CN101287465B - 青蓝霉素a用于制备作为免疫抑制剂的药物的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及可用作有效的免疫抑制剂的分离生物活性分子青蓝霉素A、其衍生物及其类似物。所述化合物的免疫抑制特性尤其针对淋巴细胞、CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞和B细胞，以及IL-4和IFN-γ及抗体的产生。所述化合物通过下调活化标记CD28的表达和上调免疫抑制标记CTLA-4的表达的机制而起作用。先前已从青蓝链霉菌(Streptomyces caeruleus)分离出青蓝霉素A，并发现其具有有效的抗真菌活性。然而，在本发明之前，尚未确定该化合物具有免疫调节活性。

Description

青蓝霉素A用于制备作为免疫抑制剂的药物的用途

技术领域

本发明涉及联吡啶化合物青蓝霉素A(Caerulomycin A)、及其衍生物和类似物作为有效的免疫抑制剂的用途。更具体地，本发明涉及抑制幼稚和活化的淋巴细胞(效应器)以及抑制IL-4和IFN-γ产生的免疫抑制剂，所述淋巴细胞如丝裂原刺激的T淋巴细胞和B淋巴细胞、CD4⁺T细胞、Th1和Th2细胞。 

本发明的功用是用于治疗由活化T细胞诱导的异常免疫反应所引起的疾病(如自身免疫病、炎症反应、由自身免疫病或其相关疾病引起的并发组织损伤或感染的纤维化或者功能障碍、或变应性疾病)以及用于抑制器官移植排斥和移植期间的移植物抗宿主病。 

化合物青蓝霉素A从新的放线菌物种异壁放线菌属物种斯比提异壁放线菌(Actinoalloteichus spitiensis sp.)新株RMV-1378^T中分离，该菌株的登记号为MTCC 6194^T：DSM 44848^T：JCM 12472^T。 

背景技术

通过识别和消除外源病原微生物(如细菌和病毒)，生物体的免疫***已发展出监视和防御机制。因此，生物体区分自身细胞或组织(自身抗原)与外源微生物(非自身抗原)，并对自身抗原不产生应答，或者对它们产生应答但不引发免疫反应。因此，生物体已发展出获得性免疫，从而及时并有效地消除非自身抗原。 

T淋巴细胞(T细胞)和B淋巴细胞(B细胞)是免疫***中适应性免疫的主要细胞。这两类细胞都参与获得性免疫，并且这些细胞间复杂的相互作用对于整个范围的免疫应答效应细胞和记忆细胞的表达是必需的。T细胞对于外源抗原是特异性的，并且在对于特定宿主防御的应答中它们的数目必定显著增加。 

T细胞的最佳活化依赖于两个独立的受体-配体识别事件。主要事件是 T细胞受体(TCR)与肽-主要组织相容性复合体(pMHC)的相互作用，所述pMHC展示在抗原呈递细胞(APC)(如B细胞、巨噬细胞和树突细胞)的表面上。然而，在没有共刺激信号时，仅仅TCR-pMHC相互作用不足以完成T细胞活化，并可导致该应答T细胞的凋亡或长期无应答(Agrewala等1994，1998)。 

正是相关的共刺激受体家族与其各自配体的相互作用提供了第二共刺激信号(CD28、CD40L)，其对于有效的T细胞活化是必需的。而且，另一组互补性的共刺激信号(CTLA-4、PD-1、BTLA)还提供负信号，该负信号降低免疫应答并由此用于维持外周T细胞耐受，从而保护免受自身免疫(Nishimura等2001，Greenwald等2001)。 

表达在T细胞表面上的主要的共刺激分子是CD28和CTLA-4/CD152。CD28在T细胞上组成性地表达。CD28的连接增强了T细胞应答的程度和持续时间；诱导抗凋亡基因BCL-X_L；增加细胞因子的分泌，尤其是白介素2(IL-2)；增强细胞粘附；通过与APC结合辅助T细胞质膜再组织；防止诱导无变应性(anergy)；并支持生发中心的形成(Lanzavecchia等1999)。CD28共刺激是启动大多数T细胞应答所必需的，并且阻断CD28信号传递导致对蛋白质抗原、寄生物和某些病毒应答的能力以及产生生发中心和介导B细胞辅助的能力显著降低。这具有治疗意义；因为阻断CD28共刺激可实现明确的免疫抑制，在自身免疫病模型中防止诱导致病性T细胞应答并在器官移植模型中实现对同种异体移植物的长期接受(Salomon等2001)。 

CTLA-4(CD152)介导如下的抑制信号。通过固定化mAb或通过与二级抗体交联的可溶性抗体交联CTLA-4可以抑制由抗CD3和抗CD28抗体诱导的T细胞应答(Krummel等1996)。尽管CTLA-4表现出CD28家族成员的共有特征，但是前者在几个重要方面是独特的。首先，与CD28相比，CTLA-4对共用配体B7-1和B7-2具有显著更高的亲合力(K_d0.2-0.4μm对比4.0μm)，并且亲合力高40-100倍(van der Merwe等1997)。 

其次，CTLA-4具有独特的表达模式。不同于CD28，CTLA-4不在幼稚T细胞的细胞表面上组成性地表达。CTLA4仅在CD4⁺T细胞被活化后(APC-TCR结合后2-3天)以及通过与B7分子结合才表达，并向T细胞传递负信号。因为B7-1和B7-2与CTLA4的结合亲合力是其与CD28的结合亲和力的40-50倍，所以活化T细胞上将以负信号传递将为主，并因 此终止免疫应答。体内阻断CTLA-4可增强抗原特异的以及抗寄生物的应答、肿瘤排斥、自身免疫病，并加剧移植排斥(Tivol等1996，Chambers等2001)。在体外，CTLA-4结合导致抑制T细胞增殖、抑制细胞因子生成以及抑制细胞周期进程(Chambers等2001，Freeman等2000)。 

CTLA-4通过许多不同的机制调节外周的耐受性。首先，CTLA-4通过直接调节T细胞受体的信号传递(即TCR链磷酸化)(Lee等1998)和生化信号(即ERK活化)来调节T细胞的活化。其次，最近的研究已表明，CD4⁺CD25⁺免疫调节T细胞组成性地表达CTLA-4(Salomon等2000)。实际上，经由CTLA-4的信号传递对于这些细胞的功能是必需的(Takahashi等2000)。因此，CTLA-4可以调节所述细胞中的信号转导，并导致其分化成调节性T细胞；或者，CTLA-4与效应细胞结合可以改变信号转导以及随后的细胞因子生成。CTLA-4的交联诱导具有免疫调节作用的TGF-β细胞因子的分泌(Chen等1998)，这为CD4⁺CTLA-4⁺CD25⁺ 调节性T细胞提供了一种可能的作用机制。 

尽管所述发现似乎提示CTLA-4在改变免疫功能中具有多种功能性作用，然而，其中一个模型表明这些看似不同的活性都是相关的，并且CTLA-4的主要作用是通过改变TCR信号传递中的早期事件来改变T细胞活化的阈值。实际上，已证明用环孢菌素A(一种钙调磷酸酶(calcineurin)抑制剂，其调控钙动员)处理T细胞导致产生TGFβ的T细胞的生成，所述T细胞与CD4⁺CTLA-4⁺CD25⁺调节性T细胞相似(Prashar等1995)。 

因此，CTLA-4结合的作用无论是作用于抑制CD28信号传递、调节T细胞活化的邻近TCR信号还是调节下游效应途径，均导致T细胞分化的改变和免疫应答的下调。因此，通过青蓝霉素A调节T细胞表面上CTLA-4/CD28的表达有可能存在抑制病情加重的治疗前景。 

迄今，已知许多表达在抗原呈递细胞表面上的共刺激分子，然而B7-1和B7-2是最有效的并负责T细胞的活化。它们与T细胞表面上表达的CD28/CTLA-4受体的相互作用是非常关键的。CD28与其配体B7-1和B7-2结合向T细胞传递共刺激信号，增强T细胞增殖和细胞因子分泌并防止诱导T细胞的无变应性(Linsley等1991)。相对而言，CTLA-4结合同样这些配体导致上述应答的下调，这对于维持T细胞内环境平衡和自体耐受是必需的(Tivol等1995)。具有～25％序列一致性的B7-1和B7-2均为 I型跨膜糖蛋白(Stamper等2001)。已确定，CD28和CTLA-4与B7配体的相互作用对于免疫应答和耐受性的活化和抑制分别是关键性的(Greenwald等2005)。 

总而言之，B细胞和T细胞应答依赖于多个复杂的相互依赖的事件。由于B细胞和T细胞在免疫中的关键作用，对它们的调节是治疗和/或预防需要或受益于免疫力增强或降低的多种疾病的主要目标，所述疾病例如自身免疫病(包括I型糖尿病、多发性硬化、哮喘、关节炎、重症肌无力、红斑狼疮、银屑病、结肠炎)、或者对移植器官的排斥、或者免疫缺陷疾病以及癌症。因此，为了治疗和预防多种免疫学病症和疾病，非常需要能够调节复杂的B细胞和T细胞应答的药物。 

成功的器官移植需要对器官受体的免疫***进行有效的生理学和药理学干预。一种干预器官移植受体(尤其是同种异体移植的受体)中免疫应答的方法是应用免疫抑制药物。在涉及例如肾移植、肝移植、心脏移植、肺移植、骨髓移植和胰腺移植的情形中，这些药物用于延长受体中移植器官的存活。 

存在几种类型的用于减少移植中器官排斥的免疫抑制药物。这些药物属于三个主要的类别，即：抗增殖剂、抗炎化合物和淋巴细胞活化抑制剂。 

细胞毒剂或抗增殖剂类的实例为硫唑嘌呤、环磷酰胺和氨甲蝶呤。在患有慢性炎性疾病的患者中和器官移植受体中，抗增殖类药物通过限制细胞活化和增殖可作为有效的免疫抑制剂。这些药物破坏有丝***和细胞***，对具有高周转率的正常细胞群(如骨髓细胞和胃肠(GI)道内层细胞)具有严重的细胞毒性副作用。因此，这些药物常具有严重的副作用，特别是淋巴细胞减少、中性粒细胞减少、骨髓抑制、***、肝脏损伤、恶性肿瘤发生率增加、脱发、胃肠道紊乱和不育。 

用于移植中的另一类免疫抑制药物通过具有抗炎作用的化合物来提供。通常，已知这类药物的代表是肾上腺皮质类固醇，其具有不产生全身细胞毒性作用的优势。这些化合物通常通过以下方式起作用：防止或抑制炎性应答，细胞因子产生，趋化性，嗜中性粒细胞、巨噬细胞或淋巴细胞的活化，或其效应功能。肾上腺皮质类固醇的典型实例是强的松和强的松龙，其影响碳水化合物和蛋白质的代谢以及免疫功能。因为皮质类固醇具有明显较低的毒性，所以这类化合物有时与细胞毒性剂(如抗增殖类化合 物)组合应用。然而，肾上腺皮质类固醇缺乏作用的特异性，并可产生广泛的代谢、抗炎以及免疫作用。这类化合物的典型副作用包括器官受体的感染增加以及妨碍伤口痊愈，以及扰乱血液动态平衡、碳水化合物和骨代谢以及矿物质调节。 

用于器官移植的第三类免疫抑制药物是具有免疫调节作用并且一般性防止或抑制白细胞活化的化合物。这些化合物通常通过以下方式起作用：阻断活化T细胞的效应功能或增殖，或者抑制细胞因子产生，或者防止或抑制血小板、粒细胞、B细胞或巨噬细胞作用的活化、分化或效应功能。环孢菌素家族化合物是这类药物中最主要的实例。这些化合物是多肽真菌代谢物，已发现其在抑制辅助性T细胞中非常有效，从而降低对新接触抗原的细胞和体液两种应答。环孢菌素通过以下方式改变巨噬细胞和淋巴细胞的活性：减少细胞因子产生或分泌，特别地，通过干扰抗原特异性CD4细胞活化，防止IL-2分泌以及许多T细胞产物的分泌，以及干扰这些淋巴因子的受体在多种细胞类型上的表达。特别地，在器官移植中环孢菌素A已被广泛地用作免疫抑制剂。其它的微生物代谢物包括环孢菌素类(如环孢菌素B和环孢菌素G)以及称为FK-506的另一种微生物产物。环孢菌素A抑制体液免疫和细胞介导的反应。环孢菌素A用于肾、肝、心脏、胰腺、骨髓和心肺移植中的器官排斥。环孢菌素A还可用于治疗自身免疫和炎性疾病，包括类风湿性关节炎、克罗恩氏病、格雷夫斯病、严重的银屑病、再生障碍性贫血、多发性硬化、斑秃、天疱疮和类天疱疮、皮肌炎、多肌炎、白塞病、葡萄膜炎、肺结节病、胆汁性肝硬化、重症肌无力和特应性皮炎。 

环孢菌素具有几个重要的缺点。尽管环孢菌素在器官移植中已提供了重要的优势，然而环孢菌素为非特异性免疫抑制。可能会导致针对外源抗原的期望免疫反应有所降低。耐受剂量不能完全抑制排斥反应。因此，并不能完全阻止针对移植组织的免疫反应，需要同时使用强的松、甲基强的松龙和/或另一些免疫抑制剂包括单克隆抗体(如抗CD3或抗CD5/CD7)进行治疗。环孢菌素可在许多器官受体中产生严重的副作用，并表现出随宿主而变化的对肝、肾、中枢神经***和胃肠道的影响。在不良的副作用中重要的是对肾和肝的破坏、牙龈组织增生、顽固性高血压以及感染和恶性肿瘤发病率增加。 

因此，需要有效的并且具有选择性的免疫抑制药物，用于自身免疫病 以及器官移植中的治疗，尤其是用于并非完全匹配的供体-受体对之间的移植。为此，我们提议采取一种合理策略，应用从新放线菌物种中分离的青蓝霉素作为免疫抑制剂用于抑制免疫应答。从本文提供的详细说明，本发明的该目的和其它目的以及另外的发明特征将显而易见。本发明的发明人已确定体内使用所需的青蓝霉素A的最佳剂量为5.0mg/kg(体重)。体外实验中用于诱导增殖抑制的青蓝霉素A的剂量比已知免疫抑制剂环孢菌素A低10倍。 

发明目的 

因此，本发明的主要的目的是证明化合物青蓝霉素、其衍生物青蓝霉素A以及其它衍生物(包括其可药用的盐)诱导T淋巴细胞和B淋巴细胞的免疫抑制。 

本发明的另一目的是证明青蓝霉素A抑制混合淋巴细胞反应。 

本发明的另一目的是证明青蓝霉素A抑制幼稚CD4⁺T细胞、抗原特异性CD4⁺T细胞以及Th1和Th2细胞的增殖。 

本发明的另一目的是证明青蓝霉素A阻碍由T细胞所产生细胞因子的分泌。 

本发明的另一目的是证明青蓝霉素A阻碍B细胞产生抗体。 

本发明的另一目的是证明青蓝霉素A调节共刺激分子(如CD28和CTLA-4)在T细胞上的表达。 

本发明的又一目的是证明青蓝霉素A调节共刺激分子(如B7-1和B7-2以及MHC分子)在抗原呈递细胞上的表达。 

发明内容

本发明涉及用于生产和聚积化合物青蓝霉素A的发酵方法，其包括在受控的好氧发酵条件下、在约中性pH的水性营养培养基中、在约25℃至约30℃范围的温度培养细菌异壁放线菌属新物种斯比提异壁放线菌(Actinoalloteichus spitiensis sp.nov.)约24至约168小时(该菌登记号为MTCC 6194)，从而在培养液中存在可分离量的青蓝霉素A。 

通过以下步骤从培养液分离所述化合物青蓝霉素A：a)从该培养液分 离固体；b)用不混溶的提取溶剂提取滤出液；c)将该提取溶剂浓缩至干燥；d)用1∶1的饱和NaCl盐水和10％甲醇稀释残留物，并用不混溶的溶剂进行分配；e)通过用适当的溶剂进行分配，从醇水级分中分离活性物质；f)合并并浓缩含有粗制青蓝霉素A的回收溶剂相；以及g)通过层析技术从粗制浓缩物中纯化青蓝霉素A。 

本发明还提供青蓝霉素A作为有效的免疫抑制剂。该药物的免疫抑制特性尤其靶向T细胞和B细胞以及由这些细胞产生细胞因子。所述药物通过下调活化标记CD28的表达以及上调抑制标记CTLA-4的表达的机制起作用。 

青蓝霉素A首先分离自青蓝链霉菌(Streptomyces caeruleus)，并发现其具有强的抗真菌活性和中等的抗细菌活性(Funk和Divekar 1959)。还已经描述了青蓝霉素A的抗阿米巴特性和植物毒性(Chatterjee等和Chandran等)。这些特性的公开内容因此通过参考并入本文中。 

本发明提供通式1的联吡啶化合物及其衍生物、酯、醚和可药用盐作为免疫抑制剂的用途， 

式1 

其中，x＝-CH:NOR₁；-COOR₁；-CHO；-CH₂OR₂； 

Y＝H；OR₃； 

R₁＝H；C₁至C₁₆的直链或支链烷基； 

R₂＝H；C₁至C₁₆的直链或支链烷基；C₁至C₁₆的直链或支链酰基； 

R₃＝H；甲基；乙基；异丙基；异丁基。 

本发明还提供式2的青蓝霉素A((E)-4-甲氧基-2，2’-联吡啶-6-甲醛肟) 作为有效的免疫抑制剂的用途， 

式2 

本发明还提供一种从斯比提异壁放线菌[MTCC 6194]分离式2化合物的方法，该方法包括： 

[a]在受控的好氧发酵条件下、在中性pH的水性营养培养基中、在温度25～30℃下振荡培养斯比提异壁放线菌菌株[MTCC 6194]30～100小时； 

[b]将步骤[a]获得的细胞沉降以得到无细胞的上清液； 

[c]利用已知方法从步骤[b]获得的上清液中提取式2的化合物，随后对其进行纯化； 

[d]任选地，使用NMR、红外和质谱数据表征所述纯化级分。 

在本发明的一个实施方案中，所述化合物是式2的(E)-4-甲氧基-2，2’-联吡啶-6-甲醛肟(青蓝霉素A)： 

式2 

在本发明的另一实施方案中，所述化合物是式3的(E)-4-甲氧基-2，2’-联吡啶-6-甲醛O-甲基肟： 

式3 

在本发明的又一实施方案中，以1.25～5.0mg/kg体重的剂量使用所述化合物。 

在本发明的一个实施方案中，所述化合物在抑制免疫应答方面是已知免疫抑制剂环孢菌素A有效性的10倍。 

在本发明的一个实施方案中，每毫升含有约0.1μg所述化合物的稀释液在48小时内抑制大约90％～97％的免疫细胞。 

在本发明的一个实施方案中，所述化合物抑制T细胞、B细胞、混合淋巴细胞反应、幼稚CD4⁺T细胞、抗原特异性效应CD4⁺T细胞、Th1细胞和Th2细胞的体外增殖。 

在本发明的一个实施方案中，所述化合物抑制细胞因子如干扰素-γ(IFN-γ)和白介素-4(IL-4)的体外分泌。 

在本发明的一个实施方案中，所述化合物下调T细胞上活化标记CD28的表达并上调T细胞上抑制标记CTLA-4的表达。 

在本发明的一个实施方案中，所述化合物增加巨噬细胞上B7-1的表达并降低巨噬细胞上B7-2和MHC分子的表达。 

在本发明的一个实施方案中，所述化合物诱导抑制α-βT细胞和γ-δT细胞，CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞，Th1和Th2细胞，幼稚、效应、记忆和调节性T细胞。 

在本发明的一个实施方案中，所述化合物诱导抑制B细胞、肥大细胞、内皮细胞、NK细胞、树突细胞(髓系树突细胞、浆细胞样树突细胞、淋巴样树突细胞、间质性树突细胞(dendritic cell，DC))、单核细胞、巨噬 细胞(脾巨噬细胞、腹膜巨噬细胞、肺泡巨噬细胞、库普弗细胞(Kuffer’scells)、朗罕氏细胞、破骨细胞、胶质细胞以及所有类型的巨噬细胞)、上皮细胞、成骨细胞、嗜酸性细胞、嗜碱性细胞、粒细胞、血小板和巨核细胞。 

在本发明的一个实施方案中，所述化合物可用于治疗自身免疫病如艾迪生病(Addison’s disease)、自身免疫性溶血性贫血、古德帕斯丘综合征(Goodpature’s syndrome)、格雷夫斯病、桥本甲状腺炎、特发性血小板减少性紫癜、胰岛素依赖型糖尿病、重症肌无力、恶性贫血、自发性不育、多发性硬化、类风湿性关节炎、***性红斑狼疮、自发性流产。 

在本发明的一个实施方案中，所述化合物诱导免疫抑制和防止移植排斥、移植物抗宿主反应并且有助于移植。 

在本发明的一个实施方案中，所述化合物可用于治疗神经性疾病如癫痫、中风、脑缺血、脑瘫、阿尔珀斯病、帕金森病、阿尔茨海默病、亨廷顿病、肌萎缩性侧索硬化、多发性硬化、卢伊体痴呆、Rhett综合征、神经痛、脊髓创伤或创伤性脑损伤等。 

在本发明的一个实施方案中，所述化合物分离自新的放线菌物种斯比提异壁放线菌(Actinoalloteichus spitiensis)[MTCC 6194]，该菌分离自印度喜马拉雅山脉的寒漠。 

在本发明的一个实施方案中，提供了用于从斯比提异壁放线菌[MTCC6194]分离式2的化合物的方法，该方法包括： 

[a]在受控的好氧发酵条件下、在pH为7.0-8.5的水性营养培养基中、在25～30℃的温度下振荡培养斯比提异壁放线菌[MTCC 6194]菌株30～100小时； 

[b]将步骤[a]获得的细胞沉降以得到无细胞的上清液； 

[c]利用已知方法从步骤[b]获得的上清液中提取式2的化合物，随后对其进行纯化； 

[d]任选地，使用NMR、红外和质谱数据表征所述纯化组分。 

在本发明的一个实施方案中，所述细胞优选培养40-70小时。 

在本发明的一个实施方案中，所述细胞优选在28-30℃的温度下培养。 

在本发明的一个实施方案中，所述细胞优选在pH 7-8.5培养。 

在本发明的一个实施方案中，所述式2化合物的回收率约为150mg/l培养液。 

在本发明的一个实施方案中，所获得的活性级分可用作免疫抑制剂。 

在本发明的一个实施方案中，提供一种用于治疗自身免疫病的方法，其包括向患者施用每千克体重1.25至5.0mg的通式1化合物。 

在本发明的一个实施方案中，所述化合物以每天单个剂型施用3天。 

在本发明的一个实施方案中，提供用于免疫抑制的免疫抑制性药物组合物，其包含1.25～5.0mg的通式1化合物以及可药用的稀释剂、添加剂和/或载体。 

发明详述 

对放线菌和真菌产物的***性研究已导致开发出了免疫抑制药物如环孢菌素A(CsA)、FK506(他克莫司)和雷帕霉素(西罗莫司)。这些药物不仅发挥强有力的抗真菌作用，并且还用作潜在的免疫抑制剂。考虑到这一点，通过分离来自印度喜马偕尔邦(Himachal Pradesh.)的Kaza和Spiti的喜马拉雅寒区的土壤和水样中的多种微生物，我们开始筛选具有抗真菌活性的生物活性化合物的研究。分离自印度喜马拉雅山脉寒漠的RMV-1378^T菌株的多方面表征清楚地表明该菌株属于异壁放线菌属(Actinoalloteichus)。生理学和生化检验可以在基因型和表型方面区分RMV-1378^T菌株与其最接近的进化近亲物种。对16S rDNA序列的分析表明该分离物与蓝灰异壁放线菌(Actinoalloteichus cyanogriseus)非常相关，其相似性为99％。然而，DNA-DNA杂交的结果显示与蓝灰异壁放线菌具有低的基因组相关性(51％)。因此，我们建议将该分离物归类为异壁放线菌属的新物种，并建议将其命名为斯比提异壁放线菌(Actinoalloteichusspitiensis sp.nov)。RMV-1378^T菌株已保藏在印度微生物典型培养物保藏中心与基因库(Microbial Type Culture Collection and Gene Bank，MTCC)，其登记号为MTCC 6194^T，并且模式菌株RMV-1378^T也已保藏在日本微生物保藏中心(Japan Collection of Micro-organisms，JCM)，其登记号为JCM 12472^T；以及德国微生物和细胞培养物保藏中心(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures，DSMZ)，其登记号为DSM 44848^T。基于核磁共振(NMR)、红外(IR)和质谱数据表征了从RMV-1378菌株分离的活性成分。所鉴定的化合物为(E)-4-甲氧基-2，2’-联吡啶-6-甲醛肟。该数据与已报道的青蓝霉素A的数据很好地对应(Divekar等1967)。 

以下是分离菌株斯比提异壁放线菌的主要特征： 

a)放线菌菌株RMV-1378^T，形成分支的、非分段的营养菌丝，并且不产生可扩散的色素。未观察到气生菌丝体和孢子的形成。 

b)DNA的G+C含量为72.0mol％。 

c)该菌株具有异壁放线菌属的典型的化学分类学特征，并且与蓝灰异壁放线菌非常相关(99.3％的16S rRNA基因序列相似性)，所述蓝灰异壁放线菌是目前仅有的具有正式公布名称的异壁放线菌属物种。然而，DNA-DNA杂交实验的结果显示与蓝灰异壁放线菌(A.cyanogriseus)模式菌株具有51.9％的相关性。 

d)基于上述数据以及RMV-1378^T(＝MTCC 6194^T＝JCM 12472^T＝DSM44848^T)的生理学和生物化学特性，该菌株被归类为异壁放线菌属新种的模式菌株，并被命名为斯比提异壁放线菌(Actinoalloteichusspitiensis sp.nov)。 

所述印度微生物典型培养物保藏中心与基因库(MTCC)是一所国立机构，其建于1986年，并由印度政府的生物技术部(DBT)以及科学和工业研究委员会(CSIR)共同发起。这是一家配备良好的现代化机构，位于昌迪加尔的微生物技术研究所(IMTECH)中。MTCC是世界培养物保藏中心联合会(World Federation of Culture Collection，WFCC)的隶属成员，并在世界微生物信息中心(World Data Centre for Microorganisms，WDCM)登记(登记号No.773)。该国立机构的主要目的是作为保藏库，向在研究机构、大学和产业中工作的科学家提供可靠的微生物培养物以及相关服务。在2002年10月4日，MTCC被世界知识产权组织(WIPO)(日内瓦)认定为印度的国际保藏机构(International DepositaryAuthority，IDA)，可根据《布达佩斯条约》进行微生物保藏。 

生产微生物的发酵 

在本发明中通过受控的微生物发酵生产青蓝霉素A。所述微生物优选培养在需氧和嗜中温条件下、pH范围约6.0～8.0的水性营养培养基中，温度优选25℃～35℃。发酵时间通常介于24～168小时，优选24～96小时。可在30℃以及pH 7.0～8.5获得令人满意的生产。所使用的营养培养基应优选由任意适当的氮源(如蛋白质水解产物，或蛋白质和/或分离的氨基酸，或任何铵和/或硝酸盐来源)和碳源(任何可同化的碳水化合物和/或脂肪)组成，并且还可含有盐(如氯化钠、碳酸钠、碳酸氢钠、氯化钾、氯化镁、碳酸钙等)。 

以28℃的孵育温度，使用含有葡萄糖5.4g、酵母提取物4.8g、麦芽提取物8.5g、CaCO₃ 3.0g、蒸馏水1000ml以及pH 7.2的培养基，得到令人满意的青蓝霉素A生产。 

应当理解，上述培养基仅仅是适于通过Actinoalloteichus spitiensis sp.nov菌株生产青蓝霉素A的培养基的一个实例。相信许多营养培养基可以替代本文公开的培养基，并可以由此实现令人满意的生长和生产。 

所有的培养和发酵必须在无菌的培养基和条件中进行。为开始发酵，必须使用在针对发酵所述相似的培养基中培养的接种物进行接种。所需接种物的百分比通常介于1％～10％；通常优选10％。 

从培养液中分离和纯化青蓝霉素 

通常联合使用提取和层析技术对发酵生产的青蓝霉素A进行分离和纯化。一种优选的步骤顺序如下： 

用不混溶的溶剂(如乙酸乙酯)提取滤出培养液。合并这些提取物并真空浓缩至干燥。用NaCl 10％/甲醇(1∶1)稀释残留提取物，并用能除去脂质的不混溶溶剂(如己烷)进行分配。用适当的溶剂如乙酸乙酯通过分配从醇水级分中分离活性物质。所回收的溶剂相构成粗制的青蓝霉素A。 

可使用层析技术(包括例如柱层析(CC)、高效快速层析、制备型中压液相层析(MPLC)和薄层层析(TLC))的适当组合从所述粗提物进一步分离和纯化青蓝霉素A。可以通过免疫抑制活性来指导分级分离。 

基于对其多种光谱特性的详尽分析，鉴定所述纯化合物为青蓝霉素A(参见分别表示于图1、2、3和4中的¹H NMR、¹³C NMR和质谱)。 

在本发明的一个实施方案中，青蓝霉素A抑制丝裂原刺激的T淋巴细胞和B淋巴细胞的活性。所述淋巴细胞用T细胞丝裂原伴刀豆球蛋白A(Con A)和B细胞丝裂原脂多糖(LPS)以及不同剂量的青蓝霉素A(0.0003-0.1μg/ml)进行刺激。与单独用丝裂原培养的细胞相比，青蓝霉素A使丝裂原诱导的增殖显著降低。 

在本发明的另一实施方案中，青蓝霉素A还表现出在体外抑制MLR反应、幼稚CD4⁺T细胞、抗原特异性CD4⁺T细胞以及Th1和Th2细胞。将青蓝霉素A的活性与公知的免疫抑制药物环孢菌素A(CsA)进行比较。可以看出在MLR中两种药物具有剂量依赖性抑制作用。令人感兴趣的是，使用比CsA低10倍的剂量，青蓝霉素A可以有效抑制相似量的增殖。 

在本发明的又一实施方案中，青蓝霉素A还在体内抑制抗原特异性T细胞的增殖。用弗氏完全佐剂将抗原(卵清蛋白：100μg/ml)乳化并通过腹膜内注射给不同组(每组5只小鼠)。将不同组的用卵清蛋白引发的动物每天注射不同剂量的青蓝霉素A(25、50、75、100μg/100μl/小鼠)。7天后处死小鼠，分别将每组的脾细胞合并，并监测体外增殖。 

在本发明的又一实施方案中，青蓝霉素A显著抑制IL-4和IFN-γ的分泌。 

本发明的另一实施方案中，青蓝霉素A通过下调CD28和上调CTLA-4表达来诱导免疫抑制。已确定CTLA-4传递免疫抑制信号。相反地，CD28向T细胞传递活化信号。已观察到，青蓝霉素A不仅显著增强CD4阳性T细胞中CTLA-4的表达和百分比，并且显著降低CD4阳性T细胞中CD28的表达和百分比。在非CD4⁺T细胞情形中也观察到类似的结果。 

本发明的另一实施方案中，青蓝霉素A抑制IgG1和IgG2a型抗体的分泌。 

在本发明的又一实施方案中，青蓝霉素A上调巨噬细胞上B7-1的表达而下调巨噬细胞上B7-2的表达。许多共刺激分子在APC表面上表达，而B7-1和B7-2是作用最强的。它们与在T细胞表面上表达的CD28/CTLA-4受体的相互作用对于T细胞活性的适当调节是关键的。为此，我们监测它们的配体B7-1和B7-2的表达。B7-1与CTLA-4和CD28的结合比B7-2更强。然而，当直接比较相对的相互作用时，B7-1与CTLA-4的结合超过与CD28结合的20倍，而B7-2与CTLA-4结合仅超过CD28 约8倍。鉴于上述发现，青蓝霉素A作为免疫抑制剂的强效作用可通过增强T细胞上CTLA-4的表达以及APC上B7-1的表达的机制观察到。 

以下的实施例作为本发明的举例说明给出，因此不应理解为其限制本发明的范围。 

实施例1：青蓝霉素A诱导淋巴细胞的免疫抑制 

青蓝霉素A诱导混合淋巴细胞反应(MLR)的免疫抑制 

所述MLR在96孔组织培养板中进行，每孔包含在200μlRPMI/FCS-10％培养基中的4×10⁵BALB/c脾细胞(反应细胞)和4×10⁵经γ-照射(3000R)的C57BL/6J脾细胞(刺激细胞)，其中还有不同浓度的青蓝霉素A(1-0.0125μg/ml)和环孢菌素A(0.0125-10μg/ml)。单独处于培养基中的BALB/c脾细胞、经γ-照射的C57BL/6J脾细胞以及BALB/c脾细胞+经γ-照射的C57BL/6J脾细胞构成对照培养物，它们也包括在内。4天后，用1μCi的[³H]-胸苷对所述培养物进行脉冲处理，并在16h后利用Skatron细胞收集器进行收集。通过液体闪烁计数测量放射性掺入，并将数据表示为平均每分钟计数(cpm)。 

青蓝霉素A显著地降低MLR反应。在抑制MLR反应方面青蓝霉素A比环孢菌素A强10倍。在仅含有细胞的对照培养物、与青蓝霉素A一起培养的细胞(不存在ConA或LPS或抗CD3Ab或APC)中未观察到显著水平的[³H]-胸苷掺入。在所有的测定中，青蓝霉素A以剂量依赖性方式起作用。 

青蓝霉素A诱导用T细胞和B细胞丝裂原刺激的淋巴细胞的免疫抑制 

将BALB/c小鼠的脾细胞(5×10⁴个细胞/孔)培养在200μlRPMI/FCS-10％培养基中，并用不同浓度的ConA(1μ/ml和2μg/ml)或者LPS(5μg/ml和10μg/ml)以及青蓝霉素A(0.0003-0.1μg/ml)进行刺激。与单独培养基、ConA和DMSO一起培养的脾细胞构成对照培养物。48h后，用0.5μCi的[³H]-胸苷对所述培养物进行脉冲处理，并在14h后利用自动细胞收集器(Skatron，Tranby，Norway)进行收集。通过液体闪烁计数测量放射性掺入，并将数据表示为平均每分钟计数(cpm)。 

与单独与ConA一起培养的细胞比较，青蓝霉素A导致ConA(1.0和2.0μg/ml)刺激细胞增殖的显著降低。我们还用LPS(5和10μg/ml)刺 激了脾细胞。令人感兴趣地，青蓝霉素A还可抑制用LPS(5和10μg/ml)刺激的细胞增殖。我们观察到青蓝霉素A的剂量(0.05和0.1μg/ml)强烈地诱导增殖抑制。 

青蓝霉素A诱导从用抗原引发的动物获得的CD4⁺T细胞的免疫抑制 

从用OVA-CFA引发的小鼠获得小鼠脾细胞的单细胞悬液。通过用溶血的Gey’s溶液处理去除红细胞。通过在37℃以及7％CO₂条件下接种于塑料培养皿上2h来除去贴壁细胞。将非贴壁细胞(1×10⁶个细胞/ml)加至尼龙棉柱上并在37℃培养90分钟。孵育后，将温的RPMI流过柱以洗脱T淋巴细胞。用RPMI漂洗所述T细胞，并与抗Mac3(TIB-168)、抗IA^d(MKD6)、抗树突细胞(TIB-227)、抗IgM和抗CD8抗体在4℃一起培养45分钟。用RPMI漂洗细胞，并与仔兔补体一起在37℃培养30分钟。用RPMI将该细胞漂洗三次，并用于增殖测定。利用流式细胞术检测用抗CD3和抗CD4抗体染色的细胞，从而分析细胞的纯度。 

从注射OVA-FCA的小鼠纯化CD4⁺T细胞，并用抗原脉冲处理的和γ-照射的脾细胞进行刺激。与抗原刺激的CD4⁺T细胞相比，在培养物中加入青蓝霉素A显著地抑制增殖。 

青蓝霉素A诱导Th2细胞的免疫抑制。 

用抗原脉冲处理脾细胞进行刺激后，使用第7-9天收获的细胞测量Th2克隆的增殖。利用ficoll-histopaque除去死细胞。用抗CD3抗体(0.1μg/ml和0.5μg/ml)刺激Th2克隆(5×10⁴个细胞/孔)，或者在具有不同浓度青蓝霉素A(0.00625-0.1μg/ml)的200μl RPMI/FCS-10％培养基中与γ-照射(3000R)的同源脾细胞(5×10⁵个细胞/孔)和伴清蛋白(100μg/ml)一起培养Th2克隆(5×10⁴个细胞/孔)。单独与伴清蛋白以及与γ-照射的同源脾细胞(无抗原)一起培养的Th2细胞构成对照培养物。将所述培养物培养在平底96孔微量滴定板中，并且在37℃和7％CO₂条件下培养细胞。48h后，用0.5μCi的[³H]-胸苷对所述培养物进行脉冲处理，并在16h后进行收集。通过液体闪烁计数测量放射性掺入，并将数据表示为平均每分钟计数(cpm)。 

将青蓝霉素A加入Th2细胞培养物，该Th2细胞已用抗CD3抗体或者经伴清蛋白脉冲处理和γ-照射的脾细胞刺激。在丝裂原刺激的淋巴细胞和抗原特异性T细胞的情形中观察到，青蓝霉素A还显著地限制Th2克 隆在两种刺激条件下的增殖。 

青蓝霉素A诱导Th1细胞的免疫抑制 

Th1细胞(1×10⁴个细胞/孔)用抗CD3抗体(10μg/ml)和不同剂量的青蓝霉素A刺激。24h后，加入[³H]-胸苷，8h后测量其掺入。 

青蓝霉素A还抑制Th1细胞的增殖(3DO.54.8)。无论是否用抗CD3抗体刺激Th1细胞，均观察到该特性。 

青蓝霉素A抑制IL-4和IFN-γ的产生 

将OVA(2mg/ml)溶于PBS(0.01M，pH 7.2)中，并用弗氏完全佐剂(FCA)将其乳化。然后，将乳液(100μl)腹膜内注射至由5只BALB/c小鼠组成的组中。单用PBS注射对照组。7天后，处死小鼠，并合并脾细胞用于增殖和细胞因子检测。脾细胞(5×10⁵个细胞/孔)与200μlRPMI/FCS-10％培养基中的OVA(200μg/ml)以及与不同浓度的青蓝霉素A(0.0003-0.1μg/ml)一起培养。与不同浓度的青蓝霉素A(无OVA)、OVA以及培养基一起培养的脾细胞构成对照培养物。48h后收集该培养物上清液，并且通过ELISA测量细胞因子。 

观察到青蓝霉素A(0.05-0.1μg/ml)显著抑制OVA特异性T细胞分泌IFN-γ。青蓝霉素A未诱导IL-10生成的任何变化。还令人感兴趣地观察到，青蓝霉素A抑制D10G4.1 Th2克隆释放IL-4，其中所述Th2克隆分别用抗CD3抗体(0.1和0.5μg/ml)或伴清蛋白脉冲处理的APC进行刺激。 

青蓝霉素A抑制抗原特异性T细胞的体内增殖 

将OVA(2mg/ml)溶于PBS(0.01M，pH 7.2)中，并用弗氏完全佐剂(FCA)将其乳化。然后，将乳液(100μl)腹膜内(i.p.)注射至每组5只BALB/c小鼠的七组中。每天用青蓝霉素A(25、50、75、100μg/100μl/小鼠)腹膜内注射四组动物。分别用100μl PBS和乙醇-PBS腹膜内免疫对照组。7天后，处死小鼠，分离并合并脾细胞用于体外增殖。 

从被注射的用抗原引发的动物分离细胞。与未施用药物的动物相比，青蓝霉素A表现出显著的增殖抑制。 

实施例2：青蓝霉素A对Th2克隆增殖之作用的动力学 

用抗CD3抗体(0.5μg/ml)刺激Th2克隆(5×l0⁴/孔)。在培养开始时(时间为0)或在不同时间点(4h-48h)加入青蓝霉素A(0.05μg/ml)。培养48h后，加入[³H]-胸苷，并在12h后测量其掺入。 

如果在培养开始16h前加入，则青蓝霉素A显示出对Th2细胞的最大抑制作用(77-90％)。甚至当42h后加入时，青蓝霉素A依然保持对培养物的抑制作用(56％)。然而，与16h前加入该药物相比，反应较弱。因此，表明青蓝霉素A不仅对活化事件具有抑制作用，而且对细胞***的较晚期阶段也具有抑制作用。 

实施例3：青蓝霉素A对钙依赖(PMA+离子霉素)途径的作用 

将细胞以5×10⁴个细胞/孔接种在平底96孔平板中。在培养开始时施加所述不同刺激物和青蓝霉素A。48h后，加入[³H]-胸苷(1μCi/孔)，并在12h后测量其掺入。观察到青蓝霉素A显著地抑制钙依赖途径的增殖。 

实施例4：青蓝霉素A诱导CTLA-4表达的上调和CD28表达的下调。 

通过流式细胞分析，检测静息的以及ConA活化的CD4⁺T细胞表面上CD28和CTLA-4的表达。简言之，用OVA(200μg/ml)或ConA(1μg/ml和2μg/ml)活化脾细胞(3×10⁶个细胞/孔)，并在不同浓度的青蓝霉素A(0.0125-0.45μg/ml)存在下进行培养。在24h、48h、72h和96h后收集所述培养物，并将细胞针对CD4、CD28和CTLA-4的表达进行染色。另外，还进行如下的培养：在培养开始24h和48h后加入青蓝霉素A，并在进一步培养24h后对细胞染色。收集细胞并使用PE(藻红蛋白)偶联的抗CD4抗体、FITC(荧光素异硫氰酸酯)偶联的抗CTLA-4以及Cy(Cy-chrome)偶联的CD28抗体进行三色染色。利用FACScan(Becton Dickinson，Mountain View，CA)的CELLQUEST软件获得来自每个悬液的所述细胞。分析中将细胞悬液中的碎片除去，其通过适当的门控设置从而仅收集来自大小与淋巴细胞一致的光散射事件(即细胞)的数据。利用直方图对平均荧光强度(MFI)进行分析，所述直方图中的横坐标和纵坐标分别表示荧光对数和相对细胞数。 

因为我们观察到青蓝霉素A介导免疫抑制，所以研究其作用机制就变得相当有必要。已经非常明确的是，CTLA-4向T细胞传递免疫抑制信号， CD28传递增殖的刺激信号。我们很好奇，于是监测了CD4⁺T细胞上CTLA-4和CD28的表达。令人感兴趣的是，观察到青蓝霉素A不仅显著增强CTLA-4阳性细胞的表达，并且还增加CTLA-4阳性细胞的百分比。相反地，它降低了CD28的表达和百分比。在非CD4⁺T细胞中也观察到了相似的结果。因此表明，青蓝霉素A通过增强CTLA-4的表达以及抑制CD28的表达从而抑制CD4⁺T细胞的增殖和细胞因子分泌。此外，未观察到青蓝霉素A对LFA-1阳性细胞的表达或百分比有任何显著变化。 

实施例5：小鼠胸腺细胞上CD69的表达 

检测青蓝霉素A存在时胸腺细胞表面上CD69的表达。从3-4周大的BALB/c小鼠获得胸腺细胞。在37℃，在青蓝霉素A存在和不存在时用1μg/ml和5μg/ml的ConA刺激胸腺细胞(4×10⁶个细胞/孔)24h。所述细胞用PE标记的抗小鼠CD69抗体进行染色。利用对CD28/CTLA-4所述的FACScan获得染色细胞。 

已知CD69是T细胞和胸腺细胞上的活化标记。令人感兴趣地，在加入青蓝霉素A后，胸腺细胞上CD69的表达没有变化。 

实施例6：青蓝霉素A调节巨噬细胞上共刺激分子B7-1、B7-2和CD40的表达 

检测腹膜巨噬细胞表面上B7-1和B7-2的表达，所述腹膜巨噬细胞与不同浓度的青蓝霉素A(0.05-0.1μg/ml)一起培养。从预先用2-3ml巯基乙酸接种4天的BALB/c小鼠收集腹膜巨噬细胞。用BSS漂洗所述细胞。通过于37℃在塑料培养皿上黏附1h，之后用冷BSS漂洗几次，从而获得所述巨噬细胞。在37℃和7％CO₂的条件下，在存在和不存在青蓝霉素A(0.05-0.1μg/ml)时，用10μg/ml的LPS刺激所述巨噬细胞(1×10⁶)24、48和72h。然后，收获所述细胞并用它们各自的抗体进行染色。简言之，将所述细胞离心(1200×g，4℃，5分钟)并吸走上清液。细胞用含有1％BSA、0.1％叠氮化钠的PBS漂洗3次。在第一步中，在4℃用生物素化抗小鼠B7-1、CD40和I-A^d(1μg/100μl)抗体孵育所述细胞(1×10⁶)45分钟。在下一步中，用链亲合素FITC(0.5μg/100μl)或偶联PE的抗小鼠B7-2(0.5μg/100μl)抗体对细胞进行染色，并孵育45分钟。在每步后进行常规漂洗步骤。最后，将细胞漂洗5次并用多聚甲醛进行固定。利用CD28/CTLA-4情形中提及的FACScan获得染色细胞。因为抗原呈递细胞 表达B7-1和B7-2，后两者是CTLA-4和CD28的配体。令人感兴趣地，青蓝霉素A增强B7-1的表达并降低B7-2分子的表达。相反地，在J774上，它增加了B7-2的表达，但是B7-1的表达未观察到显著变化。我们还评估了青蓝霉素A对另一种共刺激分子CD40表达的影响。在72h后，观察到CD40表达的略微增加。 

实施例7：青蓝霉素A下调巨噬细胞上IA^d的表达 

检测与不同浓度的青蓝霉素A(0.05-0.1μg/ml)一起培养的腹膜巨噬细胞表面上IA^d的表达。从预先用2-3ml巯基乙酸接种4天的BALB/c小鼠收获腹膜巨噬细胞。用BSS漂洗所述细胞。通过于37℃在塑料培养皿上黏附1h以及随后在冷BSS中漂洗几次而获得巨噬细胞。在37℃及7％CO₂条件下，在青蓝霉素A(0.05-0.1μg/ml)存在和不存在时，用10μg/mlLPS刺激该巨噬细胞(1×10⁶)24、48和72h。然后，收获细胞并用它们各自的抗体进行染色。 

简言之，将所述细胞进行离心(1200×g，4℃，5分钟)并吸走上清液。用含有1％BSA、0.1％叠氮化钠的PBS漂洗该细胞3次。第一步中，在4℃用生物素化抗小鼠I-A^d(1μg/100μl)抗体孵育所述细胞(1×10⁶)45分钟。在下一步中，用链亲合素FITC(0.5μg/100μl)对细胞进行染色，并孵育45分钟。在每步后进行常规漂洗步骤。最后，将细胞漂洗5次并用多聚甲醛进行固定。利用CD28/CTLA-4情形中提及的FACScan获得染色细胞。在此令人感兴趣地是，青蓝霉素A下调了IA^d的表达。这可表明青蓝霉素A可抑制APC对抗原的加工和呈递。 

实施例8：体内增殖的免疫方法 

将卵清蛋白(3mg/ml)溶于PBS(pH 7.2)中并使其在弗氏完全佐剂(FCA)中进行乳化。然后，将乳液(100μl)腹膜内(i.p.)注射至不同的组中，其中每组包括5只BALB/c小鼠。每天用青蓝霉素A(25、50、75、100μg/100μl/小鼠)腹膜内注射四组动物。用乙醇-PBS腹膜内免疫对照组。 

实施例9：OVA诱导的淋巴细胞增生和细胞因子评价 

7天后，处死小鼠，并合并脾细胞用于增殖测定。脾细胞(2×10⁵个细胞/孔)与200μl RPMI/FCS-10％培养基中的OVA(100μg/ml)以及多 种浓度的青蓝霉素A(0.1-0.0003μg/ml)一起培养。与不同浓度的青蓝霉素A(无OVA)、OVA以及培养基一起培养的脾细胞构成对照培养物。72h后，用1μCi[³H]-胸苷对所述培养物进行脉冲处理，并在14h后收获。通过液体闪烁计数测量放射性掺入，数据表示为平均每分钟计数(cpm)。 

实施例10：青蓝霉素A抑制抗原特异性T细胞的体内增殖。 

向小鼠施用不同剂量的青蓝霉素A持续7天(图1.1)。处死所述动物，并将脾细胞与抗原和不同浓度的青蓝霉素A(0.00625-0.10μg/ml)一起体外培养。令人感兴趣地，与未施用药物的动物相比，从使用所有4种浓度(25-100μg/小鼠/天)青蓝霉素A注射的动物所分离的细胞表现出对增殖的显著抑制(图1.1)。以剂量依赖的方式观察到增殖降低。当使用0.10μg/ml青蓝霉素A培养细胞时，观察到几乎完全的抑制。在另一组实验中，从用抗原引发并随后施用PBS-乙醇或青蓝霉素A(25μg/小鼠/天)7天的动物分离细胞(图1.2)。与从使用PBS-乙醇免疫的动物分离的细胞相比，从使用青蓝霉素A注射的小鼠所分离的细胞表现出显著水平的生长阻滞(图1.2)。 

附图.CaeA抑制OVA特异性T细胞的体内增殖。用OVA免疫不同的组(每组包括5只动物)，随后每天施用CaeA持续7天，之后处死小鼠。分离脾细胞(2×10⁵个细胞/孔)并与100μg/ml OVA和不同剂量的CaeA一起体外培养。72h后，加入[³H]-胸苷，16h后测量其掺入。由单独培养在培养基中的细胞组成的对照培养物显示3789±359cpm，细胞+OVA显示16387±431cpm，而从使用PBS-乙醇免疫的动物获得的并且与OVA一起体外培养的细胞显示13801±587cpm(1.1)。在另一组实验中，用OVA免疫不同的三组动物，随后在其中一组中每天施用CaeA(25μg/小鼠)，另一组每天施用乙醇(载体对照)，均施用7天，之后处死小鼠。分离脾细胞(2×10⁵个细胞/孔)，并将该脾细胞在体外单独培养或与OVA(100和200μg/ml)一起培养(1.2)。每个点代表***性实验之一的三次测定的平均值±SEM。 

实施例11 

通过发酵制备青蓝霉素A 

A.制备接种物

准备装有5ml培养基的种子培养物接种试管，所述培养基具有以下组成：每升蒸馏水中含有葡萄糖5.4g、酵母提取物4.8g、麦芽提取物8.5g、CaCO₃ 3.0g。调整pH至7.2，将培养基灭菌并在冷却后加入冷冻的斯比提异壁放线菌培养物。在28℃，以200rpm轨道振荡培养细菌30小时。将7.5ml上述培养物无菌接种至装有100ml无菌培养基的1000ml容积振荡烧瓶中，该培养基为每升蒸馏水中含有葡萄糖5.4g、酵母提取物4.8g、麦芽提取物8.5g、CaCO₃ 3.0g。用碱溶液调整pH至7.0。在28℃以200rpm轨道振荡培养该细菌30小时。 

B.发酵

将装有5升生产培养基的7升容积发酵罐在122℃灭菌30分钟，该培养基如下所述：每升蒸馏水中含有葡萄糖5.4g、酵母提取物4.8、麦芽提取物8.5g、CaCO₃ 3.0g。用500ml的第二阶段接种物接种发酵罐。在28℃，在1v/v/m通气条件下，以220rpm振荡孵育所述发酵培养物。 

C.分离

培养完成后，通过离心除去固体。用2.5升乙酸乙酯提取上清液部分(4.8升)两次。用硫酸钠干燥该合并的有机相，过滤并真空浓缩至干燥。通过用50ml己烷分配两次将该粗制残留物脱脂，并用80ml水∶甲醇(1∶1)将其溶解。用50ml乙酸乙酯两次萃取水/醇级分。利用蒸发器浓缩该有机溶剂，得到含有青蓝霉素A的粗制残留物。 

实施例12 

从粗提物分离青蓝霉素A 

用5ml丙酮溶解所述粗制残留物，并使用甲苯/丙酮75∶25混合物作为洗脱剂通过高效快速层析***(Horizon HPFC system，Biotage，USA)在硅胶(32-63μM)上进行层析。基于使用氯仿-甲醇-20％氨水(95∶4∶1)作为流动相的TLC分析，合并相似的组分。 

实施例13：青蓝霉素A[分离自异壁放线菌属新物种]在诱导免疫抑制中的作用基于以下实验： 

·用ConA(1μg/ml和2μg/ml)或LPS(5μg/ml和10μg/ml)刺激BALB/c小鼠的脾细胞，并与不同浓度的青蓝霉素A(0.0003-0.1μg/ml)一 起培养。48h后，用0.5μCi的[³H]-胸苷对该培养物进行脉冲处理，并在14h后利用自动细胞收集器收获。通过液体闪烁计数测量放射性掺入。 

·将用弗氏完全佐剂乳化的抗原卵清蛋白(100μg/ml)注射至由5只BALB/c小鼠组成的组中。单用PBS注射对照组。7天后，处死小鼠并合并脾细胞用于增殖和细胞因子测定。在200μl RPMI/FCS-10％培养基中脾细胞与卵清蛋白(200μg/ml)以及不同浓度的青蓝霉素A(0.0003-0.1μg/ml)一起培养。72h后，用1μCi[³H]-胸苷对培养物进行脉冲处理并在14h后收获。通过液体闪烁计数测量放射性掺入。48h后收集培养物上清液，并利用ELISA测量细胞因子。 

·在幼稚CD4⁺T细胞、抗原反应性CD4⁺T细胞、Th2克隆和Th1杂交瘤上监测不同剂量的青蓝霉素A的免疫抑制作用。将细胞与γ-照射(3000Rads)和抗原脉冲处理的脾细胞以及不同浓度的青蓝霉素A(0.00625-0.1μg/ml)一起进行孵育。培养物在37℃和7％CO₂条件下培养。72h后，用0.5μCi[³H]-胸苷对培养物进行脉冲处理并在14h后收获。通过液体闪烁计数测量放射性掺入。 

·青蓝霉素A对MLR反应的免疫抑制作用。使用BALB/c脾细胞(效应细胞)和γ-照射的C57BL/6J脾细胞(刺激细胞)以及不同浓度的青蓝霉素A(0.0125-1μg/ml)和环孢菌素A(0.0125-10μg/ml)阳性对照进行MLR。4天后，用1μCi[³H]-胸苷对培养物进行脉冲处理，并在16h后收获，并且通过液体闪烁计数测量放射性掺入。 

·青蓝霉素A对T细胞增殖的体内免疫抑制作用。用弗氏完全佐剂将卵清蛋白乳化并将其腹膜内注射(100μg/100μl)至不同组(5只小鼠/组)的动物中。每天用青蓝霉素A(25、50、75、100μg/100μl/小鼠)注射不同组的用抗原引发过的动物。7天后，处死小鼠并分离、合并脾细胞用于体外增殖。 

·青蓝霉素A通过上调T细胞上CTLA-4的表达及抑制T细胞上CD28的表达而诱导免疫抑制。通过流式细胞仪检测静息的和ConA活化的CD4⁺T细胞表面上CD28和CTLA-4的表达。用抗原(OVA)或丝裂原(ConA)活化脾细胞，并将其与青蓝霉素A(0.0125-0.45μg/ml)一起孵育不同时间(24、48、72和96h)。在24、48、72和96h后收获培养物，并通过使用偶联PE(藻红蛋白)的抗CD4抗体、偶联FITC(荧光 素异硫氰酸酯)的抗CTLA-4抗体和偶联Cy(cy-chrome)的抗CD28抗体进行三色染色评价CD4⁺T细胞上CD28和CTLA-4的表达。 

·类似地，如第6点中所提及的，还通过流式细胞仪监测腹膜巨噬细胞上B7-1、B7-2和I-A^d的表达。 

通式1的化合物青蓝霉素、其衍生物及其可药用的盐是有效的免疫抑制剂。 

优势： 

以下是本发明的主要优势：- 

(i)因为CD4⁺T细胞在启动和调节免疫应答中扮演了关键的角色，所以对其活化的抑制便提供了用于免疫抑制治疗的有力方法。这在许多其它免疫抑制药物及其用于自身免疫治疗的情形中已得到很好的证明(Galvin等1993，Thomson 1991，Crespo-Leiro 2003)。而且，CD4⁺T细胞的作用在许多自身免疫病中得到很好地证明(Abbas等2004，Wraith等2004)。由于青蓝霉素A抑制幼稚和抗原特异性效应CD4⁺T细胞的增殖和细胞因子(IL-4和IFN-γ)分泌，因此它将是相当有前景的自身免疫病药物。另外，青蓝霉素A显著地增加T细胞上CTLA-4的表达以及随后下调CD28的表达。我们还发现表达CTLA-4的CD4⁺T细胞的数量增加以及CD28阳性细胞的数目降低。在非CD4⁺T细胞的情形中也观察到类似的结果。通过CTLA-4介导的抑制信号抑制淋巴细胞应答的观点得到越来越多的认可(Krummel等1996，Leibson 2004)。 

(ii)对异体MHC分子的识别是影响器官移植存活的主要障碍。因此，抑制异体识别可降低慢性排斥的发生和严重程度，并将提供移植器官的长期存活。我们观察到青蓝霉素A在MLR中的剂量依赖性抑制，并且它比环孢菌素A(CsA)强10倍，所述环孢菌素A是众所周知的免疫抑制药物。我们观察到青蓝霉素A还抑制MHC分子的表达。异体MHC水平的提高是器官移植存活的主要障碍。因此，降低MHC分子的表达将为移植物提供更好的接受机会。因此表明，青蓝霉素A可以有效地用于移植。另外，青蓝霉素A优于CsA还因为使用CsA导致高的癌症发生率(Rovira等2000)。 

参考文献 

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Claims (15)

1.式2化合物(E)-4-甲氧基-2，2’-联吡啶-6-甲醛肟及其可药用盐用于制备作为免疫抑制剂的药物的用途。

2.权利要求1的用途，其中所述化合物抑制T细胞、B细胞、混合淋巴细胞反应、幼稚CD4⁺T细胞、抗原特异性效应CD4⁺T细胞、Th1细胞和Th2细胞的体外增殖。

3.权利要求1的用途，其中所述化合物抑制细胞因子的体外分泌。

4.权利要求3的用途，其中所述细胞因子选自干扰素-γ白介素-4。

5.权利要求1的用途，其中所述化合物下调T细胞上活化标记CD28的表达并上调T细胞上抑制标记CTLA-4的表达。

6.权利要求1的用途，其中所述化合物提高巨噬细胞上B7-1的表达并降低巨噬细胞上B7-2和MHC分子的表达。

7.权利要求1的用途，其中所述化合物诱导抑制α-βT细胞和γ-δT细胞，CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞，Th1和Th2细胞，幼稚、效应、记忆和调节性T细胞。

8.权利要求1的用途，其中所述化合物诱导抑制B细胞、肥大细胞、内皮细胞、NK细胞、树突细胞、单核细胞、巨噬细胞、上皮细胞、成骨细胞、嗜酸性细胞、嗜碱性细胞、粒细胞、血小板和巨核细胞。

9.权利要求8的用途，其中所述树突细胞选自髓系树突细胞、浆细胞样树突细胞、淋巴样树突细胞和间质性树突细胞。

10.权利要求8的用途，其中所述巨噬细胞选自脾巨噬细胞、腹膜巨噬细胞、肺泡巨噬细胞、库普弗细胞、朗罕氏细胞、破骨细胞和胶质细胞。

11.权利要求1的用途，其中所述化合物可用于治疗自身免疫病。

12.权利要求11的用途，其中所述自身免疫病选自艾迪生病、自身免疫性溶血性贫血、古德帕斯丘综合征、格雷夫斯病、桥本甲状腺炎、特发性血小板减少性紫癜、胰岛素依赖型糖尿病、重症肌无力、恶性贫血、自发性不育、多发性硬化、类风湿性关节炎、***性红斑狼疮和自发性流产。

13.权利要求1的用途，其中所述化合物诱导免疫抑制和防止移植排斥和移植物抗宿主反应。

14.权利要求1的用途，其中所述化合物可用于治疗神经性疾病。

15.权利要求14的用途，其中所述神经性疾病选自癫痫、中风、脑缺血、脑瘫、阿尔珀斯病、帕金森病、阿尔茨海默病、亨廷顿病、肌萎缩性侧索硬化、多发性硬化、卢伊体痴呆、Rhett综合征、神经痛、脊髓创伤或创伤性脑损伤。

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