CN101357147B

CN101357147B - 一种有指纹图谱的罗布麻叶提取物及其制备和分析方法

Info

Publication number: CN101357147B
Application number: CN2008101247294A
Authority: CN
Inventors: 王先荣; 周亚球; 光琴; 杜安全; 陈光宗
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2008-08-29
Filing date: 2008-08-29
Publication date: 2012-08-22
Anticipated expiration: 2028-08-29
Also published as: CN101357147A

Abstract

一种有指纹图谱的罗布叶提取物，其总黄酮含量以金丝桃苷计为50-60％，其中含金丝桃苷含量为10-17％，异槲皮苷含量为10-16％，水解后异槲皮苷和山奈酚含量分别为25-35％、3.5-4.5％，原花色素含量为15-25％，且有确定的总黄酮指纹图谱。本制备方法采用弱极性或中等极性大孔吸附树脂自罗布麻叶提取液的浓缩液中制备提取物粗品，粗品中总黄酮含量40-44％，再用乙醇和醋酸乙酯混合溶剂精制得到有确定指纹图谱的提取物，并构建了相应的分析方法，特别是原花色素含量测定的方法。本提取物符合口服五类原料药的标准要求，且制备方法操作简单，易于工业化。

Description

一种有指纹图谱的罗布麻叶提取物及其制备和分析方法

一、技术领域

本发明涉及一种自中草药中提取的活性物质及其提取方法，特别涉及主要含有黄酮类活性物质的提取物及其制备方法，确切地说是一种提取自罗布麻属植物罗布麻叶的一种有指纹图谱的提取物及其制备和分析方法。

二、背景技术

我国罗布麻叶资源有三种：罗布麻属植物罗布麻叶(Apocynum venetum L.)又称红麻、白麻属植物大花罗布麻叶[Poacynum hendersonni(Hook.f.)Wodson]和白麻属植物紫斑罗布麻叶[Poacynum pictum(Schrenk)Baill]，统称为罗布麻叶，因属不同属植物，其黄酮成分也有异，相互之间并无可比性。

据文献报道罗布麻叶(Apocynum venetum L.)含有黄酮及其糖苷、三萜及甾醇、木脂素、香豆素、有机酸及酯、环醇、花色素、鞣质-、糖类和氨基酸等10余类成分。药理研究表明黄酮类成分是其中的主要活性成分类别之一，化学研究表明罗布麻叶黄酮类成分以金丝桃苷、异槲皮苷、三叶豆苷、6"-0-乙酰基金丝桃苷、黄芪苷、6"-0-乙酰基异槲皮苷、6"-0-乙酰基黄芪苷、、槲皮素和山奈酚等成分含量较高。就同一种罗布麻叶而言，不同的提取方法得到的提取物由于所含的黄酮类化合物种类不同、含量也不同，其药理、药性存在很大差异。这就是说，不同提取方法得到的提取物都是不同的组合物，或者说都是一种新的组合物，虽然都统称提取物。

目前提取罗布麻叶活性成分有以下几种方法：

1、先用水或醇提取，将回收溶剂后的提取物混悬于水中，分别用氯仿、醋酸乙酯、正丁醇提取，划分成几个提取部分。再用硅胶柱或葡聚糖凝胶柱层析、分离成单组分物质。这种方法适用于实验室对单一黄酮成分的研究，也不适合总黄酮的制备。

2、申请号02110431.X公开了一种“罗布麻有效部位的提取分离方法”，罗布麻提取液经处理后通过D101，HPD100，HPD600大孔吸附树脂柱，先采用水洗脱至水洗脱液无色，并用20—39％的乙醇水溶液洗脱，再用40—70％的乙醇水溶液洗脱。收集40—70％的洗脱液浓缩后形成的浸膏即为有效部位，总黄酮含量为50-60％，该技术方案的缺点是：未能明确所提供的有效部位由哪些黄酮成分组成，虽提供有效部位总黄酮含量为50-60％，但未明确含量测定方法及对照品，众所周知，同一种样品不同的测定方法或不同的对照品所得到的含量结果是不同的，比如NaNO₂-Al(NO₃)₃-NaOH法测定的含量明显高于AlCl₃法，对照品芦丁测定的含量明显高于金丝桃苷对照品，因罗布麻属植物罗布麻叶(新疆红麻除外)芦丁含量为0.07％，金丝桃苷含量为0.35％，因此罗布麻属植物罗布麻叶及有效部位中总黄酮含量只能采用AlCl₃法，对照品只能采用金丝桃苷。

3、申请号200410064551.0公开了“一种罗布麻提取物及其提取方法”，取罗布麻叶300g，用10倍量40％乙醇水回流提取3次，每次0.5hr，合并提取液，室温下静置过夜、过滤，去沉淀，滤液减压浓缩至总体积900mL，浓缩液加1％壳聚糖的乙酸溶液180mL，搅拌2min，室温静置2—4hr，抽滤，弃去残渣，上清液过处理好的聚酰胺树脂柱，随后以600mL水，用盐酸调pH为3后，进行洗脱除杂，然后用70％乙醇水溶液洗脱至无AlCl₃反应，收集70％乙醇水溶液并减压浓缩至近干，水浴蒸干后，80℃烤箱干燥，得黄棕色至黄色粉末，为罗布麻高纯提取物，出膏率为1.8％。罗布麻高纯提取物的金丝桃苷含量为17.8％、总黄酮(以金丝桃苷计)含量为42.8％、水解后的槲皮素含量为36.7％。该技术方案所存在的问题是：虽然提供了金丝桃苷含量、总黄酮含量、水解后的槲皮素含量，但不能明确提取物由哪些黄酮成分组成，不能完整地反映该提取物质量，总黄酮(以金丝桃苷计)含量为42.8％，未达到五类原料药标准总黄酮含量为50％的要求。

4、申请号200510123187.5的公开了一种“罗布麻属植物罗布麻叶总黄酮提取物、其制备及应用”。其制备方法是：滤液通过聚酰胺柱层析，首先用水冲洗8—12个柱体积，再用不同浓度醇水溶液分段洗脱、分段收集、浓缩的方法，该法虽能得高纯度总黄酮，但因聚酰胺柱每次层析后均需要碱-酸再生，故，该法成本高，工时长，不适用于制备口服五类原料药。

三、发明内容

本发明针对上述现有技术不足，旨在提供一种有固定组分即指纹图谱的罗布麻叶提取物，所要解决的技术问题是构建相应的制备方法和分析方法。

本发明称的罗布麻叶是指罗布麻属植物罗布麻叶(Apocynum venetum L.)。所述的罗布麻叶提取物就是自罗布麻属植物罗布麻叶(Apocynum venetum L.)中提取得到的提取物。

本发明所称的有指纹图谱的罗布麻叶提取物是指该提取物中含有总黄酮指纹图谱，其特征是总黄酮含量以金丝桃苷计为50-60％(重量百分比，下同)；其中金丝桃苷含量为10-17％，异槲皮苷含量为10-16％，总黄酮苷元的含量以酸水解后测定槲皮素和山奈酚的含量计分别为25-35％和3.5-4.5％；原花色素含量以氯化花色素计为15-25％。

所述的总黄酮指纹图谱除1金丝桃苷、2异槲皮苷外，还有3三叶豆苷、46"-O-乙酰基金丝桃苷、5黄芪苷、66″-O-乙酰基异槲皮苷、76"-O-乙酰基黄芪苷、8未知峰、9槲皮素、10山奈酚，如图1所示。

上述提取物的制备方法，是以干燥的罗布麻叶粗粉为原料，包括提取、浓缩、分离和精制，所述的提取是粗粉用至少8倍量(重量/体积w/v)70-80％(体积百分比v/v，下同)乙醇溶液回流提取至少两次，得到乙醇提取液，乙醇提取液减压浓缩至1/4-1/6体积时，冷却、静置，过滤除去沉淀，得到浓缩液，浓缩液用弱极性或中等极性大孔树脂吸附分离，依次用水和20％乙醇洗脱后再用50-75％乙醇洗脱，收集50-75％乙醇洗脱液，减压浓缩干燥后得到提取物粗品；所述的精制是对提取物粗品进行精制，这就是提取物粗品用至少10倍量(w/v)乙醇与醋酸乙酯混合溶剂回流提取至少两次，乙醇与醋酸乙酯的体积比为1：5-10，过滤，得到精提液，精提液经减压脱溶、干燥后得到总黄酮含量(以金丝桃苷计)为50-60％(重量百分比w/w)的罗布麻叶提取物。

所述的弱极性或中等极性大孔树脂选自聚苯乙烯类或交联聚丙烯腈类制备的大孔树脂，如型号为AB-8型或DM301型等大孔树脂。

精制时优选乙醇与醋酸乙酯体积比为1：6-8的混合溶剂，进一步优选体积比1：7；或者采用甲醇与醋酸乙酯体积比为1：5-8的混合溶剂。

具体制备过程为：

a、将干燥的罗布麻叶粉碎成生药粗粉，用8-10倍量(g/ml)的75％乙醇水溶液加热回流提取1-2小时，共提取2-3次；

b、将提取液在低于60℃的条件下减压浓缩至1/5体积，室温下静置12小时过滤；

c、滤液通过弱极性或中极性大孔吸附树脂柱层析，大孔吸附树脂用量为生药的2.5倍量(W/W)

优选AB-8，DM301等弱极性和中极性大孔吸附树脂；

d.首先用水冲洗大孔吸附树脂8—10个柱体积洗去树脂中残留的溶液及其他杂质，用20％乙醇洗脱至洗脱液与FeCl₃无墨绿色反应以洗去鞣质，再用50-75％乙醇或50-75％甲醇洗脱2.5个或3个柱体积，收集0.5-2.5或0.5-3个柱体积的50-75％乙醇或50-75％甲醇洗脱液；将该洗脱液在低于60℃条件下减压浓缩，真空干燥得按重量百分比总黄酮含量达到40％—44％罗布麻叶提取物粗品；

e、提取物粗品的精制，用10-20倍量(g/ml)的醋酸乙酯:乙醇(V/V)(5:1-10:1)或醋酸乙酯:甲醇(V/V)(5:1-10:1).优选醋酸乙酯:乙醇(V/V)(6:1-8:1)，回流提取2-3次，每次1-2小时，过滤，合并提取液，于60℃减压回收溶剂，80℃减压干燥得按重量百分比总黄酮含量达到50％—60％的罗布麻叶提取物。

提取物中各组分的分析方法如下：

1、总黄酮含量的分析测定是以金丝桃苷为对照品，采用AlCl3-HAc-NaAc络合比色法进行测定。

2、总黄酮中主要成分金丝桃苷、异槲皮苷含量的分析测定，以金丝桃苷和异槲皮苷为对照品，采用高效液相色谱法测定，色谱分析条件为：

(1)色谱柱：采用ODS-C18色谱柱150mmx6mm，5μm；(2)流动相:水-乙腈-磷酸(825:175:1)；(3)检测波长为365nm；(4)柱温为27℃；(5)流速1.0ml/min。

3、总黄酮苷元含量测定，采用高效液相色谱法测定水解后槲皮素和山奈酚含量：

取干燥后的提取物约0.05g，精密称定，用80％甲醇溶解并定容至25ml，取2ml用80％甲醇稀释至10ml，加入盐酸1ml，置90℃水浴中加热回流60分钟，取出，立即冷却，转移至25ml量瓶中，加80％甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。用槲皮素和山奈酚为对照品，HPLC法测定，色谱分析条件为：

(1)色谱柱：采用ODS-C18柱(岛津150×6.0mm)；(2)流动相：甲醇—0.4％(体积百分浓度)磷酸溶液(体积比45：40)；(3)波长：360nm；(4)柱温：30℃；(5)流速1.0ml/min。

4、原花色素含量，采用正丁醇一盐酸法测定：

取提取物约0.1g，精密称定，用70％乙醇40ml溶解，加盐酸10ml和水5ml，置水浴中加热回流80分钟，取出，冷后，过滤，残留物用70％乙醇洗脱至无色，滤液和洗液合并，准确加70％乙醇至250ml，，取该溶液50ml，置圆底烧瓶中，减压浓缩至约3ml，，浓缩液移入分液漏斗，园底烧瓶分别用水10ml和水5ml洗两次，洗液移入分液漏斗，合并的溶液，用15ml正丁醇卒取，共萃取3次，合并正丁醇萃取液，准确加正丁醇至100ml，，用分光光度计进行测定，在545nm测定正丁醇液的吸光度。

用Ax500/75xm公式，计算原花色素(以氯化花色素计)的百分含量。

式中：A：样品正丁醇液在545nm处的吸光度；

75：氯化花色素在545nm处的吸收系数；

m：样品称取量(g)。

5、采用以下色谱分析条件测定罗布麻叶总黄酮的指纹图谱，如图1所示。

(1)色谱柱：采用ODS-C18色谱柱150mmx4.6mm，5μm；

(2)流动相采用线性梯度洗脱，其中A相为乙腈一甲醇V/V(10:1)，B相为0.4％磷酸溶液.

流动相梯度：

时间(min) A(％) B(％)

0-32 16 84

32-35 27 73

35-52 27 73

52-53 16 84

53-60 16 84

(3)检测波长为360nm：(4)柱温为27℃；(5)流速1.0ml/min。

与已有技术相比，本发明的有益效果体现在：

1、本发明采用弱极性或中极性的大孔吸附树脂先从罗布麻属植物罗布麻叶中提取富集总黄酮粗品，再用醋酸乙酯与乙醇按(5:1-10:1)的量配比进行精制，操作简单，易于工业化生产。总黄酮含量以金丝桃苷计≥50％，符合口服五类原料药的标准。

2、本发明采用高效液相色谱法，可以对金丝桃苷、异槲皮苷的黄酮成分进行明确定性和定量，也可以对水解后的总黄酮苷元槲皮素和山奈酚进行明确定性和定量，并建立了原花色素含量测定方法，另外还建立了罗布麻叶提取物中总黄酮指纹图谱。

四、附图说明

图1为本发明方法制备的罗布麻属植物罗布麻叶(Apocynum venetum L.)提取物中总黄酮HPLC图谱，也是总黄酮的指纹图谱，图中：1为金丝桃苷、2为异槲皮苷、3为三叶豆苷、4为6"-O-乙酰基金丝桃苷、5为黄芪苷、6为6"-O-乙酰基异槲皮苷、7为6"-O-乙酰基黄芪苷、8为未知峰、9为槲皮素、10为山奈酚。

该图谱能对罗布麻叶总黄酮组成成分：金丝桃苷、异槲皮苷、三叶豆苷、6"-O-乙酰基金丝桃苷、黄芪苷、6"-O-乙酰基异槲皮苷、6"-O-乙酰基黄芪苷、槲皮素、山奈酚黄酮成分进行明确定性和定量。

五、具体实施方式

下面通过具体实施方式对本发明方法作进一步说明。

(一)关于罗布麻属植物罗布麻叶提取物的制备

实施例1：

取罗布麻属植物罗布麻叶生药粗粉100g，加800ml浓度为75％乙醇水溶液加热回流提取2小时，共提取3次，合并提取液，将提取液在低于60℃的条件下减压浓缩至1/5体积，室温下静置12小时过滤；滤液以1柱体积(BV)/h流速通过装有250g AB-8弱极性大孔吸附树脂层析柱，首先用水以2BV/h流速冲洗8个柱体积，用20％乙醇洗脱至与FeCl₃无墨绿色反应，再用50％乙醇以1BV/h流速洗脱2.5个柱体积，收集0.5-2.5柱体积的50％乙醇洗脱液；将该洗脱液在低于60℃条件下减压浓缩，真空干燥得罗布麻叶提取物粗品，以金丝桃苷计粗品总黄酮含量为42.0％。

提取物粗品的精制：取粗品1g，加10ml按体积比的醋酸乙酯:乙醇5:1回流提取2次，每次2小时，过滤，合并提取液，于60℃减压回收溶剂，80℃减压干燥得罗布麻叶提取物，收得率为2.1％，本品总黄酮含量以金丝桃苷计为50.0％。外观黄棕色粉末。

实施例2：

取罗布麻属植物罗布麻叶生药粗粉100g，加1000ml浓度为75％乙醇水溶液加热回流提取2小时，共提取3次，合并提取液，将提取液在低于60℃的条件下减压浓缩至1/5体积，室温下静置12小时过滤；滤液以1BV/h流速通过装有250g AB-8弱极性大孔吸附树脂层析柱，，首先用水以2BV/h流速冲洗10个柱体积，用20％乙醇洗脱至与FeCl₃无墨绿色反应，再用50％乙醇以1BV/h流速洗脱2.5个柱体积，收集0.5-2.5柱体积的50％乙醇洗脱液；将该洗脱液在低于60℃条件下减压浓缩，真空干燥得罗布麻叶提取物粗品，以金丝桃苷计的粗品中总黄酮含量为44.0％。

提取物粗品的精制：取提取物粗品1g，加10ml按体积比醋酸乙酯:乙醇为6:1回流提取3次，每次2小时，过滤，合并提取液，于60℃减压回收溶剂，80℃减压干燥得罗布麻叶提取物，收得率为2.0％，本品以金丝桃苷计总黄酮含量为56.0％。外观黄棕色粉末。

实施例3：

取罗布麻属植物罗布麻叶生药粗粉100g，加800ml浓度为75％的乙醇水溶液加热回流提取2小时，共提取3次，合并提取液，将提取液在低于60℃的条件下减压浓缩至1/5体积，室温下静置12小时过滤；滤液以1BV/h流速通过装有250g AB-8弱极性大孔吸附树脂层析柱，，首先用水以2BV/h流速冲洗8个柱体积，用20％乙醇洗脱至与FeCl₃无墨绿色反应，再用75％乙醇以1BV/h流速洗脱3个柱体积，收集0.5-3柱体积的75％乙醇洗脱液；将该洗脱液在低于60℃条件下减压浓缩，真空干燥得罗布麻叶提取物粗品，以金丝桃苷计提取物粗品中总黄酮含量为42.0％。

提取物粗品的精制：取提取物粗品1g，加10ml按体积比醋酸乙酯:乙醇为7:1回流提取2次，每次2小时，过滤，合并提取液，于60℃减压回收溶剂，80℃减压干燥得罗布麻叶提取物，收得率为2.10％，本品以金丝桃苷计总黄酮含量为51.0％。外观黄棕色粉末。

实施例4：

取罗布麻属植物罗布麻叶生药粗粉100g，加1000ml浓度为75％的乙醇水溶液加热回流提取2小时，共提取3次，合并提取液，将提取液在低于60℃的条件下减压浓缩至1/5体积，室温下静置12小时过滤；滤液以1BV/h流速通过装有250g AB-8弱极性大孔吸附树脂层析柱，，首先用水以2BV/h流速冲洗10个柱体积，用20％乙醇洗脱至与FeCl₃无墨绿色反应，再用75％乙醇以1BV/h流速洗脱3个柱体积，收集3个柱体积的75％乙醇洗脱液；将该洗脱液在低于60℃条件下减压浓缩，真空干燥得罗布麻叶提取物粗品，以金丝桃苷计粗品中总黄酮含量为41.0％。

提取物粗品的精制：取提取物粗品1g，加20ml按体积比醋酸乙酯:乙醇为8:1回流提取3次，每次1.5小时，过滤，合并提取液，于60℃减压回收溶剂，80℃减压干燥得罗布麻叶提取物，收得率为1.90％，本品以金丝桃苷计总黄酮含量为55.0％。外观黄棕色粉末。

实施例5：

取罗布麻属植物罗布麻叶生药粗粉100g，加1000ml浓度为75％的乙醇水溶液加热回流提取2小时，共提取3次，合并提取液，将提取液在低于60℃的条件下减压浓缩至1/5体积，室温下静置12小时过滤；滤液以1BV/h流速通过装有250g DM301中极性大孔吸附树脂层析柱，首先用水以2BV/h流速冲洗8个柱体积，用20％乙醇洗脱至与FeCl₃无墨绿色反应，再用75％乙醇以1BV/h流速洗脱2.5个柱体积，收集0.5-2.5柱体积的75％乙醇洗脱液；将该洗脱液在低于60℃条件下减压浓缩，真空干燥得罗布麻叶提取物粗品，以金丝桃苷计粗品中总黄酮含量为41.0％。

提取物粗品的精制:取提取物粗品1g，加10ml按体积比为醋酸乙酯:乙醇为6:1回流提取2次，每次2小时，过滤，合并提取液，于60℃减压回收溶剂，80℃减压干燥得罗布麻叶提取物，收得率为1.92％，本品以金丝桃苷计总黄酮含量为51.0％。外观黄棕色粉末。

(二)、关于罗布麻属植物罗布麻叶提取物中总黄酮、水解后的总黄酮苷元槲皮素和山奈酚、主要组成成分金丝桃苷、异槲皮苷、原花色素的含量测定及总黄酮的指纹图谱测定：

1、罗布麻叶提取物干燥后，总黄酮含量以金丝桃苷为对照品，采用AlCl₃-HAc-NaAc络合比色法测定，其总黄酮含量见表1

2、总黄酮苷元含量测定，采用高效液相色谱法测定水解后槲皮素和山奈酚含量：

取干燥后的罗布麻叶提取物约0.05g，精密称定，用80％甲醇溶解并定容至25ml，取2ml用80％甲醇稀释至10ml，加入盐酸1ml，置90℃水浴中加热回流60分钟，取出，立即冷却，转移至25ml量瓶中，加80％甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。用槲皮素和山奈酚为对照品，HPLC法测定，其含量见表1，色谱分析条件为：

色谱柱：采用ODS-C18柱(岛津150×6.0mm)；

流动相：甲醇—0.4％磷酸溶液(45：40)；

检测波长：360nm；柱温：30℃；流速1.0ml/min。

3、罗布麻叶总黄酮干燥后，主要组成成分：金丝桃苷、异槲皮苷均采用高效液相色谱法测定，其含量见表1，色谱分析条件为：

色谱柱：采用ODS-C18色谱柱150mmx6mm，5μm；

流动相：水-乙腈-磷酸(825:175:1)；

检测波长为365nm；柱温为27℃；流速1.0ml/min。

4、原总花色素含量，采用正丁醇一盐酸法测定：

取干燥后的罗布麻叶提取物约0.1g，精密称定，用70％乙醇40ml溶解，加盐酸10ml和水5ml，置水浴中加热回流80分钟，取出，冷后，过滤，残留物用70％乙醇洗脱至无色，滤液和洗液合并，准确加70％乙醇至250ml，，取该溶液50ml，置圆底烧瓶中，减压浓缩至约3ml，，浓缩液移入分液漏斗，园底烧瓶分别用水10ml和水5ml洗两次，洗液移入分液漏斗，合并的溶液，用15ml正丁醇卒取，共萃取3次，合并正丁醇萃取液，准确加正丁醇至100ml，在545nm测定正丁醇液的吸光度。

用Ax500/75xm公式，计算原花色素(以氯化花色素计)的百分含量，其含量见表1。

表1为罗布麻叶提取物中的总黄酮、水解后总黄酮苷元、金丝桃苷、异槲皮苷和原花色素的含量

实施例	总黄酮含量％	总黄酮苷元含量％槲皮素、山奈酚	金丝桃苷含量％	异槲皮苷含量％	原花色素含量％(以氯化花色素计)
						12345	50.056.051.055.051.0	27.5 3.630.7 4.227.9 3.730.1 4.027.7 3.6	14.115.714.715.013.7	13.214.813.514.012.8	20.719.120.319.220.2

5、采用以下色谱分析条件测定罗布麻叶总黄酮的指纹图谱：

色谱柱：采用ODS-C18色谱柱150mmx4.6mm，5μm；

流动相采用线性梯度洗脱，其中A相为乙腈一甲醇(10:1)，B相为0.4％磷酸溶液.流动相梯度；

时间(min) A(％) B(％)

0-32 16 84

32-35 27 73

35-52 27 73

52-53 16 84

53-60 16 84

检测波长为360nm、柱温为27℃、流速1.0ml/min。

图1所示为本实施例方法所获得的罗布麻叶总黄酮的指纹图谱

图1中，1为金丝桃苷、2为异槲皮苷、3为三叶豆苷、4为6″-O-乙酰基金丝桃苷、5为黄芪苷、6为6″-O-乙酰基异槲皮苷、7为6"-O-乙酰基黄芪苷、8为未知峰、9为槲皮素、10为山奈酚。

Claims

1.一种有指纹图谱的罗布麻叶提取物的制备方法，以罗布麻属罗布叶(Apocynum venetum L.)粗粉为原料，包括提取、浓缩、分离和精制，其特征在于：所述的提取是原料粗粉用至少8倍量(w/v)70-80v/v％乙醇回流提取至少两次，得到乙醇提取液，乙醇提取液减压浓缩至1/4-1/6体积时冷却、静置、分离得到浓缩液，浓缩液用AB-8型或DM301型大孔树脂吸附分离，依次用水和20v/v％乙醇洗脱后再用50-75v/v％乙醇洗脱，收集50-75v/v％乙醇洗脱液，减压脱溶、干燥后得到提取物粗品；所述精制是提取物粗品用至少10倍量(w/v)乙醇与醋酸乙酯混合溶剂提取至少两次，乙醇与醋酸乙酯的体积比1∶5-10，分离得到精提液，精提液经减压脱溶、干燥后得到以金丝桃苷计的总黄酮量为50-60wt％的提取物。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：混合溶剂乙醇与醋酸乙酯的体积比为1∶6-8。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：混合溶剂乙醇与醋酸乙酯的体积比为1∶7。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的乙醇与醋酸乙酯混合溶剂替换为甲醇与醋酸乙酯混合溶剂，甲醇与醋酸乙酯体积比为1∶5-8。

5.一种由权利要求1所述的方法制备的有指纹图谱的罗布麻叶提取物，是自罗布麻属罗布麻叶(Apocynum venetum L.)中提取的提取物，其特征在于：

(1)总黄酮含量以金丝桃苷计为50-60wt％，其中金丝桃苷含量为10-17wt％，异槲皮苷含量为10-16wt％；

(2)总黄酮苷元含量以酸水解后的槲皮素和山奈酚含量计，分别为25-35wt％和3.5-4.5wt％；

(3)原花色素含量以氯化花色素含量计为15-25wt％；

(4)总黄酮指纹图谱1中，1金丝桃苷、2异槲皮苷、3三叶豆苷、4 6″-O-乙酰基金丝桃苷、5黄芪苷、6 6″-O-乙酰基异槲皮苷、7 6″-O-乙酰基黄芪苷、8未知峰、9槲皮素、10山奈酚；

(5)、采用以下色谱分析条件测定罗布麻叶总黄酮指纹图谱

(i)色谱柱：采用ODS-C18色谱柱150mm x 4.6mm，5μm；

(ii)流动相采用线性梯度洗脱，其中A相为乙腈一甲醇，其中V/V比值为10∶1，B相为0.4％磷酸溶液；

流动相梯度：

(iii)检测波长为360nm：(iv)柱温为27℃；(v)流速1.0ml/min。

6.由权利要求5所述的提取物中所含的原花色素分析方法，使用分光光度计法，其特征在于：采用盐酸水解-正丁醇萃取法处理后测定萃取液吸光度，具体方法是：取提取物0.1g，用70％乙醇40ml溶解，加盐酸10ml和水5ml，置水浴中加热回流80分钟，取出冷却后过滤，残留物用70％乙醇洗脱至无色，滤液和洗液合并，加70％乙醇至250ml，取该溶液50ml，置圆底烧瓶中，减压浓缩至3ml，浓缩液移入分液漏斗，圆底烧瓶分别用水10ml和水5ml洗两次，洗液移入分液漏斗，合并的溶液用15ml正丁醇萃取，共萃取3次，合并正丁醇萃取液，加正丁醇至100ml，在545nm测定正丁醇液的吸光度；

用A x 500/75x m公式计算获得以氯化花色素计的原花色素百分含量，

式中：A：样品正丁醇液在545nm处的吸光度，

75：氯化花色素在545nm处的吸收系数，

m：样品称取量(g)。