CN107041875B - 丝蛋白纳米粒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种丝蛋白纳米粒，包含丝素蛋白和活性药物，所述丝素蛋白负载活性药物，该活性药物选自雷公藤甲素或雷公藤红素。本发明还公开了该丝蛋白纳米粒的制备方法和应用。本发明的丝蛋白纳米粒，改善了药物雷公藤甲素和雷公藤红素的水溶性，并能更有效地对抗癌细胞的增殖，而且，联合使用载雷公藤甲素的丝蛋白纳米粒(TPL‑SFNPs)和载雷公藤红素丝的蛋白纳米粒(CL‑SFNPs)，能协同抑制癌细胞的生长，效果十分显著，对于癌症尤其是胰腺癌的治疗具有很好的应用前景。

Description

丝蛋白纳米粒及其应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种载雷公藤甲素(TPL)或雷公藤红素(CL)的丝蛋白纳米粒及其应用。
背景技术
胰腺癌(PC)是最具侵袭性的人类恶性肿瘤之一，其5年存活率仅为8％，其在所有被诊断的癌症中具有2％的发病率，相对较低，但是占全世界癌症死亡的6％。PC的化疗具有很强的毒副作用，并且PC具有潜在的耐药性，这两个原因在许多情况下都会导致患者的不幸死亡。目前胰腺癌的标准化疗药是吉西他滨，然而其疗效远远不能令人满意，其中一个原因是由于复杂的肿瘤微环境，这种微环境会使到达目标癌细胞的有效药物递送减少。迄今为止，没有药物可以促使显著延长临床总生存期。因此，仍然需要提出对胰腺癌的新治疗策略，并且迫切需要开发一些治疗药物以改善对该疾病的治疗。
雷公藤甲素(TPL，结构式如下述A所示)和雷公藤红素(CL，结构式如下述B所示)这两种主要生物活性化合物来源于中国传统的中草药雷公藤，由于其独特的二萜三环氧化物结构和广泛的生物活性，特别是抗癌活性，吸引了人们广泛的注意。TPL已被证明是多种类型癌症(包括胰腺癌，乳腺癌，黑色素瘤和肺癌)的细胞周期停滞和细胞凋亡的有效诱导剂。它可以有效地减少体外胰腺癌细胞的存活率，减少体内肿瘤的生长和转移。但是，由于其水溶性差以及严重的毒性，还不能将TPL和CL***地应用于临床。因此，迫切需要开发一种TPL和CL有效制剂以用于临床。
有效的药物递送***的设计与合成对于医疗保健至关重要。基于纳米载体的药物递送***(DDSc)，特别是纳米颗粒，具有一些优于使用纯药的特点，如增强药物在肿瘤靶向部位积聚的能力，克服细胞内药物递送以及实现控制和持续释放以增强药物生物利用度，使它们在药物递送领域产生巨大的作用。丝素蛋白(SF)是从蚕茧中再生的天然产物，被证明具有几个独特的性质，如生物相容性，可调节生物降解，稳定作用等，这使其成为能够递送一系列治疗药物的潜在药物递送载体材料之一。
发明内容
本发明要解决雷公藤甲素(TPL)和雷公藤红素(CL)难溶于水、生物利用度低的技术问题，提供一种载雷公藤甲素(TPL)或雷公藤红素(CL)的丝蛋白纳米粒，该纳米粒不仅克服了药物的疏水性缺陷，而且能更有效地对抗胰腺癌细胞增殖，是游离TPL和CL药物的2-3倍。
此外，还需要提供一种抗胰腺癌的药物组合物，包括分别载雷公藤甲素(TPL)和雷公藤红素(CL)的丝蛋白纳米粒(TPL-SFNPs和CL-SFNPs)，与单独的TPL-SFNP或CL-SFNP相比，本发明同时含有TPL-SFNP和CL-SFNP的药物组合物显著增加了对人胰腺癌细胞的生长抑制，表现出了显著的协同抗癌作用。
为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现:
在本发明的一个方面，提供了一种丝蛋白纳米粒，包含丝素蛋白和活性药物，所述丝素蛋白负载活性药物，该活性药物选自雷公藤甲素或雷公藤红素。
本发明中的丝素蛋白是一种从蚕茧中提取的天然生物大分子，被用作载体以实现雷公藤甲素和雷公藤红素的靶向药物递送。本发明的实验证明由丝素蛋白制成的空白丝蛋白纳米粒对细胞无毒性，具有较高的安全性和良好的生物相容性。
本发明丝蛋白纳米粒的粒径为150～190nm；包封率为79％～89％；载药量为52～68μg/mg。
在本发明的另一方面，提供了一种丝蛋白纳米粒的制备方法，包括以下步骤：
配制丝素蛋白溶液，在搅拌条件下向该丝素蛋白溶液中逐滴加入溶解在乙醇和丙酮二元混合溶剂中的雷公藤甲素或雷公藤红素溶液，所得悬浮液经冷冻、解冻、离心，得载雷公藤甲素或雷公藤红素的丝蛋白纳米粒。
所述二元混合溶剂与丝素蛋白溶液的体积比为1:10～50，所述丝素蛋白溶液的浓度为0.5～2.0mg/ml，所述雷公藤甲素或雷公藤红素溶液的浓度为1.0～5.0mg/ml。
本发明的上述制备方法是采用改良的去溶剂化法制备得到具有理想粒径的丝蛋白纳米粒，选用二元溶剂丙酮和乙醇的混合物，该溶剂混合物能促进丝素蛋白的脱水，从而使丝素蛋白聚合物轻度折叠以产生小于200nm的纳米粒。
在本发明的另一方面，还提供了一种上述丝蛋白纳米粒在制备治疗癌症的药物中的应用。
优选的，所述癌症包括胰腺癌、乳腺癌、黑色素瘤、或肺癌。
本发明的丝蛋白纳米粒经实验证明比游离药物具有更显著的抑制癌细胞增殖的作用，因此用于治疗癌症将更加有效。
在本发明的另一方面，还提供了一种包含上述丝蛋白纳米粒的抗胰腺癌的药物制剂。
在本发明的另一方面，还提供了一种抗胰腺癌的药物组合物，包含载雷公藤甲素的丝蛋白纳米粒(TPL-SFNP)和载雷公藤红素的丝蛋白纳米粒(CL-SFNP)。
与游离的雷公藤甲素(TPL)和雷公藤红素(CL)两个组合药物相比，本发明的丝蛋白纳米粒TPL-SFNP和CL-SFNP，在两种胰腺癌细胞系中都显示出更有效的协同增效作用。
本发明载雷公藤甲素(TPL)或雷公藤红素(CL)的丝蛋白纳米粒，不仅改善了药物雷公藤甲素和雷公藤红素的水溶性，而且由于较强的渗透和保留(EPR)效应，进一步促进了TPL和CL被动地在癌组织中积聚，加强了对胰腺癌细胞生长的抑制。载雷公藤甲素丝蛋白纳米粒(TPL-SFNPs)和载雷公藤红素丝蛋白纳米粒(CL-SFNPs)的联合用药，能显著抑制胰腺癌细胞增殖，该抑制作用是协同而不是单纯的叠加，因此，TPL-SFNPs和CL-SFNPs共同治疗癌症尤其是胰腺癌，具有非常好的应用前景。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图1是本发明实施例1通过SDS-PAGE法测定用CaCl2·CH3CH2OH·H2O三元溶剂***提取的SF的分子量范围的结果图；
图2是本发明实施例2的SF和SFNPs的表征图；
图3是本发明实施例2的Blank-SFNPs，TPL，TPL-SFNPs，CL和CL-SFNPs的FTIR光谱图；
图4是本发明实施例2的SF，Blank-SFNPs，TPL-SFNPs，CL-SFNPs的酰胺I区FTIR光谱(1700-1600cm-1)图；
图5是本发明实施例2的TPL-SFNPs(A)以及CL-SFNP(B)在37℃，pH＝7.4和pH＝5.0的PBS中的累积释放曲线图；
图6是本发明实施例3的Blank-SFNPs，TPL-SFNPs和CL-SFNPs的安全性评价图；
图7是本发明实施例3的用MTS测定TPL，TPL-SFNPs，CL，CL-SFNPs对MIA PaCa-2和PANC-1细胞的抑制增殖和杀伤作用的IC50曲线图；
图8是本发明实施例4的使用共聚焦激光扫描显微镜观察RITC-SFNPs的细胞摄取过程，并用游离RITC的细胞摄取过程作对照的纳米粒细胞内定位图；
图9是本发明实施例4的SFNPs的细胞摄取定量测定结果图；
图10是本发明实施例5的不同剂量药物抑制MIA PaCa-2和PANC-1克隆形成作用柱状图；
图11是本发明实施例6TPL和CL，TPL-SFNPs和CL-SFNPs抗MIA PaCa-2增殖的协同增效作用图；
图12是本发明实施例6TPL和CL，TPL-SFNPs和CL-SFNPs抗PANC-1增殖的协同增效作用图；
图13是本发明实施例7CL-SFNPs和TPL-SFNPs促MIA PaCa-2和PANC-1凋亡作用图。
具体实施方式
为了克服雷公藤甲素(TPL)和雷公藤红素(CL)水溶性差的缺陷，本发明研制了载雷公藤甲素(TPL)和雷公藤红素(CL)的丝蛋白纳米粒(TPL-SFNPs和CL-SFNPs)，并评估其抗人胰腺癌细胞的协同增效作用。用改良的去溶剂化方法制备TPL-SFNPs和CL-SFNPs。两种SFNPs的表征，分别通过动态激光光谱法(DLS)测粒径和电位，透射电子显微镜(TEM)观察形态。通过HPLC评价包封率，载药量和药物释放特性。用MIA PaCa-2和PANC-1人胰腺癌细胞株研究SFNPs的细胞毒性和协同增效作用，用新鲜的小鼠血液进行溶血性试验评价载药纳米粒的生物相容性。体外药物释放研究显示，在pH5(溶酶体pH)PBS中观察到SFNPs药物快速释放，而在pH7.4(血浆pH)的PBS中缓慢释放。与游离的TPL(IC50 11.25和11.58nM)和CL(IC500.84和1.23μM)相比，TPL-SFNPs(IC50 3.80和4.75nM)和CL-SFNP(IC500.38和0.64μM)能更有效地对抗MIA PaCa-2和PANC-1细胞增殖，是游离药物的2-3倍。此外，与单独的TPL-SFNPs或CL-SFNPs相比，TPL-SFNPs和CL-SFNPs的共同治疗显著增加了对相同细胞的生长抑制。用Compusyn软件计算的几乎所有浓度的联合指数(CI)值都<1，这表明TPL-SFNPs与CL-SFNPs联合的生长抑制作用是协同的而不是单纯的叠加。
下面通过具体实施例阐述本发明。
材料：
雷公藤甲素(TPL)和雷公藤红素(CL)购自Chengdu Biopurify PhytochemicalsLtd.(Chengdu，China)。蚕茧由浙江省桐乡桑树丝基地(中国桐乡)提供。截留7,000Da的透析膜(MWCO从Viskase公司(Chicago，USA)获得。Hoechst 33342和3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四唑溴化物(MTT)来自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO，USA)。罗丹明-B-异硫氰酸酯(RITC)和膜联蛋白V-FITC凋亡检测试剂盒由Sigma Chemicals(St.Louis，MO，USA)提供。HPLC级乙腈和甲醇从BDH Chemicals(Gibbstown，NJ)获得。本发明实施例中使用的其他化学品均为分析纯级，按原样使用。除非另有说明，使用的乙醇和丙酮和其他化学品从VWR国际公司(Darmstadt，德国)获得。
Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)，胎牛血清(FBS)购自Gibco BRL(Carlsbad，CA，USA)。青霉素-链霉素，0.25％胰蛋白酶-EDTA和非必需氨基酸获自美国Invitrogen Co。人PC细胞MIA PaCa-2和Panc-1细胞来自Prabhu博士实验室的赠品，最初获自美国典型培养物保藏中心(ATCC)(Rockville，MD)。
实施例1 丝蛋白纳米粒的制备
1.再生丝素蛋白(SF)制备、纯化和分子量
将购买的桑蚕茧切成小片，并在0.02M Na2CO3中脱胶两次，每次30分钟，并用去离子水彻底冲洗。空气干燥后，脱胶的丝素蛋白(SF)溶解在三元体系CaCl2-CH3CH2OH-H2O(摩尔比为1:2:8)中，在75℃持续搅拌4小时。此外，将所得SF溶液在4500rpm下离心5分钟。小心收集上清液，并在Viskase透析膜(MWCO 7000Da)中用去离子水透析3天以除去盐和乙醇。在14000rpm下离心15分钟后，使用NanoDrop TM 2000/2000c分光光度计测定制备的丝素蛋白溶液的浓度。通过SDS-PAGE(8％分离凝胶和5％冷凝凝胶)，然后通过考马斯亮蓝R-250染色分析提取的SF的分子量范围。最后将丝素蛋白溶液在4℃中储存备用。
结果：SF是由5509个氨基酸组成的并且构成重链(391kDa)和轻链(26kDa)的生物大分子，SF分子在脱胶过程中经历水解。SDS-PAGE(分离凝胶的浓度为8％)实验结果显示再生的SF是具有宽分子量分布的多肽混合物(图1)，图1中M是分子量标记。
2.丝蛋白纳米粒的制备
以上述方法提取的具可调生物降解性能及良好生物相容性的SF为载体材料，采用改良的去溶剂化法制备载雷公藤甲素(TPL)或雷公藤红素(CL)单药纳米粒TPL-SFNPs，CL-SFNPs。即用储备溶液配置2mg/ml的SF溶液，在温和不断搅拌下逐滴向其中加入溶解在乙醇：丙酮(v/v＝3:2)二元溶剂中的2.5mg/mL TPL溶液或2mg/mL CL溶液。将所得悬浮液在-20℃冰箱中冷冻16小时，并在温水(40℃)下快速解冻。然后离心收集制得的纳米粒(14000rpm，20min)，并且用去离子水洗涤去除杂质及游离药物(洗涤三次)。以去离子水重悬所得纳米粒沉淀，并超声破碎仪超声分散，随后加入5％(w/v)海藻糖作为冷冻保护剂进行冻干干燥。冻干后的纳米粒储存在2-8℃，备用。
3.处方工艺优化的实验设计
TaguchiL9正交阵列实验设计用于优化TPL-SFNPs和CL-SFNPs的制剂参数。使用三因素，三级设计来研究制剂变量的相互作用和二次效应。选择用于制剂优化的有机溶液：SF溶液，SF，TPL和CL的浓度基于初步的实验。选择用于配方优化的三个因子及其编码水平示于下表1中。使用(版本10.1，Stat-Ease Inc.，USA)软件分析结果。
表1 用于TPL-SFNP和CL-SFNP制剂开发和优化的因子和编码水平
处方优化的实验设计结果：
使用L9正交阵列实验设计(三因素，三水平)优化TPL-SFNPs和CL-SFNPs的制备工艺流程。选择用于实验设计的因素水平及结果如表2所示。参照软件实验设计选择优化的处方。通过将预测值与实验值比较来验证用于TPL-SFNP和CL-SFNP的制剂优化的实验模型的意义(表3)。优化实验的结果表明，TPL-SFNP和CL-SFNP的粒径，EE和DL与预测值相当，证明了在实验设计中使用的处方工艺优化模型的准确性和有效性。
表2 TPL-SFNPs和CL-SFNPs制备处方工艺优化的Taguchi L9正交实验设计及结果
表3 由软件推荐的TPL-SFNPs和CL-SFNPs的优化处方工艺参数及其验证结果
实施例2 纳米颗粒表征
1.方法
1.1粒径，Zeta电位和形态
将冷冻干燥的SFNP分散在去离子水(pH7.0)中。通过动态光散射检测(NanobrookOmni，Brookhaven Instrument Corp)测定NP(Blank-SFNP，TPL-SFNP，CL-SFNP)的平均尺寸和ζ电位(所有测量在室温下进行三次)。通过透射电子显微镜(TEM，H600，HITACHI，Japan)进行NP和SF的形态学检查。将SF稀释并将冻干的NP用去离子水重悬浮。通过将一滴稀悬浮液置于涂有碳膜的铜网上制备另外的样品。然后在TEM下观察样品的表面形态。
1.2红外光谱IR吸收和β-折叠含量
使用傅立叶变换红外分光光度计(FTIR，Bruker VERTEX80V，德国)进行加载药物的SFNP以及游离药物的FTIR光谱。还检测了冻干的再生SF的光谱。对于每次测量，从具有4cm-1的分辨率的32次扫描产生光谱。使用PeakFit 4.12通过酰胺I谱带的解卷积获得NP或再生SF中的SF的β-折叠含量。在800-2000cm-1的光谱区中获得吸收模式的IR光谱。
1.3药物装载能力和包封率
通过Agilent 1050 HPLC(Agilent Technologies，Palo Alto，CA，USA)分析TPL-SFNPs和CL-SFNP的包封率和载药量，使用C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm，AgilentTechnologies，USA)进行分析，TPL和CL的流动相分别为甲醇：水(55:45，v/v)和甲醇：水(90:10，v/v)，流速为1mL/min，检测波长分别为218nm和430nm。
对于包封率测定，在制备纳米粒时收集上清液，并用0.45μm微孔滤膜过滤，通过HPLC分析上清液中的游离药物。将TPL-SFNP和CL-SFNPS分散在由乙醇：丙酮(2:3，v/v)组成的二元溶剂中，超声处理10分钟以测定载药量(％)。将悬浮液进一步以14000rpm离心20分钟，收集上清液，0.45μm微孔滤膜过滤，，然后进行进样分析。纳米粒的包封率(EE)和载药量(DL)使用以下方程计算：
EE(％)＝SFNPs中的药物量/投药量×100％
DL(％)＝SFNPs中的药物量/SFNPs总量×100％
1.4体外药物释放
在pH 7.4和pH 5的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中测定SFNPs中的TPL和CL累积释放动力学行为。将相同量的SFNPs混悬在PBS中，并分别放置在加盖的玻璃瓶中，每瓶2mL，随后在37℃下培养箱以120转/分钟的振荡速度振荡。在预定的时间间隔(1,4,8,24,48,72,120和168小时)，取出每种制剂的三个玻璃瓶，并通过离心(14000rpm，15min)，分离纳米颗粒和释放介质，离心三次。通过HPLC测定纳米颗粒中残留的TPL和CL的量。以累积药物释放对时间作图得累积释放曲线。
2.结果
2.1粒径，Zeta电位和形态
如图2中的TEM图像所示，SFNPs呈现出球形和单一分散。图2中，A.SF的TEM图；B.Blank-SFNPs的TEM图；C.TPL-SFNPs TEM图和制剂图；D.CL-SFNPs的TEM图和制剂图。比例尺：200nm。TPL-SFNPs和CL-SFNPs的粒径分别为166.4±4.6nm(PDI<0.3)和170.4±2.3nm(PDI<0.3)(表4)。TPL-SFNPs和CL-SFNPs的平均Zeta分别电位为-27.2±2.0mV和-25.5±2.6mV(表1)，带负电荷的纳米颗粒具有较长的循环寿命和较小的细胞毒性，TPL-SFNPs和CL-SFNPs的上述Zeta电位，可减少聚集并延长丝蛋白纳米粒在血液中的循环时间。
表4 SF，SFNPs，TPL-SFNPs，CL-SFNPs(n＝3)的粒径，Zeta电位，包封率，载药量和β-折叠含量
2.2红外吸收光谱和β结构含量
TPL，CL，TPL-SFNPs，CL-SFNP，SF和SFNP的FTIR光谱如图3所示。TPL-SFNPs和CL-SFNPs在1415cm-1和1325cm-1的TPL和CL表现出特征吸收峰，这证实了药物成功包封到SFNP中。发现SF中的β-折叠含量为约16.8％，但在空白SFNPs中其增加至35.3％。此外，TPL-SFNPs和CL-SFNP中的β-折叠含量在TPL和CL存在下增加至57.7％和77.6％(表4，图4)。这意味着TPL和CL的增加也有利于SF从无规卷曲/螺旋到β折叠的构象转变，可能是因为TPL，CL和SF大分子之间的相互疏水作用。此外，由TPL或CL诱导的更多的β-折叠形成可能有益于它们在SFNP中的包载，从而在随后的应用中引起缓慢的药物释放作用。
2.3药物载药量和包封效率
药物包载能力是药物递送中的关键因素。为了获得高载药量以满足治疗需要，本发明使用优化的处方工艺制备了载药SFNPs。制备的TPL-SFNPs和CL-SFNPs载药量分别有57.0±4.7μg/mg和63.5±3.8μg/mg的，包封率有81.8±2.8％和87.0±1.1％(表4)。
2.4体外药物释放曲线
用两种不同pH值的PBS研究TPL-SFNPs和CL-SFNPs的累积药物释放特征。pH 7.4与正常细胞的细胞外生理pH相当，而pH 5与癌细胞的溶酶体pH相当。结果如图5A和5B所示。两种药物在pH7.4时可从纳米粒中逐渐缓慢释放，表明将药物包裹在SFNP中可以显著延长其在血浆中的循环时间。但是在整个早期时间点(1至24小时)和7天释放期，用pH 5.0的PBS温育时药物释放明显更快，累积TPL和CL释放量在24小时内为可达53％和55％，7天累积总释放量约为95％和80％，与pH 7.4中的82％和65％相比具有更快释放模式，表明SFNP可以作为药物的溶酶体递送平台。
本发明的丝蛋白纳米粒可以在生理pH下以缓慢和持续的方式释放药物，而在较低的细胞内pH下快速释放。在低pH下丝蛋白失去其整体酸性，加上其这个表面负净电荷，这都导致药物快速释放。pH依赖性药物释放也可归因于丝蛋白纳米粒内药物的有效包裹及负载。
实施例3 空白SFNPs和载药SFNPs的安全性评价
1.体外溶血性测定
在体外对SFNP、载药的SFNPs进行溶血性测定以考察其生物相容性。简言之，将0.2mL的3.8％柠檬酸钠与新鲜的4mL小鼠血混合，随后在3,000rpm离心10min，收集沉淀并将其悬浮在37℃PBS(pH 7.4)中洗涤3次，最终得到5％(v/v)的RCB悬浮液。将10mg/mL悬浮的NPs(Blank-SFNPs，TPL-SFNPs和CL-SFNPs)在PBS中与RBC一起温育。用0.1％Triton X-100和PBS加入到RBCs溶液中分别用作阳性和阴性对照。所有样品在室温下温育2小时。然后，将样品离心5min，小心收集100μL上清液，并转移至96孔板，以微量平板读数器检测血红蛋白的含量。根据以下等式计算溶血百分比：
溶血(％)＝[光学密度(y)—阴性对照光密度(c)]*100/[(阳性对照光密度—阴性对照光密度)。
结果：如图6A所示，与显示最高毒性可破坏溶液中存在的100％RBC阳性对照Triton X-100相比，用作阴性对照的PBS组，几乎没有引起溶血。与PBS类似，SFNPs和载药的SFNPs在的高浓度(10mg/mL)下不引起小鼠红细胞的任何溶血。
2.采用MTS法进行细胞存活力/细胞毒性检测
通过MTS法测定空白丝蛋白纳米粒Blank-SFNPs对人胰腺癌细胞MIA PaCa-2和PANC-1，以及正常细胞HEK293和HGF-1的细胞毒性。使用浓度范围为0.125mg/mL至1mg/mL的Blank-SFNPs来检测。将系列浓度Blank-SFNPs分别加入预先孵育的四种细胞中，继续孵育72小时后，去除培养基，然后加入100μl含有20％MTS和1％吩嗪硫酸甲酯(PMS)的无血清培养基，并孵育1小时。通过微量板读数器(μQuantTM，仪器公司)在490nm测量每个孔的吸光度。将未加药物处理细胞的细胞存活率设定为100％，无细胞的孔的作为调零孔。通过Prism软件(San Diego，CA)分析IC50值。每个实验进行至少三次。
通过MTS法测定药物及载药纳米粒对人胰腺癌细胞MIA PaCa-2和PANC-1的细胞毒性。将系列浓度的TPL，CL，TPL-SFNPs和CL-SFNP分别加入预先孵育的MIA PaCa-2和PANC-1细胞中，同法测定IC50值。
结果：Blank-SFNPs对胰腺癌细胞MIA PaCa-2和PANC-1，正常细胞HEK293和HGF-1都没有显著的抑制作用(图6B)，表明单独的SFNPs不影响所研究浓度中的任何可定量的毒性，空白SFNPs在体外具有较高的安全性和良好的生物相容性。
在图6中，A.TPL-SFNPs，CL-SFNPs及其组合在新鲜小鼠血液中的生物相容性。Triton X-100和PBS分别用作阳性对照和阴性对照。B.使用MTS测定的Blank-SFNPs在MIAPaCa-2，PANC-1，HEK-293和HGF-1细胞系中的细胞毒性。(平均值±SD，n＝5；*：P<0.05，**：P<0.01)。
载药的SFNPs的体外细胞毒性检测结果：
如图7A-7D所示。TPL，CL，TPL-SFNPs和CL-SFNPs的抑制胰腺癌细胞增殖作用中都表现出剂量的依赖性，然而，与TPC和CL相比，TPL-SFNPs和CL-SFNPs具有较低的IC50值，证明TPL-SFNPs和CL-SFNPs具有较强的抗胰腺癌作用。TPL对MIA PaCa-2作用的IC50值是11.58μM。但是对于TPL-SFNPs的IC50值则显著降低至3.8μM，与游离药物相比约减少了3倍(图7A)。类似地，对于PANC-1细胞，游离TPL和TPL-SFNPs的IC50值分别为11.25μM和4.57μM(图7B)。对于CL-SFNPs也观察到了类似的趋势。对于MIA PaCa-2细胞，游离CL的IC50值为1.32μM，而对于CL-SFNPs，IC50值降低至0.65μM，与游离药物相比约减少2倍(图7C)。同样，对于PANC-1细胞，游离CL和CL-SFNPs的IC50值分别为0.83μM和0.38μM(图7D)。因此，图7结果表明，当相同量的药物包裹在SFNPs中时，跟游离药物相比，TPL-SFNPs和CL-SFNPs可显著增强抗胰腺癌作用。
在图7中，A.TPL和TPL-SFNPs对MIA PaCa-2细胞系中的IC50曲线；B.TPL和TPL-SFNPs对PANC-1细胞系的IC50曲线；C.CL和CL-SFNPs对MIA PaCa-2细胞的IC50曲线；D.CL和CL-SFNPs对PANC-1细胞的IC50曲线。
实施例4 体外细胞摄取
1.细胞培养
将胰腺癌细胞PACA-2，PANC-1，HEK 293和HGF-1在37℃，加湿，5％CO2环境中，用含有10％胎牛血清的DMEM或EMEM培养基单层培养至70-80％。每隔一天补充培养基，在汇合度达到70-80％后对细胞进行继代培养。
2.体外细胞摄取
2.1采用激光共聚焦显微镜进行细胞内定位成像
为了研究SFNPs的细胞摄取，使用实施例1提到的制备载药纳米粒的相同方法制备荧光标记物RTIC的纳米粒(RTIC-SFNPs)。将MIA PaCa-2和PANC-1细胞(5×104个细胞/孔)接种在置于6孔板中的无菌盖玻片上，并在37℃，5％CO2下，于含有10％胎牛血清的DMEM培养基中孵育过夜。然后加入游离RTIC和RTIC-SFNPs(在培养基中浓度为0.5μM)作用5min，30min和60min(未处理的细胞用作对照)。然后，用PBS洗涤细胞三次，随后用4％β-甲醛固定15min，并再次用PBS洗涤三次。细胞核用Hoechst 33342染色并用PBS洗涤三次，然后使用Leica TCS SP2共聚焦显微镜对细胞成像，并使用Leica共聚焦软件分析图像。
2.2通过流式细胞术测定细胞摄取
采用流式细胞术定量分析MIA PA-CA-2和PANC-1对SFNPs的摄取。将5×104个细胞/孔接种在12孔板中并孵育24小时。然后加入游离RTIC和RTIC-SFNPs(培养基中浓度为0.5μM)，孵育5min，30min和60min，并用温热的(37℃)磷酸盐缓冲液(D-PBS)洗涤两次，胰蛋白酶消化细胞，用冰冷的D-PBS洗涤。最后将细胞重悬浮于500μL冰冷的D-PBS中，并在黑暗中于冰上放置10分钟。通过Becton Dickinson FACS Calibur流式细胞仪(BDBiosciences，San Jose，CA，USA)分析样品。
3.体外细胞摄取结果
3.1纳米粒的细胞内定位
以人胰腺癌细胞PANC-1和MIA PaCa-2为研究对象，采用激光共聚焦扫描仪和荧光标记法，验证了丝蛋白纳米粒SFNPs的细胞摄取，使用激发红光的RITC标记SFNPs，使用具有蓝色荧光的Hoechst 33342标记细胞核。分别将RITC，RITC-SFNPs加入到PANC-1和MIAPaCa-2细胞中，作用5min，30min和60min。结果显示RITC-SFNPs以时间依赖性方式被两种细胞系有效吸收，且在孵育60min后主要分布在细胞质或核周区域中(图8A和8B)。与30min和60min时的RITC作用组相比，RITC-SFNPs能显著更快地被内吞，表明包裹在SFNPs中的药物可以被癌细胞有效吸收，使得所载药物能够同时在细胞内释放。进入细胞的纳米粒内化过程可以被认为是结合(吸附)过程，其中的纳米粒通过内吞作用被内化。41，42一旦纳米颗粒被内吞，首先它们会在核膜周围的细胞质中被发现。尽管孵育的纳米粒具有阴性表面，但它们大部分被细胞内化并且在囊状运输期间保持稳定。还观察到两个细胞系在实验期间保持存活，这支持先前的结果，单独的丝素蛋白纳米颗粒不导致任何可测量的毒性。
在图8中，A.MIA PaCa-2，孵育时间为5min，30min和60min；B.PANC-1，孵育时间为5min，30min和60min。放大倍数：×40。
3.2通过流式细胞术(FCM)测定SFNPs的细胞摄取
结果如图9所示，与PANC-1细胞作用5min，30min和60min后，与游离RITC相比，RITC-SFNPs显示出明显较高的荧光强度，约增加了2倍的荧光强度(图9B、9D)。与游离RITC作用细胞相比，RITC-SFNPs作用的MIA PaCa-2细胞在荧光强度上也显示出显著的差异(图9A、9C)，但其强度没有在PANC-1细胞系中看到的那样显著。
在图9中，A和C：MIA PaCa-2，孵育时间为5min，30min和60min；B和D：PANC-1，孵育时间为5min，30min和60min；平均值±SD，n＝5；*：P<0.05，**：P<0.01。
实施例5 克隆形成抑制测定
1.方法
克隆形成抑制测定用于测定TPL-SFNPs和CL-SFNPs对胰腺癌细胞的生长抑制作用。将1×103MIA PaCa-2和PANC-1细胞/孔接种在6孔板中。在第三天，用不同浓度的CL和CL-SFNP(CL：0.5-0.45μM)，TPL和TPL-SFNPs(TPL：0.3-3.0nM)加入到细胞中，并继续孵育4天，移除药物，并加入新鲜培养基，再孵育7天。然后，用冰冷的甲醇和乙酸(3:1，v/v)混合物固定细胞，并孵育15分钟。最后，用0.5％结晶紫对菌落进行染色。在显微镜下手动计数超过50个细胞的菌落定义为形成克隆，使用Graph Pad Prism软件进行数据分析。未加药处理的细胞用作对照组。
2.结果
克隆形成测定或集落形成测定是基于单个细胞生长成集落的能力的体外细胞活性测定。通过细胞生长抑制测定TPL，CL，TPL-SFNPs和CL-SFNPs的抗癌活性。未经处理的MIAPaCa-2和PANC-1细胞产生大的集落，TPL，CL，TPL-SFNPs和CL-SFNPs作用的细胞显示出克隆形成的剂量依赖性抑制。与游离的TPL和CL(图10A，10B和10C，10D)相比，相同剂量下的TPL-SFNPs和CL-SFNPs在0.15和0.45μM浓度时分别显示出更高的抑制克隆形成作用，MIA PaCa-2和PANC-1癌细胞形成的集落显著减少。这表明在将TPL和CL包裹在SFNPs中后表现出优异的抗癌活性。跟MIA PaCa-2相比，PANC-1细胞对药物作用更敏感。在0.45μM的剂量下，MIAPaCa-2的克隆抑制率为70％，而PANC-1细胞的克隆抑制率高达90％。然而，两种细胞系对TPL-SFNPs都较敏感，并且在3.0nM剂量下约95％的集落被抑制(图10A和10B)。总之，TPL-SFNPs和CL-SFNPs的快速内化和持续药物释放可以显著增强相同剂量下的雷公藤红素和雷公藤甲素的抗癌作用。
在图10中，A.TPL和TPL-SFNPs对MIA PaCa-2的克隆形成抑制作用；B.TPL和TPL-SFNPs对PANC-1的克隆形成抑制作用；C.CL和CL-SFNPs对MIA PaCa-2的克隆形成抑制作用在；D.CL和CL-SFNPs对PANC-1的克隆形成抑制作用(平均值±SD，n＝3；*：P<0.05，**：P<0.01)。
实施例6 TPL-SFNPs和CL-SFNPs的协同作用
1.联合指数值的测定
为了评估TPL和CL，TPL-SFNPs和CL-SFNP的协同增效作用，将各种浓度的药物和载药的SFNPs加入预孵育的MIA PaCa-2和PANC-1细胞，作用72小时。基于Compusyn软件以及在实施例3中获得的IC50值，将实验设计为恒定组合比(表5)，并且用实施例3中描述的相同的MTS测定方法测定细胞存活率，并通过CompuSyn软件分析，计算得到联合指数值(Combination Index，CI)。计算组合指数的公式为CI＝(D)1/(Dx)1+(D)2/(Dx)2，其中(Dx)1和(Dx)2表示纯药或药物制剂，(D)1和(D)2是分别产生组合中相同作用所必需的纯药或载药的SFNPs的剂量。联合指数值(CI)<1，＝1和>1分别表示协同作用，叠加作用和拮抗作用，CI越小表示协同增效作用越强。
表5 用于联合用药分析的TPL和CL剂量范围和组合设计
2.结果：TPL-SFNPs和CL-SFNPs的协同作用
用MTS法研究TPL和CL或TPL-SFNPS和CL-SFNPs对MIA PaCa-2和PANC-1细胞抑制增殖作用。在确定单独剂量反应曲线，并得到各自的IC50值后，选择药物组合浓度的范围，用以评价使用药物组合对胰腺癌细胞的抑制增殖作用。结果发现，与单独作用(图11A1和11B1，图12A1和12B1)相比，当TPL(10和20nM)和CL(0.8和1.6μM)联合作用时，两种细胞系的细胞存活率都明显降低。联合指数CI值高于0.5(图11A2和11A3，图12A2和12A3)，表明TPL和CL的游离药物组合可以在某些浓度下协同抑制胰腺癌细胞生长。此外，发现当用两种不同的纳米粒TPL-SFNPS和CL-SFNPs共同作用于两种细胞时，细胞存活率显著降低。在用TPL浓度为2.25,4.5和9nM的TPL-SFNP和CL浓度为0.25,0.5和1μM的CL-SFNPS共同处理后，与TPL-SFNPs和CL-SFNPS单独治疗相比，MIA PaCa-2细胞系的存活率显著降低(图11B1)。对于PANC-1细胞，甚至在低剂量的TPL(1.125,2.25,4.5和9nM)和CL(0.125,0.25,0.5和1μM)(图12B1)中也观察到相同的纳米粒联合增效作用。总之，与单独的纳米粒和游离药物以及它们的联合作用相比，用CL-SFNP和TPL-SFNP联合作用时，对癌细胞的毒性显著增加。此外，使用Compusyn软件来鉴定药物联合作用的协同效应(Compusyn软件广泛用于预测在体外和体内具有独立作用机制的多种药物的联合作用产生的加和作用和协同作用效果)。用Compusyn软件计算得到，用于纳米粒联合作用的所有浓度组的联合指数值(CI)均小于1，并且在某些组合中CI值低于0.5，这表明CL-SFNP和TPL-SFNP在特定癌细胞中的生长抑制效应是协同的而不是单纯加和(图11B2和11B3，图12B2和12B3)。
在图11中，TPL和CL的联合作用：使用MTS法测得的细胞存活率(A1)和用Compusyn软件分析得到的联合指数(CI)值(A2)以及联合指数图(A3)。TPL-SFNPs和CL-SFNPs的联合作用：使用MTS法测得的细胞存活率(B1)和用Compusyn软件分析得到的联合指数(CI)值(B2)以及联合指数图(B3)。
在图12中，TPL和CL的联合作用：使用MTS法测得的细胞存活率(A1)和用Compusyn软件分析得到的联合指数(CI)值(A2)以及联合指数图(A3)。TPL-SFNPs和CL-SFNPs的联合作用：使用MTS法测得的细胞存活率(B1)和用Compusyn软件分析得到的联合指数(CI)值(B2)以及联合指数图(B3)。
实施例7 TPL-SFNPs和CL-SFNPs的促凋亡作用
1.凋亡测定
使用Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒进行细胞凋亡测定。将5×104MIA PaCa-2和PANC-1细胞接种于24孔板中，并孵育24小时，加入TPL(4.5nM)，CL(0.5μM)，TPL+CL和TPL-SFNP，CL-SFNP，TPL-SFNP+CL-SFNP(载相同量TPL和CL)作用48小时。然后，用冰冷的PBS洗涤细胞两次，胰蛋白酶消化，离心，然后重悬于冷的结合缓冲液中。得到500μL的该细胞悬液，加入5μL Annexin V-FITC和10μL propidium iodide(PI)溶液，置于冰上于黑暗中孵育10min。孵育后，通过Becton Dickinson FACS Calibur流式细胞仪(BD Biosciences，SanJose，CA，USA)分析样品。测试重复三次。
2.TPL-SFNPs和CL-SFNPs的促凋亡作用
经TPL和CL作用的MIA PaCa-2细胞早期凋亡率分别为8.2％和11.4％，而它们联合作用时总凋亡率可达30.0％，表现出了明显的协同作用(图13A和13B)。当TPL和CL单独用于PANC-1细胞时，观察到的凋亡率分别为17.0％和14.0％，而联合作用时为25.5％。单独的TPL-SFNPs和CL-SFNPs作用组与等剂量的游离CL和TPL作用组相比凋亡明显增加，作用于MIA PaCA-2细胞时，凋亡率分别为24.0％和25.2％，而当以相同浓度联合作用时，MIAPaCA-2细胞的总凋亡率显著提高(58.6％)(图13A和13B)。联合作用时，在PANC-1细胞中发现同样的趋势(图13C和13D)。总之，本实施例的实验证实TPL和CL的纳米粒联合应用，能有效促进癌细胞的凋亡，再次证明了TPL-SFNPs和CL-SFNP的联合增效作用。
在图13中，A-B.单独和联合TPL和CL，单独和联合使用CL-SFNP和TPL-SFNP(含同等剂量的TPL和CL)的促MIA PaCa-2细胞凋亡作用。C-D.单独和联合TPL和CL，单独和联合使用CL-SFNP和TPL-SFNP(含同等剂量的TPL和CL)的促PANC-1细胞凋亡作用(平均值±SD，n＝3；*：P<0.05，**：P<0.01)。
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (6)

1.一种抗胰腺癌的药物组合物，包含载雷公藤甲素的丝蛋白纳米粒和载雷公藤红素的丝蛋白纳米粒，所述雷公藤甲素的药物使用浓度为1.125nM～9nM，所述雷公藤红素的药物使用浓度为0.125μM～1μM。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述纳米粒的粒径为150～190nm。
3.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述纳米粒的包封率为79％～89％。
4.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述纳米粒的载药量为52～68μg/mg。
5.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述丝蛋白纳米粒的制备方法包括以下步骤：
配制丝素蛋白溶液，在搅拌条件下向该丝素蛋白溶液中逐滴加入溶解在乙醇和丙酮二元混合溶剂中的雷公藤甲素或雷公藤红素溶液，所得悬浮液经冷冻、解冻、离心，得载雷公藤甲素或雷公藤红素的丝蛋白纳米粒。
6.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述二元混合溶剂与丝素蛋白溶液的体积比为1:10～50，所述丝素蛋白溶液的浓度为0.5～2.0mg/ml，所述雷公藤甲素或雷公藤红素溶液的浓度为1.0～5.0mg/ml。
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