JPH06343480A

JPH06343480A - Ｓｆ２３１５ａの製造法及びその薬学的用途

Info

Publication number: JPH06343480A
Application number: JP14076893A
Authority: JP
Inventors: Tadao Yamazaki; 忠雄山崎; Akinori Naito; 明教内藤; Hisaichi Nemoto; 久一根本; Seiichi Saito; 清一斎藤; Nankin O; 南金王
Original assignee: CHUGOKU IGAKUKA GAKUIN IYAKU SEIBUTSU GIJUTSU KENKYUSHO; Nippon Kayaku Co Ltd
Current assignee: CHUGOKU IGAKUKA GAKUIN IYAKU SEIBUTSU GIJUTSU KENKYUSHO; Nippon Kayaku Co Ltd
Priority date: 1993-06-11
Filing date: 1993-06-11
Publication date: 1994-12-20

Abstract

(57)【要約】【目的】ＳＦ２３１５Ａの薬学的用途及びその製造方
法。【構成】ノカルディア属に属するＮｏｃａｒｄｉａ
ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉｖａｒ．ｋａｎｇｌｅｉ
ｓｉｓ１７４７−６４株を培養し、その培養物から単
離精製することによりＳＦ２３１５Ａを製造する。本化
合物は、免疫抑制作用を有し、且つ腫瘍細胞の増殖を抑
制する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はＳＦ２３１５Ａの製造法
及びその薬学的用途に関する。更に詳細には臓器移植に
よる拒絶反応などに適用できる免疫抑制物質として、あ
るいは抗腫瘍剤として有用なＳＦ２３１５Ａの製造法及
びその薬学的用途に関する。

【０００２】

【従来の技術】シクロスポリンＡはヘルパーＴ細胞クロ
ーンの増殖を選択的に阻害し、臓器移植の拒絶反応に対
する免疫調節薬として用いられている（Ａｇｅｎｔｓ
ａｎｄＡｃｔｉｏｎｓ，Ｖｏｌ．６，ｐｐ．４６８−４
７５（１９７６））。またＦＫ−５０６は最近発見され
たマクロライド抗生物質（Ｃ₄₄Ｈ₆₉ＮＯ₂₂）であり同様
に免疫調節薬として用いられている。しかし、これらの
薬剤は毒性、効力の面での問題がないわけでない。また
医療技術の進歩にともなって、種々の用途に適した新た
な薬剤の開発が望まれている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、これ
までの免疫抑制物質の種々の欠点を克服し得る、より理
想的な免疫抑制物質を提供することである。本発明の他
の目的は、免疫抑制物質を製造する方法を提供すること
である。本発明の更に他の目的は、新たな抗腫瘍剤を提
供することである。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、微生物の
代謝産物について、広く種々検索した結果、ノカルディ
ア属に属す一菌株が強い免疫抑制活性及び抗腫瘍活性を
持つ物質を産生することを発見した。この活性物質を培
養液より精製単離し、物理化学的な物性を検討した結
果、特開昭６２−２９６８８７号公報及びＪｏｕｒｎａ
ｌｏｆＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．４１，ｐ
ｐ．８３５−８４８（１９８８））により既に報告され
ているＳＦ２３１５Ａと同定された。特開昭６２−２９
６８８７号公報等の記載によれば、ＳＦ２３１５Ａの具
体的用途は、微生物に対するＳＦ２３１５Ａの抗菌作用
に注目した医薬、動物薬、農薬に限定されている。従っ
て本発明は、ノカルディア属に属する微生物を利用した
ＳＦ２３１５Ａの製造法及びその免疫抑制剤及び抗腫瘍
剤としての薬学的用途に関するものである。

【０００５】本発明の第１の要旨は、下記式

【化２】で表わされるＳＦ２３１５Ａの製造法であって、ノカル
ディア属に属するＳＦ２３１５Ａ生産菌を培養し、その
培養物からＳＦ２３１５Ａを採取することを特徴とする
ＳＦ２３１５Ａの製造法である。本発明の第２の要旨
は、ＳＦ２３１５Ａまたはその薬学的に許容しうる塩を
有効成分として含有する免疫抑制剤である。本発明の第
３の要旨は、ＳＦ２３１５Ａまたはその薬学的に許容し
うる塩を有効成分として含有する抗腫瘍剤である。

【０００６】本発明によれば、ＳＦ２３１５Ａはノカル
ディア属に属するＳＦ２３１５Ａ生産菌を栄養培地中で
培養して、ＳＦ２３１５Ａを生成蓄積せしめ、得られる
培養物よりＳＦ２３１５Ａを採取することによって得る
ことができる。ＳＦ２３１５Ａ生産菌の代表的な１例
は、中華人民共和国で採取されたノカルディア属に属す
る菌株、Ｎｏｃａｒｄｉａｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ
ｖａｒ．ｋａｎｇｌｅｎｓｉｓ１７４７−６４株
が挙げられる。この菌株の菌学的性質及び生理学的性質
などを以下に示す。

【０００７】１．形態的性質２８℃で２週間後に観察した結果、気菌糸は単純分岐
し、その先端は波状あるいはループ状である。基生菌糸
の分断が認められる。胞子のう及び輪生糸の形成は認め
られない。胞子表面は平滑または粗面、ときにとげ状
で、胞子はシリンダー型で、大きさが０．６〜０．８×
０．８〜１．３μｍである。また１０個内外の連鎖をな
して胞子が形成される。２．各種培地における生育各種培地上、２８℃、２週間後の生育状態を下記表１に
示す。

【０００８】

【表１】

【０００９】３．生理学的性質生育適度範囲：２７〜３７℃ 硝酸塩の還元：陰性ゼラチンの液化（グルコース・ペプトン・ゼラチン培地
上、２０℃）：陰性スターチの加水分解（スターチ・無機塩寒天培地）：陰
性脱脂牛乳の凝固：陽性脱脂牛乳のペプトン化：陽性メラニン様色素の生成：陰性４．炭素源の利用性（プリドハム・ゴドリーブ寒天培地
上）Ｌ−アラビノース＋Ｄ−キシロース＋Ｄ−グルコース＋Ｄ−フラクトース＋シュクロース＋イノシトール＋Ｌ−ラムノース＋ラフィノース − Ｄ−マニトール＋５．細胞壁中のジアミノピメリン酸ｍｅｓｏ−ジアミノピメリン酸である。

【００１０】以上を要約すると、本菌株は細胞壁がｍｅ
ｓｏ−ジアミノピメリン酸であり、インターナショナル
・ストレプトミセス属・プロジェクト（略称ＩＳＰ）の
方法によれば、胞子形成菌糸の形態は、セクションレク
チフレキシビルズ（Ｒｅｃｔｉｆｌｅｘｉｂｉｌｅｓ）
またはレクチナキュリアパーティ（Ｒｅｃｔｉｃｕｌｉ
ａｐｅｒｔｉ）に属し、胞子表面は平滑または粗面で、
成熟した菌糸の色は白色系統（Ｗｈｉｔｅｃｏｌｏｒ
ｓｅｒｉｅｓ）で、メラニン様色素及び培地中に色素は
生産しない。基生菌糸の色は淡褐色あるいは淡黄色を呈
し、分断が認められる。炭素源としてはＬ−アラビノー
ス、Ｄ−グルコース、Ｄ−フラクトース、シュクロー
ス、イノシトール、Ｌ−ラムノース、Ｄ−キシロース、
Ｄ−マンノース、Ｄ−マニトールを利用するが、ラフィ
ノースを利用しない。

【００１１】以上の性質をもとにアール・イー・ブッフ
ァナン・アンド・エヌ・イー・ギボンズ編、バージーズ
・マニュアル・オブ・デタミネーティブ・バクテリオロ
ジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓＭａｎｕａｌｏｆＤｅｔ
ｅｒｍｉｎａｔｉｖｅＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第
８版、１９７４及びバージーズ・マニュアル・オブ・シ
ステマティク・バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ
ＭａｎｕａｌｏｆＳｙｓｔｅｍａｔｉｃＢａｃｔｅ
ｒｉｏｌｏｇｙＶｏｌｕｍｅ４，１９８９）に従っ
て検索を行った結果、上記菌株は、ノカルディア属に属
することが判明したので本菌株をＮｏｃａｒｄｉａｍ
ｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉｖａｒ．ｋａｎｇｌｅｎｓｉ
ｓ１７７４−６４株（以下１７４７−６４株という）
と命名した。該菌株は、１９９１年２月２０日に中華人
民共和国の中国微生物菌種保存管理委員会に寄託され、
受託番号ＣＧＭＣＣＮｏ：０１６３が付与されてい
る。また該菌株は、１９９２年１月２８日に工業技術院
微生物工業技術研究所にブタベスト条約に基づく国際寄
託がされており、受託番号として微工研条第３７１８号
（ＦＥＲＭＢＰ−３７１８）が付与されている。

【００１２】ＳＦ２３１５Ａは、上記の菌株で代表され
るノカルディア属に属するＳＦ２３１５Ａ生産菌を培養
しその培養物から採取することによって得ることができ
る。本生産菌の培養に供される培地は、炭素源として
は、グルコース、水飴、デキストリン、シュークロー
ス、澱粉、糖蜜、動物及び植物油等を使用できる。窒素
源としては、大豆粉、小麦粉、小麦胚芽、コーンスチー
プリカー、綿実かす、肉エキス、ペプトン、酵母エキ
ス、硫酸アンモニウム、硝酸ソーダ、尿素等を利用でき
る。その他、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、コ
バルト等の無機塩類を必要に応じて添加することも有効
である。培養に適当な温度は１５〜３７℃であるが、多
くの場合、２６〜３０℃付近で培養する。ＳＦ２３１５
Ａの生産は、培地や培養条件により異なるが、振盪培
養、タンク培養とも通常１〜１０日の期間でその蓄積が
最高に達する。蓄積が最高になったときに、培養を停止
し、培養液から目的物質を単離精製する。

【００１３】ＳＦ２３１５Ａの培養液からの採取にあた
っては、その性状を利用した通常の分離手段を適宜組み
合わせて抽出して精製することができる。培養濾液を酢
酸エチル等の水不混和性の有機溶媒で抽出する方法及び
ダイヤイオンＨＰ−２０、アンバーライトＸＡＤ−２等
の吸着樹脂を用いて有効物を吸脱着し、粗製物を採る。
得られた粗抽物からの精製は、脂溶性物質の採取に用い
られる公知の方法、例えば吸着クロマトグラフィー、ゲ
ル濾過クロマトグラフィー、溶媒沈殿法、薄層クロマト
グラフィーのかき取り、高速液体クロマトグラフィー等
を組み合せて、純粋に単離することができる。

【００１４】かくして製造されるＳＦ２３１５Ａは薬学
的に許容し得る塩の形態であってもよい。これらの塩と
しては、例えばナトリウム、カリウム、リチウムなどと
のアルカリ金属塩やカルシウム、マグネシウムなどとの
アルカリ土類金属塩等が挙げられる。これらの塩は、そ
れ自体周知の方法によって得ることができる。ＳＦ２３
１５Ａを免疫抑制剤としてあるいは抗腫瘍剤として用い
る場合には、単独または賦形剤あるいは担体と混合して
注射剤、経口剤、または坐剤などとして投与される。賦
形剤及び担体としては薬剤学的に許容される通常使用さ
れるものが選ばれ、その種類及び組成は投与経路や投与
方法によって決まる。製剤中におけるＳＦ２３１５Ａの
含量の種類等により種々異なるが、通常０．１〜１００
重量％、好ましくは１〜９８重量％である。例えば注射
剤の場合には、通常０．１〜３０重量％、好ましくは１
〜１０重量％の有効成分を含むようにするのがよい。経
口投与する場合には、通常使用される固体担体もしくは
液状担体とともに錠剤、カプセル剤、粉剤、顆粒剤、液
剤、ドライシロップ剤等の形態で用いられ、カプセル
剤、錠剤、顆粒剤、粉剤等は、一般に５〜１００重量
％、好ましくは２５〜９８重量％の有効成分を含むよう
にするのがよい。ＳＦ２３１５Ａを免疫抑制剤及び抗腫
瘍剤として用いる場合の投与量は、患者の年令、体重、
症状、治療目的等により決定されるが治療に有効な量は
一般に、非経口投与で１〜１００ｍｇ／ｋｇ・日、経口
投与で５〜５００ｍｇ／ｋｇ・日である。

【００１５】

【作用】ＳＦ２３１５Ａは免疫担当細胞であるマウスリ
ンパ球の機能に対して強い抑制作用を及ぼす。即ち、Ｕ
ｍｅｚａｗａ等による方法（Ｕｍｅｚａｗａｅｔ．ａ
ｔ．，“ＳｕｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＴｉｓｓｕｅ
ＧｒａｆｔＲｅｊｅｃｔｉｏｎｂｙＳｐｅｒｑｕ
ａｌｉｎ”，ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｎｔｉ
ｂｉｏｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．３８，ｐｐ．２８３−２８
４，１９８５）に準じ、リンパ球幼若化反応に対する作
用を調べたところＳＦ２３１５ＡはＣｏｎＡ（コンカナ
バリンＡ）で刺激を受けたＴリンパ球の幼若化反応を著
しく抑制した。以上の結果は、ＳＦ２３１５ＡがＴリン
パ球の機能を有意に抑制することを示す。この抑制作用
は、体液性免疫及び細胞性免疫の抑制を意味するので、
その異常亢進が原因と考えられる臓器移植あるいは皮膚
移植における拒絶反応の抑制にＳＦ２３１５Ａが極めて
有用である。また、各種の自己免疫が主たる原因と考え
られる自己免疫病、例えばループス腎炎などの治療にも
ＳＦ２３１５Ａは極めて有用である。また、ＳＦ２３１
５Ａは、腫瘍細胞の１種であるＫ５６２白血病細胞株の
増殖を強く抑制する。従って、ＳＦ２３１５Ａは、白血
病などの腫瘍治療薬としても極めて有用である。

【００１６】

【実施例】以下に本発明を実施例及び試験例により更に
詳細に説明する。実施例１ＳＦ２３１５Ａの単離精製種培地として、グルコース２．５％、サンリッチ（大豆
粉）０．５％、酵母エキス０．５％、硫酸アンモニウム
０．５％、塩化カリウム０．２５％、第２燐酸カリウム
０．０２％、硫酸マグネシウム０．０２％、炭酸カルシ
ウム０．５％、消泡剤としてシリコンＫＭ−７００．
０１％を含む培地を５００ｍｌのエルレンマイヤーフラ
スコに１００ｍｌ分注し、１２０℃、３０分間殺菌し
た。この培地にＮｏｃａｒｄｉａｍｅｄｉｔｅｒｒａ
ｎｅｉｖａｒ．ｋａｎｇｌｅｎｓｉｓ１７４７−
６４株の寒天斜面培養の１白金耳を接種し、２７℃、１
８０回転／分のローター振盪機上に２日間培養し第一種
培養とした。ついで、前記と同組成の種培地を５００ｍ
ｌエルレンマイヤーフラスコに１００ｍｌを分注し、１
２０℃、３０分間殺菌した。この培養器に第一種培養液
２ｍｌを移植し、２７℃、２日間培養しこれを第二種培
養とした。ついで、生産培地として、グルコース５．０
％、酵母エキス１．０％、塩化アンモニウム０．５％、
炭酸カルシウム０．５％、さらに消泡剤としシリコンＫ
Ｍ−７００．０５％、プロナールＳＴ−１０．０３
％からなる培地２０リットルを３０リットル容のジャー
ファーメンターに仕込み、１２０℃、３０分間殺菌し
た。この培養槽に、前記の第二種培養液４００ｍｌを接
種し、２７℃、通気（６リットル／分）、攪拌（２２０
回転／分）で５日間培養した。

【００１７】培養終了後、濾過助剤パーライトを培養液
に添加し、濾過にて培養濾液７４リットルを得た。得ら
れた濾液７４リットルをダイヤイオンＨＰ−２０（三菱
化成社製）２．７リットルを充填したカラムに通液し、
目的物を吸着した。ついで、蒸留水及び５０％メタノー
ル水溶液でカラムを洗滌した。さらに、メタノールをカ
ラムに通液し、目的物を回収した。この回収液を減圧下
濃縮し濃縮液３００ｍｌを得た。この濃縮液を酢酸エチ
ル２５０ｍｌで２回抽出し酢酸エチル層に目的物を回収
した。酢酸エチル層を減圧濃縮し、褐色油状物９．６ｇ
を得た。この粗物質をメタノール７０ｍｌに溶解させシ
リカゲル（メルク社製Ａｒｔ．７７３４）２５ｇを加え
て減圧下、濃縮乾固した。この乾固物をクロロホルムに
懸濁させ、あらかじめクロロホルムで充填したシリカゲ
ル６０（メルク社製Ａｒｔ７７３４）１１００ｍｌのカ
ラムにかけ、クロロホルムで洗滌した。ついで、目的物
をクロロホルム：メタノール（５０：１）溶媒を通液
し、溶出した。この溶出液を濃縮乾固して褐色油状物７
９０ｍｇが得られた。この粗物質をメタノール１５ｍｌ
に溶解し、シリカゲル６０（メルク社製Ａｒｔ７７３
４）５ｇを加えて減圧下、濃縮乾固した。次いで、これ
をｎ−ヘキサンに懸濁させ、あらかじめｎ−ヘキサンで
充填したシリカゲル（メルク社製Ａｒｔ７７３４）、１
６０ｍｌのカラムにかけ、ｎ−ヘキサン洗滌後、ｎ−ヘ
キサン：アセトン（５：１）溶媒で目的成分を溶出し
た。この溶出画分を減圧下濃縮乾固すると赤褐色ペース
ト状物質が２１０ｍｇ得られた。これをｎ−ヘキサンに
懸濁させ、不溶物を濾別し、不溶物を乾燥すると赤褐色
粉末２９ｍｇが得られた。これを少量のメタノールに溶
解した後、メタノールで充填したセファデックスＬＨ−
２０（ファルマシア社製）、６０ｍｌカラムに通液し、
メタノールで展開した。有効画分を集め、減圧下濃縮乾
固すると赤褐色粉末が、１５ｍｇ得られた。これを少量
のエタノールで加温溶解させ冷却するとオレンジ色結晶
が析出した。濾別結晶を乾燥して純粋なＳＦ２３１５Ａ
１０．５ｍｇが得られた。

【００１８】かくして得られた結晶（１０．５ｍｇ）に
ついて、物理化学恒数を測定し、その分析値をＳＦ２３
１５Ａ文献記載値（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｎｔｉｂ
ｉｏｔｉｃｓＶｏｌ．４１，ｐｐ．８３５−８４８，
１９８８）と照合した。その結果、培養液の単離活性物
質をＳＦ２３１５Ａ物質と同定した。主な物性について
以下に記載する。分子量（ＦＡＢ−ＭＳ）：ｍ／ｚ３２５〔Ｍ＋Ｈ〕⁺ 紫外部吸収・スペクトル：メタノール溶液で測定したス
ペクトルを図１に示す。赤外部吸収スペクトル：臭化カリウム錠で測定したスペ
クトルを図２に示す。水素核磁気共鳴スペクトル：重ジメチルスルホキシド中
で測定したスペクトルを図３に示す。

【００１９】試験例１リンパ球幼若化反応に対するＳＦ２３１５Ａの作用Ｃ５７１３Ｌ／６マウスの脾細胞（２×１０⁵個／ウエ
ル）を、コンカナバリンＡ（５μｇ／ｍｌ）存在下にＳ
Ｆ２３１５Ａと共に７２時間培養した。リンパ球の増殖
は、培養終了の６時間前に、３７ＫＢｑの〔³Ｈ〕−チ
ミジンを添加し、その細胞内への取り込み量を測定して
評価した。結果は、ＳＦ２３１５Ａの濃度１μｇ／ｍｌ
で阻害率９７．７％を示した。試験例２Ｋ５６２白血病細胞株の増殖に対するＳＦ２３１５Ａの
作用Ｋ５６２細胞（１×１０⁵個）を、ＳＦ２３１５Ａと共
に、７２時間培養した。培養後、コールターカウンター
を用いて細胞数を測定し評価した。結果は、ＳＦ２３１
５Ａの濃度１μｇ／ｍｌにおいて阻害率８９．８％を示
した。

【００２０】実施例２錠剤の製造ＳＦ２３１５Ａ３０重量部、結晶乳糖１２０重量部、
結晶セルロース１４７重量部及びステアリン酸マグネシ
ウム３重量部をＶ型混合機で打錠し、１錠３００ｍｇの
錠剤を得た。

【００２１】

【発明の効果】試験例１及び２に示した結果から明らか
なように、ＳＦ２３１５Ａは濃度１μｇ／ｍｌにおいて
リンパ球幼若化反応に対して阻害率９７．７％を示し、
Ｋ５６２白血病細胞株の増殖に対して阻害率８９．８％
を示した。従って、ＳＦ２３１５Ａは、Ｔリンパ球の機
能を有意に抑制するため臓器移植における拒絶反応の抑
制並びに自己免疫疾患の治療に有用であり、また腫瘍の
治療にも有用である。

【図面の簡単な説明】

【図１】Ｎｏｃａｒｄｉａｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ
ｖａｒ．ｋａｎｇｌｅｎｓｉｓ１７４７−６４株
の培養物から単離精製されたＳＦ２３１５Ａの紫外部吸
収スペクトルを示す。

【図２】Ｎｏｃａｒｄｉａｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ
ｖａｒ．ｋａｎｇｌｅｎｓｉｓ１７４７−６４株
の培養物から単離精製されたＳＦ２３１５Ａの赤外部吸
収スペクトルを示す。

【図３】Ｎｏｃａｒｄｉａｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ
ｖａｒ．ｋａｎｇｌｅｎｓｉｓ１７４７−６４株
の培養物から単離精製されたＳＦ２３１５Ａの水素核磁
気共鳴スペクトルを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者斎藤清一千葉県柏市松葉町４−７−２−407 (72)発明者王南金中華人民共和国北京宣武区天壇西里１号

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記式【化１】で表わされるＳＦ２３１５Ａの製造法であって、ノカル
ディア属に属するＳＦ２３１５Ａ生産菌を培養し、その
培養物からＳＦ２３１５Ａを採取することを特徴とする
ＳＦ２３１５Ａの製造法。
【請求項２】ＳＦ２３１５Ａ生産菌がＮｏｃａｒｄｉ
ａｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉｖａｒ．ｋａｎｇｌ
ｅｎｓｉｓ１７４７−６４株（微工研条寄第３７１５
号：ＦＥＲＭＢＰ−３７１８）である請求項１記載の
製造法。
【請求項３】ＳＦ２３１５Ａまたはその薬学的に許容
しうる塩を有効成分として含有する免疫抑制剤。
【請求項４】ＳＦ２３１５Ａまたはその薬学的に許容
しうる塩を有効成分として含有する抗腫瘍剤。