CN101747393B - 同时制备淫羊藿苷、朝藿定a、b、c化学对照品的方法 - Google Patents
同时制备淫羊藿苷、朝藿定a、b、c化学对照品的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种同时制备淫羊藿苷、朝藿定A、B、C化学对照品的分离制备方法。以含量为10％-50％的淫羊藿苷提取物为原料，经初步柱分离，以制备型高效液相色谱为主要分离手段，通过两步高效液相制备，提取液直接减压浓缩至干即可获得纯度大于98％的朝藿定A、B、C和淫羊藿苷化学对照品。本发明工艺步骤简单、纯度高、色泽好，并且可大规模生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种同时制备淫羊藿苷、朝藿定A、B、C化学对照品的分离制备新方法。主要包括柱分离浓缩富集以及快速的高效液相制备方法除杂及精制。四种对照品的结构式如下：
R1 R2 R3
朝藿定A：rha-(1-2)glu glu CH3
朝藿定B：rha-(1-2)xyl glu CH3
朝藿定C：rha-(1-2)rha glu CH3
淫羊藿甙：rha glu CH3
背景技术
淫羊藿(Herba Epimedii)是我国使用最为悠久的中药之一，具有补肾阳、强筋骨、祛风湿的功效。现代研究表明，淫羊藿具有抗骨质疏松、增强性功能、增加心脑血管血流量等多方面药理作用。淫羊藿苷是淫羊藿的主要活性成分，也是我国2005版国家药典中淫羊藿药材的含量测定成分；而朝藿定A、B、C是淫羊藿苷的糖基取代类似物且同属于千分之一级的高含量成分(张华峰等，分析测试学报，2007，26(2)：198-201；谢娟平等，中草药，2007，38(4)：613-614)，因此，对淫羊藿药材同时进行朝藿定A、B、C及淫羊藿苷的多指标测定具有重要意义。但是，作为质控指标成分，必须有大量的化学对照品提供，目前，除淫羊藿苷外，其它三种对照品市场上少有提供。对于对照品的制备方法研究，目前主要集中在淫羊藿苷和朝藿定C的分离纯化上(胡云峰等，中国专利CN200510061251.1，2007年公开；郭宝林等，中国专利CN2007100002610.5，2007年公开；王晓春等，中国专利CN200610101222.5，2007年公开)，而朝藿定A和B的分离制备几乎没有报道。
发明内容
本发明在前期研究淫羊藿苷和朝藿定C的规模化制备基础上，通过原料药优选、目标对照品富集方法研究及对照品精制高效液相方法开发等多方面研究，本发明提供了一种低成本、快速的高效液相制备色谱方法，可以同时制备纯度大于98％的朝藿定A、B、C和淫羊藿苷，并且单一对照品制备规模可达1g/月，累计制备规模可达月产5g对照品。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案：
同时制备淫羊藿苷、朝藿定A、B、C化学对照品的方法，以质量含量为10％-50％的淫羊藿苷提取物为原料，经初步柱分离，以制备型高效液相色谱为主要分离手段，通过两步高效液相制备，提取液直接减压浓缩至干即可获得纯度大于98％的相应对照品，规模为每个对照品月产量1克，累计月产5g对照品；具体步骤如下：
1)初步柱分离：
淫羊藿苷提取物用水或体积浓度40-80％乙醇水溶液溶解，树脂柱或聚酰胺柱分离，乙醇-水溶液梯度洗脱，其中乙醇的体积浓度从0％-100％变化，收集20％-80％乙醇洗脱物，浓缩干燥得黄色粉末I；
2)第一步高效液相制备：
黄色粉末I用体积浓度40-80％乙醇水溶液溶解，配置成浓度为50～150mg/ml的供试品溶液，经0.45μm微孔滤膜过滤；采用柱长10-50cm、直径1-10cm的高效液相制备色谱柱进行分离，六通阀或泵进样，进样体积为1-50ml，以体积浓度为45-60％的甲醇-水或体积浓度为20-40％的乙腈-水溶液为洗脱体系，流速控制在10-400ml/min，在线紫外检测，分别收集含有朝藿定A和B的洗脱液(流份1)；含有朝藿定C和淫羊藿苷的洗脱液(流份2)，以上两个流份分别干燥得黄色粉末II和黄色粉末III；
3)第二步高效液相制备：
黄色粉末II以体积浓度为20-40％的含乙腈水溶液为洗脱体系进行第二次高效液相制备，其余条件同步骤2)，分别收集纯度＞98％的朝藿定A流份和纯度＞98％的朝藿定B的流份。
黄色粉末III以体积浓度为20-40％的含乙腈水溶液为洗脱体系进行第二次高效液相制备，其余条件同步骤2)，分别收集纯度大于98％的含有朝藿定C和淫羊藿苷的高纯流份；
4)目标化学对照品的获得：
以上四种高纯流份直接浓缩至干即可得到纯度大于98％的相应对照品，其为亮黄色粉末。
上述方法中，初步柱分离用树脂以非极性大孔吸附树脂较好。高效液相制备柱的填料为C6、C8或C18键合相填料，其粒径为5～20μm，紫外检测波长优选270nm、318nm或349nm，具体检测波长根据样品中目标对照品信号的超载情况而定。
以本发明从淫羊藿提取物中分离朝藿定A、B、C及淫羊藿苷化学对照品具有如下优点和进步：
1.本发明以制备型高效液相为分离手段，分离效率高，可以保证对照品的纯度。
2.本发明通过柱分离对目标对照品进行初步富集，然后采用两步高效液相制备方法分别进行除杂和精制，工艺较简单。
3、本发明发展的高效液相制备方法为快速制备方法，单针分离时间在10-30分钟之间，非常适合大批量化学对照品的制备；同时加上制备溶剂的回收再利用，可实现批量制备的低成本。
4.本发明采用紫外检测器在线检测，各个对照品的分离情况可以直接检测，可直接选择性收集高纯度样品，从而实现纯度保证下的高回收率。
总之，本发明工艺步骤简单、纯度高、色泽好，并且可大规模生产。
附图说明
图1为朝藿定A的HPLC分析图谱(270nm)，其积分报告如下：
| Name | Retention Time | Area | ％Area | |
| 1 | 2.568 | 251910 | 1.20 | |
| 2 | 3.087 | 13633 | 0.07 | |
| 3 | 3.361 | 1265 | 0.01 | |
| 4 | 3.520 | 54871 | 0.26 | |
| 5 | 朝藿定A | 7.038 | 20635806 | 98.47 |
图2为朝藿定B的HPLC分析图谱(270nm)，其积分报告如下：
| Name | Retention Time | Area | ％Area | |
| 1 | 1.368 | 48442 | 0.18 | |
| 2 | 1.571 | 25759 | 0.09 | |
| 3 | 1.793 | 36112 | 0.13 | |
| 4 | 2.527 | 320702 | 1.18 | |
| 5 | 3.364 | 5271 | 0.02 | |
| 6 | 3.509 | 3416 | 0.01 | |
| 7 | 朝藿定B | 7.584 | 26786204 | 98.39 |
图3为朝藿定C的HPLC分析图谱(270nm)，其积分报告如下：
| Name | Retention Time | Area | ％Area | |
| 1 | 2.498 | 210103 | 1.02 | |
| 2 | 3.184 | 4929 | 0.02 | |
| 3 | 3.360 | 9203 | 0.04 | |
| 4 | 朝藿定C | 8.315 | 20358900 | 98.91 |
图4为淫羊藿苷(朝藿定D)的HPLC分析图谱(270nm)，其积分报告如下：
| Name | Retention Time | Area | ％Area | |
| 1 | 0.615 | 252448 | 0.92 | |
| 2 | 2.554 | 204808 | 0.75 | |
| 3 | 淫羊藿苷 | 10.264 | 26778047 | 98.33 |
具体实施方式
现结合实施例和附图对本发明做进一步详细说明，实施例仅限于说明本发明，而非对本发明的限定。
实施例1
本实施例中，以含量为20％的淫羊藿苷提取物为原料，初步柱分离采用HPD柱，高效液相制备以10μmC18键合相填料为吸附剂，分别采用一定比例的甲醇-水及乙腈-水为洗脱溶剂，经两步高效液相制备获得各个对照品。具体工艺步骤如下：
1)初步柱分离
淫羊藿苷提取物用40％乙醇水溶液溶解，HPD-100树脂柱分离，乙醇-水溶液梯度洗脱，收集20％-80％乙醇洗脱物，浓缩干燥得黄色粉末I。
2)第一步高效液相制备
黄色粉末I用40％乙醇水溶液溶解，配置成浓度为150mg/ml的供试品溶液，经0.45μm微孔滤膜过滤；制备型高效液相柱填料品牌为ChromatorexC18键合相填料；粒径为10μm，柱长22cm、直径7.5cm；六通阀进样，进样体积为10ml，以55％甲醇-水溶液为洗脱体系，流速控制在160ml/min，在线紫外检测，分别收集含有朝藿定A和B的洗脱液(流份1)；含有朝藿定C和淫羊藿苷的洗脱液(流份2)，以上两个流份分别减压浓缩干燥得黄色粉末II和黄色粉末III。
3)第二步高效液相制备
黄色粉末II以体积浓度为30％的含乙腈水溶液为洗脱体系进行第二次高效液相制备，其余条件同步骤2)，分别收集含有朝藿定A、B的高纯流份。
黄色粉末III以体积浓度为30％的的含乙腈水溶液为洗脱体系进行第二次高效液相制备，其余条件同步骤2)，分别收集含有朝藿定C和淫羊藿苷的高纯流份。
4)各个化学对照品的获得
上述各高纯流份直接浓缩至干即可得到纯度大于98％的各相应对照品朝藿定A、B、C及淫羊藿苷(图1-图4)。
实施例2
本实施例中，以含量为20％的淫羊藿苷提取物为原料，初步柱分离采用HPD柱，高效液相制备以10μmC18键合相填料为吸附剂，分别采用一定比例的甲醇-水及乙腈-水为洗脱溶剂，经两步高效液相制备获得各相应对照品。具体工艺步骤如下：
1)初步柱分离
淫羊藿苷提取物用水溶液溶解，HPD-100树脂柱分离，乙醇-水溶液梯度洗脱，收集20％-80％乙醇洗脱物，浓缩干燥得黄色粉末I。
2)第一步高效液相制备
黄色粉末I用50％乙醇水溶液溶解，配置成浓度为100mg/ml的供试品溶液，经0.45μm微孔滤膜过滤；制备型高效液相柱填料品牌为ChromatorexC18键合相填料；粒径为10μm，柱长19cm、直径7.5cm；泵进样，进样体积为20ml，以60％甲醇-水溶液为洗脱体系，流速控制在140ml/min，在线紫外检测，分别收集含有朝藿定A和B的洗脱液(流份1)；含有朝藿定C和淫羊藿苷的洗脱液(流份2)，以上两个流份分别减压浓缩干燥得黄色粉末II和黄色粉末III。
3)第二步高效液相制备
黄色粉末II以体积浓度为25％的含乙腈水溶液为洗脱体系进行第二次高效液相制备，其余条件同步骤2)，分别收集含有朝藿定A、B的高纯流份。
黄色粉末III以体积浓度为25％的的含乙腈水溶液为洗脱体系进行第二次高效液相制备，其余条件同步骤2)，分别收集含有朝藿定C和淫羊藿苷的高纯流份。
4)步骤同实施例1。
实施例3
本实施例中，以含量为15％的淫羊藿苷提取物为原料，初步柱分离采用聚酰胺柱，高效液相制备以5μm C18键合相填料为吸附剂，分别采用一定比例的甲醇-水及乙腈-水为洗脱溶剂，经两步高效液相制备获得各相应对照品。具体工艺步骤如下：
1)初步柱分离
淫羊藿苷提取物用45％乙醇水溶液溶解，聚酰胺柱分离，乙醇-水溶液梯度洗脱，收集20％-80％乙醇洗脱物，浓缩干燥得黄色粉末I。
2)第一步高效液相制备
黄色粉末I用45％乙醇水溶液溶解，配置成浓度为120mg/ml的供试品溶液，经0.45μm微孔滤膜过滤；制备型高效液相柱填料品牌为McirosorbC18键合相填料，粒径为5μm；柱长17cm、直径5cm；六通阀进样，进样体积为8ml，以50-60％甲醇-水溶液为洗脱体系，流速控制在180ml/min，在线紫外检测，分别收集含有朝藿定A和B的洗脱液(流份1)；含有朝藿定C和淫羊藿苷的洗脱液(流份2)，以上两个流份分别减压浓缩干燥得黄色粉末II和黄色粉末III。
3)第二步高效液相制备
黄色粉末II以体积浓度为25％的含乙腈水溶液为洗脱体系进行第二次高效液相制备，其余条件同步骤2)，分别收集含有朝藿定A、B的高纯流份。
黄色粉末III以体积浓度为25％的的含乙腈水溶液为洗脱体系进行第二次高效液相制备，其余条件同步骤2)，分别收集含有朝藿定C和淫羊藿苷的高纯流份。
4)步骤同实施例1。
实施例4
本实施例中，以含量为25％的淫羊藿苷提取物为原料，初步柱分离采用聚酰胺柱，高效液相制备以5μm C18键合相填料为吸附剂，分别采用一定比例的甲醇-水及乙腈-水为洗脱溶剂，经两步高效液相制备获得各相应对照品。具体工艺步骤如下：
1)初步柱分离
淫羊藿苷提取物用40％乙醇水溶液溶解，聚酰胺柱分离，乙醇-水溶液梯度洗脱，收集20％-80％乙醇洗脱物，浓缩干燥得黄色粉末I。
2)第一步高效液相制备
黄色粉末I用40-80％乙醇水溶液溶解，配置成浓度为80mg/ml的供试品溶液，经0.45μm微孔滤膜过滤；制备型高效液相柱填料品牌为McirosorbC18键合相填料，粒径为5μm；柱长17cm、直径5cm；泵进样，进样体积为20ml，以60％甲醇-水溶液为洗脱体系，流速控制在180ml/min，在线紫外检测，分别收集含有朝藿定A和B的洗脱液(流份1)；含有朝藿定C和淫羊藿苷的洗脱液(流份2)，以上两个流份分别减压浓缩干燥得黄色粉末II和黄色粉末III。
3)第二步高效液相制备
黄色粉末II以体积浓度为28％的含乙腈水溶液为洗脱体系进行第二次高效液相制备，其余条件同步骤2)，分别收集含有朝藿定A、B的高纯流份。
黄色粉末III以体积浓度为28％的的含乙腈水溶液为洗脱体系进行第二次高效液相制备，其余条件同步骤2)，分别收集含有朝藿定C和淫羊藿苷的高纯流份。
4)步骤同实施例1。
Claims (3)
1.同时制备淫羊藿苷、朝藿定A、B、C化学对照品的方法，其特征在于：以质量含量为10％-50％的淫羊藿苷提取物为原料，经初步柱分离，以制备型高效液相色谱为主要分离手段，通过两步高效液相制备，提取液直接减压浓缩至干即可获得纯度大于98％的相应对照品；具体步骤如下：
1)初步柱分离：
淫羊藿苷提取物用水或体积浓度40-80％乙醇水溶液溶解，树脂柱或聚酰胺柱分离，乙醇-水溶液梯度洗脱，其中乙醇的体积浓度从0％-100％变化，收集20％-80％乙醇洗脱物，浓缩干燥得黄色粉末I；
2)第一步高效液相制备：
黄色粉末I用体积浓度40-80％乙醇水溶液溶解，配置成浓度为50～150mg/ml的供试品溶液，经0.45μm微孔滤膜过滤；采用柱长10-50cm、直径1-10cm的高效液相制备色谱柱进行分离，六通阀或泵进样，进样体积为1-50ml，以体积浓度为45-60％的甲醇-水或体积浓度为20-40％的乙腈-水溶液为洗脱体系，流速控制在10-400ml/min，在线紫外检测，分别收集含有朝藿定A和B的洗脱液，其为流份1；含有朝藿定C和淫羊藿苷的洗脱液，其为流份2，以上两个流份分别干燥得黄色粉末II和黄色粉末III；
3)第二步高效液相制备：
黄色粉末II以体积浓度为20-40％的含乙腈水溶液为洗脱体系进行第二次高效液相制备，其余条件同步骤2)，分别收集纯度＞98％的朝藿定A流份和纯度＞98％的朝藿定B的流份。
黄色粉末III以体积浓度为20-40％的含乙腈水溶液为洗脱体系进行第二次高效液相制备，其余条件同步骤2)，分别收集纯度大于98％的含有朝藿定C和淫羊藿苷的高纯流份；
4)目标化学对照品的获得：
以上四种高纯流份直接浓缩至干即可得到纯度大于98％的相应对照品，其为亮黄色粉末；
第一步或第二步高效液相制备过程采用的制备柱的填料为C6、C8、或C18键合相填料，粒径为5-20μm。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：柱分离过程采用的树脂柱为非极性树脂柱。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：高效液相制备过程采用采用在线紫外检测，其检测波长优选270nm、318nm或349nm。
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| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20120411 Termination date: 20191217 |