KR101399483B1

KR101399483B1 - 면역억제성 제제로서 비피리딘 화합물 '카에루로마이신 ａ'유도체 및 그의 아날로그의 용도

Info

Publication number: KR101399483B1
Application number: KR1020087005988A
Authority: KR
Inventors: 아르빈드 쿠마르 신글라; 자이베드 나임 아그레왈라; 라케쉬 물라즈 보흐라; 졸리 라빈데르 싱
Original assignee: 카운슬 오브 사이언티픽 앤드 인더스트리얼 리서치
Priority date: 2005-09-12
Filing date: 2006-09-08
Publication date: 2014-05-26
Also published as: WO2007031832A3; KR20080042888A; US8114895B2; JP2009507818A; JP5254017B2; ZA200802166B; EP1942889A2; WO2007031832A2; CN101287465A; US20070078167A1; CN101287465B; BRPI0616561A2; EP1942889B1

Abstract

본 발명은 효과적인 면역억제성 제제로서, 분리된 생물활성 분자 카에루로마이신 A, 그의 유도체 및 아날로그에 관한 것이다. 상기 화합물의 면역억제성은 림프구, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포 및 B 세포에 대항해서, 그리고 IL-4, IFN-γ 및 항체의 생성에 있어서 특히 표적이 된다. 상기 화합물은 활성화 마커 CD28의 발현을 하향조절하고 면역억제성 마커 CTLA-4를 상향조절하는 기작을 통해 작용한다. 카에루로마이신 A는 이전부터 스트렙토미세스 카에루레우스(Streptomyces caeruleus)로부터 분리되었고 유용한 항곰팡이성 활성을 갖는 것으로 알려졌다. 그러나, 본 발명 이전에, 이러한 화합물이 면역조절성 활성을 갖는 것으로 알려지진 않았다.

카에루로마이신, 면역억제

Description

면역억제성 제제로서 비피리딘 화합물 '카에루로마이신 Ａ' 유도체 및 그의 아날로그의 용도{Use of bipyridine compound 'caerulomycin A' derivatives and analogs thereof as immunosuppressive agents}

본 발명은 효과적인 면역억제성 제제로서 비피리딘 화합물 카에루로마이신 A, 그의 유도체 및 아날로그의 용도에 관한 것이다. 더 구체적으로는 본 발명은 미토겐(mitogen)으로 자극받은 T 및 B-림프구, CD4⁺ T 세포, Th1 및 Th2 세포와 같은, 미경험(naive) 및 활성화된 림프구(작용자)와 IL-4 및 IFN-γ의 생성을 억제하는 면역억제성 제제에 관한 것이다.

본 발명의 유용성은 자가면역 질환(autoimmune disease), 염증 반응, 섬유증(fibrosis) 또는 조직 손상 또는 감염과 함께 자가 면역 질환 또는 그의 관련된 질환에 의해 야기되는 기능 부전(dysfunction) 또는 알레르기 질환과 같은 활성화된 T 세포에 의해 유도되는 비정상적 면역 반응에 의한 질환을 치료하고, 이식하는 동안에 장기 이식(organ transplantation)의 거부 반응 및 이식 편대 숙주 질환(graft versus host disease)을 억제하는 것이다.

상기 화합물, 카에루로마이신 A는 접수 번호 MTCC 6194^T:DSM 44848^T:JCM 12472^T를 갖는 방선균류(actinomycetes), 액티노알로테이쿠스 스피티엔시 스(Actinoalloteichus spitiensis) sp. 신균주 RMV-1378^T의 신규의 종으로부터 분리되었다.

생체(organism)의 면역 시스템은 박테리아 및 바이러스와 같은 병원성 외부 미생물을 인식하고 제거하는 감시 및 방어 메카니즘과 함께 발달되었다. 따라서, 상기 생체는 자신의 세포 또는 조직(자가 항원)과 외부 미생물(비자기 항원)을 구별하고, 자가 항원에는 반응하지 않거나, 또는 이들에는 면역 반응의 적용을 실패하도록 하여 반응한다. 따라서, 상기 생체는 즉시 그리고 효과적으로 비자기 항원을 제거하기 위하여 획득된 면역성(acquired immunity)을 개발하여 왔다.

T 림프구 (T 세포) 및 B 림프구 (B 세포)는 상기 면역 시스템에서 적응성 부분 (adaptive arm)의 핵심 세포이다. 이들 둘 다 획득된 면역성에 관여하고 이들 세포의 복잡한 상호작용은 상기 면역 반응의 완전한 범위의 작용자(effector) 및 기억 세포(memory cell)의 발현에 요구된다. T 세포는 외부 항원에 대해 특이적이고 그들의 수는 특이적 숙주 방어에 대한 반응에 있어서 크게 증가해야 한다.

T 세포의 최적의 활성화는 두 가지 구분된 수용체-리간드 인식 사건에 의존한다. 주된 사건은 T 세포 수용체(TCRs)와 B 세포, 대식세포(macrophage) 및 수지상 세포(dendritic cell)와 같은 항원-제시 세포(APC)의 표면에 나타나는 펩티드-조직 적합성 복합체(peptide-histocompatibility complexes, pMHC)와의 결합이다. 그러나, 보조-자극성 신호의 부재시에 있어서는, 상기 TCR-pMHC 결합만으로는 완벽 한 T 세포 활성화에 충분하지 않고 세포 사멸(apoptotic death) 또는 반응성 T 세포의 연장된 무반응성(prolonged unresponsiveness)을 야기할 수 있다(Agrewala 등, 1994, 1998).

두 번째 보조-자극성 신호(CD28, CD40L)를 제공하는 것은 관련된 보조-자극성 수용체의 패밀리와 그의 각 리간드와의 결합이며, 이는 유효한 T 세포 활성화에 요구된다. 게다가, 두 번째, 상보적인 보조-자극성 신호(CTLA-4, PD-I, BTLA)의 세트(set)는 또한 면역 반응을 감소시키는 음 신호(negative signal)를 제공하고, 그러한 기능으로서 말초성 T 세포 내성을 유지하여 자가면역성에 대항하여 보호한다(Nishimura 등 2001, Greenwald 등 2001).

T 세포의 표면에서 발현되는 핵심의 보조-자극성 분자는 CD28 및 CTLA-4/CD152이다. CD28는 구성적으로 T 세포에서 발현된다. CD28 결합은 T 세포 반응의 크기 및 지속성을 강화하고, 항-세포사멸 유전자 BCL-X_L을 유도하며, 시토킨 분비, 특히 인터루킨 2 (IL-2)를 증가시키며, 세포 부착(cell adhesion)을 강화하고, APC에 결합할 때 상기 T 세포의 세포막의 재구성을 촉진하고, 면역성 결여(anergy) 유도를 방지하며 배 중심(germinal center)의 형성을 지지한다(Lanzavecchia 등 1999). CD28 보조-자극(co-stimulation)은 대부분의 T 세포 반응의 개시에 필요하고, CD28 신호전달의 차단은 단백질 항원, 기생균(parasite) 및 일부 바이러스에 반응하는, 그리고 배 중심을 생성하고 B 세포 도움을 매개하는 능력을 크게 감소시킨다. 이와 같은 사실은 CD28 보조-자극의 차단은 매우 면역억제적이고, 자가면역 성 질환 모델에서 병원성 T 세포 반응의 유도를 방지하고 장기 이식의 모델에서 동종이식(allograft)의 연장된 허용성을 가능하게 하는 면에서 치료학적 의미가 있다(Salomon 등 2001).

CTLA-4 (CD152)는 그러한 억제성 신호(inhibitory signal)를 매개한다. 고정화된 mAb 또는 2차 항체와 가교된 용해성 항체에 의해 CTLA-4를 가교시키는 것은 항-CD3 및 항-CD28 항체에 의해 유도되는 T 세포 반응을 억제하였다(Krummel 등 1996). 비록 CTLA-4는 상기 CD28 패밀리 구성원들의 상기의 공통적인 특징들을 보이지만, 몇몇의 중요한 면에 있어서는 독특하다. 첫 번째, CTLA-4는 CD28과 비교되는 공유하는(shared) 리간드 B7-1 및 B7-2에 대하여 현저하게 높은 친화성을 갖고(K_d 0.2-0.4 μm 대 4.0 μm), 40 내지 100 배의 높은 접착성(avidity)을 갖는다(van der Merwe 등 1997).

두 번째, CTLA-4는 독특한 발현 패턴을 갖는다. CD28과는 달리, CTLA-4는 미경험 T 세포(naive T cell)의 세포 표면에서 구성적으로 발현되지 않는다. CTLA4는 CD4⁺ T 세포가 활성화된 후 (APC-TCR 결합 후 2 내지 3일 경과 후)에만 발현되고, B7 분자와 결합하여 T 세포에 음성 신호를 전달한다. CTLA4에 대한 B7-1 및 B7-2의 결합 친화성이 CD28의 경우보다 40 내지 50 배 더 높기 때문에, 음성 신호 전달은 활성화된 T 세포에서 우세하고, 그에 따라 면역 반응이 종결하게 된다. 인 비보 CTLA-4 차단은 항원 특이적 및 항기생균 반응, 종양 거부, 자가면역 질환을 강화하고, 이식 거부를 더욱 악화시킨다(Tivol 등 1996, Chambers 등 2001). 인 비트로에 서는, CTLA-4의 결합은 T 세포 증식, 시토킨 생성 및 세포 주기 진행의 억제를 야기한다(Chambers 등 2001, Freeman 등 2000).

CTLA-4는 다른 많은 메카니즘에 의해 말초 내성(peripheral tolerance)을 조절한다. 첫 번째, CTLA-4는 생화학적 신호 (즉, ERK 활성화)뿐만 아니라 T 세포 수용체 신호전달 (즉, TCR 사슬 인산화)(Lee 등 1998)을 직접적으로 조절하여 T 세포의 활성화를 조절한다. 두 번째, 최근 연구는 CD4⁺CD25⁺ 면역조절성 T 세포가 CTLA-4를 구성적으로 발현하는 것을 보였다 (Salomon 등 2000). 사실상, CTLA-4를 통한 신호전달은 이들 세포의 기능에 필수적이다 (Takahashi 등 2000). 따라서, CTLA-4는 상기 세포 내에서 조절 T 세포로의 분화를 이끄는, 신호 전달(signal transduction)을 조절할 수 있고, 또한, 상기 작용자 세포에서의 CTLA-4 결합은 신호 전달을 변화시키고 뒤이은 시토킨 생성을 변경할 수 있다. CTLA-4의 가교는 면역조절성 TGF-β 시토킨의 분비를 유도하여(Chen 등 1998), CD4⁺CTLA4⁺CD25⁺ 조절성 T 세포에 대한 하나의 가능한 작용 메카니즘을 제공한다.

비록 상기 발견들은 면역 기능을 변경함에 있어서, CTLA-4의 다중 기능성 효과를 제안하는 것으로 보이지만, 상기 모델들 중의 하나는 이들 외견상 상이한 활성들이 모두 관련되어 있고 CTLA-4의 주된 효과는 TCR 신호전달에 있어서 초기 사건을 변경하여 T 세포 활성화의 역치(threshold)를 변경하는 것이다. 사실상, 칼슘 동원화(calcium mobilization)를 조절하는 칼시뉴린(calcineurin) 저해제인, 시클로스포린 A로 T 세포를 처리하면 CD4⁺CTLA4⁺CD25⁺ 조절성 T 세포와 유사한 TGFβ-생 성 T 세포의 형성을 야기한다 (Prashar 등 1995).

따라서, T 세포 활성화의 CD28 신호전달의 억제, 근접(proximal) TCR 신호의 조절 또는 다운-스트림 작용자 경로에 지향된 것이든지간에 관련된 CTLA-4 결합(engagement)의 효과는 변경된 T 세포 분화 및 면역 반응의 하향 조절을 야기한다. 따라서, 카에루로마이신 A에 의한 T 세포의 표면에서의 CTLA-4/CD28의 발현을 조절하는 것에 의하여 상기 질환의 악화를 억제하는 치료학상의 잠재적인 가능성이 존재한다.

항원 제시 세포의 표면에서 발현되는 많은 보조-자극성 분자들이 현재 알려져 있긴 하지만 B7-1 및 B7-2이 가장 강력하며 T 세포의 활성화에 관여한다. 이들의 T 세포의 표면에서 발현되는 CD28/CTLA-4 수용체와의 결합은 매우 중요하다. CD28과 그의 리간드 B7-1 및 B7-2과의 결합은, T 세포에 보조-자극성 신호를 전달하고, 그의 증식 및 시토킨 분비를 강화하며, T 세포의 면역성 결여 유도를 방지한다(Linsley 등 1991). 대조적으로, 이들의 동일한 리간드에 의한 CTLA-4의 결합은 T 세포 항상성(homeostasis) 및 자가-내성(self-tolerance)을 유지하기 위해 필수적인 상기 반응의 하향 조절을 야기한다(Tivol 등 1995). 약 25%의 서열 동일성을 공유하는, B7-1 및 B7-2는 타입 I의 막통과 당단백질(transmembrane glycoprotein)이다(Stamper 등 2001). CD28 및 CTLA-4와 B7-리간드의 결합은 면역 반응 및 내성의 활성화 및 억제에 있어서 각각 중요하다 (Greenwald 등 2005).

요약하면, B 및 T 세포 반응은 다중 및 복잡한 상호의존적 사건(interdependent event)에 의존한다. 면역에 있어서 B 및 T 세포의 핵심 역할 때 문에, 그들의 조절은 강화된 또는 감소된 면역을 필요로 하거나 그로부터 이득을 얻는 다양한 질환, 예를 들어, 타입 I 당뇨병, 다발성 경화증, 천식, 관절염, 중증 근무력증(myasthenia gravis), 홍반성 낭창, 건선, 대장염(colitis)을 포함하는 자가면역 질환, 또는 이식된 장기의 거부, 또는 면역결핍 질환, 및 암을 치료하는 및/또는 예방하기 위한 주요 표적이다. 따라서, 많은 면역적 질환 및 질병을 치료하고 예방하는 목적으로 상기 복합적인 B 및 T 세포 반응을 조절할 수 있는 약물에 대한 강한 필요성이 있다.

성공적인 장기 이식은 장기 수혜자(organ recipient)의 면역 시스템의 효과적인 생리학적이고 약리적인 개입이 요구된다. 장기 이식 수혜자의 면역 반응에 개입하는 하나의 접근방법은, 특히 동종 이식(allogenic graft)을 대상으로 하는 수혜자의 경우, 면역억제성 약물의 사용에 의한 것이다. 이들 약물은 예를 들어, 신장, 간, 심장, 폐, 골수 및 췌장 이식이 관여하는 경우에 있어서 수혜자의 이식된 장기의 생존을 연장하기 위해 사용된다.

이식에 있어서 장기 거부를 감소시키는 용도로 사용될 수 있는 면역억제성 약물의 몇몇 유형이 있다. 그러한 약물은 3가지 주된 분류로 나뉘는데, 즉, 항증식성 제제, 항염증성 화합물 및 림프구 활성화 저해제이다.

세포독성 또는 항증식성 제제의 분류의 예는 아자티오프린(azathioprine), 시클로포스파아미드(cyclophosphamide) 및 메소트렉사이트(methotrexate)이다. 상기 항증식성 분류의 약물은 만성 염증성 질환을 갖는 환자에서 및 장기 이식 수혜자에서 세포활성화 및 증식을 억제함으로써 효과적인 면역억제제일 수 있다. 유사 분열(mitosis) 및 세포 분열을 소멸시키는 이들 약물들은 골수 세포 및 위장내 관 주름의 세포(gastrointestinal(GI) tract lining)와 같은 높은 전환율(turn-over rate)를 갖는 정상적인 세포군에 있어서 심각한 세포독성 부작용을 갖는다. 따라서, 상기 약물은 종종 심각한 부작용, 특히 림프구 감소증(lymphopenia), 중성구 감소증(neutropenia), 골수 억제(bone marrow depression), 출혈성 방광염(hemorrhagic cystitis), 간 손상, 종양의 증가된 발병, 탈모(hair loss), 위장내관 장애(GI tract disturbances), 및 불임을 야기한다.

이식에 있어서 사용되는 두 번째 분류의 면역억제성 약물들은 항-염증성 활성을 갖는 화합물에 의해 제공된다. 이 약물 분류의 대표적인 것은 부신 코르티코스테로이드(adrenal corticosteroid)로 일반적으로 알려져 있고, 글로벌(globally) 전신성 세포독성 효과를 발휘하지 않는다는 이점을 갖는다. 이들 화합물은 대개 항염증 반응, 시토킨 생성, 주화성(chemotaxis), 중성구(neutrophil), 대식세포 또는 림프구 활성화, 또는 그의 작용자 기능을 방지 또는 억제함으로써 작용한다. 부신 코르티코스테로이드의 전형적인 예는 면역 기능 뿐만 아니라 탄수화물 및 단백질 물질대사에도 영향을 미치는, 프레드니손(prednisone), 프레드니솔론(prednisolone)이다. 이러한 분류의 화합물은 상기 코르티코스테로이드가 독성이 상당하게 작기 때문에 때때로 항증식성 분류의 화합물과 같은, 세포독성 제제와 조합되어 사용된다. 그러나 상기 부신 코르티코스테로이드는 효과의 특이성이 결여되고, 광범위한 물질대사성, 항-염증성 및 면역 효과를 발휘할 수 있다. 이러한 분류의 전형적인 부작용은 증가된 장기-수혜자 감염 및 상처 치료의 방해 뿐만 아니라 혈류역학적 균형(hemodynamic balance) 교란, 탄수화물 및 뼈 물질대사와 미네럴 조절의 교란을 포함한다.

장기 이식에 사용되는 세 번째 분류의 면역억제성 약물은 면역조절적이고 일반적으로 백혈구 활성화를 방지 또는 억제하는, 화합물에 의해 제공된다. 상기 화합물은 대개 활성화된 T-세포 작용자 기능 또는 증식을 차단하고, 또는 시토킨 생성을 억제하고, 또는 혈소판(platelet), 과립구(granulocyte), B-세포, 또는 대식 세포 활성의 활성화, 분화 또는 작용자 기능을 방지하거나 억제하는 것에 의해 작용한다. 상기 화합물의 시클로스포린(cyclosporin) 패밀리는 이러한 분류에 있어서의 약물의 주요 예이다. 상기 화합물은 새롭게 만나는 항원에 대한 세포성 및 체액성 반응을 감소하기 위하여 헬퍼 T 세포를 억제함에 있어서 매우 효과적인 것으로 알려진, 폴리펩티드 곰팡이 대사산물이다. 시클로스포린은 시토킨 생성 또는 분비를 감소시키고 특히, 항원 특이적 CD4 세포의 활성화를 방해하거나, 또는 IL-2 분비 및 많은 T-세포 생성물의 분비를 방지할 뿐만 아니라 다양한 세포 유형에서 이들 림포카인(lymphokine)에 대한 수용체의 발현을 방해하여 대식세포 및 림프구 활성을 변경시킨다. 시클로스포린 A는 특히, 장기 이식에 있어서 면역억제성 제제로서 널리 사용되어 왔다. 다른 미생물 대사물질은 시클로스포린 B 및 시클로스포린 G와 같은 시클로스포린, 및 FK-506로 알려진 다른 미생물 생성물을 포함한다. 시클로스포린 A는 체액성 면역 뿐만 아니라 세포 중개 반응도 억제한다. 시클로스포린 A는 신장, 간, 심장, 췌장, 골수 및 심폐(heart-lung) 이식에 있어서 장기 거부을 위한 것이다. 또한, 시클로스포린 A는 류머티스 관절염, 크론씨 질환, 그레이브스 질환(Graves' disease), 심한 건선, 재생불량성 빈혈(aplastic anemia), 다발 경화증, 원형 탈모증(alopecia areata), 펜피구스 및 펜피고이드(penphigus and penphigoid), 피부근염(dermatomyositis), 다발성근염(polymyositis), 베체트병, 포도막염(uveitis), 폐 사르코시디오시스(sarcocidiosis), 쓸개관 간경화(biliary cirrhosis), 중증 근무력증(myasthenia gravis) 및 아토피성 피부염(atopic dermatitis)을 포함하는, 자가면역 및 염증 질환의 치료에 유용하다.

시클로스포린은 몇가지 상당한 단점을 가지고 있다. 시클로스포린은 장기 이식에 있어서 상당한 이점을 제공하는 반면, 시클로스포린은 비 특이적 면역억제제이다. 원하는 면역 반응은 외부 항원에 대항하여 감소할 수 있다. 허용된 투여량은 거부 반응의 완벽한 억제를 제공하진 않는다. 따라서, 이식된 조직에 대한 면역 반응은 완전하게 저해되지 않고, 프레드니손, 메틸프레드니솔론 및/또는 항-CD3 또는 항-CD5/CD7와 같은 단일클론성 항체를 포함하는, 다른 면역억제 제제로 부수적인 치료를 요구한다. 시클로스포린은 많은 장기 수혜자에 심각한 부작용을 일으킬 수 있고 간, 신장, 중추신경계 및 위장 관에서 숙주-다양성 효과(host-variable effect)를 보일 수 있다. 상기 역부작용 중에서 중요한 것은 신장 및 간의 손상, 검 조직의 증식증(hyperplasia), 불응성 고혈압(refractory hypertension) 그리고 감염 및 종양의 증가된 발병이다.

따라서, 자가면역 질환의 치료를 위하여 그리고 장기 이식, 특히 완벽하지 못하게 연결된 한 쌍의 증여자-수혜자(less-than-perfectly matched donor-recipient pairs) 사이의 이식에 있어서도, 효능있고 선택성이 있는 면역억제성 약 물에 대한 필요성은 남게 된다. 따라서, 본 발명은 면역 반응을 억제하기 위한 면역억제제로서 방선균의 신규한 종으로부터 분리된 카루로마이신(Carulomycin)을 사용하는 합리적인 접근방법을 제안한다. 본 발명 발명의 이 목적 및 다른 목적 뿐만 아니라, 추가적인 발명적 특징들은 본 명세서에서 제공되는 상세한 설명으로부터 명백할 것이다. 본 발명의 발명자는 인 비보로 요구되는 카에루로마이신 A의 적정 투여량이 5.0 mg/kg/체중 이라는 것을 확인했다. 상기 증식에 있어서 억제를 유도하는 인 비트로 실험에 사용된 카에루로마이신 A의 투여량은 알려진 면역억제제, 시클로스포린 A보다 10배 더 작았다.

따라서 본 발명의 핵심 목적은 그의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 화합물 카에루로마이신, 그의 유도체 카에루로마이신 A 및 다른 유도체들이 T 및 B 림프구의 면역억제를 유도한다는 것을 증명하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 카에루로마이신 A가 혼합된 림프구 반응을 억제하는 것을 증명하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 카에루로마이신 A가 미경험 CD4⁺ T 세포, 항원 특이적 CD4⁺ T 세포와 Th1 및 Th2 세포의 증식을 억제하는 것을 증명하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 카에루로마이신 A가 T 세포에 의해 생성되는 시토킨의 분비를 지체시키는 것을 증명하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 카에루로마이신 A가 B 세포에 의한 항체의 생성을 지체시키는 것을 증명하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 카에루로마이신 A가 T 세포에서 CD28 및 CTLA-4와 같은 보조자극성 분자(costimulatory molecule)의 발현을 조절하는 것을 증명하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 카에루로마이신 A가 항원 제시 세포에서 B7-1 및 B7-2와 MHC 분자와 같은 보조자극성 분자의 발현을 조절하는 것을 증명하는 것이다.

본 발명은 약 24 내지 약 168시간 동안, 약 25 내지 약 30 ℃에서, 약 중성 pH의, 수성 영양 배지 내의 조절된 호기성 발효 조건 하에서, 접수 번호 MTCC 6194를 갖는, 액티노알로테이쿠스 스피티엔시스(Actinoalloteichus spitiensis) sp. 신규 박테리아를 배양하는 단계를 포함하고, 그 결과 카에루로마이신 A의 분리가능한 양이 배양액에 존재하는, 상기 화합물 카에루로마이신 A를 생성하고 축적하는 발효 방법에 관한 것이다.

상기 화합물 카에루로마이신 A는 a) 상기 배양액으로부터 고형물을 분리하는 단계, b) 비혼합성 추출 용매(immiscible extraction solvent)로 여과액(filtrate broth)을 추출하는 단계, c) 상기 추출 용매를 건조물(dryness)로 농축하는 단계, d) 상기 잔류물을 포화된 수성 NaCl 및 10% 메탄올 1:1로 희석화하고 비혼합성 용매로 분획화하는 단계, e) 적절한 용매로 분획화하여 상기 수성 알코올 분획으로부터 활성 물질을 제거하는 단계, f) 상기 조(crude) 카에루로마이신 A을 포함하는 회수된 용매 상을 조합하고 농축하는 단계, 및 g) 크로마토그래피 기술로 상기 조 농축된 물질로부터 상기 카에루로마이신 A를 정제하는 단계에 의하여 상기 배양액으로부터 분리된다.

또한 본 발명은 효과적인 면역억제성 제제로서, 카에루로마이신 A를 제공한다. 상기 약물의 면역억제성 성질은 특히 T 및 B-세포 및 이들 세포에 의한 시토킨의 생성을 표적으로 한다. 상기 약물은 활성화 마커 CD28의 발현을 하향 조절하고 억제 마커 CTLA-4의 발현을 상향 조절하는 기작을 통해 작동한다.

카에루로마이신 A는 스트렙토미세스 카에루레우스(Streptomyces caeruleus)로부터 처음으로 분리되었고 강한 항곰팡이 활성 및 약한(mild) 항박테리아 활성을 갖는 것으로 알려졌다(Funk 및 Divekar 1959).

또한 카에루로마이신 A의 항아메바성 성질 및 식물독성(phytotoxic property)은 이미 기술되었다(Chatterjee 등 및 Chandran 등). 이들 특성의 개시는 본 명세서에 참조에 의해 포함된다.

본 발명은 면역억제성 제제로서 일반식 1의 비피리딘 화합물, 면역억제성 제제로서 그의 유도체, 에스테르, 에테르 및 약학적으로 허용가능한 염의 용도를 제공한다.

식 1

상기에서, X = -CH:NOR₁, -COOR₁, -CHO, -CH₂OR₂이고, Y = H, OR₃이고, R₁ = H, C₁ 내지 C₁₆의 정상 또는 가지형 사슬 알킬이고, R₂ = H, C₁ 내지 C₁₆의 정상 또는 가지형 사슬 알킬, C₁ 내지 C₁₆의 정상 또는 가지형 사슬 아실이고, R₃ = H, 메틸, 에틸, 이소프로필, 이소부틸이다.

또한 본 발명은 효과적인 면역억제성 제제로서, 카에루로마이신 A, 식 2의 (E)-4-메톡시-2,2'-비피리딘-6-카브알데히드 옥심의 용도를 제공한다.

식 2

또한 본 발명은 액티노알로테이쿠스 스피티엔시스(Actinoalloteichus spitiensis)[MTCC 6194]로부터 식 2의 화합물의 분리방법을 제공한다. 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다.

[a] 교반 상태 하에서 25 내지 30 ℃에서 30 내지 100시간 동안 중성 pH의 수성 영양 배지에 조절된 호기성 발효 조건 하에서 액티노알로테이쿠스 스피티엔시스[MTCC 6194]의 균주를 배양하는 단계,

[b] 단계 [a]에서 얻어지는 세포를 침전시켜 세포 유리 상청액을 얻는 단계,

[c] 알려진 방법에 의하여 단계 [b]에서 얻어지는 상청액으로부터 식 2의 화합물을 추출한 후 정제하는 단계,

[d] 선택적으로, NMR, 적외선 및 질량 스펙트럼 데이터를 사용하여 상기 정제된 분획을 특정하는 단계.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 화합물은 식 2의 (E)-4-메톡시-2,2'-비피리딘-6-카브알데히드 옥심(카에루로마이신 A)이다.

식 2

본 발명의 다른 구체예에서, 상기 화합물은 식 3의 (E)-4-메톡시-2,2'-비피리딘-6-카브알데히드 O-메틸 옥심이다.

식 3

본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 화합물은 1.25 내지 5.0 mg/체중kg의 투여량으로 사용된다.

본 발명의 구체예에서, 상기 화합물은 면역 반응을 억제하는 것에 있어서 알려진 면역억제성 제제인, 시클로스포린 A보다 10배 더 효과적이다.

본 발명의 구체예에서, 상기 희석제의 ml 당 상기 화합물 약 0.1 μg은 48시간 이내에 약 90% 내지 97%의 상기 면역 세포를 억제한다.

본 발명의 구체예에서, 상기 화합물은 T 세포, B 세포, 혼합 림프구 반응(Mixed Lymphocyte Reaction), 미경험 CD4⁺ 세포, 항원 특이적 작용자 CD4⁺ T 세포, Th1 세포 및 Th2 세포의 인 비트로 증식을 억제한다.

본 발명의 구체예에서, 상기 화합물은 인터페론-감마 (IFN-γ) 및 인터루킨-4 (IL-4)와 같은 시토킨의 인 비트로 분비를 억제한다.

본 발명의 구체예에서, 상기 화합물은 T 세포에서 활성화 마커 CD28의 발현을 하향 조절하고 억제 마커 CTLA-4의 발현을 상향 조절한다.

본 발명의 구체예에서, 상기 화합물은 대식세포에서 B7-1의 발현을 증가시키고 B7-2 및 MHC 분자의 발현을 감소시킨다.

본 발명의 구체예에서, 상기 화합물은 알파-베타 T 세포 및 감마-델타 T 세포, CD4⁺ T 세포 및 CD8⁺ T 세포, Th1 및 Th2 세포, 미경험, 작용자, 기억 및 조절 T 세포의 억제를 유도한다.

본 발명의 구체예에서, 상기 화합물은 B 세포, 비만 세포, 내피 세포, NK 세포, 수지상 세포(골수 수지상 세포(myeloid DC), 림프종 수지상 세포(plasmacytoid DC), 림프 수지상 세포(lymphoid DC), 간질성 수지상 세포), 단핵세포, 대식세포(비장 대식세포(splenic macrophage), 복막 대식세포, 폐포 대식세포(alveolar macrophage), 쿠퍼 세포, 랑게르한스 세포, 파골세포, 교세포 및 모든 종류의 대식세포), 상피 세포, 골아세포(osteoblast), 호산구, 호염기구, 과립구, 혈소판 및 거핵구의 억제를 유도한다.

본 발명의 구체예에서, 상기 화합물은 아디손 질환(Addison's disease), 자가면역 용혈성 빈혈(autoimmune hemolytic anemia), 굿페스쳐 증후군(Goodpature's syndrome), 그레이브스 질환(Graves' disease), 하시모토 갑상선염(Hashimoto's thyroiditis), 특발성 혈소판감소성 자반증(idiopathic thrombocyopenia purpura), 인슐린 의존성 당뇨병, 중증 근무력증(Myasthenia Gravis), 악성 빈혈, 자발성 불임, 다발성 경화증, 류머티스 관절염, 전신성 홍반성 루푸스, 자발성 유산과 같은 자가면역 질환의 치료에 유용하다.

본 발명의 구체예에서, 상기 화합물은 면역억제를 유도하고 이식 거부, 이식 편대 숙주 반응(graft versus host reaction)을 방지하며 이식에 있어서 도움을 준다.

본 발명의 구체예에서, 상기 화합물은 간질, 발작, 뇌 허혈증, 뇌성 마비, 알퍼 질환(Alper's disease), 파킨슨 질환, 알츠하이머 질환, 헌팅턴 질환, 근위축성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis), 다발성 경화증, 루이체 치매(dementia with Lewy bodies), 레트 증후군(Rhett syndrome), 신경병증 통증(neuropathic pain), 척수 외상(spinal cord trauma), 또는 외상성 뇌 손상 등과 같은 신경학적 질환의 치료에 유용하다.

본 발명의 구체예에서, 상기 화합물은 인도, 히말라야의 추운 사막에서 분리된, 방선균 액티노알로테이쿠스 스피티엔시스(Actinoalloteichus spitiensis)[MTCC 6194]의 신규한 종으로부터 분리된다.

본 발명의 구체예에서, 액티노알로테이쿠스 스피티엔시스[MTCC 6194]로부터 식 2의 화합물의 분리방법을 제공하고, 상기 제조방법은 하기의 단계를 포함한다.

[a] 교반 상태 하에 25 내지 30 ℃에서 30 내지 100시간 동안 pH 7.0 내지 8.5의 수성 영양 배지에서 조절된 호기성 발효 조건 하에서 액티노알로테이쿠스 스피티엔시스[MTCC 6194]의 균주를 배양하는 단계,

[b] 단계 [a]에서 얻어진 세포를 침전시켜 세포 유리 상청액을 얻는 단계,

본 발명의 구체예에서, 상기 세포는 바람직하게는 40 내지 70시간 동안 배양된다.

본 발명의 구체예에서, 상기 세포는 바람직하게는 28 내지 30 ℃에서 배양된다.

본 발명의 구체예에서, 상기 세포는 바람직하게는 pH 7 내지 8.5에서 배양된다.

본 발명의 구체예에서, 식 2의 화합물의 회수량은 약 150 mg/상기 배양액l 이다.

본 발명의 구체예에서, 얻어진 상기 활성 분획은 면역억제성 제제로서 유용하다.

본 발명의 구체예에서, 체중 kg 당, 상기 일반식 1의 화합물 1.25 내지 5.0 mg를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 자가면역 질환의 치료방법을 제공한다.

본 발명의 구체예에서, 상기 화합물은 3일 동안 날마다 단일 투여 형태(single dosage form)로 투여된다.

본 발명의 구체예에서, 약학적으로 허용가능한 희석제, 첨가물 및/또는 담체와 함께 상기 일반식 1의 화합물 1.25 내지 5.0 mg을 포함하는 면역억제에 유용한 면역억제적인 약학적 조성물을 제공한다.

방선균(actinomycete) 및 곰팡이로부터 유래한 생성물의 전신적 연구는 시클로스포린 A(CsA), FK506(타크로리무스(tacrolimus)) 및 라파마이신(시로리무스(sirolimus))과 같은 면역억제성 약물의 개발을 이끌어 왔다. 이들 약물은 강력한 항곰팡이 효과를 발휘할 뿐만 아니라 잠재적인 면역억제제로서 사용된다. 이러한 점을 고려하여 우리는 히마찰프라데시(Himachal Pradesh) 내에 카자(Kaza) 및 스피티(Spiti)의 추운 히말라야 지역의 토양 및 물 샘플로부터 다양한 미생물을 분리하여 항곰팡이 활성을 갖는 생물활성 화합물을 스크리닝하는 연구를 시작했다. 인도, 히말라야의 추운 사막으로부터 분리된, RMV-1378^T 균주의 다상 특성확인 결과는 상기 균주가 액티노알로테이쿠스 속(genus Actinoalloteichus)에 속하는 것을 명백히 확인했다. 생리학적 및 생화학적 테스트는 그의 근접한 계통발생적 친척으로부터 상기 RMV-1378^T 균주의 유전자형 및 표현형 구분을 허용하였다. 16S rDNA 서열의 분석은 상기의 분리물이 99%의 유사성을 갖는 액티노알로테이쿠스 시아노그리시우스(Actinoalloteichus cyanogriseus)와 매우 밀접하게 관련이 있는 것으로 나타났다. 그러나, DNA-DNA 혼성화의 결과는 액티노알로테이쿠스 시아노그리세우스와의 낮은 유전적 관련성을 보였다(51 %). 따라서, 우리는 상기 분리주가 액티노알로테이쿠스 스피티엔시 sp. nov라는 명명으로 제안된, 액티노알로테이쿠스의 신규한 종으로 분류될 것을 제안했다. 상기 RMV-1378^T 균주는 접수번호 MTCC 6194^T 로 인도의 미생물 표준 배양물 은행 및 유전자 은행(Microbial Type Culture Collection and Gene Bank : (MTCC))에 기탁되었고, 또한 균주 타입 RMV-1378^T는 접수번호 JCM 12472^T 로 일본의 일본 미생물 은행(Japan Collection of Micro-organisms : (JCM)) 및 접수번호 DSM 44848^T 로 독일의 독일 미생물 및 세포 배양물 은행(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures : (DSMZ))에 또한 기탁되었다. RMV-1378 균주로부터 분리된 상기 활성 성분은 핵자기공명(NMR), 적외선(IR) 및 질량 스펙트럼 데이터를 기초로 특정되었다. 상기 확인된 화합물은 (E)-4-메톡시-2,2'-비피리딘-6-카브알데히드 옥심이었다. 상기 데이터는 이미 보고된 카에루로마이신 A의 데이터에 잘 일치했다(Divekar 등 1967).

상기 분리된 액티노알로테이쿠스 스피티엔시 균주의 주된 특성은 하기와 같다.

a) 액티노박테리아 균주, RMV-1378^T은 가지형, 비-분획성 영양 균사(vegetative hyphae)를 형성하고 확산성 색소를 생성하지 않는다. 공기 균사체(aerial mycelium) 뿐만 아니라 포자 형성도 관찰되지 않았다.

b) 상기 DNA의 G+C 함량은 72.0 mol%이다.

c) 상기 균주는 전형적인 액티노알로테이쿠스 속의 화학 분류적 특성을 갖고, 현재 유효하게 공표된 명명을 갖는 유일한 액티노알로테이쿠스 종, 액티노알로테이쿠스 시아노그리세우스와 밀접하게 관련된다(16S rRNA 유전자 서열 유사성 99.3%). 그러나, DNA-DNA 혼성화 실험의 결과는 액티노알로테이쿠스 시아노그리세우스의 균주 타입과 51.9 %의 관련성을 보였다.

d) 상기의 데이터 및 RMV-1378^T (=MTCC 6194^T=JCM 12472^T=DSM 44848^T)의 생리학적 및 생화학적 독특함을 기초로 이러한 균주는 액티노알로테이쿠스 스피티엔시 sp. nov.라는 명명이 알맞는, 액티노알로테이쿠스의 신규한 종의 균주 타입으로 분류된다.

국가 기구(National Facility)인, 미생물 표준 배양물 및 유전자 은행(MTCC)은 1986년에 설립되었고 인도 정부의 생명공학부(Department of Biotechnology (DBT), Govt.of India) 및 과학기술연구협의회(Council of Scientific and Industrial Research(CSIR))가 공동으로 후원하고 있다. 이는 찬디가르(Chandigarh)의 미생물공학협회(Institute of Microbial Technology (IMTECH))에 위치하는 설비가 잘 구비된 현대적 시설이다. MTCC는 배양물 은행 세계 연맹(World Federation of Culture Collection (WFCC))에 가입된 구성원이고 세계 미생물 데이터센터(World Data Centre for Microorganisms)에 등록되어 있다(WDCM: 등록번호 773). 이러한 국가 기구의 주된 목적은 연구 기관, 대학 및 산업에서 일하는 과학자들에게 기탁기관(depository)으로서 활동하고, 인증된 미생물 배양물(authentic microbial culture)을 공급하고 관련 서비스를 제공하기 위한 것이다. 2002년 10월 4일에, MTCC는 세계지적재산권 기구(WIPO)(제네바)로부터 부다페스트 조약(Budapest Treaty) 하의 미생물의 기탁에 관한, 인도의 국제 기탁 기관(International Depositary Authority, IDA)으로 인정받았다.

상기 생산 미생물의 발효

카에루로마이신 A는 미생물의 상기 조절된 발효에 의해 본 발명에서 생산된다. 이 미생물은 호기성 및 중온성 조건 하에, 바람직하게는 25 ℃ 내지 35 ℃, 약 6.0 내지 8.0 의 pH에서 수성 영양 배지에서 바람직하게는 성장한다. 상기 발효의 길이는 전형적으로 24 내지 168 시간 사이, 바람직하게는, 24 내지 96 시간 사이의 범위이다. 좋은 생산성은 30 ℃ 및 pH 7.0 내지 8.5에서 얻을 수 있다. 채택된 상기 영양 배지는 바람직하게는 단백질 가수분해물, 또는 단백질 및/또는 분리된 아미노산, 또는 임의의 암모늄 및/또는 질산염 원과 같은 임의의 적절한 질소 원, 임의의 동화성 탄수화물 및/또는 지방과 같은 탄소 원을 포함할 수 있고, 또한 염화나트륨, 탄산나트륨, 탄산수소나트륨, 염화칼륨, 염화마그네슘, 탄산칼슘 등과 같은 염을 포함할 수 있다.

포도당 5.4 g, 효모 추출물 4.8 g, 맥아 추출물 8.5 g, CaCO₃ 3.0 g, 증류수 1000 ml을 포함하는 배지, pH 7.2 및 배양 온도 28 ℃에서, 카에루로마이신 A의 생산이 잘 되었다.

상기 배지는 액티노알로테이쿠스 스피티엔시 sp. 신균주에 의한 카에루로마이신 A의 생산을 위한 적절한 배지의 단지 일 예인 것으로 이해되어야 한다. 좋은 성장과 생산성을 보이는 광범위한 영양 배지가 본 명세서에서 개시된 배지와 대체될 수 있다.

모든 배양 및 발효는 멸균된 배지 및 조건에서 수행된다. 발효를 시작하기 위해서는, 상기 발효에 대하여 이미 기술된 것과 유사한 배지에서 성장한 접종물(inoculum)로 씨드 접종할 필요가 있다. 전형적으로 요구되는 접종물의 백분율은 1 내지 10 %의 범위, 10%가 일반적으로 바람직하다.

배양액으로부터 카에루로마이신 A의 분리 및 정제

발효에 의해 생성되는 상기 카에루로마이신 A의 분리 및 정제는 전형적으로 추출과 크로마토그래피 기술의 조합을 사용하여 수행된다. 바람직한 단계의 순서는 하기와 같다.

에틸 아세테이트와 같은 비혼합성 용매로 상기 여과액(filtrate broth)을 추출한다. 이들 추출물을 결합하고 진공에서(in vacuo) 건조시켜 농축한다. NaCl 10%/메탄올 (1:1)로 상기 잔류 추출물을 희석하고 지방을 제거할 수 있는 헥산과 같은 비혼합성 용매로 분획한다. 에틸 아세테이트와 같은 적절한 용매로 분획하여 상기 수성 알코올 분획으로부터 상기 활성 물질을 제거한다. 상기 회수된 용매 상은 조(crude) 카에루로마이신 A를 구성한다.

상기 조 추출물로부터 카에루로마이신 A의 추가적인 분리 및 정제는 크로마토그래피 기술, 예를 들어, 컬럼 크로마토그래피(CC), 고성능 섬광 크로마토그래피(high performance flash chromatography), 준비성 중압 액체 크로마토그래피(MPLC) 및 박층 크로마토그래피(thin layer chromatography, TLC)의 적절한 조합의 사용에 의해 영향을 받을 수 있다. 분획화는 면역억제성 활성에 의해 인도될 수 있다.

그의 다양한 스펙트럼 특징의 상세한 분석을 기초로, 상기 순수한 화합물은 카에루로마이신 A로 확인되었다(도 1, 2, 3 및 4에 각각 나타난 ¹H NMR, ¹³C NMR 및 질량 스펙트럼을 참조).

본 발명의 구체예에서, 카에루로마이신 A는 미토겐으로 자극된 T 및 B-림프구의 활성을 억제했다. 상기 림프구는 T 세포 미토겐 콘카나발린 A(Con A) 및 B 세포 미토겐 리포폴리사카라이드 (LPS) 및 상이한 투여량의 카에루로마이신 A (0.0003-0.lμg/ml)로 자극받았다. 미토겐만으로 배양된 상기 세포들과 비교하면, 카에루로마이신 A는 미토겐으로 유도된 증식에서 상당한 감소를 유도했다.

본 발명의 다른 구체예에서, 카에루로마이신 A는 또한 MLR 반응, 미경험 CD4⁺ T 세포, 항원 특이적 CD4⁺ T 세포, 그리고 Th1 및 Th2 세포의 인 비트로 억제를 보였다. 카에루로마이신 A 활성은 잘 알려진 면역억제성 약물 시클로스포린 A(CsA)와 비교되었다. MLR에서 상기의 두 약물에 의한 용량 의존적 억제가 관찰되었다. 흥미롭게도, 카에루로마이신 A는 CsA보다 10 배 더 적은 양을 사용하여 유사한 양의 증식을 억제함에 있어서 효과적이었다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 카에루로마이신 A는 또한 항원 특이적 T 세포의 인 비보 증식을 억제했다. 항원(오브알부민(ovalbumin): lOOμg/ml)은 프로인트 완전 보조액(Freund's complete adjuvant)으로 유화되고 여러 군(5 생쥐/군)에서 복강내로 투여되었다. 오브알부민-자극된 동물(ovalbumin-primed animals)의 여러 군은 상이한 투여량의 카에루로마이신 A(25, 50, 75, 100 μg/lOOμl/생쥐)가 날마다 투여되었다. 7일 후, 생쥐를 희생시켰고, 각각의 군으로부터 비장세포(splenocytes)을 개별적으로 수집하고(pool), 인 비트로 증식을 모니터했다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 카에루로마이신 A는 IL-4 및 IFN-γ의 분비를 상당하게 억제했다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 카에루로마이신 A는 CD28 발현을 하향 조절하고 CTLA-4 발현을 상향 조절하여 면역억제를 유도했다. CTLA-4는 면역억제성 신호를 전달하는 것으로 확립되어 있다. 대조적으로, CD28은 T 세포에 활성화 신호를 전달한다. 카에루로마이신 A는 CTLA-4의 발현 뿐만 아니라 CTLA-4/CD4 양성 T 세포의 백분율도 상당하게 강화하고 CD28의 발현 및 CD28/CD4 양성 T cell의 백분율을 감소시키는 것으로 관찰되었다. 유사한 결과는 비(non)-CD4⁺ T 세포의 경우에도 관찰되었다.

본 발명의 다른 구체예에서, 카에루로마이신 A는 항체의 IgGl 및 IgG2a 타입의 분비를 억제했다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 카에루로마이신 A는 대식세포에서 B7-1을 상향조절했지만 B7-2 발현을 하향조절했다. 많은 보조자극성 분자가 APC의 표면에서 발현되나 B7-1 및 B7-2이 가장 강력하다. T 세포 표면에서 발현되는 CD28/CTLA-4 수용체와의 그들의 결합은 T세포 활성의 적절한 조절을 위해 결정적이다. 따라서, 우리는 그들의 리간드 B7-1 및 B7-2의 발현을 모니터했다. B7-1은 B7-2보다 CTLA-4 및 CD28에 더 강하게 결합한다. 그러나, 상기 관련되는 결합을 직접 비교할 경우, B7-1은 CD28보다 CTLA-4에 20배 더 결합하는 반면, B7-2는 CD28에 비해 CTLA-4에 약 8배 더 결합하였다. 상기된 결과에 비추어 보면, 면역억제성 제제로서 카에루로마이신 A의 강력한 역할은 T 세포에서의 CTLA-4 및 APC에서의 B7-1의 발현 증가 메카니즘에 의해 나타나는 것으로 볼 수 있다.

하기의 실시예는 본 발명의 구체적인 설명을 위한 것이고 따라서 본 발명의 보호범위를 한정하기 위하여 해석될 수 없다.

실시예 1: 카에루로마이신 A는 림프구의 면역억제를 유도한다.

카에루로마이신 A는 혼합 림프구 반응( MLR )의 면역억제를 유도한다.

200μl RPMI/FCS-10% 배지에 4x10⁵ BALB/c 비장세포 (반응 세포) 및 4xl0⁵ γ-조사된(irradiated) (3000R) C57BL/6J 비장세포 (자극 세포) 및 다양한 농도의 카에루로마이신 A (l-0.0125μg/ml) 및 시클로스포린 A (0.0125-10μg/ml)를 포함하는 각각의 웰을 갖는 96-웰 조직 배양 플레이트에서 상기 MLR을 수행했다. 배지에 BALB/c 비장세포만, γ-조사된 C57BL/6J 비장세포 및 BALB/c 비장세포 + γ-조사된 C57BL/6J 비장세포로 구성되는 대조군 배양물을 또한 유지했다. 4일 후, 상기 배양액들을 [³H]-티미딘의 lμCi로 펄스했고 16시간 후 스카트론 셀 하베스터(Skatron cell harvester)로 수확했다. 삽입된 방사성활성을 액체 섬광 계수로 측정하고 데이터는 분당 평균 계수(counts per minute, cpm)로 표현했다.

카에루로마이신 A는 상기 MLR 반응을 실질적으로 감소시켰다. 카에루로마이신 A는 상기 MLR 반응의 억제에 있어서 시클로스포린 A보다 10배 더 강력했다. 세포만(ConA 또는 LPS 또는 항-CD3Ab 또는 APC 중 어느 하나의 부재시), 즉, 카에루로마이신 A와 함께 배양된 세포를 포함하는 대조군에서는 유의한 수준의 [³H] -티미딘 삽입이 관찰되지 않았다. 모든 분석에서는, 카에루로마이신 A를 용량 의존적 방 식으로 작용했다.

카에루로마이신 A는 T 세포 및 B세포 미토겐으로 자극받은 림프구의 면역억제를 유도한다.

BALB/c 생쥐의 비장세포를 200μl의 RPMI/FCS-10% 배지에서 배양했고(5x10⁴ 세포/웰) 상이한 농도의 ConA (lμg/ml 및 2μg/ml) 또는 LPS (5μg/ml 및 lOμg/ml) 및 카에루로마이신 A (0.0003-O.lμg/ml)로 자극했다. 비장세포로 구성된 대조군 배양물을 배지만, ConA 및 DMSO와 함께 배양했다. 48시간 후, 상기 배양물을 [³H]-티미딘의 0.5μCi로 펄스했고 14시간 후 자동 세포 하베스터(Skatron, Tranby, Norway)로 수확했다. 삽입된 방사성활성을 액체 섬광 계수로 측정하고 데이터는 분당 평균 계수(cpm)으로 표현했다.

ConA만으로 배양한 상기 세포들과 비교하면, 카에루로마이신 A는 ConA (1.0 및 2.0 μg/ml)로 자극된 세포의 증식에 있어서 상당한 감소를 유도했다. 또한 본 발명자들은 LPS (5 및 10 μg/ml)로 비장세포를 자극했다. 흥미롭게도, 카에루로마이신 A는 또한 LPS (5 및 10 μg/ml)로 자극받은 상기 세포들의 증식을 억제했다. 본 발명자들은 카에루로마이신 A의 용량(0.05 및 0.1 μg/ml)이 상기 증식에서 강력한 억제를 유도하는 것을 관찰했다.

카에루로마이신 A는 항원-자극을 받은 동물로부터 얻어지는 CD4 ⁺ T 세포의 면역억제를 유도한다.

생쥐 비장세포의 단일 세포 현탁액을 OVA-CFA로 자극을 받은 생쥐로부터 얻었다. 상기 적혈구 세포를 용혈성 게이 용액(hemolytic Gey's solution)을 처리하여 제거했다. 상기 점착성 세포를 37 ℃ 및 7% CO₂에서 2시간 동안 플라스틱 페트리 접시에 도말하여 제거했다. 상기 비접착성 세포를 나일론 울 컬럼(nylon wool column)에 로딩했고(lxl0⁶ 세포/ml) 37 ℃에서 90분 동안 배양했다. 상기 배양 후, 따뜻한 RPMI를 컬럼에 통과시켜 T 림프구를 용리했다. 상기 T 세포를 RPMI으로 세척했고 4 ℃에서 45분 동안 항-Mac3 (TIB-168), 항-IA^d (MKD6), 항-수지상 세포 (TIB-227), 항-IgM 및 항-CD8 Abs와 함께 배양했다. 상기 세포를 RPMI으로 세척했고 37 ℃에서 30분 동안 아기 토끼 보충물(baby rabbit complement)과 함께 배양했다. 상기 세포를 RPMI로 세 번 세척했고 상기 증식 분석에 사용했다. 상기 세포의 순도는 항-CD3 및 CD4 Abs로 염색된 세포의 유세포 분석(flow-cytometry)으로 분석했다.

CD4⁺ T 세포를 OVA-FCA이 투여된 생쥐로부터 정제했고 항원-펄스 및 γ-조사된 비장세포로 자극했다. 항원으로 자극받은 CD4⁺ T 세포와 비교하면, 배양액 내에 카에루로마이신 A의 첨가는 상기 증식을 상당하게 억제했다.

카에루로마이신 A은 Th2 세포의 면역억제를 유도한다.

Th2 클론의 증식을 항원 펄스된 비장세포로 자극 후 7 내지 9일에 수확된 세포를 사용하여 측정했다. 상기 죽은 세포는 피콜-히스토펙(ficoll-histopaque)으로 제거했다. Th2 클론 (5x10⁴ 세포/웰)을 항-CD3 Ab (0.1 μg/ml 및 0.5 μg/ml)로 자극하거나 또는 200μl RPMI/FCS-10% 배지에서 γ-조사된 (3000 R) 동형(syngeneic) 비장세포 (5xlO⁵ 세포/웰) 및 콘알부민(conalbumin) (lOOμg/ml)과 함께 및 다양한 농도의 카에루로마이신 A (0.00625-0.1 μg/ml)와 함께 배양했다. 콘알부민만 그리고 γ- 조사된 동형 비장세포 (항원없이)와 함께 배양된 Th2 세포로 구성된 상기 대조군 배양물을 또한 유지했다. 상기 배양물을 평평한 96 웰 마이크로타이터 플레이트에 유지했고 상기 세포를 37 ℃ 및 7 % CO₂에서 배양했다. 48시간 후, 상기 배양물을 [³H]-티미딘의 0.5μCi로 펄스했고 16시간 후 수확했다. 삽입된 방사성활성을 액체 섬광 계수로 측정하고 데이터는 분당 평균 계수(cpm)로 표현했다.

카에루로마이신 A를 항-CD3 Ab 또는 콘알부민 펄스 및 γ-조사된 비장세포로 자극받은 Th2 세포의 배양물에 첨가했다. 미토겐으로 자극된 림프구 및 항원 특이적 T 세포의 경우에서 관찰한 바와 같이, 카에루로마이신 A는 또한 실질적으로 상기 자극 조건의 모두에 있어서 Th2 클론의 증식을 제한했다.

카에루로마이신 A는 Th1 세포의 면역억제를 유도한다.

Th1 세포 (lxl0⁴ 세포/웰)를 항-CD3 Ab (10 μg/ml) 및 상이한 용량의 카에 루로마이신 A로 자극했다. 24시간 후, [³H] -티미딘을 첨가했고, 그의 삽입을 8시간 후 측정했다.

카에루로마이신 A는 또한 Th1 세포 (3DO.54.8)의 증식을 억제했다. 이러한 특성은 Th1 세포가 항-CD3 Ab로 자극되었는지 여부와는 상관없이 관찰되었다.

카에루로마이신 A는 IL -4 및 IFN -γ의 생성을 억제한다.

OVA (2mg/ml)을 PBS (0.01 M, pH 7.2)에 녹이고 프로인트 완전 보조액에 유화시켰다. 그 후 유탁물(emulsion)(lOOμl)을 5 BALB/c 생쥐로 구성되는 군에 복강내로 투여했다. 대조군은 PBS만으로 투여했다. 7일 후, 생쥐를 희생시켰고 비장세포를 수집하고 증식 및 시토킨 분석에 사용했다. 비장세포 (5x10⁵ 세포/웰)를 200μl RPMI/FCS-10% 배지에 OVA (200μg/ml) 그리고 다양한 농도의 카에루로마이신 A (0.0003-0.1 μg/ml)와 함께 배양했다. 또한 상이한 농도의 카에루로마이신 A (OVA 없이), OVA 그리고 배지와 함께 배양된 비장세포로 구성된 상기 대조군 배양물을 유지했다. 상기 배양물 상청액을 48시간 후 수집했고 시토킨은 ELISA로 측정했다.

카에루로마이신 A (0.05-0.1 μg/ml)는 OVA-특이적 T 세포에 의해 IFN-γ의 분비를 유의하게 억제하는 것으로 관찰되었다. 카에루로마이신 A는 IL-1O의 생성에 있어서 어떠한 변화도 유도하지 않았다. 또한 카에루로마이신 A가 항-CD3 Ab (0.1 및 0.5 μg/ml) 또는 콘알부민 펄스된 APC로 자극받은 D10G4.1 Th2 클론에 의한 IL-4의 분비를 억제한다는 것을 알게된 것은 흥미로웠다.

카에루로마이신 A는 항원 특이적 T 세포의 인 비보 증식을 억제한다.

OVA (2mg/ml)을 PBS (0.01 M, pH 7.2)에 녹이고 프로인트 완전 보조액(FCA)에 유화시켰다. 그 후 유탁물(lOOμl)을 각 세트에 5 BALB/c 생쥐를 포함하는 7개의 군에 복강내로 투여했다. 동물의 4개의 군에 카에루로마이신 A (25, 50, 75,100 μg/lOOμl/생쥐)를 날마다 복강내로 투여했다. 상기 대조군을 PBS 그리고 에탄올-PBS 각각 lOOμl를 복강내로 면역화했다. 7일 후, 생쥐를 희생시켰고 비장세포를 분리했고 인 비트로 증식을 위해 수집(pool)했다.

상기 세포를 투여했던 항원-자극을 받은 동물로부터 분리했다. 카에루로마이신 A는 약물을 투여하지 않은 상기 동물과 비교하여 증식에 있어서 실질적인 억제를 보였다.

실시예 2: Th2 클론의 증식에서 카에루로마이신 A의 효과의 속도론( kinetics )

Th2 클론 (5xlO⁴/웰)을 항-CD3 Ab (0.5 μg/ml)로 자극했다. 카에루로마이신 A (0.05 μg/ml)을 상기 배양의 개시(0시간) 또는 다양한 시간대(4시간 내지 48시간)에서 첨가했다. 상기 배양의 48시간 후, [³H]-티미딘을 첨가했고, 그의 삽입을 12시간 후 측정했다.

상기 배양의 개시의 16시간 이전에 첨가된 경우에 있어서 카에루로마이신 A 는 Th2 세포에서 최태의 억제성 효과를 보였다(77-90 %). 42시간 이후 상기 배양에서 첨가된 경우에서도 카에루로마이신 A의 억제성 효과는 상기 생물에서 유지되었다(56 %). 그러나, 상기 반응은 상기 약물이 16시간 이전에 첨가된 경우와 비교해서는 더 작았다. 따라서, 카에루로마이신 A는 상기의 활성화 사건에서뿐만 아니라 세포 분열의 후기 단계에서도 억제성 효과를 발휘하는 것으로 나타났다.

실시예 3: 칼슘 의존적 ( PMA + 이노마이신 ) 경로에서 카에루로마이신 A의 효과

세포를 평평한 바닥 96-웰 플레이트에 5x10⁴ 세포/웰으로 접종했다. 상기의 다양한 자극 및 카에루로마이신 A를 상기 배양의 개시시에 첨가했다. 48시간 후, [³H]-티미딘 (1 μCi/웰)을 첨가했고, 12시간 후 그의 삽입을 측정했다. 카에루로마이신 A는 칼슘 의존적 경로의 증식을 상당하게 억제하는 것으로 관찰되었다.

실시예 4: 카에루로마이신 A는 CTLA -4의 상향조절 및 CD28 발현의 하향조절을 유도한다.

CD28 및 CTLA-4의 발현을 유세포 분석으로 휴지 및 ConA로 활성화된 CD4⁺ T 세포의 표면에서 검출했다. 요약하면, 상기 비장세포(3xl0⁶ 세포/웰)를 OVA (200μg/ml) 또는 ConA (lμg/ml 및 2μg/ml)로 활성화했고 상이한 농도의 카에루로마이 신 A (0.0125-0.45μg/ml)의 존재에서 배양했다. 상기의 배양물을 24, 48, 72 및 96 시간 후에 수확했고 CD4, CD28 및 CTLA-4의 발현에 대하여 세포들을 염색했다. 또한, 카에루로마이신 A를 배양의 개시시의 24시간 및 48시간 후에 첨가했고 상기 세포를 24시간 동안의 더 배양 후 염색한 배양물도 준비했다. 상기 세포들을 수확했고 PE가 접합된 항-CD4 Ab, FITC (Fluorescein isothiocyanate)가 접합된 항-CTLA-4, 및 Cy (Cy-chrome)가 접합된 CD28 Abs를 사용하여 3-색 염색을 했다. 각 현탁물의 상기 세포들을 FACScan의 CELLQUEST 소프트웨어로 확인했다 (Becton Dickinson, Mountain View, CA). 상기 세포 현탁물의 파편(debris)을 림프구와 일치하는 크기의 빛 분산 사건 (즉, 세포)으로 나오는 데이터만을 수집하게 하는 적절한 관문(gating)에 의해 상기의 분석으로부터 배제시켰다. 횡축 및 종축이 각각 로그 형광 및 상대 세포 수를 의미하는 히스토그램에서 평균 형광 강도(mean fluorescence intensity, MFI)에 대한 분석을 수행했다.

본 발명자들은 카에루로마이신 A로 매개된 면역억제를 관찰했기 때문에, 따라서 그의 작용 메카니즘을 연구할 필요가 있었다. CTLA-4는 면역억제성 신호를 T 세포에 전달하고 CD28은 증식을 위한 자극성 신호를 전달하는 것은 잘 확립되어 있다. 따라서 본 발명자들은 CD4⁺ T 세포에서 CTLA-4 및 CD28의 발현을 모니터하는 것에 관심을 갖게 되었다. 카에루로마이신 A가 CTLA-4 발현 뿐만 아니라 CTLA-4 양성 세포의 백분율을 상당하게 강화하는 것을 관찰한 것은 흥미로웠다. 반대로, 카에루로마이신은 CD28의 발현 및 백분율을 감소시켰다. 비-CD4⁺ T 세포의 경우에 있 어서 유사한 결과를 관찰했다.

따라서, 카에루로마이신 A는 CTLA-4의 발현을 강화하고 CD28의 발현을 억제하므로써 CD4⁺T 세포에 의한 증식 및 시토킨 분비를 억제하는 것을 나타낸다. 또한, 카에루로마이신 A는 LFA-I 양성 세포에서 발현 또는 백분율 변화에 있어서 어떠한 상당한 변화도 보여 주지 않았다.

실시예 5: 생쥐 흉선 세포에서 CD69 의 발현

카에루로마이신 A의 존재 하에서 CD69의 발현을 흉선 세포의 표면에서 검출했다. 흉선 세포를 3 내지 4주령 BALB/c 생쥐로부터 얻었다. 흉선 세포(4xl0⁶ 세포/웰)를 카에루로마이신의 존재 및 부재 하에서 37 ℃, 24시간 동안 1μg/ml 및 5μg/ml의 ConA로 자극했다. 상기 세포를 PE 표지된 항-생쥐 CD69 Ab로 염색했다. 상기 염색된 세포를 CD28/CTLA-4의 경우에서 상기된 바와 같이 FACScan으로 획득했다.

CD69는 T 세포 및 흉선 세포에서 활성화 마커라는 것은 알려져 있다. 흥미롭게도, 카에루로마이신 A의 첨가 후 상기 흉선 세포의 CD69의 발현에는 어떠한 변화도 없었다.

실시예 6: 카에루로마이신 A는 대식세포에서 보조-자극성 분자 B7-1, B7-2 및 CD40 의 발현을 조절한다.

상기 B7-1 및 B7-2의 발현을 상이한 농도의 카에루로마이신 A (0.05-0.lμg/ml)로 배양된 복막 대식세포의 표면에서 검출했다. 복막 대식세포를 4일 전에 2-3 ml의 티오글리코레이트(thioglycolate)와 함께 접종한 BALB/c 생쥐로부터 수확했다. 상기 세포를 BSS로 세척했다. 상기 대식세포를 37 ℃에서 1시간 동안 플라스틱 페트리 접시에 고착시키고 뒤이어 찬 BSS에서 몇 번 세척하므로써 얻었다. 상기 대식세포 (1xIO⁶)를 37 ℃ 및 7 % CO₂에서 카에루로마이신 A (0.05-0.lμg/ml)의 존재 및 부재 하에서 24, 48 및 72시간 동안 lOμg/ml의 LPS로 자극했다. 그 후 상기 세포를 수확했고 그들 각각의 항체로 염색했다. 요약하면, 상기 세포를 원심분리했고 (1200xg, 4 ℃, 5분), 상청액을 흡입했다. 상기 세포를 PBS 중의 1% BSA, 0.1% 소듐 아지드로 3번 세척했다. 첫 번째 단계에서, 상기 세포 (1x10⁶)를 4 ℃에서 45분 동안 바이오티닐레이트된 항-생쥐 B7-1, CD40 및 I-A^d (lμg/lOOμl) Ab와 함께 배양했다. 다음 단계에서, 세포를 스트렙타비딘 FITC (0.5μg/100μl) 또는 PE가 접합된 항-생쥐 B7-2 (0.5μg/100μl) Ab로 염색했고, 45분 동안 배양했다. 일반적인 단계의 세척을 각각의 단계에서 수반했다. 마지막으로 상기 세포를 5번 세척했고 파라포름알데히드로 고정했다. 상기 염색된 세포를 CD28/CTLA-4의 경우에서 언급된 바와 같이 FACScan로 획득했다. 상기의 항원 제시 세포는 CTLA-4 및 CD28의 리간드인 B7-1 및 B7-2을 발현하기 때문에, 흥미롭게도, 카에루로마이신 A는 B7-1의 발현을 강화하고 B7-2 분자의 디스플레이를 감소시켰다. 반대로, 카에루로마이신 A는 J774에서 B7-2의 발현을 증가시키지만 B7-1 발현의 경우에 있어서는 어떠한 주된 변화가 관찰되지 않았다. 또한 본 발명자들은 또 다른 보조 자극성 분자 CD40의 발현에 있어서 카에루로마이신 A의 역할을 평가했다. 72시간 후 CD40의 발현에 있어서 미세한 증가를 관찰했다.

실시예 7: 카에루로마이신 A는 대식세포에서 IA ^d 의 발현을 하향 조절한다.

IA^d의 발현을 상이한 농도의 카에루로마이신 A(0.05-0.lμg/ml)와 함께 배양된 복막 대식세포의 표면에서 검출했다. 복막 대식세포를 4일 전에 2-3 ml의 티오글리코레이트(thioglycolate)와 함께 접종한 BALB/c 생쥐로부터 수확했다. 상기 세포를 BSS로 세척했다. 상기 대식세포를 37 ℃에서 1시간 동안 플라스틱 페트리 접시에 부착시키고 뒤이어 찬 BSS로 몇 번 세척하여 얻었다. 상기 대식세포 (1xIO⁶)를 37 ℃ 및 7 % CO₂에서 카에루로마이신 A (0.05-0.lμg/ml)의 존재 및 부재 하에서 24, 48 및 72시간 동안 lOμg/ml의 LPS로 자극했다. 그 후 상기 세포를 수확했고 그들 각각의 항체로 염색했다.

요약하면, 상기 세포를 원심분리했고 (1200xg, 4 ℃, 5분), 상청액을 흡입했다. 상기 세포를 PBS 중의 1% BSA, 0.1% 소듐 아지드로 3번 세척했다. 첫 번째 단계에서, 상기 세포 (1x10⁶)를 4 ℃에서 45분 동안 바이오티닐레이트된 항-생쥐 I-A^d (lμg/lOOμl) Ab와 함께 배양했다. 다음 단계에서, 세포를 스트렙타비딘 FITC (0.5μg/100μl)로 염색했고, 45분 동안 배양했다. 일반적인 단계의 세척을 각각의 단계에서 수반했다. 마지막으로 상기 세포를 5번 세척했고 파라포름알데히드로 고정했다. 상기 염색된 세포를 CD28/CTLA-4의 경우에서 언급된 바와 같이 FACScan으로 획득했다. 카에루로마이신 A가 IA^d의 발현을 하향 조절한다는 것을 본 명세서에서 언급한 것은 흥미롭다. 이는 카에루로마이신 A는 상기의 APC에 의한 항원의 가공 및 제시를 억제할 수 있다는 것을 나타낼 수 있다.

실시예 8: 인 비보 증식을 위한 면역 방법

오브알부민 (3mg/ml)을 PBS (pH 7.2)에 녹이고 프로인트 완전 보조액(FCA)으로 유화시켰다. 그 후 유탁물(lOOμl)을 각 세트에 5 BALB/c 생쥐를 포함하는 상이한 군에 복강내로 투여했다. 동물의 4개의 군에 카에루로마이신 A (25, 50, 75,100 μg/lOOμl/생쥐)를 날마다 복강내로 투여했다. 대조군은 에탄올-PBS에 의하여 복강내로 면역화했다.

실시예 9: 오브알부민 -유도된 림프구증식 및 시토킨 추정

7일 후, 생쥐를 희생시켰고 비장세포를 수집했고 증식 분석에서 사용했다. 비장세포 (2x10⁵ 세포/웰)를 200μl RPMI/FCS-10% 배지 중 OVA (100μg/ml) 그리고 다양한 농도의 카에루로마이신 A (0.1-0.0003 μg/ml)와 함께 배양했다. 또한 상이한 농도의 카에루로마이신 A (OVA 없이), OVA 및 배지와 함께 배양된 비장세포로 구성된 대조군 배양물을 유지했다. 72시간 후, 상기 배양물을 [³H]-티미딘의 1μCi로 펄스했고 14시간 후 수확했다. 삽입된 방사성활성을 액체 섬광 계수로 측정하고 데이터는 분당 평균 계수(cpm)로 표현했다.

실시예 10: 카에루로마이신 A은 항원 특이적 T 세포의 인 비보 증식을 억제한다.

상기 생쥐를 7일 동안 상이한 투여량의 카에루로마이신 A로 투여했다(도 1). 상기 동물을 희생시켰고 비장세포를 항원 및 상이한 농도의 카에루로마이신 A (0.00625-0.10 μg/ml)와 함께 인 비트로 배양했다. 흥미롭게도, 카에루로마이신의 4가지 농도의 모두(25-100 μg/생쥐/일)를 투여한 상기 동물로부터 분리된 세포는 약물을 투여하지 않은 상기 동물들과 비교했을 때 증식에 있어서 실질적인 억제성을 보였다(도 1). 투여량 의존적 방식으로 상기 증식에서의 감소를 관찰했다. 세포가 0.10 μg/ml의 카에루로마이신 A로 배양되었을 때 거의 완벽한 억제를 관찰했다. 또 다른 실험 세트에 있어서, 항원을 처리한 후 7일 동안 PBS-에탄올 또는 카에루로마이신 A (25 μg/생쥐/일)를 투여한 동물로부터 상기 세포를 분리했다 (도 2). 카에루로마이신 A를 투여한 상기 생쥐로부터 분리된 세포는 성장에 있어서 PBS-에탄올에 의해 면역화된 상기 동물로부터 분리된 세포와 비교한 것과 같이 상당한 수준의 지체(retardation)를 보였다(도 2)

도. CaeA 는 인-비보 OVA 특이적 T 세포의 증식을 억제한다.

각각 5마리 동물을 포함하는, 상이한 군을 OVA로 면역화하고, 뒤이어 생쥐를 희생시키기 전 7일 동안 날마다 CaeA를 투여했다. 비장세포 (2xl0⁵ 세포/웰)를 분리하고 lOOμg/ml OVA 및 다양한 용량의 CaeA와 함께 인 비트로 배양했다. 72시간 후, [³H]-티미딘을 첨가했고, 16시간 후 그의 삽입화를 측정했다. 배지만으로 배양된 세포로 구성된 상기 대조군 배양물은 3789±359 cpm을 보였고, 세포+OVA는 16387±431 cpm을 보였고 PBS-에탄올에 의해 면역화하고 OVA와 함께 인-비트로 배양된 상기 동물로부터 얻은 세포는 13801±587 cpm을 보였다(도 1). 또 다른 실험 세트에 있어서, 세가지 상이한 군을 OVA로 면역화하고 뒤이어 생쥐를 희생시키기 전에 7일 동안 날마다, 상기 군 중에서 하나에는 CaeA (25μg/생쥐) 그리고 또 다른 군에는 알코올 (비히클 대조군)을 투여했다. 비장세포 (2x10⁵ 세포/웰)를 분리하고 인 비트로만으로 또는 OVA 100 및 200 μg/ml와 함께 배양했다(도 2). 각각의 점은 상기 대표적인 실험 중의 하나로부터 3배수 측정값의 평균±SEM을 나타낸다.

실시예 11: 카에루로마이신 A의 발효에 의한 제조

A. 접종물 제조

증류수 리터당 포도당 5.4 g, 효모 추출물 4.8 g, 맥아 추출물 8.5 g, CaCO₃ 3.0 g의 조성을 갖는 5 ml를 가진 씨드 배양물 접종시험관을 준비했다. pH를 7.2로 조정하고, 상기의 배양액(broth)을 멸균시키고 냉각 후 액티노알로테이쿠스 스피티 에미스 sp. nov의 얼린 배양물을 첨가했다. 200 rpm에서 선회 교반(orbital agitation)하면서 30시간 동안 28 ℃에서 박테리아를 배양했다. 증류수 리터당 포도당 5.4 g, 효모 추출물 4.8 g, 맥아 추출물 8.5 g, CaCO₃ 3.O g으로 정의되는 멸균 배양 배지 100 ml를 가진 1000 ml의 흔들 플라스크 내에 상기 배양액 7.5 ml를 무균적으로 접종했다. 알칼리 용액으로 pH를 7.0으로 조정했다. 200 rpm에서 선회 교반으로 30시간 동안 28 ℃에서 박테리아를 배양했다.

B. 발효

증류수 리터당 포도당 5.4 g, 효모 추출물 4.8 g, 맥아 추출물 8.5 g, CaCO₃ 3.O g로 정의된 생산 배지 5 리터를 가진 7 리터의 발효기를 30분 동안 122 ℃에서 멸균했다. 두 번째 단계의 접종물 500 ml을 상기 발효기에 접종했다. 28 ℃에서 lv/v/m 통기(aeration)로 220 rpm 교반으로 상기 발효 배양물을 배양했다.

C. 분리

상기의 배양의 종료 후, 원심분리로 고형물을 제거했다. 상기 상청액 부분(4.8 리터)을 2.5리터의 에틸 아세테이트로 두번 추출했다. 상기 결합된 유기 상을 황산나트륨으로 건조하고, 여과하여 진공에서 건조물로 농축했다. 상기 조 잔류물을 물:메탄올(1:1) 80 ml에 녹이고, 50 ml의 핵산으로 두 번 분획하여 탈지(defat)하였다. 상기 물/에탄올 분획을 에틸 아세테이트 50 ml로 두번 추출했다. 상기 유기 용매를 증발기에서 농축하여 카에루로마이신 A를 포함하는 조 잔류물(crude residue)을 산출했다.

실시예 12: 조 추출물로부터 카에루로마이신 A의 분리

상기 조 잔류물을 5 ml 아세톤 중에 녹이고 용리 용매로서 톨루엔/아세톤 75:25의 혼합물을 사용하여 고성능 섬광 크로마토그래피 시스템 (high performance flash chromatography System)(Horizon HPFC system, Biotage, USA)에 의한 실리카 겔(32-63 μM)에서 크로마토그래피했다. 이동상으로서 클로로폼-메탄올-20% 수성 암모니아 95:4:1을 사용한 TLC 분석에 근거하여, 기초로 분획을 결합했다.

실시예 13: 면역억제의 유도에 있어서 [ 액티노알로테이쿠스의 신규 종으로부터 분리된] 카에루로마이신 A의 작용은 하기의 사항을 기초로 한다.

ㆍ BALB/c 생쥐의 비장세포를 ConA (lμg/ml 및 2μg/ml) 또는 LPS (5μg/ml 및 lOμg/ml)로 자극하고 상이한 농도의 카에루로마이신 A (0.0003-0.lμg/ml)와 함께 배양했다. 48시간 후, 상기 배양물을 0.5μCi의 [³H]-티미딘으로 펄스했고 14시간 후 자동 세포 하베스터로 수확했다. 삽입된 방사성활성을 액체 섬광 계측에 의하여 측정했다.

ㆍ 프로인트 완전보조액 중에 유화된 항원 오브알부민 (100 μg/ml)을 5 BALB/c 생쥐로 구성된 군에 투여했다. 대조군은 PBS만으로 투여되었다. 7일 후, 생 쥐를 희생시켰고 비장세포를 수집하여 증식 및 시토킨 분석을 위해 사용했다. 비장세포를 200μl RPMI/FCS-10% 배지 중에 오브알부빈 (200μg/ml) 및 다양한 농도의 카에루로마이신 A (0.0003-0.lμg/ml)와 함께 배양했다. 72시간 후, 상기 배양액을 1μCi의 [³H]-티미딘으로 펄스했고 14시간 후 수확했다. 삽입된 방사성활성을 액체 섬광 계측에 의하여 측정했다. 상기 배양물 상청액을 48시간 후 수집했고 시토킨을 ELISA로 측정했다.

ㆍ 상이한 용량의 카에루로마이신 A의 면역억제성 효과를 미경험 CD4⁺ T 세포, 항원 반응성 CD4⁺ T 세포, Th2 클론 및 Th1 하이브리도마에서 모니터했다. 상기 세포를 γ-조사된 (3000 Rads) 및 항원-펄스된 비장세포 및 다양한 농도의 카에루로마이신 A (0.00625-0.lμg/ml)와 함께 배양했다. 상기 배양물을 37 ℃ 및 7% CO₂에서 배양했다. 72시간 후, 상기 배양물을 0.5μCi의 [³H]-티미딘으로 펄스했고 14시간 후 수확했다. 삽입된 방사성활성을 액체 섬광 계측에 의하여 측정했다.

ㆍ MLR 반응에서 카에루로마이신 A의 면역억제성 효과. 다양한 농도의 카에루로마이신 A (0.0125-1 μg/ml) 및 양성 대조군인 시클로스포린 A (0.0125-10μg/ml)와 함께 BALB/c 비장세포 (응답 세포) 및 γ-조사된 C57BL/6J 비장세포 (자극 세포)를 사용하여 상기의 MLR을 수행했다. 4일 후, 상기 배양물을 1μCi의 [³H]-티미딘으로 펄스했고 16시간 후 수확했다. 삽입된 방사성활성을 액체 섬광 계측에 의하여 측정했다.

ㆍ T 세포의 증식에서 카에루로마이신 A의 인 비보 면역억제성 효과. 오브알부민을 프로인트 완전 보조액(FAC)으로 유화하고 상이한 군(5 생쥐/군)의 동물에 복강내로 투여했다(lOOμg/lOOμl). 상이한 군의 항원-자극을 받은 동물에 카에루로마이신 A (25, 50, 75, 100 μg/lOOμl/생쥐)를 매일 투여했다. 7일 후, 생쥐를 희생시켰고 비장세포를 분리했고, 인 비트로 증식을 위해 수집했다.

ㆍ 카에루로마이신 A는 T 세포에서 CTLA-4를 상향조절하고 CD28 발현을 억제하여 면역억제를 유도한다. 휴지 및 ConA 활성화된 CD4⁺ T 세포의 표면에서 유세포 분석(flowcytometry)으로 CD28 및 CTLA-4 발현을 검출했다. 상기 비장세포를 항원 (OVA) 또는 미토겐 (ConA)으로 활성화시켰고 카에루로마이신 A (0.0125-0.45μg/ml)와 함께 상이한 지속기간(24, 48, 72 및 96 시간) 동안 배양했다. 상기 배양물을 24, 48, 72 및 96 시간 후 수확했고 CD4⁺ T 세포에서 CD28 및 CTLA-4의 발현을 PE가 접합된 항-CD4 Ab, FITC가 접합된 항-CTLA-4 Ab, Cy(Cy-chrome)이 접합된 CD28 Ab를 사용한 3-칼라 염색으로 평가했다.

ㆍ 유사하게, B7-1, B7-2 및 I-A^d의 발현을 6번에서 언급한 바와 같이 복막 대식세포에서 유세포 분석으로 또한 모니터했다. 일반식 1의 상기 화합물 카에루로마이신, 그의 유도체 및 약학적으로 허용가능한 그의 염은 면역억제성 제제로서 효과적이다.

유리한 점( Advantages ):

본 발명의 주요 이점은 하기와 같다.

(i) CD4⁺ T 세포는 면역 반응의 개시시 그리고 조절에 있어서 결정적인 역할을 하기 때문에 그의 활성화를 억제하는 것은 면역억제성 치료에 있어서 강력한 접근방법을 제공한다. 이것은 다른 많은 면역억제성 약물 및 자가면역의 약물치료의 경우에 있어서 매우 잘 기록되어 있다(Galvin 등 1993, Thomson 1991, Crespo-Leiro 2003). 또한, 상기의 CD4⁺ T 세포의 역할은 많은 자가면역 질환에 있어서 매우 잘 기록되어 있다(Abbas 등 2004, Wraith 등 2004). 카에루로마이신 A는 미경험 및 항원 특이적 작용자 CD4⁺ T 세포에 의해 상기 증식 및 시토킨 (IL-4 및 IFN-γ) 분비를 억제하기 때문에 자가면역 질환에 있어서 매우 전망있는 의약일 것이다. 또한, 카에루로마이신 A는 T 세포에서 CTLA-4을 상당하게 증가시켰고 뒤이어 CD28 발현을 하향조절했다. 또한 본 발명자들은 CTLA-4를 발현하는 CD4⁺ T 세포의 증가된 양과 CD28 양성 세포의 수가 감소하는 것을 확인했다. 비-CD4⁺ T 세포의 경우에 있어서도 유사한 결과가 관찰되었다. 림프구 반응은 CTLA-4로 매개된 억제성 신호에 의해 억제된다는 개념에 의하여 점점 인식되고 있다(Krummel 등 1996, Leibson 2004).

(ii) 동종이형 MHC 분자의 인식은 장기 이식에 있어서 주된 장애이다. 따라서 알로-인식(allo-recognition)의 억제는 만성 거부반응의 발병 및 악화를 감소시킬 수 있고 이식된 장기의 장기간 지속되는 생존을 제공할 것이다. 본 발명자들은 상기 MLR에서 카에루로마이신 A에 의한 투여량 의존적 억제를 관찰했고 그것은 잘 알려진 면역억제성 약물인, 시클로스포린 A (CsA)보다 10배 더 강력했다. 본 발명자들은 또한 카에루로마이신이 MHC 분자의 발현을 억제하는 것을 관찰했다. 동종이형 MHC의 증가된 수준은 장기 이식 생존에 있어서 주된 장애이다. 따라서 MHC 분자의 발현의 억제는 좀 더 허용성이 개선된 이식을 제공할 것이다. 따라서, 이는 카에루로마이신 A가 이식에서 효과적으로 사용될 수 있음을 보여준다. 또한, 카에루로마이신 A는 CsA의 사용에 있어서 기록된 높은 암 발병 때문에 CsA에 비해 이점을 갖고 있다(Rovira 등 2000).

참조문헌:

1. Abbas AK, Lohr J, Knoechel B, Nagabhushanam V. T cell tolerance and autoimmunity. Autoimmun Rev. 3:2004:471-475.

2. Agrewala JN, Vinay DS, Joshi A, Mishra GC. A 150-kDa molecule of macrophage membrane stimulates interleukin-2 and interferon-gamma production and proliferation of ovalbumin-specific CD4⁺T cells. Eur J Immunol. 24:1994:2092-7.

3. Agrewala JN, Suvas S, Verma RK, Mishra GC. Differential effect of anti-B7-l and anti-M150 antibodies in restricting the delivery of costimulatory signals from B cells and macrophages. J Immunol. 160: 1998: 1067-77.

4. Chandran RR, Sankaran R, Divekar PV. Phytotoxic properites of caerulomycin and some of its derivatives. J Antibiot (Tokyo). 1968:243.

5. Chatterjee DK, Raether W, Iyer N, Ganguli BN. caerulomycin, an antifungal antibiotic with marked in vitro and in vivo activity against Entamoeba histolytica. Z Parasitenkd. 1984;70(5):569-73.

6. Chambers CA, Kuhns MS, Egen JG, Allison JP. CTLA-4-mediated inhibition in regulation of T cell responses: mechanisms and manipulation in tumor immunotherapy. Annu Rev Immunol. 19:2001:565-594.

7. Chen W, Jin W, Wahl SM. Engagement of cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4 (CTLA-4) induces transforming growth factor beta (TGF-beta) production by CD4(⁺) T cells. J Exp Med. 188:1998:1849-57.

8. Crespo-Leiro MG. Tacrolimus in heart transplantation. Transplant Proc. 35:2003:1981-3.

9. Divekar PV, Read G, Vining LC. caerulomycin, a new antibiotic from Streptomyces caeruleus Baldacci. I. Structure. Can J Chem. 45:1967:1215-22.

10. Funk A, Divekar PV. caerulomycin, a new antibiotic from Streptomyces caeruleus Baldacci. I. Production, isolation, assay, and biological properties. Can J Microbiol. 5:1959:317-21.

11. Freeman GJ, Long AJ, Iwai Y, Bourque K, Chernova T, Nishimura H, Fitz LJ, Malenkovich N, Okazaki T, Byrne MC, Horton HF, Fouser L, Carter L, Ling V, Browman MR, Carreno BM, Collins M, Wood CR, Honjo T. ' Engagement of the PD-I immunoinhibitory receptor by a novel B7 family member leads to negative regulation of lymphocyte activation. J Exp Med. 92:2000:1027-34.

12. Galvin F, Freeman GJ, Razi-Wolf Z, Benacerraf B, Nadler L, Reiser H. Effects of cyclosporin A, FK 506, and mycalamide A on the activation of murine CD4⁺ T cells by the murine B7 antigen. Eur. J. Immunol. 23: 1993: 283-6.

13. Greenwald RJ, Boussiotis VA, Lorsbach RB, Abbas AK, Sharpe AH. CTLA-4 regulates induction of anergy in vivo. Immunity. 14:2001:145-55.

14. Greenwald RJ, Freeman GJ, Sharpe AH. The B7 family revisited. Annu Rev Immunol. 23:2005:515-548.

15. Krummel MF, Allison JP. CTLA-4 engagement inhibits IL-2 accumulation and cell cycle progression upon activation of resting T cells. J Exp Med. 183:1996:2533-40.

16. Lanzavecchia A, Lezzi G, Viola A. From TCR engagement to T cell activation: a kinetic view of T cell behavior. Cell. 96:1999:1-4.

17. Lee KM, Chuang E, Griffin M, Khattri R, Hong DK, Zhang W, Straus D, Samelson LE, Thompson CB, Bluestone JA. Molecular basis of T cell inactivation by CTLA-4. Science 282:1998:2263-66.

18. Leibson PJ. The regulation of lymphocyte activation by inhibitory receptors. Curr Opin Immunol. 16:2004:328-36.

19. Linsley PS, Brady W, Urnes M, Grosmaire LS, Damle NK, Ledbetter JA. CTLA-4 is a second receptor for the B cell activation antigen B7. J Exp Med.174:1991:561-9.

20. Nishimura H, Okazaki T, Tanaka Y, Nakatani K, Hara M, Matsumori A, Sasayama S, Mizoguchi A, Hiai H, Minato N, Honjo T. Autoimmune dilated cardiomyopathy in PD- 1 receptor-deficient mice. Science. 291 :2001:319-22.

21. Prashar Y, Khanna A, Sehajpal P, Sharma VK, Suthanthiran M. Stimulation of transforming growth factor-beta 1 transcription by cyclosporine. FEBS Lett. 358:1995:109-12.

22. Rovira P, Mascarell L, Truffa-Bachi P. The impact of immunosuppressive drugs on the analysis of T cell activation. Curr Med Chem. 7:2000:673-92.

23. Salomon B, Lenschow DJ, Rhee L, Ashourian N, Singh B, Sharpe A, Bluestone JA. B7/CD28 costimulation is essential for the Homeostasis of the CD4⁺ CD25⁺ immunoregulatory T cells that control autoimmune diabetes. Immunity 12:2000:431-40.

24. Salomon B, Bluestone JA. Complexities of CD28/B7: CTLA-4 costimulatory pathways in autoimmunity and transplantation. Annu. Rev. Immunol. 19:2001:225-52.

25. Stamper CC, Zhang Y, Tobin JF, Erbe DV, Ikemizu S, Davis SJ, Stahl ML, Seehra J, Somers WS, Mosyak L. Crystal structure of the B7-1/CTLA-4 complex that inhibits human immune responses. Nature 410:2001 :608-l 1.

26. Takahashi T, Tagami T, Yamazaki S, Uede T, Shimizu J, Sakaguchi N, Mak TW, Sakaguchi S. Immunologic Self-tolerance maintained by CD25 (+) regulatory T cells constitutively expressing cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4. J Exp Med. 192:2000:303-10.

27. Thomson AW. The immunosuppressive macrolides FK-506 and rapamycin. Immunol Lett. 29:1991:105-11.

28. Tivol EA, Borriello F, Schweitzer AN, Lynch WP, Bluestone JA, Sharpe AH. Loss of CTLA-4 leads to massive lymphoproliferation and fatal multiorgan tissue destruction, revealing a critical negative regulatory role of CTLA-4. Immunity 3:1995:541-47.

29. Tivol EA, Schweitzer AN, Sharpe AH. Costimulation and autoimmunity. Curr. Opin. Immunol. 8:1996:822-830.

30. van der Merwe PA, Bodian DL, Daenke S, Linsley P, Davis SJ. CD80 (B7-1) binds both CD28 and CTLA-4 with a low affinity and very fast kinetics. J. Exp. Med. 185:1997: 393-404.

31. Wraith DC, Nicolson KS, Whitley NT. Regulatory CD4⁺ T cells and the control of autoimmune disease. Curr Opin Immunol. 16:2004:695-701.

Claims

일반식 1의 화합물 3,6-디치환된-4-메톡시-2,2'-비피리딘 또는 그 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 면역 억제용 약학적 조성물로서,

식 1

상기에서, X = -CH:NOR₁, -COOR₁, -CHO, -CH₂OR₂이고, Y = H, OR₃이고, R₁ = H, C₁ 내지 C₁₆의 직선형 또는 가지형 사슬 알킬이고, R₂ = H, C₁ 내지 C₁₆의 정상 또는 가지형 사슬 알킬, C₁ 내지 C₁₆의 정상 또는 가지형 사슬 아실이고, R₃ = H, 메틸, 에틸, 이소프로필, 이소부틸인 것인 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기의 화합물은 식 2의 (E)-4-메톡시-2,2'-비피리딘-6-카브알데히드 옥심 (카에루로마이신 A)인 것인 약학적 조성물.

식 2
제1항에 있어서, 상기의 화합물은 식 3의 (E)-4-메톡시-2,2'-비피리딘-6-카브알데히드 O-메틸 옥심인 것인 약학적 조성물.

식 3
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 1.25 내지 5.0 mg/체중kg의 투여량 범위인 약학적 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물은 알려진 면역억제성 제제인, 시클로스포린 A보다 면역 반응을 억제하는 것에 있어서 10배 더 효과적인 것인 약학적 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 희석제 ml 당 0.1 μg의 상기 화합물은 48시간 이내에 90% 내지 97%의 면역 세포를 억제하는 것인 약학적 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물은 T 세포, B 세포, 혼합 림프구 반응, 미경험 CD4⁺ 세포, 항원 특이적 작용자 CD4⁺ T 세포, Th1 세포 및 Th2 세포의 인 비트로 증식을 억제하는 것인 약학적 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물은 인터페론-감마(IFN-γ) 또는 인터루킨-4(IL-4)을 포함하는 시토킨의 인 비트로 분비를 억제하는 것인 약학적 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물은 T 세포 상에서 활성화 마커 CD28의 발현을 하향 조절하고 억제 마커 CTLA-4의 발현을 상향 조절하는 약학적 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물은 대식세포 상에서 B7-1의 발현을 증가시키고 B7-2 및 MHC 분자의 발현을 감소시키는 것인 약학적 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물은 알파-베타 T 세포 및 감마-델타 T 세포, CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포, Th1 및 Th2 세포, 미경험, 작용자, 기억 및 조절 T 세포의 억제를 유도하는 것인 약학적 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물은 B 세포, 비만 세포, 내피 세포, NK 세포, 골수 수지상 세포, 림프종 수지상 세포, 림프 수지상 세포, 및 간질성 수지상 세포를 포함하는 수지상 세포, 단핵세포, 비장 대식세포, 복막 대식세포, 폐포 대식세포, 쿠퍼 세포, 랑게르한스 세포, 파골세포, 교세포 및 모든 종류의 대식세포를 포함하는 대식세포, 상피 세포, 골아세포, 호산구, 호염기구, 과립구, 혈소판 및 거핵구의 억제를 유도하는 것인 약학적 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 아디손 질환, 자가면역 용혈성 빈혈, 굿페스쳐 증후군, 그레이브스 질환, 하시모토 갑상선염, 특발성 혈소판감소성 자반증, 인슐린 의존성 당뇨병, 중증 근무력증, 악성 빈혈, 자발성 불임, 다발성 경화증, 류머티스 관절염, 전신성 홍반성 루푸스, 또는 자발성 유산을 포함하는 자가면역 질환의 치료에 유용한 것인 약학적 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물은 면역억제를 유도하고 거부 반응, 이식 편대 숙주 반응을 방지하며 이식에 도움을 주는 것인 약학적 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물은 간질, 발작, 뇌 허혈증, 뇌성 마비, 알퍼 질환, 파킨슨 질환, 알츠하이머 질환, 헌팅턴 질환, 근위축성 측삭 경화증, 다발성 경화증, 루이체 치매, 레트 증후군, 신경병증 통증, 척수 외상, 또는 외상성 뇌 손상을 포함하는 신경학적 질환의 치료에 유용한 것인 약학적 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기의 화합물은 인도의 히말라야의 차가운 사막으로부터 분리된, 악티노마이세테스 액티노알로테이쿠스 스피티엔시스(Actinoalloteichus spitiensis) [MTCC 6194]의 신종으로부터 분리된 것인 약학적 조성물.
액티노알로테이쿠스 스피티엔시스(Actinoalloteichus spitiensis) [MTCC 6194]로부터의 면역억제성 제제로서 유용한 제2항의 화합물의 분리방법으로서,

[a] 교반 상태 하에 25 내지 30 ℃에서 30 내지 100시간 동안 pH 7.0 - 8.5의 수성 영양 배지 내의 조절된 호기성 발효 상태 하에서 액티노알로테이쿠스 스피티엔시스(Actinoalloteichus spitiensis) [MTCC 6194]의 균주를 배양하는 단계,

[b] 단계 [a]에서 얻어지는 세포를 침전시켜 세포 유리 상청액을 얻는 단계, 및

[c] 단계 [b]에서 얻어지는 상기 상청액으로부터 식 2의 (E)-4-메톡시-2,2'-비피리딘-6-카브알데히드 옥심 (카에루로마이신 A)을 추출한 후 그를 정제하는 단계를 포함하는 방법.

식 2
제17항에 있어서, 상기 세포는 40 내지 70시간 동안 배양되는 것인 방법.
제17항에 있어서, 상기 세포는 28 내지 30 ℃에서 배양되는 것인 방법.
제17항에 있어서, 상기 세포는 pH 7 내지 pH 8.5에서 배양되는 것인 방법.
제17항에 있어서, 상기의 식 2의 화합물의 회수는 150 mg/배양액인 것인 방법.
제17항에 있어서, 상기에서 얻어지는 활성 분획은 면역억제성 제제로서 유용한 것인 방법.
약학적으로 허용가능한 희석제, 첨가제 및 담체 중 하나 이상과 함께 식 1의 화합물 1.25 내지 5.0 mg을 포함하는 면역억제에 유용한 면역억제성 약학적 조성물로서,

식 1

상기에서, X = -CH:NOR₁, -COOR₁, -CHO, -CH₂OR₂이고, Y = H, OR₃이고, R₁ = H, C₁ 내지 C₁₆의 정상 또는 가지형 사슬 알킬이고, R₂ = H, C₁ 내지 C₁₆의 정상 또는 가지형 사슬 알킬, C₁ 내지 C₁₆의 정상 또는 가지형 사슬 아실이고, R₃ = H, 메틸, 에틸, 이소프로필, 이소부틸인 약학적 조성물.
제17항에 있어서, 상기 방법은

[d] NMR, 적외선 및 중량 스펙트럼 데이터를 사용하여 상기 정제된 분획을 특성화하는 단계를 더 포함하는 방법.