；胆固醇25-羟化酶；runt-相关转录因子3；推定的(hypothetical)蛋白FLJ23191；白细胞介素11受体，α；前胶原C-内肽酶增强子；卷发同源物7(果蝇)(frizzledhomolog 7(Drosophila))；推定的基因BC008967；胶原，VIII型，α1；tenascin C(hexabrachion)；易洛魁人同源框蛋白5(iroquois homeobox protein 5)；hephaestin；整联蛋白，β8；突触小泡糖蛋白2(synaptic vesicle glycoprotein 2)；智人cDNA FLJ12280fis，克隆MAMMA1001744；细胞因子受体样因子1；钾中间体/小导电性钙活化通道，N亚家族，成员4(potassium intermediate/small conductance calcium-activated channel,subfamily N,member 4)；整联蛋白，α7；DKFZP586L151蛋白；与PDZ-结合基序(TAZ)的转录共活化剂(transcriptional co-activator with PDZ-binding motif(TAZ))；sineoculis同源框同源物2(果蝇)；KIAA1034蛋白；早期生长反应3(early growth response3)；末端减少同源框5(distal-less homeobox 5)；推定的蛋白FLJ20373；醛-酮还原酶家族1，成员C3(3-α羟甾醇脱氢酶，II型)(aldo-keto reductase family 1,member C3(3-αhydroxysteroid dehydrogenase,type II))；biglycan；纤连蛋白1；前脑啡肽；整联蛋白，β-样1(具有EGF-样重复结构域)；智人mRNA全长***cDNA克隆EUROIMAGE 1968422；EphA3；KIAA0367蛋白；利尿钠肽受体C/鸟苷酸环化酶C(atrionatriuretic肽受体C)；推定的蛋白质FLJ14054；智人mRNA；cDNA DKFZp564B222(来自克隆DKFZp564B222)；泡囊相关的膜蛋白5(myobrevin)；含EGF的fibulin-样细胞外基质蛋白1；BCL2/腺病毒E1B 19kDa相互作用蛋白质3-样(BCL2/adenovirus E1B 19kDa interacting protein 3-like)；AE结合蛋白1；细胞色素c氧化酶亚单位VIIa多肽1(肌肉)；成神经细胞瘤，肿瘤发生1的抑制(neuroblastoma,suppression of tumorigenicity 1)；胰岛素-样生长因子结合蛋白2，36kDa；(i)MCP-1、IL-6、IL-8、GCP-2、HGF、KGF、FGF、HB-EGF、BDNF、TPO、MIP1a、RANTES和TIMP1的至少一种的分泌；和(j)通过ELISA检测的，缺少TGF-β2、ANG2、PDGFbb、MIP1b、I309、MDC和VEGF的至少一种的分泌。
在某些实施方式中，有害的免疫反应是移植物抗宿主疾病， 而在其他实施方式中，有害的免疫反应是移植的组织的排斥。产后衍生的细胞可以是胎盘衍生的细胞、脐带衍生的细胞，或胎盘衍生的细胞和脐带衍生的细胞的组合。在各种实施方式中，通过注射或输注来施用细胞组合物，或者它可以通过植入到移植接受者中的设备、支架或基质的植入(implantation of a device,scaffold or matrix implanted in the transplantrecipient)来施用。
在某些实施方式中，所述细胞组合物包含至少约50％产后衍生的细胞(postpartum-derived cells)。在其他实施方式中，所述细胞组合物包含基本上同质的产后衍生的细胞的群体。在某些实施方式中，所述细胞与至少一种其他细胞类型一起施用。所述其他细胞类型可以与产后衍生的细胞同时地、或在其之前、或在其之后施用。在某些实施方式中，所述细胞与用于治疗有害免疫反应的至少一种其他试剂一起施用。所述其他试剂可以与产后衍生的细胞同时地、或在其之前、或在其之后施用。所述其他试剂可以包括抗血栓形成试剂(antithrombogenic agent)、抗炎症试剂、免疫抑制试剂、免疫调节试剂或抗细胞凋亡试剂的一种或多种。
本发明的另一个方面特征在于用于在与移植供体组织相容性不匹配的移植接受者中抑制有害免疫反应的药物组合物，包括药学上可接受的载体和在与移植供体组织相容性不匹配的移植接受者中有效抑制有害免疫反应的数量的以上描述的产后衍生的细胞。
在某些实施方式中，有害的免疫反应是移植物抗宿主疾病，而在其他实施方式中，有害的免疫反应是移植的组织的排斥。产后衍生的细胞可以是胎盘衍生的细胞、脐带衍生的细胞，或胎盘衍生的细胞和脐带衍生的细胞的组合。在各种实施方式中，所述药物组合物被配制用于通过注射或输注来施用，或者它可以被配制为通过植入到移植接受者中的设备、支架或基质的植入来施用。
在某些实施方式中，所述药物组合物包含至少约50％产后衍生的细胞在其他实施方式中，它包含基本上同质的产后衍生的细胞的群体。在某些实施方式中，所述药物组合物包含至少一种其他细胞类型或用于治疗有害免疫反应的至少一种其他试剂。所述其他试剂可以包括抗血栓形成试剂、抗炎症试剂、免疫抑制试剂、免疫调节试剂或抗细胞凋亡试剂的一种或多种。
本发明的另一个方面特征在于用于在与移植供体组织相容性不匹配的移植接受者中抑制有害免疫反应的试剂盒，包括药学上可接受的载体和如上所述产后衍生的细胞的群体，以及在抑制有害免疫反应的方法中使用所述试剂盒的说明。所述试剂盒还可以包括一种或多种的：用于培养产后衍生的细胞的至少一种试剂和说明书、或至少一种其他细胞类型、或用于抑制有害免疫反应的至少一种其他试剂。
本发明的另一个方面特征在于在与移植供体组织相容性不匹配的移植接受者中抑制有害免疫反应的方法，包括向所述患者施用组合物，所述组合物包含一种或多种的：通过上述产后衍生的细胞产生的条件培养基、产自上述产后衍生的细胞的细胞溶胞产物、产自上述产后衍生的细胞的可溶细胞级分、或含有上述产后衍生的细胞的细胞外基质。
本发明的又一个方面特征在于用于在与移植供体组织相容性不匹配的移植接受者中抑制有害免疫反应的药物组合物，包含药学上可接受的载体和有效在与移植供体组织相容性不匹配的移植接受者中抑制有害免疫反应的数量的前述的条件培养基、细胞溶胞产物、可溶细胞级分或细胞外基质。
本发明的再另一个方面特征在于用于在与移植供体组织相容性不匹配的移植接受者中抑制有害免疫反应的试剂盒，包括药学上可接受的载体、以上描述的包含产后衍生的细胞的条件培养基、细胞溶胞产物、可溶细胞级分或细胞外基质，以及在抑制有害免疫反应的方法中使用所述试剂盒的说明。
根据以下的附图、详细说明和随后的实施例，本发明的其他特征和益处将被理解。
附图的简要说明
附图1.显示了在圆底平板中使用第三方IFNg处理的胎盘衍生的细胞的双向混合淋巴细胞反应(MLR)的结果的柱形图。
附图2.显示了在圆底平板中使用未处理的胎盘衍生的细胞的双向混合淋巴细胞反应(MLR)的结果的柱形图。
附图3.显示了在圆底平板中使用第三方IFNg处理的脐带衍生的细胞的双向混合淋巴细胞反应(MLR)的结果的柱形图。
附图4.显示了在圆底平板中使用未处理的脐带衍生的细胞的双向混合淋巴细胞反应(MLR)的结果的柱形图。
说明性实施方式的详细说明
在整个说明书和权利要求中使用了关于本发明的方法和其他方面的各种术语。除非另有陈述，这些术语按照它们在本领域中的一般含义来给出。其他特别地限定的术语按照与在此提供的定义相符的方式来解释。
在说明书和实施例中可以使用以下缩写：PPDC，产后衍生的细胞；UDC，脐带衍生的细胞；PDC，胎盘衍生的细胞；MHC，主要组织相容性复合体；HLA，人类白细胞抗原；BMT，骨髓移植；HSCT，造血干细胞移植；GVHD，移植物抗宿主疾病；
干细胞是根据单个细胞自我更新和分化产生后代细胞的能力来定义的未分化的细胞，包括自我更新的祖细胞、非更新的祖细胞、和末期分化的细胞。干细胞还特征在于它们从多胚层(内胚层、中胚层和外胚层)体外分化成各种细胞谱系的功能细胞的能力，以及在移植后产生多胚层的组织、在注射入胚泡之后贡献于如果不是全部也是大多数组织的能力。
干细胞根据它们的发育潜力被分类为：(1)全能性的；(2)多潜能性的(pluripotent)；(3)多能性的(multipotent)；(4)寡能性的(oligopotent)；和(5)单能性的(unipotent)。全能细胞能够产生所有的胚胎和胚胎外细胞类型。多潜能细胞能够产生所有的胚胎细胞类型。多能细胞包括能够产生细胞谱系的子集、但都处于特定组织、器官或生理***内的那些(例如，造血干细胞(HSC)可以产生子代，所述子代包括HSC(自我更新的)、血细胞限制的寡能性祖代细胞，和作为血液的成分的所有细胞类型和成分(例如，血小板))。寡能性的细胞可以产生比多能干细胞更为局限的细胞谱系的子集；单能的细胞能够产生单个细胞谱系(例如，***发生干细胞)。
干细胞还在获得它们的来源的基础上来分类。成年人干细胞一般是在包含多种分化的细胞类型的组织中发现的多能未分化的细胞。成年人干细胞可以自我更新。在正常的环境中，它还可以分化产生它所发源的组织的特化的细胞类型，以及可能的其他组织类型。胚胎干 细胞是来自胚泡阶段胚胎的内细胞团的多潜能细胞。胎儿干细胞是来源于胎儿组织或膜的细胞。产后干细胞是多能或多潜能细胞，其基本上发源于来出生后可获得的胚胎外组织，即，胎盘和脐带。已经发现这些细胞拥有多潜能干细胞的特征，包括快速增殖和分化成许多细胞谱系的潜力。产后干细胞可以是血液衍生的(例如，从脐带血液获得的那些)，或非血液衍生的(例如，从脐带和胎盘的非血液组织获得的)。
胚胎组织一般定义为来自胚胎的组织(其在人类中是指从受精到发育约六周的时期)。胎儿组织是指来自胎儿的组织，其在人类中是指从发育约六周到分娩的时期。胚胎外组织是与胚胎或胎儿相关的但不来源于胚胎或胎儿的组织。胚胎外组织包括胚胎外膜(绒毛膜、羊膜、卵黄囊和尿囊)、脐带和胎盘(其本身形成于绒毛膜和母亲的基蜕膜)。
分化是非特化的(“未定型的”)或较少特化的细胞获得特化细胞例如神经细胞或肌细胞的特征的过程。分化的细胞是具有在细胞的谱系内的进一步特化的(“定型的”)位置的细胞。术语定型的当用于分化的过程时是指细胞在分化途径上进行到某一点，在此，在正常的环境下它将继续分化成特定的细胞类型或细胞类型的子集，但在正常的环境下不能分化成不同的细胞类型或回复成较少分化的细胞类型。去分化是指细胞在细胞谱系内回复成较少特化(或定型的)位置的过程。如在此使用的，细胞的谱系是指细胞的遗传性，即，它来自于哪种细胞和它产生哪种细胞。细胞的谱系将细胞置于发育和分化的遗传流程图中。
在广义上，祖细胞是具有能力来产生比自身更为分化的子代、并仍然保持补充祖代的库的能力的细胞。根据该定义，干细胞本身也是祖细胞，最接近的前体与末端分化的细胞也是这样。当涉及本发明的细胞时，如以下更详细描述的，可以使用祖细胞的这种广泛的定义。在狭义上，祖细胞通常被定义为作为分化途径中的中间体的细胞，即，它来自于干细胞，是成熟细胞类型或细胞类型的子集的产生中的中间体。这种类型的祖细胞一般不能自我更新。因而，如果在此提及这种细胞类型，它将被称为非更新祖细胞或中间体祖代或前体细胞。
术语抑制是指降低在移植供体组织针对移植接受者的适应性的免疫反应中观察到的有害的免疫学事件、移植物抗宿主疾病、以及移植接受者针对移植供体组织的适应性免疫反应。
本发明的细胞泛指产后的细胞或产后衍生的细胞(PPDC)。它们有时还更具体地指脐带衍生的细胞(UDC)或胎盘衍生的细胞(PDC)。此外，细胞可以被描述为干细胞或祖细胞，后一术语广义地使用。术语衍生的被用于表明细胞已经从人们的生物学来源获得并被体外地生长或操作(例如，在生长培养基(Growth Medium)中培养来扩增群体和/或产生细胞系)。以下详细描述了本发明的脐带干细胞的体外操作和脐带衍生的细胞的独特特征。
各种术语被用于描述培养中的细胞。细胞培养一般涉及从活有机体取得并在受控的条件生长的细胞(“培养”或“培养的”)。原始细胞培养物是在第一次传代培养之前直接取自有机体的细胞、组织或器官的培养物。当细胞置于生长培养基中处在便于细胞生长和/或***的环境中时，细胞扩增，产生细胞的更大的群体。当细胞在培养中扩增时，细胞增殖的速率有时由细胞在数目上加倍所需的时间量来度量。这被称为加倍时间。
细胞系是由原始细胞培养物的一次或多次传代培养形成的细胞群体。每一轮传代培养被称为传代。当细胞被传代培养时，它们被称为已经传代。特定的细胞或细胞系的群体有时称为或表征为它传代的次数。例如，传代十次的培养的细胞群体可以称为P10培养物。原始培养物，即，在从组织分离细胞之后的第一培养物被称为P0。在第一次传代培养之后，细胞被称为二级培养物(P1或传代1)。在第二次传代培养之后，细胞称为第三培养物(P2或传代2)，如此等等。本领域技术人员将理解的是，在传代期间可能有多次群体加倍；因而，培养物的群体加倍的数量大于传代数。在传代之间时期的细胞扩增(即，群体加倍的数目)取决于许多因素，包括但不限于播种密度、底物、培养基、生长条件和传代之间的时间。
条件培养基是一种培养基，其中培养了特定的细胞或细胞群体，然后被去除。当细胞在培养基中培养时，它们可以分泌为其他细胞提供营养支持的细胞因子。这些营养因子包括但不限于激素、细胞因子、细胞外基质(ECM)、蛋白质、泡囊、抗体和微粒。含有细胞因子的培养基是条件培养基。
生长培养基一般是指足够培养PPDC的培养基。特别地，用于培养本发明的细胞的一种当前优选的培养基包括Dulbecco’s Modified Eagle培养基(也称为Dulbecco’s最低必需培养基)(DMEM)。特别优选的是DMEM-低葡萄糖(在此也称DMEM-LG)(Invitrogen,Carlsbad,CA)。DMEM-低葡萄糖优选的补充有15％(v/v)胎儿牛血清(例如，限定的胎儿牛血清，Hyclone,Logan UT)、抗生素和抗真菌剂(优选的，50-100单位/毫升青霉素，50-100微克/毫升链霉素，和0-0.25微克/毫升两性霉素B；Invitrogen，Carlsbad,CA)，以及0.001％(v/v)2-巯基乙醇(Sigma,St.Louis MO)。
术语标准生长条件是指在37℃、在包含5％CO2的标准的湿润空气中的细胞培养。虽然这种条件对于培养是有用的，要理解的是这种条件能够由本领域技术人员改变，他将理解培养细胞的领域中可用的选择。
一般地，营养因子被定义为促进细胞的存活、生长、增殖和/或成熟，或刺激细胞的提高的活性的物质。
当涉及培养的脊椎动物细胞时，术语衰老(以及复制型衰老或细胞衰老)是指可归因于有限的细胞培养的性质；即，它们不能生长超过有限数量的群体加倍(有时称为Hayflick’s限制)。虽然细胞衰老使用成纤维细胞样细胞被首次描述，可以在培养中成功地生长的大多数正常人细胞类型经历细胞衰老。不同细胞类型的体外寿命是可变的，但是最大寿命一般少于100次群体加倍(这是所有细胞在培养中变得衰老因而使得培养物不能***的加倍次数)。衰老不取决于时序时间(chronological time)，而是由培养物经历的细胞***或群体加倍的次数来度量。因而，当重新引入生长因子时，通过除去必需的生长因子而变得静息的细胞能够恢复生长和***，此后进行与连续生长的细胞等量的相同次数的加倍。类似地，当细胞在各种次数的群体加倍之后在液氮中冷冻然后解冻并培养时，它们经历与培养中维持不冷冻的细胞基本上相同数量的加倍。衰老的细胞不是死亡的或垂死的细胞；它们实际上对程序性细胞死亡(细胞凋亡)有抗性，并维持在它们的非***状态长达三年。这些细胞是非常有活力和代谢活性的，但是它们不***。还没有发现衰老的细胞的非***状态通过任何生物学、化学或病毒试剂而是可逆的。
术语有效量是指化合物、材料或组合物的浓度或数量，如在此描述的其足够实现特定的生物学结果。这些结果包括但不限于，抑制移植供体组织针对移植接受者的适应性免疫反应、以及移植接受者针 对移植供体组织的适应性免疫反应，抑制移植物抗宿主疾病，以及抑制移植排斥。这种有效的活性可以通过例如向接受者施用本发明的细胞和/或组合物来实现。对于向患者体内施用的PPDC，有效量可以从少至数百个或更少到多至数百万或更多。在特定的实施方式中，有效量可以从103-1011个，更具体的至少约104个细胞。要理解的是，要施用的细胞的数量将取决于要治疗的失调的特点而改变，包括但不限于要治疗的大小或总容量/表面积、以及施用的位点与要治疗的区域位置的接近度、和本领域技术人员熟悉的其他因素。
术语有效期(或时间)和有效条件是指时间期间或其他可控制的条件(例如，体外方法的温度、湿度)，对于试剂或药物组合物实现其预期结果是必需的或优选的。
适应性免疫(adaptive immunity)或适应性免疫反应在此广义地、可互换地使用，是指对于抗原攻击的免疫反应，包括免疫记忆的发育。适应性免疫反应无限制地包括体液和细胞免疫。
体液免疫或体液免疫反应在此可互换地使用，是指响应于抗原攻击的免疫球蛋白分子的产生。
细胞免疫或细胞免疫反应或细胞介导的免疫在此可互换地使用，是指响应于抗原攻击的细胞毒性或辅助T淋巴细胞、单核细胞和细胞因子的产生、活化和/或增殖。该术语包括所有不能利用抗体转移到天然接受者的所有适应性免疫。
先天免疫是指身体关于对抗原攻击的抗性的非特异性机制，其在使用特定抗原的随后的攻击时不增强。
术语患者或受试者在此可互换地使用，是指动物，包括哺乳动物，优选的人类，其使用在此描述的药物组合物或根据在此描述的方法来治疗。
术语供体或移植供体在此可互换地使用，是指作为要移植到另一个有机体的细胞或组织的来源的任何有机体。术语接受者或移植接受者或移植患者在此可互换地使用，是指接受来自供体的移植的组织的任何有机体。
组织相容性不匹配(histocompatibility-mismatch)是指在移植供体和移植接受者之间组织相容性抗原方面的任何差异，其可以引发移植的细胞或组织针对移植接受者的组织的免疫反应，可以引发移植接 受者针对移植的细胞或组织的免疫反应，和/或可以引起移植的组织的排斥或移植物抗宿主疾病。
排斥是指针对移植的细胞或组织的任何免疫反应，其可以引起移植物的降低的生长或生命力，或移植物存活的失败。
移植物抗宿主疾病(graft versus host disease,GVHD)在此按广义使用，是指来自移植供体的细胞或组织针对移植接受者的细胞或组织的任何免疫反应，不考虑反应的严重度和持续时间，不考虑移植接受者是否显现本领域公认的GVHD的任何临床症状。
术语药学上可接受的载体(或介质)，其可以与术语生物学相容的载体或介质可互换地使用，是指试剂、细胞、化合物、材料、组合物和/或剂型，其不仅与要治疗性施用的细胞和其他试剂是相容的，而且在可靠的医学判断的范畴内，适合于接触人类和动物的组织而没有过度的毒性、刺激、变应性反应或其他具有合理的效益/风险比例的并发症。如在此更详细地描述的，适用于本发明的药学上可接受的载体包括液体、半固体(例如，凝胶)和固体材料(例如，细胞支架和基片，管片和其他本领域已知的和在此更详细描述的这样的材料)。这些半固体和固体材料可以被设计以抵抗身体内的降解(非生物可降解的)，或者它们被设计以在身体内降解(生物可降解的，生物可侵蚀的)。生物可降解的材料可以进一步是生物可重吸收的或生物可吸收的，即，可以溶解于或吸收到体液中(水溶性的植入物是一个实例)，或降解并最终从身体排出，通过转变成其他材料或通过天然的途径分解和消除。
对于细胞或组织移植在此使用了几个术语。术语自体的转移、自体移植、自体移植物等等，是指其中移植供体也是移植接受者的移植。术语同种异体的转移、同种移植、同种异体移植物等等，是指其中移植供体是移植接受者的相同物种、但不是相同个体的移植。其中供体的细胞已经与接受者组织相容性匹配的细胞移植有时被称为同基因的转移。术语异种的转移、异种移植、异种移植物等等是指其中移植供体是移植接受者的不同物种的移植。
根据在此描述的方法，哺乳动物胎盘和脐带在足月或足月妊娠前的末期之时或稍后，例如在出生后的娩出之后被回收。产后的组织可以在无菌容器例如烧瓶、烧杯、培养皿或袋中从出生位置转移到实验室。容器可以具有溶液或培养基，包括但不限于盐溶液，例如， Dulbecco’s修改的Eagle’s培养基(DMEM，也称为Dulbecco’s最低必需培养基)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)或用于用来移植的器官的运输的任何溶液，例如威斯康星大学溶液或全氟化合物溶液。一种或多种抗生素和/或抗真菌剂，例如但不限于青霉素、链霉素、两性霉素B、庆大霉素和制霉菌素可以被添加到所述培养基或缓冲液。产后的组织可以使用抗凝血剂溶液，例如含有肝素的溶液来清洗。优选的是在提取PPDC之前将组织保持在大约4-10℃。更优选的是，在提取PPDC之前组织不被冷冻。
PPDC的分离优选的在无菌环境中实现。脐带可以通过本领域已知的手段从胎盘分离。做为选择，使用不分离的脐带和胎盘。优选的在分离PPDC之前从产后组织除去血液和碎屑。例如，产后组织可以用缓冲溶液洗涤，例如但不限于磷酸盐缓冲盐水。洗涤缓冲液也可以包含一种或多种抗真菌的和/或抗生试剂，例如但不限于青霉素、链霉素、两性霉素B、庆大霉素和制霉菌素。
包含完整胎盘或其片段或切片的产后组织通过机械力来解聚(切剁或剪切力)。在当前优选的实施方式中，分离操作还利用酶学消化过程。本领域已知许多酶对于从复合组织基质分离单独的细胞以促进培养物中的生长是有用的。从微弱地消化(例如，脱氧核糖核酸酶和中性的蛋白酶，分散酶(dispase))到强烈消化(例如，木瓜蛋白酶和胰蛋白酶)，这些酶是商业上可获得的。于此相符的酶的非穷尽列表包括粘多糖酶活性、金属蛋白酶、中性蛋白酶、丝氨酸蛋白酶(例如，胰蛋白酶、糜蛋白酶或弹性蛋白酶)和脱氧核糖核酸酶。当前优选的是选自金属蛋白酶、中性蛋白酶和粘液溶解活性的酶活性。例如，已知胶原酶对于从组织分离各种细胞是有用的。脱氧核糖核酸酶可以消化单链的DNA并可以最小化分离期间的细胞聚集。优选的方法包括使用例如胶原酶和分散酶、或胶原酶、分散酶以及透明质酸酶的酶处理，提供了这样的方法，其中在某些优选的实施方式中，胶原酶和中性蛋白酶分散酶的混合物被用于解离步骤。更优选的是那些方法，其在存在至少一种来自溶组织梭状芽胞杆菌(Clostridium histolyticum)的胶原酶、以及蛋白酶活性、分散酶和嗜热菌蛋白酶之一的情况下进行消化。再更优选的是使用胶原酶和分散酶活性进行消化的方法。还优选的是除了胶原酶和分散酶活性之外包括使用透明质酸酶活性来消化的方法。熟练的技术人员将理解，为了从各种组织来源分离细胞，许多这样的酶处理是本领域已知的。例如，LIBERASEBlendzyme(Roche)系列的酶组合适用于本方法。其他的酶来源是已知的，熟练的技术人员也可以之间从它们的天然来源获得这些酶。熟练的技术人员还具有良好的知识来评估新的或其他的酶或酶组合在分离本发明的细胞方面的实用性。优选的酶处理是0.5、1、1.5或2小时时间或更久。在其他优选的实施方式中，组织在解离步骤的酶处理期间在37℃孵育。
在本发明的一些实施方式中，产后组织被分割成包含组织的各个部位的切片，例如，胎盘的新生儿的、新生的/母亲的、和母亲的部分。分离的切片然后根据在此描述的方法通过机械和/或酶学解离来离解。新生儿的或母亲的***的细胞可以通过本领域已知的任何方法来鉴别，例如，通过核型分析或Y染色体的原位杂交。
长出PPDC的分离的细胞或产后组织可以用于启动、或播种细胞培养物。分离的细胞被转移到无菌的组织培养器皿，其是未包被的，或包被有细胞外基质或配体，例如层粘连蛋白、胶原(天然的、变性的或交联的)、明胶、纤连蛋白和其他细胞外基质蛋白。PPDC被培养在能够维持细胞的生长的任何培养基中，例如但不限于DMEM(高或低葡萄糖)、改进的DMEM、DMEM/MCDB 201、Eagle’s基础培养基、Ham’s F10培养基(F10)、Ham’s F-12培养基(F12)、Hayflick’s培养基、Iscove’s修改的Dulbecco’s培养基、间质干细胞生长培养基(MSCGM)、DMEM/F12、RPMI 1640和CELL-GRO-FREE。培养基可以补充有一种或多种成分，包括，例如，胎儿牛血清(FBS)，优选的约2-15％(v/v)；马血清(ES)；人类血清(HS)；胎儿小牛；β-巯基乙醇(BME或2-ME)，优选的约0.001％(v/v)；一种或多种生长因子，例如血小板衍生生长因子(PDGF)，表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血管内皮的生长因子(VEGF)、胰岛素-样生长因子-1(IGF-1)、白细胞抑制因子(LIF)和***；氨基酸，包括L－缬氨酸；和一种或多种抗生素和/或抗真菌剂来控制微生物污染，例如，青霉素G、链霉素硫酸盐、两性霉素B、庆大霉素和制霉菌素，单独的或组合的。培养基优选的包含实施例所定义的生长培养基。
细胞以一定密度播种到培养容器中以允许细胞生长。在优 选的实施方式中，细胞在空气中约0到约5体积百分比的CO2中培养。在某些优选的实施方式中，细胞在空气中约2到约25百分比O2中，优选的在空气中约5到约20百分比O2中培养。细胞优选的在约25到约40℃培养，更优选的在37℃培养。细胞优选的在孵化器中培养。培养容器中的培养基可以是静态的或摇动的，例如，使用生物反应器。PPDC优选的在低氧逆境下培养(例如，添加谷胱甘肽、维生素C、过氧化氢酶、维生素E、N-乙酰半胱氨酸)。如在此使用的“低氧化逆境”是指没有或最小的对培养的细胞的自由基损害的条件。
最合适的培养基、培养基制备和细胞培养物技术的选择方法是本领域公知的，在各种来源中描述了，包括Doyle et al.,(eds.),1995,CELL&TISSUE CULTURE:LABORATORYPROCEDURES,John Wiley&Sons,Chichester；and Ho and Wang(eds.),1991,ANIMAL CELLBIOREACTORS,Butterworth-Heinemann,Boston，通过引用将它们合并在此。
在培养分离的细胞或组织片段足够的时间之后，作为从产后组织的迁移或细胞***的结果之一或两者，PPDC将长出。在本发明的某些实施方式中，PPDC被传代或移动到含有与最初使用的相同或不同类型的新鲜培养基的独立培养容器中，在其中细胞群体可以有丝***地扩增。本发明的细胞可以在传代0和衰老之间的任一点使用。细胞优选的被传代约3到约25次之间，更优选的被传代约4到约12次，优选的被传代10或11次。可以进行克隆和/或亚克隆来确认已经分离了细胞的克隆群体。
在本发明的某些方面，产后组织中存在的不同的细胞类型被分级成亚群，从中可以分离PPDC。这可以使用用于细胞分离的标准技术实现，包括但不限于，酶处理来将产后组织离解成它的组成细胞，之后克隆和选择特定的细胞类型，例如但不限于根据形态学和/或生物化学的标记物来选择；选择期望的细胞的生长(正选择)、选择不需要的细胞的破坏(负选择)；根据混合的群体中与例如大豆凝集素的不同细胞可凝集性来分离；冻融操作；混合的群体中细胞的不同粘附性质；过滤；常规的和区带离心；离心的淘选(逆流离心)；单位重力分离；逆流分布；电泳；以及荧光活化的细胞分选(FACS)。对于克隆选择和细胞分离技术的综述，参见Freshney,1994,CULTURE OF ANIMAL CELLS:A MANUAL OF BASICTECHNIQUES,3rd Ed.,Wiley-Liss,Inc.,New York，通过引用将其合并在此。
培养基根据需要来改变，例如，通过使用例如移液管小心地从平皿吸出培养基，并补充新鲜的培养基。继续孵育直到在平皿中积累了足够数量或密度的细胞。可以除去原始的外植的组织切片，其余的细胞使用标准技术或使用细胞刮刀胰蛋白酶化。在胰酶消化之后，收集细胞，移到新鲜培养基中并如上述的孵育。在某些实施方式中，培养基在胰酶消化之后大约24小时至少改变一次以除去任何漂浮的细胞。保持在培养基中的细胞被认为是PPDC。
PPDC可以被低温保存。因而，在以下更详细描述的优选的实施方式中，用于自体转移(用于母亲或孩子)的PPDC可以来孩子出生之后来自适合的产后组织，然后低温保存以在将来它们需要移植时是可用的。
PPDC可以被表征，例如，通过生长特征(例如，群体加倍能力，加倍时间，衰老的传代数)、核型分析(例如，正常的染色体组型；母系的或新生儿的***)、流式细胞术(例如，FACS分析)、免疫组织化学和/或免疫细胞化学(例如表位的检测)、基因表达分布(例如，基因芯片阵列；聚合酶链式反应(例如，逆转录酶PCR、实时PCR和常规的PCR))、蛋白质阵列，蛋白质分泌(例如，通过血浆凝结分析或PDC条件培养基的分析，例如，通过酶联免疫吸附测定(ELISA))、混合淋巴细胞反应(例如，作为PBMC的刺激的度量)、和/或本领域已知的其他方法。
衍生自胎盘组织的PPDC的实例保藏在美国典型培养物保藏所(ATCC,Manassas,VA)并分配以下ATCC登记号码：(1)称为PLA 071003(P8)的株系于2004年6月15日保藏，分配的登记号No.PTA-6074；(2)称为PLA 071003(P11)的株系于2004年6月15日保藏，分配的的登记号NO.PTA-6075；以及(3)称为PLA 071003(P16)的株系于2004年6月16日保藏，分配的登记号NO.PTA-6079。衍生自脐组织的PPDC的实例与2004年6月10日保藏在美国典型培养物保藏所，登记号如下：(1)称为UMB 022803(P7)的株系分配了登记号NO.PTA-6067；(2)称为UMB 022803(P17)的株系分配了登记号NO.PTA-6068。
在各种实施方式中，PPDC具有一种或多种以下生长特征：(1)它们需要L－缬氨酸来在培养中生长；(2)它们能够在含有约5％到至少约20％的氧的空气中生长，(3)它们具有在到达衰老之前在培养中加倍至少约40次的能力；和(4)它们在包被的或未包被的组织培养器皿上附着和生长，其中包被的组织培养器皿包含明胶、层粘连蛋白、胶原、聚鸟氨酸、玻连蛋白或纤连蛋白的包被。
在某些实施方式中，PPDC具有正常的染色体组型，其在细胞传代时被维持。染色体分型对于从来自胎盘的母体细胞中鉴定和辨别新生儿细胞是有用的。染色体分型的方法是可获得的和技术人员已知的。
在其他实施方式中，PPDC可以特征在于某些蛋白质的产生，包括(1)产生组织因子、波形蛋白和α-平滑肌肌动蛋白的至少一种；和(2)产生CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α、PD-L2和HLA-A、B、C细胞表面标记物的至少一种，如流式细胞术所检测的。在其他实施方式中，所述PPDC可以特征在于不产生CD31、CD34、CD45、CD80、CD86、CD117、CD141、CD178、B7-H2、HLA-G和HLA-DR,DP,DQ细胞表面标记物的至少一种，如流式细胞术所检测的。特别优选的是，细胞产生组织因子、组波形蛋白和α-平滑肌肌动蛋白的至少两种。更优选的是产生蛋白组织因子、波形蛋白和α-平滑肌肌动蛋白的所有三种的那些细胞。
在其他实施方式中，PPDC可以特征在于基因表达，其相对于作为成纤维细胞、间质干细胞或髂嵴骨髓细胞的人类细胞，对于编码以下至少一种的基因是提高的：白细胞介素8；浆膜蛋白1；趋化因子(C-X-C基序)配体1(melonoma生长刺激活性，α)；趋化因子(C-X-C基序)配体6(粒细胞趋化性蛋白2)；趋化因子(C-X-C基序)配体3；肿瘤坏死因子，α-诱导的蛋白3；C型凝集素超家族成员3；胚胎性癌肉瘤1；醛脱氢酶1家族成员A2；肾素；氧化的低密度脂蛋白受体1；智人克隆IMAGE:4179671；蛋白激酶Czeta；推定的蛋白DKFZp564F013；卵巢癌1中下调的；以及来自克隆DKFZp547k1113的智人基因。
在再其他的实施方式中，PPDC可以特征在于基因表达，其相对于作为成纤维细胞、间质干细胞或髂嵴骨髓细胞的人类细胞，对于编码以下至少一种的基因是降低的：短体态同源框2；热激27kDa 蛋白2；趋化因子(C-X-C基序)配体12(基质细胞衍生的因子1)；弹性蛋白(瓣膜上主动脉狭窄，Williams-Beuren综合征)；智人mRNA；cDNA DKFZp586M2022(来自克隆DKFZp586M2022)；间充质同源框2(生长延滞-特异性同源框)；sine oculis同源框同源物1(果蝇)；晶状体蛋白，αB；形态发生蛋白2的散乱相关的活化物；DKFZP586B2420蛋白；类似于neuralin 1的；tetranectin(血纤蛋白溶酶原结合蛋白)；src同源三(SH3)和半胱氨酸富含结构域；胆固醇25羟化酶；runt相关的转录因子3；白细胞介素11受体，α；前胶原C-内肽酶增强子；卷发同源物7(果蝇)；推定的基因BC008967；胶原，VIII型，α1；tenascin C(hexabrachion)；易洛魁人同源框蛋白5；hephaestin；整联蛋白，β8；突触小泡糖蛋白2；成神经细胞瘤，肿瘤发生1的抑制；胰岛素-样生长因子结合蛋白2，36kDa；智人cDNAFLJ12280fis，克隆MAMMA1001744；细胞因子受体样因子1；钾中间体/小导电性钙活化通道，N亚家族，成员4；整联蛋白，β7；与PDZ-结合基序(TAZ)的转录共活化剂；sine oculis同源框同源物2(果蝇)；KIAA1034蛋白；泡囊相关的膜蛋白5(myobrevin)；含EGF的fibulin-样细胞外基质蛋白1；早期生长反应3；末端减少同源框5；推定的蛋白FLJ20373；醛-酮还原酶家族1，成员C3(3-α羟甾醇脱氢酶，II型)；biglycan；与PDZ-结合基序(TAZ)的转录共活化物；纤连蛋白1；前脑啡肽；整联蛋白，βlike 1(具有EGF-样重复结构域)；智人mRNA全长***cDNA克隆EUROIMAGE 1968422；EphA3；KIAA0367蛋白；利尿钠肽受体C/鸟苷酸环化酶C(atrionatriuretic肽受体C)；推定的蛋白FLJ14054；智人mRNA；cDNA DKFZp564B222(来自克隆DKFZp564B222)；BCL2/腺病毒E1B 19kDa相互作用蛋白3样；AE结合蛋白1；和细胞色素c氧化酶亚单位VIIa多肽1(肌肉)。
在其他实施方式中，所述PPDC可以是特征在于MCP-1、IL-6、IL-8、GCP-2、HGF、KGF、FGF、HB-EGF、BDNF、TPO、MIP1a、RANTES和TIMP1的至少一种的分泌。在选择性的实施方式中，PPDC可以特征在于没有TGF-β2、ANG2、PDGFbb、MIP1b、I309、MDC和VEGF的至少一种的分泌，如通过ELISA检测的。
在优选的实施方式中，细胞包含两种或多种以上列出的生长、蛋白/表面标志产生、基因表达或物质分泌特征。更优选的是包含三 种、四种、五种或更多所述特征的那些细胞。再更优选的是包含六种、七种或八种或更多种所述特征的PPDC。当前再更优选的是包含所有上述特征的细胞。
在某些优选的实施方式中，PPDC来源于基本上没有血液的脐带组织，能够在培养中自我更新和扩增，具有分化成至少神经表型的细胞的能力，生长需要L－缬氨酸，可以在至少约5％氧气中生长，并且包括至少一个以下特征：在培养中至少约40次加倍的能力；在包被的或未包被的组织培养器皿上附着和扩增，其包含明胶、层粘连蛋白、胶原、聚鸟氨酸、玻连蛋白或纤连蛋白的包被；产生波形蛋白和α平滑肌肌动蛋白；产生CD10、CD13、CD44、CD73和CD90；并且，相对于作为人类成纤维细胞、间质干细胞或髂嵴骨髓细胞的人类细胞，基因的表达对于编码白细胞介素8和浆膜蛋白1的基因被提高。在某些实施方式中，这种PPDC不产生CD45和CD117。这个段落中描述的PPDC可以用于与移植供体组织相容性不匹配的移植接受者中抑制有害免疫反应的方法，可以用于药物组合物，用于在与移植供体组织相容性不匹配的的移植接受者中抑制有害免疫反应，其中这种组合物包括具有这些特征的细胞和药学上可接受的载体，可以用于试剂盒，用于制造、使用和实践如在此描述和例示的这样的方法和药物组合物。此外，在这个段落中描述的PPDC可以用于产生条件细胞培养基，其可以用于制造、使用和实践在此描述和例示的这些方法和药物组合物。
在本发明的几个方面中当前优选用于本发明的细胞是具有如上所述特征的产后细胞，更特别的是其中细胞具有正常的染色体组型并在传代时维持正常的染色体组型的那些，以及进一步的，其中细胞表达标记物CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α和HLA-A、B、C的每一种，其中细胞产生相应于所列标记物的免疫学可检测的蛋白质。再更优选的是那些细胞，其除了上述的之外不产生与标记物CD31、CD34、CD45、CD117、CD141或HLA-DR,DP,DQ的任一个相应的蛋白质，如流式细胞术所检测的。
在本发明的几个方面的另一个中，本发明提供了包含如上所述的细胞的细胞群体。细胞群体在本发明的方法方面、以及在以比分离的细胞可以提供的更大的数量来制造药物细胞组合物和细胞溶胞产物方面是有用的。
优选的群体包含约1％的产后衍生的细胞到约10％的产后细胞。更优选的群体包含至少约10％产后衍生的细胞。更优选的群体包含至少约25％的产后衍生的细胞。并且，某些优选的群体包含约50％的产后衍生的细胞。这样的群体对于共培养物或其他培养物是有用的，其中细胞是同样稠密的并以相同的速率***，或者其中在共培养的或单独的培养物的扩增之后群体被调节到每个培养物的约50％。对于某些应用更优选的是包含至少约65％的产后衍生的细胞的群体。包含至少90％产后衍生的细胞的群体对于本发明的某些方面是高度优选的。更优选的群体基本上仅包含产后衍生的细胞。
所述群体可以包含产后衍生的细胞的克隆的细胞系。这种群体是特别有用的，其中分离了具有高度希望的功能的细胞克隆。新生儿和母系的克隆都是有用的并在此提供了。从培养的细胞分离克隆的细胞系的方法是本领域已知的。
在各种实施方式中，本发明的方法可以利用从产后细胞的群体制备的细胞溶胞产物、可溶的细胞级分和膜富集的细胞级分。这种溶胞产物和级分具有多种实用性。在体内细胞溶胞产物、更特别是可溶的细胞级分的使用容许在与移植供体组织相容性不匹配的移植接受者中使用有益的细胞内环境而不刺激淋巴细胞或产生其他有害的免疫学反应、不促进移植的组织的排斥、并且不除非排斥。
裂解细胞的方法是本领域公知的，包括机械破碎、酶破坏、或化学物质破坏或其组合的各种手段。这样的细胞溶胞产物可以细胞的生长培养基中从细胞直接制备，从而含有分泌的生长因子等等，中可以从在例如PBS或另一种溶液中没有培养基地洗涤的细胞来制备。为了在生长培养基中从细胞直接地产生溶胞产物，优选的是细胞在来自要使用所述溶胞产物的物种的血清中生长，在某些实施方式中，洗涤的细胞可能是优选的。如果优选，洗涤的细胞可以以比全市的群体密度大的浓度重悬浮。
从产后衍生的细胞的群体制备的细胞溶胞产物可以照原样使用，通过例如超滤或冻干或甚至干燥、富集、部分纯化来进一步浓缩，与本领域已知的药学上可接受的载体或稀释剂组合，或与其他化合物例如生物学上、如药学上有用的蛋白质组合物来组合。细胞溶胞产物可以体外或体内地、单独地、或例如与同基因的或自体的活细胞一起地使用。 如果被导入体内，所述溶胞产物可以在治疗的位点局部地导入，或远程地导入以向患者提供例如需要的细胞生长因子。优选的，所述溶胞产物不是免疫原性的，更优选的，它们在同基因的和同种异体的接受者的广泛群体中是免疫耐受的，而没有不利的免疫学结果或反应。本发明的细胞溶胞产物对于处在任何阶段或年龄的细胞是有用的，其已经在生长和扩增的条件下，例如在生长培养基上生长。对于溶胞产物的制备，甚至衰老的细胞也是有用的，可以提供生物学有用的某些因子。对于制备溶胞产物和细胞级分，不能存活的或甚至死的或被杀死的细胞也具有实用性。
本发明的方法也可以利用包含产后衍生的细胞和另一种治疗试剂、因子或生物学活性试剂例如药物化合物的药物组合物。这些生物学活性试剂包括但不限于，IGF、LIF、PDGF、EGF、FGF以及抗凝血的、抗细胞凋亡的试剂、抗炎症试剂、免疫抑制或免疫调节试剂、和抗氧化剂。除了所述PPDC和生物学活性成分之外，这种组合物可以进一步包含一种或多种其他的细胞类型。
因而，与产后衍生的细胞一起，其他的生物学活性分子，例如抗血栓形成试剂、抗细胞凋亡试剂和抗炎症试剂可能是有用的，可以独立地、或与两种或更多这样的化合物或试剂组合地、与所述细胞按顺序地施用或共同施用。例如，抗细胞凋亡试剂对于最小化程序性细胞死亡可能是有用的。这样的试剂包括但不限于EPO、EPO衍生物和类似物、它们的盐、TPO、IGF-I、IGF-II、肝细胞生长因子(HGF)和半胱氨酸蛋白酶抑制物。抗炎症试剂包括但不限于P38MAP激酶抑制物、statins、IL-6和IL-1抑制物、Pemirolast、Tranilast、Sirolimus、非甾类抗炎性化合物，例如Tepoxalin、Tolmetin和Suprofen。
可以与产后衍生的细胞共同施用的其他生物学活性因子或治疗试剂包括，例如，抗凝血因子、免疫抑制或免疫调节试剂和抗氧化剂。产后衍生的细胞与免疫抑制试剂的共同施用或组合治疗的一个目的是补充免疫抑制剂有效性。在一个实施方式中，产后衍生的细胞与免疫抑制剂的组合治疗可以实现相同水平的生物学效力而容许减少施用的免疫抑制剂的剂量，从而减轻当使用单独的免疫抑制剂时遭遇的不希望的副作用。在另一个实施方式中，产后衍生的细胞与免疫抑制剂的组合治疗可以容许提高总体生物学效力而不增加施用的免疫抑制剂的剂量， 这与单独的免疫抑制剂的治疗相反。免疫抑制和免疫调节试剂的实例包括calcineurin抑制物，例如环孢霉素、Tacrolimus，mTOR抑制物例如Sirolimus或Everolimus；抗增殖剂，例如咪唑硫嘌呤和mycophenolate mofetil；皮质类固醇，例如氢化***或氢化可的松；皮抗体，例如单克隆的抗IL-2Rα受体抗体、Basiliximab、Daclizumab；多克隆抗T细胞抗体，例如抗胸腺细胞球蛋白(ATG)、抗淋巴细胞球蛋白(ALG)和单克隆的抗T细胞抗体OKT3。可以与本发明的细胞一起治疗性地提供的抗凝血化合物包括，例如，肝素、肝素衍生物、尿激酶和PPack(脱氧苯基丙氨酸脯氨酸精氨酸氯甲基酮)；抗凝血酶化合物、血小板受体拮抗剂、抗凝血酶抗体、抗血小板受体抗体、阿斯匹林、潘生丁、鱼精蛋白、水蛭素、***素抑制物和血小板抑制物。抗氧化剂理所当然是本领域公知的，任何药学上可接受的抗氧化剂可以与本发明的细胞一起施用，包括probucol；维生素A、C和E、辅酶Q-10、谷胱甘肽、L半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸或上述抗氧化剂的衍生物、类似物或盐。
除了以上的之外，来自所述细胞的组合物可以根据本发明的方法使用。在此提供了细胞溶胞产物、可溶细胞级分和膜富集的细胞级分，如上文详细地描述的。来自所述细胞的细胞外基质，例如包括基底膜也是有用的，并在此提供了。来自所述细胞的细胞溶胞产物、可溶细胞级分、膜富集的细胞级分和细胞外基质都可以视情况施用给患者，或与本发明的细胞共同施用，有或者没有其他的细胞或细胞类型。
本发明的方法还可以包括使用在此提供的条件培养基。这种培养基首先被用于生长本发明的细胞或培养物，在生长期间其向培养基中分泌一种或多种有用的产物。来自这些新的细胞的条件培养基对于多种目的是有用的，包括例如，支持需要由本发明的细胞或培养物分泌到培养基中的生长因子或营养因子的其他哺乳动物细胞的生长，以及促进例如血管生成。制备和保存条件培养基的方法是本领域已知的，主要包括消除细胞，例如通过离心。
本发明在它的另一个方面中提供了用于移植的细胞组合物，包含药学上可接受的载体和基本上没有血液的、来自哺乳动物产后组织的产后衍生的细胞。所述细胞能够在培养中自我更新和扩增，并且具有抑制移植的细胞或组织针对接受者的任何免疫反应、和/或抑制接受者针对移植的组织的任何免疫反应以抑制排斥的潜力。
所述产后衍生的细胞能够在含有约5％到至少约20％的氧气的空气中生长。所述细胞还需要L－缬氨酸用于生长，具有在培养中至少约40次加倍的潜力，在包被的或未包被的组织培养器皿上附着和扩增，其中包被的组织培养器皿包被有明胶、层粘连蛋白或纤连蛋白；生产组织因子、波形蛋白和α平滑肌肌动蛋白；产生CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α和HLA-A、B、C的每一种；并且不产生CD31、CD34、CD45、CD117、CD141或HLA-DR,DP,DQ的任一种，如通过流式细胞术所检测的。在优选的实施方式中，所述细胞来源于人类组织。
所述细胞组合物可以治疗性地施用给移植接受者。所述细胞组合物可以包括在与移植供体组织相容性不匹配的移植接受者中抑制有害免疫反应例如移植物抗宿主疾病和/或移植的细胞或组织的排斥的细胞或细胞产物。
所述细胞组合物可以通过例如注射来施用给移植接受者。在某些实施方式中，所述细胞组合物在移植的原位处或附近注射。在其他实施方式中，所述注射可以在移植组织的表面上、邻近的区域中、或甚至更为远离的区域。在优选的实施方式中，所述细胞可以在移植的区域的内部。特别优选的是可以静脉内地注射的并适当地位于期望的作用位点的细胞。
所述细胞组合物还可以以基质-细胞复合物的形式提供。基质包括生物相容的支架、格构、自我组装结构等等，无论是生物可吸收的或不是生物可吸收的、液体、凝胶还是固体。这种基质是治疗性细胞治疗、外科修复、组织工程和伤口愈合领域中已知的。优选的，用细胞预先处理所述基质。更优选的，所述基质用细胞与所述基体紧密相连地或在它的间隙中填充。在某些实施方式中，细胞可以附着于所述基质，在其他实施方式中，所述细胞可以被捕集或包含在基质间隙内。最优选的是，这些基质-细胞复合物是与所述基质紧密相连地生长的细胞，当治疗地使用时，移植的组织的生长和存活被刺激和支持，适当的血管生成被类似地刺激或支持，移植接受者针对移植的组织或移植的组织针对接受者的任何免疫反应被抑制。基质-细胞组合物可以按本领域已知的任何途径导入患者的身体，包括但不限于植入、注射、外科的附着、用其他组织的移植、注射，等等。在某些实施方式中，体内的、或再更优选的 原位、例如原位可聚合的凝胶的基质形式可以根据本发明来使用。这种凝胶的实例是本领域已知的。
在某些实施方式中，产后衍生的细胞或其共培养物可以播种到这样的三维基质例如支架上并植入体内，其中播种的细胞能够在框架上或框架中增殖或帮助建立移植的组织并抑制体内的移植物抗宿主反应，有或者没有其他细胞的协助。
PPDC或其共培养物在三维框架上的生长优选的引起三维组织的形成或者这种组织的建立，其可以在体内被利用，例如，来抑制移植的细胞或组织针对接受者的任何免疫反应，和/或抑制移植的细胞或组织的排斥。在一个实施方式中，所述三维支架可以作为管状结构来制备，例如，用于血管或管道的移植。
根据本发明的一个方面，PPDC或其共培养物被接种、播种到三维框架或基质上，例如，支架、泡沫材料或水凝胶。所述框架可以被配置成各种形状，例如一般地扁平的、一般地圆柱形的或管形的，或可以是考虑矫正物结构所需或期望的完全自由的形状。在某些实施方式中，所述PPDC在三维结构上生长，而在其他实施方式中，所述细胞仅是存活的或甚至是死亡的，然而此时它们抑制移植的细胞或组织针对接受者的任何免疫反应、和/或抑制移植的细胞或组织的排斥。在某些实施方式中，所述PPDC促进移植的细胞或组织的维管化、生长和生命力。
所述基质可以被设计从而基质结构支持PPDC或其共培养物而没有随后的降解，或容许移植物血管化并支持自身，在这点上，基质被降解。Hutmacher,J.Biomat.Sci.PolymerEdn.,12(1):107-124(2001)提供了基质设计的综述。
预期在此使用的所述基质、支架、泡沫材料和自我组织***可以与除本发明的细胞之外的任何一种或多种细胞、生长因子、药物或其他成分组合地植入，例如促进痊愈、组织的生长、或刺激其维管化或神经分布、或者增强或改善治疗结果或本发明的实践的生物学活性试剂。
本发明的细胞可以在培养物中自由地生长或从培养物中除去并接种到三维框架上。以例如大约106到5×107个细胞每毫升的细胞浓度接种所述三维框架，优选的引起在相对更短的时间内三维支持物的建立。此外在某些应用中，优选的是取决于期望的结果使用更多或更少 数量的细胞。
在某些实施方式中，有用的是在培养物中重新创建体内存在的细胞小环境，从而细胞在体内植入或体外使用之前生长的程度可以改变。PPDC或其共培养物可以在植入之前或之后接种在框架上。对于在植入之前细胞在框架上的接种，框架优选的在合适的生长培养基中孵育。在孵育期间，接种的细胞将生长并包围所述框架，并且可以，例如，桥接或部分地桥接其中的任何空间间隙。
可以用于本发明的方面中的基质例如支架的实例包括衬垫(纺织的、编织的、和更优选的无纺的)、多孔的或半多孔的泡沫材料、自我组织肽等等。无纺的衬垫可以是，例如，使用由天然或合成聚合物组成的纤维来形成。在优选的实施方式中，以商品名称VICRYL(Ethicon,Inc.,Somerville,NJ)销售的乙二醇和乳酸的可吸收共聚物(PGA/PLA)可以用于形成衬垫。如美国专利No.6,355,699中讨论的通过例如冻干、冷冻干燥的过程形成的、由例如聚(ε-己内酯)/聚(羟基乙酸)(PCL/PGA)共聚物组成的泡沫材料也可以充当支架。如在此使用的，凝胶也形成适合的基质。实例包括原位可聚合的凝胶、和水凝胶，例如由自我组装肽组成的。这些材料经常被用作组织生长的支持物。原位形成的可降解的网络也适合于本发明的(参见，例如Anseth,K.S.et al.,2002,J.Controlled Release 78:199-209；Wang,D.et al.,2003,Biomaterials 24:3969-3980；He et al.的美国专利公开2002/0022676)。这些材料可以被配制为适合于注射的液体，然后通过各种手段(例如，温度、pH值、光暴露)诱导来原位或体内地形成可降解的水凝胶网络。
根据一个实施方式，所述框架是毡制品，其可以由从生物可吸收材料例如PGA、PLA、PCL共聚物或混合物或透明质酸制成的多纤维纱线组成。纱线使用标准的纺织加工技术包括卷曲、切割、梳棉和针编来制成毡制品。在另一个实施方式中，本发明的细胞播种到可以是复合结构的泡沫材料支架上。此外，三维框架可以被模压成有用的形状，例如身体内要通过移植来修复、替换或添加的特定结构。
所述框架可以在接种本发明的细胞之前进行处理来增强细胞附着。例如，在用本发明的细胞接种之前，可以用0.1摩尔乙酸处理尼龙基质并在聚赖氨酸、PBS和/或胶原中孵育来包被所述尼龙。聚苯乙烯可以使用硫磺酸类似地处理。
此外，三维框架的外表面可以被修饰以改善细胞的附着或生长和组织分化，例如通过用血浆包被所述框架或添加一种或多种蛋白质(例如，胶原、弹性纤维、网状纤维)、糖蛋白、氨基多糖(例如，硫酸肝素、软骨素-4-硫酸盐、软骨素-6-硫酸盐、硫酸皮肤素、硫酸角蛋白)、细胞基质和/或其他材料，例如但不限于明胶、藻酸盐、琼脂、琼脂糖和植物胶，等等。
在某些实施方式中，所述支架包含材料或用材料处理，所述材料使得它是非凝血酶原性的。这些处理和材料也可以促进和维持内皮生长、迁移和细胞外基质沉积。这些材料和处理的实例包括但不限于，天然的材料，例如基底膜蛋白，如层粘连蛋白和IV型胶原、合成材料，例如ePTFE，以及片段化的聚聚氨酯脲硅酮，例如PURSPAN(The PolymerTechnology Group,Inc.,Berkeley,CA)。这些材料可以进一步被处理来使得支架为非凝血酶原性的。这种处理包括抗血栓试剂，例如肝素，以及改变材料的表面电荷的处理，例如血浆包被。
不同比例的各种类型的胶原，例如，沉积在框架上的胶原可能影响组织特异性细胞或其他细胞的生长，所述细胞稍后可能接种在所述框架上，或可能在体内在所述结构上生长。例如，对于三维的皮肤培养***，I和III型胶原优选的被沉积在起始基质上。做为选择，框架可以用合成期望的合适胶原类型的细胞的混合物来接种。因而，取决于要培养的组织，可以选择要接种到框架上的、或通过接种在上面的细胞产生的合适的胶原类型。例如，框架中胶原纤维和弹性纤维的相对数量可以通过控制初始接种物中胶原生产细胞和弹性蛋白生产细胞的比例来调节。例如，由于动脉的内壁富含弹性蛋白，动脉支架应当含有分泌弹性蛋白的平滑肌细胞的共培养物。
本发明的播种的或接种的三维框架可以用于多种应用。这些包括但不限于从基质获得的培养的细胞或培养的基质本身的体内移植或植入。
PPDC可以接种在扁平的支架上。所述支架优选的在植入之前在培养基中孵育。两个或更多扁平框架可以置于另一个之上并缝合在一起来产生多层的框架。
支架可以被切割成条带(例如，形状矩形的)，它的宽度近似等于最终将***其中的管形器官的内部圆周，例如，肝管的管道。 细胞可以接种在支架上并通过漂浮或悬浮在液体培养基中来孵育。在合适的汇合阶段，支架可以通过将长边缘连接在一起来卷成管状。接缝可以使用合适直径的合适材料的纤维将两个边缘缝合在一起来闭合。
根据本发明，支架可以形成管状、用PPDC接种并在悬浮在孵育室中的培养基中。为了防止细胞阻塞管腔，管状框架的开放末端之一可以固定在喷嘴上。液体培养基可以从连接到孵育室的来源室被压迫通过这个喷嘴来产生通过所述管状框架内部的液流。另一个开放末端可以固定在导向收集室的流出小孔上，从收集室中培养基可以被重新循环通过来源室。当孵育完成时，管道可以从所述喷嘴和流出小孔分开。这种方法由Ballermann,B.J.,etal.,Int.Application No.WO 94/25584和在美国申请系列号No.08/430,768中描述，通过引用将这两者的全部内容合并在此。
一般地，两个三维框架可以使用任何的以下方法根据本发明组合成管状。
两个或更多扁平框架可以置于另一个之上并缝合在一起。这种双层的片层然和可以如上所述被卷起、连接在一起并固定。
充当内层的一个管状管状支架可以用PPDC接种并孵育。第二支架可以作为宽度稍大于所述管状框架的外圆周长的扁平条带来生长。在获得了合适的生长之后，扁平框架可以卷绕在所述管状支架的外侧，随后闭合所述扁平框架的两个边缘的接缝，以及优选的，将所述扁平框架固定到内管上。
可以单独地生长具有稍微不同的直径的两个或更多管形的网孔。具有较小直径的框架可以***到较大一个的内部并被固定。
对于这些方法的每一种，通过对所述双层的管重新应用所述方法可以添加更多的层。支架可以在PPDC的任何生长期组合，当需要时，组合的支架的孵育可以继续。
管形结构的内腔面可以由材料组成或用材料处理，所述材料使得所述管状支架的内腔面是非凝血酶原性的。这些处理和材料也可以促进和维持内皮生长、迁移和细胞外基质沉积。这些材料和处理的实例包括但不限于，天然的材料，例如基底膜蛋白，如层粘连蛋白和IV型胶原、合成材料，例如ePTFE，以及片段化的聚聚氨酯脲硅酮，例如PURSPAN(ThePolymer Technology Group,Inc.,Berkeley,CA)。这些 材料可以进一步被处理来使得所述管状支架的内腔面为非凝血酶原性的。这种处理包括抗血栓试剂，例如肝素，以及改变材料的表面电荷的处理，例如血浆包被。
在某些实施方式中，所述治疗性细胞组合物还包含细胞，其表达以下的至少一种：白细胞介素8，浆膜蛋白1、趋化因子(C-X-C基序)配体1(黑素瘤生长刺激活性，α)、趋化因子(C-X-C基序)配体6(粒细胞趋化性蛋白2)、趋化因子(C-X-C基序)配体3、和肿瘤坏死因子、α诱导的蛋白3，或者相对于作为成纤维细胞、间质干细胞或髂嵴骨髓细胞的人类细胞其具有以下至少一种的降低的表达：短体态同源框2、热激27kDa蛋白2、趋化因子(C-X-C基序)配体12(基质细胞衍生的因子1)、弹性蛋白(瓣膜上主动脉狭窄，Williams-Beuren综合征)、智人mRNA、cDNA DKFZp586M2022(来自克隆DKFZp586M2022)、间充质同源框2(生长延滞-特异性同源框)、sine oculis同源框同源物1(果蝇)、晶状体蛋白、αB、形态发生蛋白2的散乱相关的活化物、DKFZP586B2420蛋白、类似于neuralin 1的、tetranectin(血纤蛋白溶酶原结合蛋白)、src同源性三(SH3)和半胱氨酸富含结构域、B细胞转位基因1、抗增殖、胆固醇25-羟化酶、runt相关的转录因子3、推定的蛋白FLJ23191、白细胞介素11受体α、前胶原C-内肽酶增强子、卷发同源物7(果蝇)、推定的基因BC008967、胶原，VIII型，α1、tenascin C(hexabrachion)、易洛魁人同源框蛋白5、hephaestin；整联蛋白，β8、突触小泡糖蛋白2、智人cDNA FLJ12280 fis、克隆MAMMA1001744、细胞因子受体样因子1、钾中间体/小导电性钙活化通道，N亚家族，成员4、整联蛋白α7、DKFZP586L151蛋白、与PDZ-结合基序(TAZ)的转录共活化剂、sine oculis同源框同源物2(果蝇)、KIAA1034蛋白、早期生长反应3；末端减少同源框5、推定的蛋白FLJ20373、醛-酮还原酶家族1，成员C3(3-α羟甾醇脱氢酶，II型)、biglycan、纤连蛋白1、前脑啡肽、整联蛋白，β-样1(具有EGF-样重复结构域)、智人mRNA全长***cDNA克隆EUROIMAGE 1968422、EphA3、KIAA0367蛋白、利尿钠肽受体C/鸟苷酸环化酶C(atrionatriuretic肽受体C)、推定的蛋白质FLJ14054、智人mRNA；cDNA DKFZp564B222(来自克隆DKFZp564B222)；泡囊相关的膜蛋白5(myobrevin)、含EGF的fibulin-样细胞外基质蛋白1、BCL2/腺病 毒E1B 19kDa相互作用蛋白质3-样、AE结合蛋白1、细胞色素c氧化酶亚单位VIIa多肽1(肌肉)、成神经细胞瘤，肿瘤发生1的抑制、胰岛素-样生长因子结合蛋白2，36kDa。
优选的细胞组合物还包含分泌MCP-1、IL-6、IL-8、GCP-2、HGF、KGF、FGF、HB-EGF、BDNF、TPO、MIP1a、RANTES和TIMP1的至少一种，不分泌TGF-β2、ANG2、PDGFbb、MIP1b、I309、MDC和VEGF的至少一种的细胞，如通过ELISA所检测的。
在又一个方面，本发明提供了在与移植供体组织相容性不匹配的移植接受者中抑制有害免疫反应的方法，包括以有效抑制所述有害免疫反应的数量向所述移植接受者施用产后衍生的细胞组合物。
在某些实施方式中，所述有害免疫反应是适应性。。在详细的实施方式中，所述有害免疫反应是移植的组织针对移植患者的免疫反应，并且可以引起移植物抗宿主疾病。在另一个详细的实施方式中，有害免疫反应是移植的组织的排斥。在某些实施方式中，所述方法有效抑制移植物抗宿主疾病和移植的组织的排斥。在所有这些实施方式中，优选的是，包含所述组合物的产后衍生的细胞是脐带衍生的细胞、胎盘衍生的细胞、或者脐带和胎盘衍生的细胞的组合。
产后衍生的细胞组合物可以提供对移植的组织的生长、刺激或生活力的支持。所述产后衍生的细胞可以与细胞部分、细胞溶胞产物或与其他同种异体的、同基因的或自体的细胞共同施用，而成功的有害免疫反应抑制可以包括在不存在其他细胞、细胞部分或细胞溶胞产物的情况下向移植患者施用PPDC。细胞不必整合到移植的组织中，然而优选的是PPDC在患者中至少部分地整合、增殖或存活。在其他优选的实施方式中，所述患者经历了来自PPDC施用的额外的益处，例如，PPDC支持其他细胞的生长的能力，包括在移植的组织中或周围存在的干细胞或祖细胞，移植的组织的生长和维管化，以及有益细胞因素、趋化因子、细胞因子等等的产生。在某些实施方式中，所述移植接受者受益于使用PPDC的治疗方法，但是PPDC在患者中不存活持续的时期。在一个实施方式中，所述细胞在数目、生存力或生化活性上逐渐地降低，在其他实施方式中，细胞的降低之前是一段时间的活性，例如生长、***或生化活性。在其他实施方式中，衰老的、不能存活的或甚至死的细胞能够具有有益的效果。
所述方法可以进一步包括除了细胞组合物之外施用一种或多种试剂。这些试剂可以在施用所述细胞组合物之前、之后或同时施用。适合的试剂的非限制性实例包括抗血栓形成试剂、抗炎症试剂、免疫抑制试剂、免疫调节试剂和抗细胞凋亡试剂或其他本领域适合的试剂。合适的试剂的选择在本领域技术人员的能力之内，并且可以取决于移植接受者的物理特征或总体健康状态或健康度而变化。
PPDC的施用优选的通过移植、植入、注射、熔接、经由导管递送、经由植入到移植接受者中的设备递送、或作为基质-细胞复合物提供、或用于提供细胞治疗的本领域已知的任何其他方法来进行。
在本发明的方法的其他实施方式中，所述细胞组合物包含约50％的产后衍生的细胞。在优选的实施方式中，所述细胞组合物基本上仅包含产后衍生的细胞。在进一步优选的实施方式中，所述治疗性细胞组合物包含基本上同质的产后衍生的细胞的群体。
根据本发明，特征还在于在与移植供体组织相容性不匹配的移植接受者中抑制有害免疫反应的方法，其中所述方法包括向患者施用组合物，所述组合物包含由产后衍生的细胞产生的条件培养基、产后衍生的细胞产生的细胞溶胞产物、产后衍生的细胞产生的可溶细胞级分、或产后衍生的细胞的细胞外基质。所述有害免疫反应可以是移植物抗宿主疾病或移植的组织的排斥。在这些实施方式中，被用作制造所述组合物的产后衍生的细胞可以是脐带衍生的细胞、胎盘衍生的细胞或两者的组合。除了所述组合物之外，其他细胞类型或其他试剂例如抗血栓形成试剂、抗炎症试剂、免疫抑制试剂、免疫调节试剂、抗细胞凋亡试剂可以被施用给所述移植接受者。
还在此提供的是在与移植供体组织相容性不匹配的移植接受者中抑制有害免疫反应的方法，包括以有效抑制所述有害免疫反应的数量向患者施用产后衍生的细胞组合物，其中所述产后衍生的细胞组合物作为基质-细胞复合物来施用。在某些实施方式中，所述基质是支架，优选的生物可吸收的，至少包含所述产后衍生的细胞。
还提供了用于实践本发明的方法的试剂盒。当用于在与移植供体组织相容性不匹配的移植接受者中抑制有害免疫反应时，所述试剂盒包括PPDC组合物，有或者没有基质、并且有或者没有共培养物存在。试剂盒任选地还包括施用所述细胞的手段，例如，通过注射，以及 如果需要用于所述细胞的药学上可接受的载体。所述试剂盒包括使用所述细胞的说明。
本发明还提供了本发明的组织、细胞、群体和细胞组合物的库存。如以上讨论的，PPDC是容易低温保存的。因而本发明提供了在库中低温保存所述细胞的方法，其中所述细胞被冷冻保存并根据所述细胞的免疫学、生物化学和遗传学性质与细胞的完整特征相关联。取决于操作的要求和患者的需要，这样冷冻的细胞可以为了自体的、同基因的或同种异体移植物治疗性地使用。优选的，关于每个低温保存的样品的信息被保存在计算机中，其是可根据外科医生的需求、操作和具有适合的匹配的患者而查找的，所述匹配根据细胞或群体的特征来进行。优选的，本发明的细胞被生长和扩增到期望的细胞数量，在存在或缺少基质或支持物的情况下单独地或作为共培养物来制备细胞组合物。而对于某些应用，可能优选的是使用新制备的细胞，其余部分可以是通过冷冻细胞和在计算机中输入信息使计算机条目与样品相关来低温保存和库存的。即使在不需要为了免疫学目的与这些细胞的接受者匹配移植来源或供体时，库存***使得它易于为治疗需要匹配例如库存的细胞的期望生物化学或遗传学性质。在与小量库存的样品匹配期望的性质时，样品为了治疗用途被检索和准备。如在此描述制备的细胞溶胞产物也可以根据本发明被低温保存和库存。
在本发明的另一个方面，提供了用于PPDC的分离、生长与维持、和使用的试剂盒。细胞、细胞溶胞产物、可溶细胞级分、膜级分和基质可以方便地用作试剂盒的部分，例如，用于培养或植入的试剂盒。本发明提供了试剂盒，其包括产后衍生的细胞和其他成分，包括分离、生长或维持、或使用所述细胞或细胞级分的说明，以及例如基质(例如，支架)材料、水化试剂(例如，生理学相容的盐水溶液、制备的细胞培养基)、细胞培养底物(例如，培养皿、平板、小瓶，等等)、细胞培养基(无论是液体还是脱水形式)、抗生素化合物、激素，等等。用于生长的试剂盒例如可以包括如在此使用的生长培养基的所有成分，包括血清，例如胎儿牛血清。而所述试剂盒可以包括任何这些成分，优选的，它包括它的预期用途所必需的所有成分。如果希望，试剂盒也可以包括细胞(一般是低温保存的)，其可以播种到在此描述的格构中。用于分离的试剂盒将含有进行在此描述的分离方法所需的所有东西，除 了脐带组织之外，其应当在分离时从组织库新鲜获得或冷冻。提供了用于离解组织的外科工具，优选的为酶，或稳定形式的酶的选择，其是以上公开的方法所需的或优选的缓冲液、培养基、细胞过滤器等等。还方便地提供了具有可选步骤的详细说明以及任选或可选材料的供应商的列表。可以包括对照细胞，用于比较分离的细胞和例如ATCC保藏的UDC培养物。
用于利用PPDC的试剂盒优选的含有细胞的群体、或包含所述细胞的组合物、来自如上所述细胞的成分和产物、或级分或条件培养基。在某些实施方式中，所述试剂盒可以包括一种或多种细胞群体，至少包括PDC和/或UDC和药学上可接受的载体(液体、半固体或固体)。在某些实施方式中所述群体是UDC或PDC的同质的或甚至克隆的细胞系。在其他实施方式中，所述试剂盒包括共培养中使用的其他细胞系。试剂盒优选的包括所希望的其他生物学活性试剂，例如抗凝血酶原试剂、抗炎症试剂、抗细胞凋亡试剂、和免疫抑制或免疫调节化合物。所述试剂盒任选地还可以包括施用所述细胞的手段，例如通过注射。所述试剂盒可以进一步包括使用所述细胞的说明。为了野战医院用途，例如为军队用途制备的试剂盒可以包括完整过程的供应品，包括组织支架、外科缝线等等，其中所述细胞将与急性损伤的修复一起使用。在此描述的用于分析和体外方法的试剂盒可以含有一种或多种的：(1)UDC或UDC的级分、成分或产物，(2)用于进行所述体外方法的试剂，(3)视情况而定，例如用于共培养的其他细胞或细胞群体，和(4)用于进行体外方法的说明。用于制备细胞衍生的成分的试剂盒可以包括细胞的生长所需的成分和制备感兴趣的细胞级分所需的成分，以及从细胞获得希望的成分的说明。还在此提供了用于条件培养基的生产和收集的试剂盒，并且包括细胞、培养基、收集容器、说明书、用于分析感兴趣的分泌的分子的标准，等等。
以下的实施例更详细地描述了本发明的实施方式的几个方面。提供了这些实施例来进一步说明、而不是限制在此描述的本发明的方面。
实施例1
来自产后组织的细胞的衍生
这个实施例描述了从胎盘和脐带组织制备产后衍生的细胞。在足月的或前足月妊娠的出生之时获得产后的脐带和胎盘。从脐带和胎盘组织的5个独立的供体获得细胞。测试了不同的细胞分离方法来产生细胞的能力，所述细胞具有1)作为干细胞通常特征的分化成不同表型的细胞的能力，或2)提供对其他细胞或组织有用的营养因子的能力。
方法&材料
脐带细胞分离。从National Disease Research Interchange(NDRI,Philadelphia,PA)获得脐带。在正常的分娩后获得组织。在层流罩中无菌地进行细胞分离方案。为了除去血液和碎屑，脐带在磷酸盐缓冲盐水(PBS；Invitrogen,Carlsbad,CA)在在存在抗真菌剂和抗生素(100单位/毫升青霉素、100微克/毫升链霉素、0.25微克/毫升两性霉素B)的情况下洗涤。在150cm2组织培养平板中在存在50毫升培养基(DMEM-低葡萄糖或DMEM-高葡萄糖；Invitrogen)的情况下机械地分离组织，直到组织被切碎成细浆。切碎的组织转移到50毫升锥形管中(每试管大约5克组织)。组织然后在DMEM-低葡萄糖培养基或DMEM-高葡萄糖培养基中消化，每一种都含有如上所述的抗真菌剂和抗生素。在某些实验中，使用胶原酶和分散酶的酶混合物(在DMEM:-低葡萄糖培养基中，“C:D；”胶原酶(Sigma,St Louis,MO)，500单位/毫升；和分散酶(Invitrogen)，50单位/毫升)。在其他实验中，使用胶原酶、分散酶和透明质酸酶(“C:D:H”)的酶混合物(在DMEM:-低葡萄糖培养基中，胶原酶，500单位/毫升；分散酶，50单位/毫升；和透明质酸酶(Sigma)，5单位/毫升)。含有所述组织、培养基和消化酶的锥形管在37℃在轨道摇动器(Environ,Brooklyn,NY)中以225rpm孵育2小时。
在消化之后，组织在150×g离心5分钟，吸出上清液。团粒重悬浮在20毫升生长培养基中(DMEM:低葡萄糖(Invitrogen)，百分之15(v/v)胎儿牛血清(FBS；限定的牛血清；Lot#_AND18475；Hyclone,Logan,UT)、0.001％(v/v)2-巯基乙醇(Sigma)、1毫升每100毫升的如上所述抗生素/抗真菌剂。细胞悬液过滤通过70微米尼龙细胞过滤器(BDBiosciences)。包含生长培养基的另外5毫升清洗液通过所述 过滤器。细胞悬液然后通过40微米尼龙细胞过滤器(BD Biosciences)，随后是另外5毫升生长培养基的清洗液。
过滤物重悬浮在生长培养基(总体积50毫升)中，并在150×g离心5分钟。吸出物上清液，细胞重悬浮在50毫升新鲜的生长培养基中。这个过程再重复两次。
在最后的离心时，吸出上清液，细胞团粒重悬浮在5毫升新鲜生长培养基中。活细胞的数量使用锥石蓝染色来测定。细胞然后在标准条件下培养。
从脐带分离的细胞以5,000个细胞/cm2播种在明胶包被的T-75cm2烧瓶(CorningInc.,Corning,NY)中具有如上所述的抗生素/抗真菌剂的生长培养基中。2天后(在各个实验中，细胞孵育2-4天)，从烧瓶中吸出耗费的培养基。细胞用PBS洗涤三次来除去碎屑和血液衍生的细胞。细胞然后补充生长培养基，并容许生长到汇合(从传代0开始约10天)到传代1。在随后的传代中(从传代1到2等等)，在4-5天内细胞达到亚汇合(百分之75-85汇合)。对于这些随后的传代，细胞以5000个细胞/cm2播种。细胞在具有百分之5二氧化碳和空气氧的湿润孵化器中在37℃生长。
胎盘细胞分离。从NDRI(Philadelphia,PA)获得胎盘组织。所述组织来自妊娠，并在正常的外科分娩时获得。如对脐带细胞分离所描述的分离胎盘细胞。
以下实施例应用于从胎盘组织分离母亲衍生和新生儿衍生的细胞的群体。
在层流罩中无菌地进行细胞分离方案。胎盘组织在磷酸盐缓冲盐水(PBS；Invitrogen,Carlsbad,CA)中在存在抗真菌剂和抗生素(如上所述)的情况下洗涤来除去血液和碎屑。胎盘组织然后解剖成三个切片：顶部线(新生儿一侧或侧面)、中线(新生儿和母亲的混合的细胞分离物)和底部线(母亲的一侧或侧面)。
在具有抗生素/抗真菌剂的PBS中分别地洗涤分离的切片几次来进一步除去血液和碎屑。然后在存在50毫升DMEM/低葡萄糖的情况下在150cm2组织培养平板中将每个切片机械地离解成细浆。浆液转移到50毫升锥形管中。每个管含有大约5克组织。组织在含有抗真菌剂和抗生素(100U/毫升青霉素，100微克/毫升链霉素，0.25微克/ 毫升两性霉素B)和消化酶的DMEM-低葡萄糖或DMEM-高葡萄糖培养基中消化。在某些实验中，使用胶原酶和分散酶(“C:D”)的酶混合物，含有在DMEM-低葡萄糖培养基中500单位/毫升的胶原酶(Sigma,St Louis,MO)和50单位/毫升的分散酶(Invitrogen)。在其他实验中，使用胶原酶、分散酶和透明质酸酶(C:D:H)的混合物(在DMEM:-低葡萄糖培养基中，胶原酶，500单位/毫升；分散酶，50单位/毫升；和透明质酸酶(Sigma)，5单位/毫升)。含有所述组织、培养基和消化酶的锥形管在轨道摇动器(Environ,Brooklyn,NY)中以225rpm在37℃孵育2小时。
在消化之后，组织在150×g离心5分钟，吸去产生的上清液。团粒重悬浮在具有青霉素/链霉素/两性霉素B的20毫升生长培养基中。细胞悬液过滤通过70微米尼龙细胞过滤器(BD Biosciences)，随后是具有另外5毫升生长培养基的清洗液。总细胞悬液通过40微米尼龙细胞过滤器(BD Biosciences)，随后是另外5毫升生长培养基作为清洗液。
过滤物重悬浮在生长培养基(总体积50毫升)中，并在150×g离心5分钟。吸出物上清液，细胞团粒重悬浮在50毫升新鲜的生长培养基中。这个过程再重复两次。在最后的离心之后，吸出上清液，细胞团粒重悬浮后5毫升新鲜的生长培养基中。使用锥石蓝排阻测试确定细胞计数。然后在标准条件下培养细胞。
LIBERASE细胞分离。用DMEM-低葡萄糖培养基中的LIBERASE(BoehringerMannheim Corp.,Indianapolis,IN)(2.5毫克每毫升，BlendzymeRoche AppliedSciences,Indianapolis,IN)和透明质酸酶(5单位/毫升，Sigma)从脐带组织分离细胞。组织的消化和细胞的分离如以上对其他蛋白酶消化所描述的，利用LIBERASE/透明质酸酶混合物代替C:D或C:D:H酶混合物。使用LIBERASE的组织消化引起了容易扩增的细胞群体从产后组织的分离。
利用其他酶组合的细胞分离。使用不同的酶组合比较了从脐带分离细胞的过程。为消化比较的酶包括：i)胶原酶；ii)分散酶；iii)透明质酸酶；iv)胶原酶：分散酶混合物(C:D)；v)胶原酶：透明质酸酶混合物(C:H)；vi)分散酶：透明质酸酶混合物(D:H)；和vii)胶原酶：分散酶：透明质酸酶化合物(C:D:H)。观察了利用这些 不同的酶消化条件在细胞分离中的差异(表1-1)。
表1-1:利用改变的酶组合从脐带组织的细胞分离
酶消化 分离的细胞 细胞扩增
胶原酶 X X
分散酶 +(>10h) +
透明质酸酶 X X
胶原酶：分散酶 ++(<3h) ++
胶原酶：透明质酸酶 ++(<3h) +
分散酶：透明质酸酶 +(>10h) +
胶原酶：分散酶：透明质酸酶 +++(<3h) +++
图解:+＝好,++＝非常好,+++＝极好,X＝在测试的条件下没有成功
从脐带中残余血液的细胞分离。进行其他尝试来通过不同的方法从脐带分离细胞的库。在一种情况下，脐带被切下，用生长培养基洗涤来移去血凝块和凝胶状的材料。收集血液、凝胶状材料和生长培养基的化合物，并在150×g离心。团粒重悬浮并播种到明胶包被的烧瓶上的生长培养基中。从这些实验中，分离了容易扩增的细胞群体。
从脐带血的细胞分离。细胞还从获自NDRI的脐带血样品中分离。在此使用的分离方案是Ho等人的国际专利申请PCT/US2002/029971(Ho,T.W.et al.,WO2003025149 A2)的方案。脐带血液(NDRI,Philadelphia PA)的样品(分别为50毫升和10.5毫升)与裂解缓冲液(过滤器灭菌的155mM氯化铵、10毫摩尔碳酸氢钾、0.1毫摩尔EDTA，缓冲到pH 7.2(所有成分来自Sigma,St.Louis,MO))混合。以脐带血比裂解缓冲液1:20的比例裂解细胞。产生的细胞悬浮液涡旋5秒，在环境温度下孵育2分钟。离心溶胞产物(200×g，10分钟)。细胞团粒重悬浮在含有百分之10胎儿牛血清(Hyclone,Logan UT)、4毫摩尔谷氨酰胺(MediatechHerndon,VA)、100单位青霉素每100毫升和100微克链霉素每100毫升(Gibco,Carlsbad,CA)的完全最低必需培养基(Gibco,Carlsbad CA)中。重悬浮的细胞被离心(在200×g，10分钟)，吸出上清液，细胞团粒在完全培养基中洗涤。细胞直接播种到 T75烧瓶(Corning,NY)、T75层粘连蛋白包被的烧瓶、或T175纤连蛋白包被的烧瓶(都来自Becton Dickinson,Bedford,MA)中。
使用不同的酶组合和生长条件的细胞分离。为了确定细胞群体是否可以在不同的条件下分离并在分离之后在各种条件下立即扩增，根据以上提供的操作，使用C:D:H的酶组合在有或者没有百分之0.001(v/v)2-巯基乙醇(Sigma,St.Louis,MO)的生长培养基中消化细胞。这样分离的胎盘衍生细胞在各种条件下播种。所有细胞在存在青霉素/链霉素的情况下生长(表1-2)。
表1-2:产后的细胞在改变的条件下的分离和培养物扩增：
条件 培养基 15％FBS BME 明胶 20％O2 生长因子
1 DMEM-Lg Y Y Y Y N
2 DMEM-Lg Y Y Y N(5％) N
3 DMEM-Lg Y Y N Y N
4 DMEM-Lg Y Y N N(5％) N
5 DMEM-Lg N(2％) Y N(层粘连蛋白) Y EGF/FGF(20ng/mL)
6 DMEM-Lg N(2％) Y N(层粘连蛋白) N(5％) EGF/FGF(20ng/mL)
7 DMEM-Lg N(2％) Y N(Fibrone) Y PDGF/VEGF
8 DMEM-Lg N(2％) Y N(Fibrone) N(5％) PDGF/VEGF
9 DMEM-Lg Y N Y Y N
10 DMEM-Lg Y N Y N(5％) N
11 DMEM-Lg Y N N Y N
12 DMEM-Lg Y N N N(5％) N
13 DMEM-Lg N(2％) N N(层粘连蛋白) Y EGF/FGF(20ng/mL)
14 DMEM-Lg N(2％) N N(层粘连蛋白) N(5％) EGF/FGF(20ng/mL)
15 DMEM-Lg N(2％) N N(Fibrone) Y PDGF/VEGF
16 DMEM-Lg N(2％) N N(Fibrone) N(5％) PDGF/VEGF
使用不同的酶组合和生长条件的细胞分离。在所有条件下，在传代0和1之间细胞附着和扩增良好(表1-2)。在条件5-8和13-16之下，细胞展现了增殖良好直到播种后的4次传代，在此时它们被低温保存和库存。
结果
利用不同的酶组合的细胞分离。C:D:H的组合提供了在分离之后的最好的细胞产量，与其他条件相比产生了在培养中扩增多得多的世代的细胞(表1)。使用单独的胶原酶或透明质酸酶没有获得可扩增的细胞群体。没有进行尝试来确定这个结果是否对于所测试的胶原是特异性的。
使用不同的酶组合和生长条件的细胞分离。在对酶消化和生长测试的所有条件下，在传代0和1之间细胞附着和扩增良好(表2)。在实验条件5-8和13-16之中，细胞增殖良好直到播种后的4次传代，在此时它们被低温保存。所有细胞被库存用于进一步的研究。
从脐带中残余血液的细胞分离。有核的细胞快速地附着和生长。通过流式细胞术分析了这些细胞，类似于通过酶消化获得的细胞。
从脐带血的细胞分离。该制品含有红细胞和血小板。在前3周，没有有核细胞附着和***。在播种后3周改变培养基，没有观察到细胞附着和生长。
概述。细胞的群体可以利用酶组合胶原酶(基质金属蛋白酶)、分散酶(中性蛋白酶)和透明质酸酶(分解透明质酸的粘多糖酶)有效地从脐带和胎盘组织得到。也可以使用作为的LIBERASE。特别地，作为胶原酶(4Wunsch单位/g)和嗜热菌蛋白酶(1714酪蛋白单位/g)的Blendzyme也可以与透明质酸酶一起使用来分离细胞。当在明胶包被的塑料制品上的生长培养基中培养时，这些细胞很容易扩增许多代。
还从脐带中的残余血液、而不是脐带血中分离了细胞。在所使用的条件下附着和生长的、从组织中洗出的血液凝块中细胞的存在，可能是由于在解剖过程中细胞被释放。
实施例2
产后衍生的细胞的生长特征
产后衍生的细胞(PPDC)的细胞扩增潜力与分离的干细胞的其他群体相比较。细胞扩增到衰老的过程被称为Hayflick’s极限(Hayflick L.1974a,1974b)。产后衍生的细胞是高度适合于治疗用途的，因为它们可容易地扩增到足够的细胞数量。
材料和方法
明胶包被烧瓶。通过添加20毫升2％(w/v)猪明胶(B型：225 Bloom；Sigma,StLouis,MO)到T75烧瓶(Corning,Corning,NY)中在室温下20分钟来包被组织培养塑料烧瓶。在除去明胶溶液之后，添加10毫升磷酸盐缓冲盐水(PBS)(Invitrogen,Carlsbad,CA)，然后吸出。
PPDC与其他细胞群体的扩增潜力的比较。为了比较扩增潜力，使用里以下细胞群体：i)间质干细胞(MSC；Cambrex,Walkersville,MD)；ii)脂肪衍生的细胞(美国专利No.6555374B1；美国专利申请US20040058412)；iii)正常的皮肤成纤维细胞(cc-2509lot#_9F0844；Cambrex,Walkersville,MD)；iv)脐带衍生的细胞；和v)胎盘衍生的细胞。细胞首先以5,000个细胞/cm2播种到明胶包被的T75烧瓶上具有青霉素/链霉素/两性霉素B的生长培养基中。对于随后的传代，细胞培养物如下处理。在胰酶消化之后，在锥石蓝染色对活细胞计数。细胞悬液(50微升)与锥石蓝(50毫升，Sigma,St.Loui MO)混合。使用血球计估计活细胞数量。
在计数之后，细胞以5,000个细胞/cm2播种到明胶包被的T75烧瓶上25毫升新鲜生长培养基中。细胞在37℃在标准条件下生长。生长培养基每周改变两次。当细胞达到约85％汇合时它们进行传代；重复这个过程直到细胞到达衰老。
在每个传代，细胞被胰蛋白酶化和计数。计算活细胞产量、群体加倍[In(最终的细胞/最初的细胞)/In 2]和加倍时间(培养的时间(h)/群体加倍)。为了测定最佳的细胞扩增，通过用早先传代的总产量乘以每个传代的扩增因数(即，扩增因数＝最终的细胞/起初的细胞)来确定每次传代的总细胞产量。
细胞库在低密度下的扩增潜力。利用不同的条件集合，还测试了在传代10时库存的细胞的扩增潜力。测试了正常的皮肤成纤维细胞(cc-2509lot#_9F0844；Cambrex,Walkersville,MD)、脐带衍生的细胞和胎盘衍生的细胞。这些细胞群体早先在传代10时库存，以5,000个cells/cm2培养，并在每次传代时生长到汇合。测定了在传代10解冻细胞之后细胞密度对细胞群体的影响。细胞在标准条件下解冻，使用锥石蓝染色计数。解冻的细胞然后以1000个细胞/cm2播种到具有如上所述抗生素/抗真菌剂的DMEM:低葡萄糖生长培养基中。细胞在37℃在标准空气条件下生长。生长培养基每周改变两次，当细胞达到约85％汇合时进行传代。细胞随后传代直到衰老，即，直到它们不能更进一步地扩增。细胞在每个传代进行胰蛋白酶化和计数。计算细胞产量、群体加倍[In(最终的细胞/最初的细胞)/In 2]和加倍时间(培养的时间(h)/群 体加倍)。通过用早先传代的总产量乘以每个传代的扩增因数(即，扩增因数＝最终的细胞/起初的细胞)来确定每次传代的总细胞产量。
在低密度下从初始细胞播种的PPDC扩增。测试了在低细胞播种条件下新分离的PPDC的扩增潜力。如在此描述的制备PPDC。细胞以1000个细胞/cm2播种，如上所述传代直到衰老。细胞在37℃在标准空气条件下生长。生长培养基每周改变两次。当细胞达到约85％汇合时细胞进行传代。在每个传代，细胞进行胰蛋白酶化和通过锥石蓝染色来计数。为每个传代计算细胞产量、群体加倍[In(最终的细胞/最初的细胞)/In 2]和加倍时间(培养的时间(h)/群体加倍)。通过用早先传代的总产量乘以每个传代的扩增因数(即，扩增因数＝最终的细胞/起初的细胞)来确定每次传代的总细胞产量。细胞在明胶包被的和未明胶包被的烧瓶上生长。
克隆的新生儿胎盘衍生的细胞的扩增。使用克隆来从胎盘组织扩增新生儿细胞的群体。在从胎盘分离三种不同的细胞群体之后(如在此描述的)，这些细胞群体在标准生长条件下扩增，然后进行染色体分型来揭示分离的细胞群体的身份。由于细胞是从产下男孩的母亲分离的，通过进行中期涂片(metaphase spreads)来区分男性和女性染色体是简单的。这些实验表明，胎儿侧面的细胞对于新生儿表型是染色体组型阳性的，中层细胞对于新生儿和母亲表型是染色体组型阳性的，母亲侧面的细胞对于母亲细胞是染色体组型阳性的。
细胞在低氧培养条件下的扩增。已经展现的是，低氧细胞培养条件可以在某些环境中改善细胞扩增(US20040005704)。为了确定PPDC的细胞扩增是否可以通过改变细胞培养条件来改善，脐带衍生的细胞的培养物在低氧条件下生长。细胞以5000个细胞/cm2播种到明胶包被的烧瓶上的生长培养基中。细胞首先在标准空气条件下培养到传代5，在此时将它们转移到低氧(5％CO2)培养条件下。
其他生长条件。在其他方案中，细胞在未包被的、胶原包被的、纤连蛋白包被的、层粘连蛋白包被的和细胞外基质蛋白包被的平板上扩增。培养物已经展现了在这些不同的基质上扩增良好。
结果
PPDC与其他干细胞和非干细胞群体的扩增潜力的比较。 脐带衍生的和胎盘衍生的细胞都扩增了超过40个传代，在60天中产生了>1E17个细胞的产量。相比之下，MSC和成纤维细胞分别在<25天和<60天衰老。然而脂肪衍生的细胞扩增了几乎60天，它们产生了4.5E12的总细胞产量。因而，当以5000个细胞/cm2在使用的实验条件下播种时，与在相同的条件下生长的其他细胞类型相比，产后衍生的细胞扩增得好得多(表2-1)。
表2-1:生长到衰老的不同细胞群体的生长特征
细胞类型 衰老 总群体加倍 总细胞产量
MSC 24d 8 4.72E7
脂肪细胞 57d 24 4.5E12
成纤维细胞 53d 26 2.82E13
脐带 65d 42 6.15E17
胎盘 80d 46 2.49E19
细胞库在低密度下的扩增潜力。脐带衍生的、胎盘衍生的和成纤维细胞扩增超过10个传代，在60天内产生>1E11个细胞的产量(表2-2)。在这些条件下在60天之后，成纤维细胞变得衰老，而脐带衍生的和胎盘衍生的细胞群体在80天后衰老，分别完成了>50和>40次群体加倍。
表2-2：使用低密度生长扩增从传代10直到衰老的不同细胞群体的生长特征
细胞类型 衰老 总群体加倍 总细胞产量
成纤维细胞(P10) 80d 43.68 2.59E11
脐带(P10) 80d 53.6 1.25E14
胎盘(P10) 60d 32.96 6.09E12
在低密度下从初始细胞播种的PPDC扩增。PPDC在明胶包被的和未包被的平板或烧瓶上以低密度(1000个细胞/cm2)扩增。在 这些条件下这些细胞的生长潜力是良好的。细胞容易地在对数期生长中扩增。细胞扩增的速率类似于在胎盘衍生的细胞以5000个细胞/cm2在明胶包被的烧瓶上在生长培养基中播种时所观察到的。在未包被的烧瓶或明胶包被的烧瓶上培养之间没有观察到细胞扩增潜力方面的差异。然而，在明胶包被的烧瓶上细胞似乎表型上要小得多，在未包被的烧瓶上观察到大得多的细胞表型。
克隆的新生儿或母体胎盘衍生的细胞的扩增。克隆的新生儿或母亲细胞群体可以分别从分离自胎盘的新生儿侧面或母亲侧面的胎盘衍生的细胞中扩增。细胞被连续稀释，然后播种到明胶包被的平板上生长培养基中，用于在96孔明胶包被的平板中1个细胞/孔地扩增。对于这种初始克隆，鉴定可扩增的克隆，进行胰蛋白酶化，重新播种到12孔明胶包被的平板上的生长培养基中，随后以5000个细胞/cm2传代到T25明胶包被的烧瓶中的生长培养基中。进行亚克隆来确保已经鉴定了细胞的克隆群体。对于亚克隆实验，细胞进行胰蛋白酶化并以0.5个细胞/孔重新播种。生长良好的亚克隆以5,000个细胞cm2/烧瓶在明胶包被的T25烧瓶中扩增。细胞以5000个细胞cm2/烧瓶进行传代。克隆的生长特征可以进行标绘来展现细胞扩增。核型分析可以确认克隆是新生儿的还是母亲的。
细胞在低氧培养条件下的扩增。细胞在降低的氧条件下扩增良好，然而，在低氧条件的培养看起来对所使用条件下PPDC的细胞扩增没有显著影响。
概述。包括以约5000个细胞/cm2的密度在生长培养基中在明胶包被的或未包被的烧瓶中、在标准空气氧之下生长分离的产后衍生的细胞的细胞扩增条件足以在传代11时产生大量的细胞。此外，数据表明，细胞可以使用低密度培养条件容易地扩增(例如，1000个细胞/cm2)。在低氧条件下产后衍生的细胞的扩增也促进细胞扩增，然而当利用这些生长条件时没有观察到细胞扩增潜力方面的增加性改善。当前，对于产生细胞的大库(large pools)在标准空气条件下培养产后衍生的细胞是优选的。然而，当改变培养条件时，产后衍生的细胞扩增同样地可以被改变。这种策略可以用于增强这些细胞群体的增殖和分化能力。在所使用的条件之下，当MSC和脂肪衍生细胞的扩增潜力受限时，产后衍生的细胞容易地扩增到大的数量。
实施例2的参考文献
1)Hayflick L.1974a.JAm Geriatr Soc.22:1-12.
2)Hayflick L.1974b.Gerontologist.14:37-45.
3)美国专利公开US20040058412
4)国专利公开US20040048372
5)国专利公开US20040005704.
实施例3
胎盘衍生的细胞的生长培养基的评估
评估了一些细胞培养基支持胎盘衍生的细胞的生长的能力。在使用MTS比色分析3天之后评定了在正常(20％)和低(5％)氧下胎盘衍生的细胞的生长。
方法&材料
传代8(P8)的胎盘衍生的细胞以1×103个细胞/孔播种到96孔平板的具有青霉素/链霉素的生长培养基中。8小时之后，如下所述改变培养基，细胞在正常(空气的)或低(5％，v/v)氧下在37℃、5％CO2孵育48小时。将MTS添加到培养基(CELLTITER 96水性单溶液细胞增殖分析，Promega,Madison,WI)中3小时，在490纳米测量吸光度(Molecular Devices,Sunnyvale CA)。
表3-1.培养基
结果
MTS分析的标准曲线建立了吸光度的增加和细胞数量增加之间的线性关联。获得的吸光度值被转变成估计的细胞数量，计算相对于初始播种的改变(％)。
血清的影响。在标准氧条件下向培养基添加血清引起了吸光度方面以及因而活细胞数量方面可重现的剂量依赖性增加。向完全MSCGM中添加血清引起了吸光度方面剂量依赖性降低。在没有添加血清的培养基中，细胞仅在CELLGRO-FREE、Ham’s F10和DMEM在可观地生长。
氧的影响。降低的氧看起来提高了在生长培养基、Ham’sF10和MSCGM中细胞的生长速度。以生长的递减的顺序，引起最佳细胞生长的培养基是生长培养基>MSCGM>Iscove’s+10％FBS＝DMEM-H+10％FBS＝Ham’s F12+10％FBS＝RPMI 1640+10％FBS。
概述。胎盘衍生的细胞可以在正常的或低氧下在多种培养基中生长。在具有0、2和10％(v/v)血清的十二种基础培养基中在5％或空气氧中测定了胎盘衍生的细胞的短期生长。一般地，除了无蛋白的Ham’s F10和CELLGRO-Free之外，胎盘衍生的细胞在无血清条件下也不生长。在这些无血清培养基中的生长是用含有15％血清的培养基所观察到的最大生长的约25-33％。
实施例4
产后衍生的细胞在含有D-缬氨酸的培养基中的生长
报道的是，含有D-缬氨酸而不是正常L－缬氨酸同种型的培养基可以用于选择性地抑制培养物中成纤维细胞样细胞的生长(Hongpaisan,2000；Sordillo et al.,1988)。早先不知道的是产后衍生的细胞是否可以在含有D-缬氨酸的培养基中生长。
方法&材料
胎盘衍生的细胞(P3)、成纤维细胞(P9)和脐带衍生的细胞(P5)以5×103个细胞/cm2播种到明胶包被的T75烧瓶(Corning,Corning,NY)中。在24小时之后，除去培养基，细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)(Gibco,Carlsbad,CA)洗涤来除去残余的培养基。培养基用修改的生长培养基(具有D-缬氨酸、15％(v/v)透析的胎儿牛血清(Hyclone Logan,UT)、0.001％(v/v)β巯基乙醇(Sigma)、青霉素/链霉素(Gibco)的DMEM(Gibco特别定制))替换。
结果
与播种到含透析的血清的生长培养基中的细胞不同，播种到含有D-缬氨酸的培养基中的胎盘衍生的、脐带衍生的和成纤维细胞不增殖。成纤维细胞形态上改变，大小增加并改变形状。在4周后，所有的细胞死亡并最终从烧瓶表面脱离。这些结果表明，含有D-缬氨酸的培养基不适合于选择性地生长产后衍生的细胞。
实施例4的参考文献
1)Hongpaisan J.2000.Cell Biol Int.24:1-7.
2)Sordillo LM,Oliver SP,Akers RM.1988).Cell Biol Int Rep.12:355-64.
实施例5
胎盘衍生的细胞的低温保存介质
评估了用于胎盘衍生的细胞的低温保存的低温保存介质。
方法&材料
在明胶包被的T75烧瓶中的生长培养基中生长的胎盘衍生的细胞用PBS洗涤并使用1毫升Trypsin/EDTA(Gibco)胰蛋白酶化。通过添加10毫升生长培养基来停止胰蛋白酶消化。细胞在150×g离心，除去上清液，细胞团重悬浮在1毫升生长培养基中。移出60微升的细胞悬液等分量，并添加到60微升锥石蓝(Sigma)中。使用血球计估计活细胞数量。细胞悬液分成四个相等的等分量，每个含有88×104个细胞。细胞悬液进行离心，重悬浮在1毫升每种以下的培养基中，并转移到冷冻瓶(Nalgene)中。
1.)生长培养基+10％(v/v)DMSO(Hybrimax,Sigma,St.Louis,MO)
2.)细胞冷冻培养基w/DMSO,w/甲基纤维素，无血清(C6295,Sigma,St.Louis,MO)
3.)细胞冷冻培养基，无血清(C2639,Sigma,St.Louis,MO)
4.)细胞冷冻培养基w/甘油(C6039，Sigma,St.Louis,MO)
使用“Mr Frosty”冷冻容器根据厂家的说明书(Nalgene,Rochester,NY)在-80℃冷冻器中以大约-1℃/分钟冷却细胞。细胞的小瓶转移到液氮中2天，之后在37℃水浴中快速解冻。细胞添加到10毫升生长培养基中并离心，之后估计细胞数量和生存力。细胞以5000个细胞/cm2播种到明胶包被的烧瓶上来确定细胞是否将附着和增殖。
结果
要被低温保存的细胞的初始生存力通过锥石蓝染色评定为100％。要被低温保存的细胞的初始生存力通过锥石蓝染色评定为100％。
由于细胞裂解，对于C6295存在着细胞数量和生存力方面的相称的降低。在所有四种溶液中低温保存的活细胞附着、***并在3 天内产生汇合的单层细胞。在估计的生长速度中没有可辨别的差异。
概述。细胞的低温保存是用于细胞库或细胞产物的制备的一种可用的操作。比较了四种低温保存混合物保护人类胎盘衍生的细胞免于冷冻损伤的能力。Dulbecco’s修改的Eagle’s培养基(DMEM)和10％(v/v)二甲亚砜(DMSO)是为了胎盘衍生的细胞的低温保存所比较的那些的优选的培养基。
实施例6
产后衍生的细胞的核型分析
用于细胞疗法的细胞系优选的是同质的，并且没有任何污染细胞类型。用于细胞疗法的细胞应当具有正常的染色体数量(46)和结构。为了鉴定同质的并且没有非产后组织来源的细胞的胎盘和脐带衍生的细胞系，分析了细胞样品的染色体组型。
材料和方法
来自男性婴儿的产后组织的PPDC在含有青霉素/链霉素的生长培养基中培养。选择来自男性婴儿(X,Y)的产后组织来容许区分新生儿衍生的细胞和母亲衍生的细胞(X,X)。细胞以5000个细胞每平方厘米播种到T25烧瓶(Corning,Corning,NY)中的生长培养基中，并扩增到80％汇合。含有细胞的T25烧瓶用生长培养基填充到颈部。样品由快递送交到临床的细胞遗传学实验室(估计的实验室到实验室转运时间是一个小时)。在染色体最好地显现的中期期间分析细胞。在中期计数的二十个细胞中，五个被分析为正常的同质的染色体组型数量(两组)。如果观察到两组染色体组型，细胞样品被表征为同质的。如果观察到超过两组染色体组型，细胞样品被表征为异质的。当鉴定出异质的染色体组型数(四组)时，对其他中期细胞进行计数和分析。
结果
送往染色体分析的所有细胞样品被说明展现了正常的外观。分析的十六个细胞系中的三个展现了异质的表型(XX和XY)，表明来自新生儿和母亲来源的细胞的存在(表6-1)。来自组织胎盘-N的细胞从胎盘的新生儿侧面分离。在传代零，这个细胞似乎是同质的XY。然而，在传代9，细胞系是异质的(XX/XY)，表明了母亲来源的细胞的早先未检出的存在。
表6-1.PPDC核型分析的结果
组织 传代 计数的中期细胞 分析的中期细胞 核型的数量 ISCN核型
胎盘 22 20 5 2 46，XX
脐带 23 20 5 2 46，XX
脐带 6 20 5 2 46，XY
胎盘 2 20 5 2 46，XX
脐带 3 20 5 2 46，XX
胎盘-N 0 20 5 2 46，XY
胎盘-V 0 20 5 2 46，XY
胎盘-M 0 21 5 4 46，XY[18]/46，XX[3]
胎盘-M 4 20 5 2 46，XX
胎盘-N 9 25 5 4 46，XY[5]/46，XX[20]
胎盘-N C1 1 20 5 2 46，XY
胎盘-N C3 1 20 6 4 46，XY[2]/46，XX[18]
胎盘-N C4 1 20 5 2 46，XY
胎盘-N C15 1 20 5 2 46，XY
胎盘-N C20 1 20 5 2 46，XY
图解：N-新生儿侧面；V-绒毛区；M-母亲侧面；C-克隆
概述。如临床细胞发生学实验室所说明的，染色体分析鉴定了染色体组型正常呈现的胎盘和脐带衍生的细胞。如通过同质的染色体组型所鉴定的，核型分析也鉴定出没有母亲细胞的细胞系。
实施例7
通过流式细胞术对人类产后衍生的细胞表面标志的评估
通过流式细胞术的细胞表面蛋白或“标志物”的表征可以用于确定细胞系的身份。表达的一致性可以从多个供体、以及暴露于不同的处理和培养条件的细胞中来确定，表征了分离自胎盘和脐带的产后衍生的细胞(PPDC)系(通过流式细胞术)，提供了用于鉴定这些细胞系的分布型。
材料和方法
培养基和培养容器。细胞在具有青霉素/链霉素的生长培养基(Gibco Carlsbad，CA)中培养。细胞在血浆处理的T75、T150和T225组织培养烧瓶(Corning，Corning，NY)中培养直到汇合。***生长面 通过在室温下孵育2％(w/v)明胶(Sigma,St.Louis,MO)20分钟来用明胶包被。
抗体染色和流式细胞术分析。烧瓶中的粘附细胞在PBS中洗涤，用Trypsin/EDTA脱离。收获细胞，离心，以1×107每毫升的细胞浓度重悬浮在PBS中的3％(v/v)FBS中。根据厂家的说明，针对感兴趣的细胞表面标记物(参见下文)的抗体添加到一百微升细胞悬液中，混合物在4℃在暗处孵育30分钟。孵育之后，细胞用PBS洗涤，离心来除去未结合的抗体。细胞重悬浮在500微升PBS中，通过流式细胞术分析。使用FACScaliburTM仪器(BectonDickinson,San Jose,CA)进行流式细胞术分析。
使用了针对细胞表面标记物的以下抗体。
胎盘和脐带比较。在传代8时将胎盘衍生的细胞与脐带衍生的细胞比较。
传代与传代的比较。在传代8、15和20分析胎盘和脐带衍生的细胞。
供体与供体的比较。为了比较供体之间的差异，相互比较了来自不同供体的胎盘衍生的细胞，以及相互比较了来自不同供体的脐带衍生的细胞。
表面包被比较。在明胶包被的烧瓶上培养的胎盘衍生的细胞与在未包被的烧瓶上培养的胎盘衍生的细胞进行比较。在明胶包被的烧瓶上培养的脐带衍生的细胞与在未包被的烧瓶上培养的脐带衍生的细胞进行比较。
消化酶的比较。比较了用于细胞的分离和制备的四种处理。比较了通过用1)胶原酶；2)胶原酶/分散酶；3)胶原酶/透明质酸酶；和4)胶原酶/透明质酸酶/分散酶处理从胎盘分离的细胞。
胎盘层的比较。来自胎盘组织的母亲侧面的细胞与来自胎盘组织的绒毛区的细胞和来自胎盘的新生胎儿侧面的细胞进行比较。
结果
胎盘和脐带的比较。通过流式细胞术分析的胎盘和脐带衍生的细胞显示了CD10、CD13、CD44、CD73、CD 90、PDGFr-α和HLA-A、B、C的阳性表达，通过相对于IgG对照的提高的荧光值所表明。这些细胞对于CD31、CD34、CD45、CD117、CD141和HLA-DR、DP、DQ的可检测表达是阴性的，如与IgG对照可比较的荧光值所表明的。考虑了阳性曲线的荧光值中的变异。阳性曲线的平均值(即，CD13)和范围(即，CD90)显示了某些变异，但是曲线看来是正常的，确认了同质的群体。两个曲线分别展现了大于IgG对照的值。
传代与传代的比较——胎盘衍生的细胞。通过流式细胞术分析的处在传代8、15和20的胎盘衍生的细胞对于CD10、CD13、CD44、CD73、CD 90、PDGFr-α和HLA-A、B、C的表达都是阳性的，如相对于IgG对照的提高的荧光值中所反映的。细胞对于CD31、CD34、CD45、CD117、CD141和HLA-DR、DP、DQ的表达是阴性的，具有与IgG对照一致的荧光值。
传代与传代的比较——脐带衍生的细胞。通过流式细胞术分析的处在传代8、15和20的脐带衍生的细胞都表达CD10、CD13、 CD44、CD73、CD 90、PDGFr-α和HLA-A、B、C，如相对于IgG对照的提高的荧光值中所表明的。这些细胞对于CD31、CD34、CD45、CD117、CD141和HLA-DR、DP、DQ是阴性的，如与IgG对照一致的荧光值所表明的。
供体与供体的比较——胎盘衍生的细胞。通过流式细胞术分析的胎盘衍生的细胞都CD10、CD13、CD44、CD73、CD 90、PDGFr-α和HLA-A、B、C，具有相对于IgG对照的提高的荧光值。细胞对于CD31、CD34、CD45、CD117、CD141和HLA-DR、DP、DQ的表达是阴性的，如与IgG对照一致的荧光值所表明的。
供体与供体的比较——脐带衍生的细胞。通过流式细胞术分析的从独立的供体分离的脐带衍生的细胞都显示了CD10、CD13、CD44、CD73、CD 90、PDGFr-α和HLA-A、B、C的阳性表达，在相对于IgG对照的提高的荧光值中所反映。这些细胞对于CD31、CD34、CD45、CD117、CD141和HLA-DR、DP、DQ的表达是阴性的，具有与IgG对照一致的荧光值。
使用明胶表面包被对胎盘衍生的细胞的影响。通过流式细胞术分析的、在明胶包被的或未包被的烧瓶上扩增的胎盘衍生的细胞都表达CD10、CD13、CD44、CD73、CD 90、PDGFr-α和HLA-A、B、C，如相对于IgG对照的提高的荧光值所反映的。这些细胞对于CD31、CD34、CD45、CD117、CD141和HLA-DR、DP、DQ的表达是阴性的，如与IgG对照一致的荧光值所表明的。
使用明胶表面包被对脐带衍生的细胞的影响。通过流式细胞术分析的在明胶包被和未包被烧瓶上扩增的脐带衍生的细胞对于CD10、CD13、CD44、CD73、CD 90、PDGFrα和HLA-A、B、C的表达都是阳性的，具有相对于IgG对照提高的荧光值。这些细胞对于CD31、CD34、CD45、CD117、CD141和HLA-DR、DP、DQ的表达是阴性的，具有IgG对照一致的荧光值。
用于制备细胞的酶消化操作对于细胞表面标记物分布的影响。通过流式细胞术分析的、使用各种消化酶分离的胎盘衍生的细胞都表达CD10、CD13、CD44、CD73、CD 90、PDGFr-α和HLA-A、B、C，如相对于IgG对照提高的荧光值所表明的。这些细胞对于CD31、CD34、CD45、CD117、CD141和HLA-DR、DP、DQ的表达是阴性的，如与IgG 对照一致的荧光值所表明的。
胎盘层的比较。通过流式细胞术分析的、分别从胎盘的母亲层、绒毛层和新生儿层分离的细胞显示了CD10、CD13、CD44、CD73、CD 90、PDGFr-α和HLA-A、B、C的阳性表达，如相对于IgG对照的提高的荧光值所表明的。这些细胞对于CD31、CD34、CD45、CD117、CD141和HLA-DR、DP、DQ的表达是阴性的，如与IgG对照一致的荧光值所表明的。
概述。通过流式细胞术对胎盘和脐带衍生的细胞的分析确定了这些细胞系的身份。胎盘和脐带衍生的细胞对于CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α、HLA-A、B、C是阳性的，对于CD31、CD34、CD45、CD117、CD141和HLA-DR、DP、DQ是阴性的。在包括供体、传代、培养容器表面包被、消化酶和胎盘层的变量方面的差异之间，这种身份是一致的。在单独的荧光值直方图曲线平均值和范围方面观察到某些变异，但在所有测试的条件下所有的阳性曲线都是正常的并且表达大于IgG对照的荧光值，因而确认了细胞包含具有标记物的阳性表达的同质的群体。
实施例8
产后组织表型的免疫组织化学的特征
通过免疫组织化学分析了在人类产后组织、即脐带和胎盘中存在的细胞的表型。
材料&方法
组织制备。收获人类脐带和胎盘组织，浸入固定在4％(w/v)多聚甲醛中4℃过夜。使用针对以下表位的抗体进行免疫组织化学：波形蛋白(1:500；Sigma,St.Louis,MO)，结蛋白(1:150，针对兔产生的；Sigma；或1:300，针对小鼠产生的；Chemicon,Temecula,CA)，α-平滑肌肌动蛋白(SMA；1:400；Sigma)，细胞角蛋白18(CK18；1:400；Sigma)，von Willebrand因子(vWF；1:200；Sigma)和CD34(人类CD34III类；1:100；DAKOCytomation,Carpinteria,CA)。此外，测试了以下标记物：抗人类GROα-PE(1:100；Becton Dickinson，Franklin Lakes,NJ)，抗人类GCP-2(1:100；Santa Cruz Biotech,Santa Cruz,CA)，抗 人类氧化的LDL受体1(ox-LDL R1；1:100；Santa Cruz Biotech)，和抗人类NOGO-A(1:100；Santa CruzBiotech)。用解剖刀修整固定的样本，放置在含有乙醇的干冰水浴上的OCT包埋化合物(Tissue-Tek OCT；Sakura,Torrance,CA)内。然后使用标准恒冷切片机(LeicaMicrosystems)对冷冻的块切片(10微米厚度)，并固定在玻璃载片上用于染色。
免疫组织化学。如早先的研究类似地进行免疫组织化学(例如，Messina,et al.,2003,Exper.Neurol.184:816-829)。组织切片用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤，暴露于含有PBS、4％(v/v)山羊血清(Chemicon,Temecula,CA)和0.3％(v/v)Triton(Triton X-100；Sigma)的蛋白封闭溶液中1小时来接近细胞内抗原。在感兴趣的表位位于细胞表面的情况下(CD34、ox-LDL、R1)，在所有的操作步骤中省略Triton以避免表位损失。此外，在原始抗体是针对山羊产生的情况下(GCP-2、ox-LDL R1、NOGO-A)，在整个操作中使用3％(v/v)驴血清替代山羊血清。然后在封闭溶液中稀释的原始抗体添加到切片上在室温下持续4小时。除去原始抗体溶液，在添加二级抗体溶液(在室温下1小时)之前用PBS洗涤，二级抗体溶液含有封闭物以及山羊抗小鼠IgG–Texas Red(1:250；Molecular Probes,Eugene,OR)和/或山羊抗兔IgG-Alexa 488(1:250；Molecular Probes)或驴抗山羊IgG–FITC(1:150；Santa CruzBiotech)。洗涤培养物，添加10微摩尔DAPI(Molecular Probes)10分钟来显现细胞核。
在免疫染色之后，使用合适的荧光过滤器在Olympus反向上荧光显微镜(Olympus,Melville,NY)上使用合适的荧光滤片显现荧光。高于对照染色的荧光信号代表阳性染色。使用数字彩色摄像机和 软件(Media Cybernetics,Carlsbad,CA)捕获代表性的图像。对于三重染色的样品，一次仅使用一个发射滤片采集每个图像。然后使用AdobePhotoshop软件(Adobe,San Jose,CA)制成层叠的混合画面。
结果
脐带特征。波形蛋白、结蛋白(desmin)、SMA、CK18、vWF和CD34标记物在脐带内存在的细胞的子集中表达。特别是，vWF和CD34表达局限于脐带内含有的血管。CD34+细胞处在最内层(管腔 面)。波形蛋白表达在整个脐带的基质和血管中发现。SMA局限于动脉&静脉的基质和外壁，而不在血管本身内含有。CK18和结蛋白仅在血管中观察到，结蛋白限于中间层和外层。
胎盘特征。波形蛋白、结蛋白、SMA、CK18、vWF和CD34都在胎盘内观察到，并且是区域特异性的。
GROα、GCP-2、ox-LDL R1和NOGO-A组织表达。这些标记物都没有在脐带或胎盘组织中观察到。
概述。波形蛋白、结蛋白、α-平滑肌肌动蛋白、细胞角蛋白18、von Willebrand因子和CD 34在人类脐带和胎盘内的细胞中表达。
实施例9
使用寡核苷酸阵列对产后组织衍生的细胞的分析
GENECHIP阵列被用于比较脐带和胎盘衍生的细胞与成纤维细胞、人类间质干细胞和来自人类骨髓的另一个细胞系的基因表达分布型。这种分析提供了产后衍生的细胞的特征和这些细胞的鉴定的独特分子标记物。
材料和方法
细胞的分离和培养。人类脐带和胎盘在患者同意下从正常的足月分娩从NationalDisease Research Interchange(NDRI，Philadelphia,PA)获得。如实施例1描述的接受组织和分离细胞。细胞在明胶包被的组织培养塑料烧瓶上在生长培养基(使用DMEM-LG)中培养。在37℃用5％CO2孵育培养物。
人类皮肤成纤维细胞购自Cambrex Incorporated(Walkersville,MD；批号9F0844)和ATCC CRL-1501(CCD39SK)。两个细胞系在具有10％(v/v)胎儿牛血清(Hyclone)和青霉素/链霉素(Invitrogen)的DMEM/F12培养基(Invitrogen,Carlsbad,CA)中培养。细胞在标准组织处理的塑料上生长。
人类间质干细胞(hMSC)购自Cambrex Incorporated(Walkersville,MD；批号2F1655、2F1656和2F1657)，并根据厂家的说明在MSCGM培养基(Cambrex)中培养。细胞在37℃、5％CO2在标准的组织培养的塑料上生长。
人类髂嵴骨髓来自于患者同意的NDRI。骨髓根据Ho等人(WO03/025149)阐述的方法来加工。骨髓以1份骨髓比20份裂解缓冲液的比例与裂解缓冲液(155mM NH4Cl、10mMKHCO3和0.1mM EDTA，pH 7.2)混合。细胞悬液进行涡旋，在环境温度下孵育2分钟，在500×g离心10分钟。丢弃上清液，细胞团重悬浮在补充有10％(v/v)胎儿牛血清和4mM谷氨酰胺的最低必需培养基-α(Invitrogen)中。细胞再次离心，细胞团重悬浮在新鲜培养基中。活的单核细胞使用锥石蓝排阻(Sigma,St.Louis,MO)来计数。单核细胞以5×104个细胞/cm2播种到组织培养的塑料烧瓶中。细胞在标准空气O2或在5％O2下在37℃、5％CO2下孵育。细胞培养5天而不改变培养基。在5天的培养之后除去培养基和非粘附的细胞。粘附的细胞维持在培养中。
mRNA的分离和GENECHIP分析。细胞的活跃生长的培养物用细胞刮刀在冷的PBS中从烧瓶上移除。细胞在300×g离心5分钟。除去上清液，细胞重悬浮在新鲜的PBS中并再次离心。除去上清液，细胞团直接冷冻并保持在-80℃。提取细胞mRNA并转录成cDNA，其然后转录成cRNA并生物素标记。生物素标记的cRNA与HG-U133A GENECHIP寡核苷酸阵列(Affymetrix，Santa Clara CA)杂交。各级厂家的说明进行杂交和数据收集。使用“微阵列的显著性分析(Significance Analysis of Microarrays)”(SAM)版本1.21计算机软件(Stanford University；Tusher,V.G.et al.,2001,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98:5116-5121)来进行分析。
结果
分析了十四个不同的细胞群体。细胞和传代信息、培养底物和培养基在表9-1中列出。
表9-1.微阵列研究分析的细胞。通过标识码和分析时的传代、细胞生长底物和生 长培养基来列出细胞系。
细胞群体 传代 底物 培养基
脐带(022803) 2 明胶 DMEM,15％FBS,2-ME
脐带(042103) 3 明胶 DMEM,15％FBS,2-ME
脐带(071003) 4 明胶 DMEM,15％FBS,2-ME
胎盘(042203) 12 明胶 DMEM,15％FBS,2-ME
胎盘(042903) 4 明胶 DMEM,15％FBS,2-ME
胎盘(071003) 3 明胶 DMEM,15％FBS,2-ME
ICBM(070203)(5％02) 3 塑料 MEM,10％FBS
ICBM(062703)(std.O2) 5 塑料 MEM,10％FBS
ICBM(062703)(5％02) 5 塑料 MEM,10％FBS
hMSC(Lot2F1655) 3 塑料 MSCGM
hMSC(Lot2F1656) 3 塑料 MSCGM
hMSC(Lot2F1657) 3 塑料 MSCGM
h成纤维细胞(9F0844) 9 塑料 DMEM-F12,10％FBS
h成纤维细胞(CCD39SK) 4 塑料 DMEM-F12,10％FBS
通过主成分分析(Principle Component Analysis)评估了数据，分析了在细胞中差异表达的290个基因。这项分析容许群体之间的相似性的相对比较。表9-2显示了适合于比较细胞配对的欧几里德距离。欧几里得距离是基于根据在细胞类型之间差异表达的290个基因的细胞比较。欧几里得距离与290个基因的表达之间的相似性成反比(即，距离越大，存在的相似性越小)。
表9-2.细胞对的欧几里得距离
ICBM-hMSC 24.71
胎盘的-脐带的 25.52
ICBM-成纤维细胞 36.44
ICBM-成纤维细胞-胎盘 37.09
成纤维细胞-MSC 39.63
ICBM-脐带的 40.15
成纤维细胞-脐带的 41.59
MSC-胎盘 42.84
MSC-脐带的 46.86
ICBM-胎盘 48.41
表9-3、9-4和9-5显示了在胎盘衍生的细胞中提高的(表9-3)、在脐带衍生的细胞中提高的(表9-4)和在脐带和胎盘衍生的细胞中降低的(表9-5)基因的表达。标题为“探针集ID”的栏是指位于芯片的特定位置上几个寡核苷酸探针的集合的厂家标识码，其与指定的基因(“基因名称”栏)杂交，所述基因包含可以以特定的登记号码(“NCBI登记号”栏)在NCBI(GenBank)数据库中找到的序列。
表9-3.与分析的其他细胞系相比在胎盘衍生的细胞中显示了具有特异性提高的表达的基因
表9-4.与分析的其他细胞系相比在脐带衍生的细胞中显示了具有特异性提高的表达的基因
表9-5.与分析的其他细胞系相比在脐带和胎盘衍生的细胞中显示了具有降低的表达的基因
表9-6、9-7和9-8显示了在人类成纤维细胞(表9-6)、ICBM细胞(表9-7)和MSC(表9-8)中提高的基因表达。
表9-6.与分析的其他细胞系相比在成纤维细胞中显示了具有提高的表达的基因。
表9-7.与分析的其他细胞系相比在ICBM衍生的细胞中显示了具有提高的表达的基因。
表9-8.与分析的其他细胞系相比在MSC细胞中显示了具有提高 的表达的基因。
概述。进行当前的检验来提供来自于脐带和胎盘的产后细胞的分子特征。这些分析包括来自三个不同的脐带和三个不同的胎盘的细胞。所述检验还包括皮肤成纤维细胞的两个不同细胞系、间质干细胞的三个细胞系、以及髂嵴骨髓细胞的三个细胞系。这些细胞表达的mRNA使用含有22,000个基因的探针的寡核苷酸阵列来分析。结果显示，在这五种不同的细胞类型中290个基因是差异表达的。这些基因包括在胎盘衍生的细胞中特异性提高的十个基因，和在脐带衍生的细胞中特异性地提高的七个基因。与其他细胞类型相比，发现五十四个基因在胎盘和脐带中具有特异性更低的表达水平。选定的基因的表达通过PCR确认(参见随后的实施例)。这些结果显示了，产后衍生的细胞具有不同的基因表达分布型，例如，与骨髓衍生的细胞和成纤维细胞相比。
实施例10
产后衍生的细胞中的细胞标记物
在之前的实施例中，来自人类胎盘和人类脐带的细胞中的相似性和不同通过将它们的基因表达分布与来自其他来源的细胞的基因表达分布相比较(使用寡核苷酸阵列)来评估。鉴定出六个“标志”基因：氧化的LDL受体1，白细胞介素-8，凝乳酶，reticulon，趋化因子受体配体3(CXC配体3)，和粒细胞趋化性蛋白2(GCP-2)。这些“标志”基因在产后衍生的细胞中以相对高的水平表达。
进行在这个实施例中描述的操作来证实微阵列数据并发现基因和蛋白表达之间的一致性/不一致性，以及建立用于检测胎盘和脐带衍生的细胞的独特标识的一系列可靠的分析。
方法&材料
细胞。胎盘衍生的细胞(三个分离物，包括通过核型分析鉴定的主要为新生儿的一个分离物)、脐带衍生的细胞(四个分离物)、和正常人类皮肤成纤维细胞(NHDF；新生儿的和成人的)在明胶包被的T75烧瓶中具有青霉素/链霉素的生长培养基中生长。间质干细胞(MSC)在间质干细胞生长培养基Bullet试剂盒(MSCGM；Cambrex,Walkerville,MD)中生长。
对于IL-8方案，细胞从液氮中解冻，以5000个细胞/cm2平铺在明胶包被的烧瓶中，在生长培养基中生长48小时，然后在10毫升的血清饥饿培养基[DMEM-低葡萄糖(Gibco,Carlsbad,CA)，青霉素/链霉素(Gibco,Carlsbad,CA)和0.1％(w/v)牛血清白蛋白(BSA；Sigma,St.Louis,MO)]中生长另外8小时。在这种处理之后，提取RNA，上清液在150×g离心5分钟来除去细胞碎屑。上清液然后在-80℃冷冻用于ELISA分析。
ELISA分析的细胞培养。来自胎盘和脐带的产后细胞，以及来自人类新生儿***的人类成纤维细胞在明胶包被的T75烧瓶中的生长培养基中培养。细胞在传代11时在液氮中冷冻。将细胞解冻并转移到15毫升离心管中。在150×g离心5分钟之后，丢弃上清液。细胞重悬浮在4毫升培养基中并计数。细胞在含有15毫升生长培养基的75cm2烧瓶中以375,000个细胞/烧瓶生长24小时。培养基改变成血清饥饿培 养基持续8小时。在孵育的结束时收集血清饥饿培养基，在14,000×g离心5分钟(并保存在-20℃)。
为了估计每个烧瓶中的细胞数目，2毫升Trypsin/EDTA(Gibco,Carlsbad,CA)添加到每个烧瓶中。在细胞从烧瓶分离之后，用8毫升的生长培养基中和胰蛋白酶活性。细胞转移到15毫升离心管中，在150×g离心5分钟。除去上清液，将1毫升生长培养基添加到每个管中来重悬浮细胞。使用血球计估计细胞数量。
ELISA分析。细胞分泌到血清饥饿培养基中的IL-8的数量使用ELISA分析(R&DSystems,Minneapolis,MN)来分析。所有的分析根据厂家提供的说明来测试。
总RNA分离。从汇合的产后衍生的细胞和成纤维细胞提取RNA，或对于IL-8表达从如上所述处理的细胞提取。细胞根据厂家的说明(RNeasy Kit；Qiagen,Valencia,CA)用含有β-巯基乙醇的350微升缓冲液RLT(Sigma,St.Louis,MO)裂解。根据厂家的说明提取RNA(RNeasy Mini Kit；Qiagen,Valencia,CA)，并进行DNase处理(2.7U/样品)(SigmaSt.Louis,MO)。用50微升DEPC处理的水洗脱RNA，并保存在-80℃。
逆转录。还从欧诺人类胎盘和脐带提取RNA。组织(30毫克)悬浮在700微升含2-巯基乙醇的缓冲液RLT中。样品机械地匀化，根据厂家的说明进行RNA提取。用50微升DEPC处理的水洗脱RNA，保存在-80℃。RNA用TaqMan逆转录试剂(Applied Biosystems,Foster City,CA)使用随机六聚体逆转录，在25℃10分钟、37℃60分钟以及95℃10分钟。样品保存在-20℃。
通过cDNA微阵列鉴定为在产后细胞中独特地调节的基因(标志基因—包括氧化的LDL受体、白细胞介素-8、凝乳酶和reticulon)，使用实时和常规PCR进一步来研究。
实时PCR。使用Assays-on-Demand基因表达产物对cDNA样品进行PCR：氧化的LDL受体(Hs00234028)；凝乳酶(Hs00166915)；reticulon(Hs00382515)；CXC配体3(Hs00171061)；GCP-2(Hs00605742)；IL-8(Hs00174103)；和GAPDH(Applied Biosystems,Foster City,CA)根据厂家的说明(Applied Biosystems,Foster City,CA)与cDNA和TaqMan Universal PCR主混合物混合，使用具有ABI Prism 7000 SDS软 件(Applied Biosystems,Foster City,CA)的7000序列检测***。热循环条件起初是50℃2分钟和95℃10分钟，随后是95℃15秒和60℃1分钟的40个循环。根据厂家的说明分析PCR数据(来自Applied Biosystems的UserBulletin#_2，用于ABI Prism 7700序列检测***)。
常规的PCR。使用PRISM 7700(Perkin Elmer Applied Biosystems,Boston,Massachusetts,USA)进行常规PCR来确认实时PCR的结果。使用2微升cDNA溶液、1×AmpliTaq Gold通用混合物PCR反应缓冲液(Applied Biosystems,Foster City,CA)和94℃5分钟的初始变性来进行PCR。为每个引物集优化扩增。对于IL-8、CXC配体3和reticulon(94℃15秒，55℃15秒和72℃30秒，30个循环)；对于凝乳酶(94℃15秒，53℃15秒和72℃30秒，30个循环)；对于氧化的LDL受体和GAPDH(94℃15秒、55℃15秒和72℃30秒，33个循环)。用于扩增的引物在表1中列出。最终的PCR反应中的引物浓度是1微摩尔，除了GAPDH之外，其是0.5微摩尔。GAPDH引物与实时PCR相同，只是厂家的TaqMan探针不添加到最终的PCR反应中。样品在2％(w/v)琼脂糖凝胶上运行，用溴化乙锭染色(Sigma,St.Louis,MO)。使用焦点长度照相机(VWR International,South Plainfield,NJ)使用667 UniversalTwinpack胶片(VWR International,South Plainfield,NJ)捕获图像。
表10-1:使用的引物
免疫荧光。PPDC用冷的4％(w/v)多聚甲醛(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)在室温下固定10分钟。使用处在传代0(P0)(分离后直接的)和传代11(P11)的每种脐带和胎盘衍生的细胞的一个分离物(胎盘衍生的两个分离物，脐带衍生的细胞的两个分离物)和成纤维细胞(P11)。使用针对以下表位的抗体进行免疫细胞化学：波形蛋白(1:500，Sigma,St.Louis,MO)，结蛋白(1:150；Sigma—针对兔产生的；或1:300；Chemicon，Temecula，CA—针对小鼠产生的)，α-平滑肌肌动蛋白(SMA；1:400；Sigma)，细胞角蛋白18(CK18；1:400；Sigma)，vonWillebrand因子(vWF；1:200；Sigma)，和CD34(人类CD34 III类；1:100；DAKOCytomation,Carpinteria,CA)。此外，对传代11的产后细胞测试了以下标记物：抗人类GROα-PE(1:100；Becton Dickinson，Franklin Lakes,NJ)，抗人类GCP-2(1:100；Santa Cruz Biotech,Santa Cruz,CA)，抗人类氧化的LDL受体1(ox-LDL R1；1:100；Santa Cruz Biotech)，和抗人类NOGO-A(1:100；Santa Cruz Biotech)。
培养物用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤，暴露于含有PBS、4％(v/v)山羊血清(Chemicon,Temecula,CA)和0.3％(v/v)(Triton X-100；Sigma,St.Louis,MO)的蛋白封闭溶液中30分钟来接近细胞内抗原。在感兴趣的表位位于细胞表面的情况下(CD34，ox-LDL R1)，在所有的操作步骤中省略Triton X-100以避免表位损失。此外，在原始抗体是针对山羊产生的情况下(GCP-2、ox-LDL R1、NOGO-A)，使用3％(v/v)驴血清替代山羊血清。然后在封闭溶液中稀释的原始抗体添加到培养物，在室温下持续1小时。除去原始抗体溶液，在添加二级抗体溶液(在室温下1小时)之前用PBS洗涤，二级抗体溶液含有封闭物以及山羊抗小鼠IgG–Texas Red(1:250，Molecular Probes,Eugene,OR)和/或山羊抗兔IgG-Alexa 488(1:250，Molecular Probes)或驴抗山羊IgG–FITC(1:150，Santa CruzBiotech)。然后洗涤培养物，添加10微摩尔DAPI(Molecular Probes)10分钟来显现细胞核。
在免疫染色之后，使用合适的荧光过滤器在Olympus反向上荧光显微镜(Olympus,Melville,NY)上使用合适的荧光滤片显现荧光。在所有情况下，阳性染色代表高于对照染色的荧光信号，其中以上列出的整个操作之后是排除应用原始抗体溶液。使用数字彩色摄像机和 软件(Media Cybernetics,Carlsbad,CA)捕获代表性的图像。 对于三重染色的样品，一次仅使用一个发射滤片采集每个图像。然后使用Adobe软件(Adobe,San Jose,CA)制成层叠的混合画面。
用于FACS分析的细胞的制备。烧瓶中的粘附细胞在磷酸盐缓冲盐水(PBS)(Gibco,Carlsbad,CA)中洗涤，用Trypsin/EDTA(Gibco,Carlsbad,CA)脱离。收获细胞，离心，以1×107每毫升的细胞浓度重新悬浮在PBS中的3％(v/v)FBS中。将一百微升等分量放入锥形管中。对细胞内抗原染色的细胞用Perm/Wash缓冲液(BD Pharmingen，San Diego，CA)渗透化。抗体按照厂家说明添加到等分量中，细胞在4℃在暗处孵育30分钟。孵育之后，细胞用PBS洗涤，离心来除去过量抗体。需要二级抗体的细胞重悬浮在100微升的3％FBS中。根据厂家的说明添加二级抗体，细胞在4℃在暗处孵育30分钟。孵育之后，细胞用PBS洗涤，离心来除去过量的二级抗体。洗涤的细胞重悬浮在0.5毫升PS中，通过流式细胞术分析。使用以下的抗体：氧化的LDL受体1(sc-5813；Santa Cruz,Biotech)，GROa(555042；BD Pharmingen,Bedford,MA)，小鼠IgG1kappa，(P-4685和M-5284；Sigma)，驴抗山羊IgG(sc-3743；SantaCruz,Biotech.)。使用(Becton Dickinson,San Jose,CA)进行流式细胞术分析。
结果
对来自人类胎盘、成年人和新生儿成纤维细胞和间质干细胞(MSC)的cDNA进行的选择“标志”基因的实时PCR的结果表明，与其他细胞相比，氧化的LDL受体和凝乳酶在胎盘衍生的细胞中以更高的水平表达。从实时PCR获得的数据通过ΔΔCT方法来分析并在对数尺度上表示。与其他细胞相比，reticulon和氧化的LDL受体表达的水平在脐带衍生的细胞中更高。在产后衍生的细胞和对照之间没有发现CXC配体3和GCP-2表达水平方面的显著差异。实时PCR的结果通过常规PCR来确认。PCR产物的测序进一步验证了这些观察结果。使用以上列出的常规PCR CXC配体3引物，在产后衍生的细胞和对照之间没有发现CXC配体3的表达水平方面的显著差异。
在产后细胞中细胞因子、IL-8的产生在生长培养基培养的和血清饥饿的产后衍生的细胞中都提高。所有的实时PCR数据用常规的PCR和通过测序PCR产物来验证。
当在无血清培养基中生长的细胞的上清液中检查IL-8的存在时，在来自脐带衍生的细胞和胎盘细胞的某些分离物的培养基中检测到最高的数量(表10-1)。在来自人类皮肤成纤维细胞的培养基中没有检测到IL-8。
表10-1:ELISA测量的IL-8蛋白数量
ND:未检出
还通过FACS分析检查了胎盘衍生的细胞的氧化的LDL受体、GCP-2和GROα的产生。细胞测试了GCP-2的阳性。通过这种方法没有检出氧化的LDL受体和GRO。
还通过免疫细胞化学分析测试了胎盘衍生的细胞的选定蛋白质的产生。在分离之后直接地(传代0)，来自人类胎盘的细胞用4％多聚甲醛固定，并暴露于六种蛋白质的抗体：von Willebrand因子、CD34、细胞角蛋白18、结蛋白、α-平滑肌肌动蛋白和波形蛋白。细胞对于α-平滑肌肌动蛋白和波形蛋白都是染色阳性的。这种模式保持到传代11。在传代0的仅少数细胞(<5％)对于细胞角蛋白18是染色阳性的。
来自人类脐带的处在传代0的细胞通过免疫细胞化学分析来探测选定蛋白质的产生。在分离之后立即地(传代0)，细胞用4％多聚甲醛固定，并暴露于以下六种蛋白质的抗体：von Willebrand因子、 CD34、细胞角蛋白18、结蛋白、α-平滑肌肌动蛋白和波形蛋白。脐带衍生的细胞对于α-平滑肌肌动蛋白和波形蛋白是阳性的，染色模式直到传代11是一致的。
概述。通过微阵列和PCR(实时的和常规的)测量的基因表达之间的一致性已经对于四种基因建立了：氧化的LDL受体1、凝乳酶、reticulon和IL-8。这些基因的表达在PPDC中在mRNA水平是差异调节的，IL-8在蛋白质水平也是差异调节的。在来自胎盘的细胞中通过FACS分析没有在蛋白水平上检测到氧化的LDL受体的存在。GCP-2和CXC配体3的差异表达没有在mRNA水平确认，然而GCP-2在胎盘衍生的细胞中通过FACS分析在蛋白质水平检测到GCP-2。虽然这个结果不是由最初从微阵列实验获得的数据所反映的，这可能是由于方法的敏感性方面的差异。
在分离之后立即地(传代0)，来自人类胎盘的细胞对于α-平滑肌肌动蛋白和波形蛋白都是染色阳性的。这种模式也在传代11的细胞中观察到。这些结果表明，波形蛋白和α-平滑肌肌动蛋白表达可以在生长培养基中以及在这些操作中利用的条件下在传代的细胞中保持。来自人类脐带的处在传代0的细胞被探测α-平滑肌肌动蛋白和波形蛋白的表达，对于两者都是阳性的。这种染色模式保持到传代11。
实施例11
产后衍生的细胞的营养因子的分泌
测量了选定的营养因子从胎盘和脐带衍生的细胞的分泌。为检测选择的因子包括：(1)已知具有血管生成活性的那些，例如肝细胞生长因子(HGF)(Rosen et al.(1997)Ciba Found.Symp.212:215-26)、单核细胞趋化性蛋白1(MCP-1)(Salcedo et al.(2000)Blood 96；34-40)、白细胞介素-8(IL-8)(Li et al.(2003)J.Immunol.170:3369-766)、角质化细胞生长因子(KGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血管内皮生长因子(VEGF)(Hughes et al.(2004)Ann.Thorac.Surg.77:812-8)、基质金属蛋白酶1(TIMP1)、angiopoietin 2(ANG2)、血小板衍生的生长因子(PDGF-bb)、促血小板生成素(TPO)、肝素结合表皮生长因子(HB-EGF)、基质衍生的因子1α(SDF-1α)；(2)已知具有亲神经/神经保护性活性的那些，例如脑衍 生的神经营养因子(BDNF)(Cheng et al.(2003)Dev.Biol.258；319-33)、白细胞介素-6(IL-6)、粒细胞趋化性蛋白-2(GCP-2)、转化生长因子β2(TGFβ2)；和(3)已知具有趋化因子活性的那些，例如巨噬细胞炎症性蛋白1α(MIP1a)、巨噬细胞炎症性蛋白1β(MIP1b)、单核细胞化学吸引剂-1(MCP-1)、Rantes(活化调节的、正常的T细胞表达和分泌的)、I309、胸腺和活化调节的趋化因子(TARC)、Eotaxin、巨噬细胞衍生的趋化因子(MDC)、IL-8)。
方法&材料
细胞培养。来自胎盘和脐带的PPDC以及来自人类新生儿***的人类成纤维细胞在明胶包被的T75烧瓶上的具有青霉素/链霉素的生长培养基中培养。细胞在传代11时低温保存，保持在液氮中。在细胞解冻之后，生长培养基添加到细胞中，随后转移到15毫升离心管，细胞在150×g离心5分钟。丢弃上清液。细胞团重悬浮在4毫升生长培养基中，对细胞进行计数。细胞以375,000个细胞/75cm2含15毫升生长培养基的烧瓶播种，培养24小时。培养基转换为无血清培养基(DMEM-低葡萄糖(Gibco)，0.1％(w/v)牛血清白蛋白(Sigma)，青霉素/链霉素(Gibco))8小时。在孵育的末尾通过在14,000×g离心5分钟来收集条件无血清培养基，保存在-20℃。为了估计每个烧瓶中细胞的数量，细胞用PBS洗涤，使用2毫升Trypsin/EDTA来脱离。通过添加8毫升生长培养基来抑制胰蛋白酶活性。细胞在150×g离心5分钟。除去上清液，细胞重悬浮在1毫升生长培养基中。使用血球计估计细胞数量。
ELISA分析。细胞在37℃在5％二氧化碳和空气氧中生长。胎盘衍生的细胞(批次101503)也在5％氧或β-巯基乙醇(BME)中生长。每个细胞样品产生的MCP-1、IL-6、VEGF、SDF-1α、GCP-2、IL-8和TGF-β2的数量通过ELISA分析(R&D Systems,Minneapolis,MN)来测量。所有的分析根据厂家的说明来进行。
多通道ELISA分析。使用Proteome阵列(PierceBiotechnology Inc.)测量趋化因子(MIP1a、MIP1b、MCP-1、Rantes、I309、TARC、Eotaxin、MDC、IL8)、BDNF和血管生成因子(HGF、KGF、bFGF、VEGF、TIMP1、ANG2、PDGF-bb、TPO、HB-EGF)。Proteome Arrays是用于每孔2到16个蛋白质的定量测定的 多通道夹心ELISA。通过将2×2、3×3或4×4模式的4到16种不同的捕获抗体点样到96孔平板的每个孔中来产生阵列。在夹心ELISA操作之后，整个平板进行成像来捕获平板的每个孔中每个点样处产生的化学发光信号。在每个点样中产生的信号的数量与原始标准或样品中目标蛋白质的数量成正比。
结果
ELISA分析。MCP-1和IL-6由胎盘和脐带衍生的细胞和皮肤成纤维细胞分泌(表11-1)。SDF-1α由在5％O2中培养的胎盘衍生的细胞和由成纤维细胞分泌。GCP-2和IL-8由脐带衍生的细胞和由在存在BME或5％O2的情况下培养的胎盘衍生的细胞分泌。GCP-2也由人类成纤维细胞分泌。TGF-β2不是通过ELISA分析可检测的。
表11-1.ELISA分析结果
(表示的值是皮克/毫升/百万细胞(n＝2，sem)
图解:ND:未检出。
多通道ELISA分析。TIMP1、TPO、KGF、HGF、FGF、HBEGF、BDNF、MIP1b、MCP1、RANTES、I309、TARC、MDC和IL-8从脐带衍生的细胞分泌(表11-2和11-3)。TIMP1、TPO、KGF、HGF、HBEGF、BDNF、MIP1a、MCP-1、RANTES、TARC、Eotaxin和IL-8从胎盘衍生的细胞分泌(表12-2和12-3)。没 有检出Ang2、VEGF或PDGF-bb。
表11-2.多通道ELISA分析结果
TIMP1 ANG2 PDGFbb TPO KGF HGF FGF VEGF HBEGF BDNF
Hfb 19306.3 ND ND 230.5 5.0 ND ND 27.9 1.3 ND
P1 24299.5 ND ND 546.6 8.8 16.4 ND ND 3.81.3 ND
U1 57718.4 ND ND 1240.0 5.8 559.3 148.7 ND 9.3 165.7
P3 14176.8 ND ND 568.7 5.2 10.2 ND ND 1.9 33.6
U3 21850.0 ND ND 1134.5 9.0 195.6 30.8 ND 5.4 388.6
图解:hFB(人类成纤维细胞),P1(胎盘衍生的细胞(042303)),U1(脐带衍生的细胞(022803)),
P3(胎盘衍生的细胞(071003)),U3(脐带衍生的细胞(071003)).ND:未检出。
表11-3.多通道ELISA分析结果
MIP1a MIP1b MCP1 RANTES I309 TARC Eotaxin MDC IL8
hFB ND ND 39.6 ND ND 0.1 ND ND 204.9
P1 79.5 ND 228.4 4.1 ND 3.8 12.2 ND 413.5
U1 ND 8.0 1694.2 ND 22.4 37.6 ND 18.9 51930.1
P3 ND ND 102.7 ND ND 0.4 ND ND 63.8
U3 ND 5.2 2018.7 41.5 11.6 21.4 ND 4.8 10515.9
图解:hFB(人类成纤维细胞),P1(胎盘衍生的PPDC(042303)),U1(脐带衍生的PPDC(022803)),
P3(胎盘衍生的PPDC(071003)),U3(脐带衍生的PPDC(071003)).ND:未检出。
概述。脐带和胎盘衍生的细胞分泌许多营养因子。这些营养因子的一些，例如HGF、bFGF、MCP-1和IL-8在血管生成中起到重要作用。其他营养因子，例如BDNF和IL-6在神经再生中具有重要的作用。
实施例12
产后衍生的细胞的体外免疫学评估
体外评估了产后衍生的细胞(PPDC)的免疫学特征，以图预测如果有的话这些细胞在体内移植时引发的免疫学反应。通过流式细胞术分析了HLA-DR、HLA-DP、HLA-DQ、CD80、CD86和B7-H2的存在。这些蛋白由抗原呈递细胞(APC)表达，并且是天然CD4+T细胞的直接刺激所需的(Abbas&Lichtman,CELLULAR AND MOLECULAR IMMUNOLOGY,5th Ed.(2003)Saunders,Philadelphia,p.171)。还通过流式细胞术分析了细胞系的HLA-G(Abbas&Lichtman,2003,supra)、CD 178(Coumans,et al.,(1999)Journal of ImmunologicalMethods 224,185-196)和PD-L2(Abbas&Lichtman,2003,supra；Brown,et.al.(2003)TheJournal of Immunology 170,1257-1266)的表达。胎盘组织中存在的细胞对这些蛋白的表达被认为介导了胎盘组织在子宫内的免疫特免状态。为了预测胎盘和脐带衍生的细胞系引发体内免疫反应的程度，在单途径混合淋巴细胞反应(MLR)中测试了细胞系。
材料和方法
细胞培养。细胞在用2％明胶(Sigma,St.Louis,MO)包被的T75烧瓶(Corning,Corning,NY)中的含有青霉素/链霉素的生长培养基中培养到汇合。
抗体染色。细胞在磷酸盐缓冲盐水(PBS)(Gibco,Carlsbad,CA)中洗涤，用Trypsin/EDTA(Gibco,Carlsbad,MO)脱离。收获细胞，离心，以1×107每毫升的细胞浓度重新悬浮在PBS中的3％(v/v)FBS中。抗体(表12-1)根据厂家的说明添加到一百微升细胞悬液中，在4℃在暗处孵育30分钟。孵育之后，细胞用PBS洗涤，离心来除去未结合的抗体。细胞重新悬浮在五百微升PBS中，使用FACSCalibur仪器(Becton Dickinson,San Jose,CA)通过流式细胞术来分析。
表12-1.抗体
混合淋巴细胞反应。标记为细胞系A的传代10脐带衍生的细胞、以及标记为细胞系B的传代11胎盘衍生的细胞的低温保存的小瓶在干冰上送往CTBR(Senneville,Quebec)来使用CTBR SOP No.CAC-031进行混合淋巴细胞反应。从多个男性和女性志愿者供体收集外周血单核细胞(PBMC)。刺激物(供体)同种异体PBMC、自体的PBMC和产后细胞系用丝裂霉素C处理。自体的和丝裂霉素C处理的刺激物细胞添加到应答者(接受者)PBMC中并培养4天。在孵育之后，[3H]胸腺嘧啶核苷添加到每个样品中，培养18小时。在收获细胞之后，提取放射性标记的DNA，使用闪烁计数器测量[3H]-胸腺嘧啶核苷掺入。
同种异体供体的刺激指数(SIAD)计算为接受者加丝裂霉素C处理的同种异体供体的平均增殖除以接受者的基础增殖。PPDC的刺激指数计算为接受者加丝裂霉素C处理的产后细胞系的平均增殖除以接受者的基础增殖。
结果
混合淋巴细胞反应—胎盘衍生的细胞。筛选七个人类志愿者献血者来鉴定在与另外六个献血者的混合淋巴细胞反应中展现健壮的增殖反应的单个同种异体供体。这个供体被选定为同种异体阳性对照供体。其余六个献血者被选定为接受者。同种异体阳性对照供体和胎盘衍生的细胞系用丝裂霉素C处理并与六个单独的同种异体接受者在混 合淋巴细胞反应中培养。使用两个细胞培养平板、每个平板三个接受者一式三份进行反应(表12-2)。平均刺激指数从1.3(平板2)到3(平板1)，同种异体供体阳性对照从46.25(平板2)到279(平板1)(表12-3)。
表12-2.混合淋巴细胞反应数据—细胞系B(胎盘)
平板ID:平板2
表12-3.在与六个单独的同种异体接受者的混合淋巴细胞反应中胎盘细胞和同种异体供体的平均刺激指数
平均刺激指数
接受者 胎盘
平板1(接受者1-3) 279 3
平板2(接受者4-6) 46.25 1.3
混合淋巴细胞反应—脐带衍生的细胞。筛选六个人类志愿者献血者来鉴定在与另外五个献血者的混合淋巴细胞反应中展现健壮的增殖反应的单个同种异体供体。这个供体被选定为同种异体阳性对照供体。其余五个献血者被选定为接受者。同种异体阳性对照供体和脐带衍生的细胞系用丝裂霉素C处理并与五个单独的同种异体接受者在混合淋巴细胞反应中培养。使用两个细胞培养平板、每个平板三个接受者一式三份进行反应(表12-4)。平均刺激指数从6.5(平板1)到9(平板2)，同种异体供体阳性对照从42.75(平板1)到70(平板2)(表12-5)。
表12-4.混合淋巴细胞反应数据—细胞系A(脐带)
表12-5.在与五个单独的同种异体接受者的混合淋巴细胞反应中脐带衍生的细胞和同种异体供体的平均刺激指数
平均刺激指数
接受者 脐带
平板1(接受者1-4) 42.75 6.5
平板2(接受者5) 70 9
抗原递呈细胞标记物——胎盘衍生的细胞。通过流式细胞术分析的胎盘衍生的细胞的直方图显示了HLA-DR、DP、DQ、CD80、CD86和B7-H2的阴性表达，如通过与IgG对照一致的荧光值所表示的，表明了胎盘衍生的细胞系缺少直接刺激CD4+T细胞所需的细胞表面分子。
免疫调节标记物—胎盘衍生的细胞。通过流式细胞术分析的胎盘衍生的细胞的直方图显示了PD-L2的阳性表达，如相对于IgG对照的提高的荧光值所表示的，以及CD178和HLA-G的阴性表达，如与IgG对照一致的荧光值所表示的。
抗原递呈细胞标记物—脐带衍生的细胞。通过流式细胞术分析的脐带衍生的细胞的直方图显示了HLA-DR、DP、DQ、CD80、CD86和B7-H2的阴性表达，如通过与IgG对照一致的荧光值所表示的，表明了脐带衍生的细胞系缺少直接刺激CD4+T细胞所需的细胞表面分子。
免疫调节细胞标记物—脐带衍生的细胞。通过流式细胞术分析的脐带衍生的细胞的直方图显示了PD-L2的阳性表达，如相对于IgG对照的提高的荧光值所表示的，以及CD178和HLA-G的阴性表达，如与IgG对照一致的荧光值所表示的。
概述。在用胎盘衍生的细胞系进行的混合淋巴细胞反应中，平均刺激指数从1.3到3，同种异体阳性对照的平均刺激指数从46.25到279。在用脐带衍生的细胞系进行的混合淋巴细胞反应中，平均刺激指数从6.5到9，同种异体阳性对照的平均刺激指数从42.75到70。胎盘和脐带衍生的细胞系对于刺激性蛋白HLA-DR、HLA-DP、HLA-DQ、CD80、CD86和B7-H2的表达是阴性的，如通过流式细胞术所测量的。胎盘和脐带衍生的细胞系对于免疫调节性蛋白HLA-G和CD178的表达 是阴性的，对于PD-L2的表达是阳性的，如通过流式细胞术所测量的。同种异体供体PBMC含有表达HLA-DR、DQ、CD8、CD86和B7-H2的抗原呈递细胞，从而允许天然CD4+T细胞的刺激。在胎盘和脐带衍生的细胞上直接刺激天然CD4+T细胞所需的抗原呈递细胞表面分子的缺乏，以及免疫调节蛋白PD-L2的存在，可以说明与同种异体对照相比这些细胞在MLR中展现的低刺激指数。
实施例13
人类产后衍生的细胞作为第三方来抑制免疫学反应的体外评估
体外评估了胎盘和脐带衍生的细胞(PDC、UDC)作为第三方来抑制双单体型不匹配的外周血单核细胞(PBMC)群体之间免疫学反应的能力。新近的报导表明，各种细胞类型对于抑制移植物和供体细胞群体之间的免疫学反应可能是有用的(1，2)。混合淋巴细胞反应被用于研究PDC或UDC作为第三方来抑制双单体型不匹配的外周血单核细胞(PBMC)群体之间免疫反应的能力(3)。
材料和方法：
PBMC分离和培养。通过梯度离心从获自健康的同意供体的全血直接地分离PBMC，重悬浮在具有10％FBS的RPMI 1640中。
PDC和UDC培养。胎盘或脐带衍生的细胞以5.0E+03个细胞每平方厘米播种，在生长培养基(DMEM-低葡萄糖，15％FBS，BME和P/S)中扩增到大约70％汇合，用胰蛋白酶收获。在扩增期间用500U/ml IFN-γ处理细胞来诱导HLA-DR、DP、DQ表达。
单体型不匹配。刺激物PBMC、应答者PBMC和PDC或UDC是6种主要组织相容性不匹配中的6种。
刺激物细胞增殖抑制作用。PDC或UDC和刺激物PBMC在标准条件下用25μg/ml丝裂霉素C处理30分钟来抑制细胞增殖。然后用新鲜的RPMI 1640洗涤细胞。
混合淋巴细胞反应。在圆底96孔平板中用在含10％FBS的RPMI 1640中培养的所有细胞进行混合淋巴细胞反应。丝裂霉素C处理的PDC或UDC以2.5E+04或1.25E+04个细胞每孔打板到指定的孔中。丝裂霉素C处理的刺激物PBMC和应答者PBMC各自以1.0E+05个细 胞每孔打板到指定的孔中。
胸腺嘧啶核苷掺合。在培养六天之后，20μl的50μCi/ml[3H]胸腺嘧啶核苷溶液添加到每个孔中。在七天的培养之后，用TopCount1闪烁计数仪器评估[3H]胸腺嘧啶核苷掺合。标记掺合表示为每分钟计数(cpm)。
结果:
胎盘衍生的细胞的结果在表13-1、13-2中和在附图1和2中显示。表13-1.IFN-γ处理的胎盘衍生的细胞
表13-2.未处理的胎盘衍生的细胞
脐带衍生的细胞的结果在表13-3、13-4中和在附图3和4中显示。
表13-3.IFN-γ处理的脐带衍生的细胞
表13-4.未处理的脐带衍生的细胞
从表格和附图中可以看出，在单途径MLR中，与仅仅应答者PBMC和仅仅刺激物PBMC相比，应答者PBMC显示了提高的[3H] 胸腺嘧啶核苷掺合。这表明了当与丝裂霉素C处理的刺激物PBMC共培养物时这些细胞的增殖。这种应答者PBMC增殖的水平表明了应答者PBMC对丝裂霉素C处理的刺激物PBMC的免疫学反应。
与单独的单体型不匹配的丝裂霉素C处理的PDC共培养的应答者PBMC的[3H]胸腺嘧啶核苷掺合水平低于与单体型不匹配的丝裂霉素C处理的刺激物PBMC共培养的应答者PBMC掺合的[3H]胸腺嘧啶核苷水平。这表明PDC在这项分析中引起了单体型不匹配的应答者PBMC的减少的免疫反应。
在这些培养物中添加丝裂霉素C处理的PDC(IFN-γ处理的或未处理的)作为第三方降低了应答者PBMC[3H]标记的胸腺嘧啶核苷掺合的水平。这表明，第三方PDC抑制了应答者PBMC对丝裂霉素C处理的刺激物细胞的免疫学反应。这种抑制看来是剂量依赖性的，因为细胞剂量与应答者PBMC抑制作用直接相关。
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本发明不局限于以上描述和例示的实施方式，而能够在附随的权利要求的范围内改变和修改。

Claims (18)

1.药学上可接受的载体和来源于没有血液的人类脐带组织的同质的脐带衍生的细胞群体在制备用于在与移植供体组织相容性不匹配的移植接受者中抑制有害免疫反应的细胞组合物中的用途，其中所述细胞群体能够在培养中自我更新和扩增，且其中所述细胞群体具有以下特征：
a) 在培养中至少40次加倍的潜力；
b) 产生CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α、PD-L2和HLA-A、B、C；
c) 通过流式细胞术检测，不产生CD31、CD34、CD45、CD80、CD86、CD117、CD141、CD178、B7-H2、HLA-G和HLA-DR、DP、DQ；
d) 表达白细胞介素8；浆膜蛋白1；趋化因子C-X-C基序配体1；趋化因子C-X-C基序配体6；趋化因子C-X-C基序配体3；肿瘤坏死因子，以及α-诱导的蛋白3。
2.权利要求1的用途，其中所述有害免疫反应是移植物抗宿主疾病。
3.权利要求1的用途，其中所述有害免疫反应是移植的组织的排斥。
4.权利要求1的用途，其中所述细胞组合物配制为通过注射或输注来施用。
5.权利要求1的用途，其中所述细胞组合物配制为通过植入移植接受者的设备、支架或基质的植入来施用。
6.权利要求1的用途，其中所述组合物还包含至少一种其他细胞类型。
7.权利要求1的用途，其中所述组合物还包含用于治疗有害免疫反应的至少一种其他试剂。
8.权利要求7的用途，其中所述至少一种其他试剂是抗血栓形成试剂、抗炎症试剂、免疫调节试剂或抗细胞凋亡试剂的一种或多种。
9.权利要求8的用途，其中所述至少一种其他试剂是免疫抑制试剂。
10.组合物在制备用于在与移植供体组织相容性不匹配的移植接受者中抑制有害免疫反应的药物中的用途，所述组合物包含同质的脐带衍生的细胞群体产生的条件培养基、从同质的脐带衍生的细胞群体产生的细胞溶胞产物、从同质的脐带衍生的细胞群体产生的可溶细胞级分、或含有同质的脐带衍生的细胞群体的细胞外基质的一种或多种，其中所述细胞群体来源于没有血液的人类脐带组织，能够在培养中自我更新和扩增，且具有以下的特征：
a) 在培养中至少40次加倍的潜力；
b) 产生CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α、PD-L2和HLA-A、B、C；
c) 通过流式细胞术检测，不产生CD31、CD34、CD45、CD80、CD86、CD117、CD141、CD178、B7-H2、HLA-G和HLA-DR、DP、DQ；
d) 表达白细胞介素8；浆膜蛋白1；趋化因子C-X-C基序配体1；趋化因子C-X-C基序配体6；趋化因子C-X-C基序配体3；以及肿瘤坏死因子，α-诱导的蛋白3。
11.权利要求10的用途，其中所述有害免疫反应是移植物抗宿主疾病。
12.权利要求10的用途，其中所述有害免疫反应是移植的组织的排斥。
13.权利要求10的用途，其中所述组合物配制为通过注射或输注来施用。
14.权利要求10的用途，其中所述组合物配制为通过植入移植接受者的设备、支架或基质的植入来施用。
15.权利要求10的用途，其中所述组合物与用于治疗有害免疫反应的至少一种其他试剂一起施用。
16.权利要求15的用途，其中所述至少一种其他试剂与所述组合物同时地、或在其之前或之后施用。
17.权利要求15的用途，其中所述至少一种其他试剂是抗血栓形成试剂、抗炎症试剂、免疫调节试剂或抗细胞凋亡试剂的一种或多种。
18.权利要求17的用途，其中所述至少一种其他试剂是免疫抑制试剂。
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