CN101269179A - 治疗老年痴呆的中药制剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种治疗老年痴呆的中药制剂及其制备方法,它是由中药原料人参、炙黄芪、淫羊藿、延胡索、天麻、当归、制何首乌、黄精和石菖蒲经醇提、水煮工艺制备而成,本发明是以中医理论为指导,利用科学理论和先进技术,研制而出的一种疗效好、毒副作用小的治疗老年痴呆的中药制剂,经实验研究证明,该中药制剂对拟AD大鼠模型的学习记忆能力有较好的改善作用。同时,可提高机体的抗疲劳和抗应激能力,对肾虚有较好的治疗作用。此外本发明还提供了一种适合工业生产的、优选的制备方法。
Description
技术领域
本发明涉及中药技术领域,特别是涉及一种治疗老年痴呆的中药制剂及其制备方法。
背景技术
随着全球人口老龄化,阿尔茨海默氏病(Aizheimer’s disease,AD)的发病率呈逐年上升的趋势。由于缺乏有效的治疗手段,AD已成为继心、脑血管疾病和肿瘤之后第4位危害人类健康的致死性疾病。据统计我国60岁以上的老年人口总数占人口总数的10%左右,约有5%为AD患者。因此,寻找防治AD的有效药物已经成为生命科学中亟待解决的问题。
目前国内外广泛用于临床的抗老年痴呆药物中确实有一批疗效确切、使用较安全的化学药品,但是,如同大多数化学药一样,应用于临床的神经***化学药也越来越多地显示副作用。事实证明大量经过中药治疗的AD患者,不仅智能状况大为改善,而且还能延年益寿。采用中医药治疗AD在世界范围内越来越被人们所接受。国内乃至世界范围内从中医中药、天然药物出发,利用现代科学技术研究开发预防和治疗老年性痴呆的药物,合乎当今世界范围内“回归自然”的潮流。
现代医学认为:β-淀粉样肽、Tau蛋白、载脂蛋白(APOE)、神经递质的改变、基因突变、自由基、金属元素、营养及代谢障碍、肿瘤、激素、免疫***机能障碍、慢性病毒感染、脑外伤等都会引起老年痴呆。
在临床应用中,王德华等人的补肾固本法即用愚聪汤(制附子、淫羊藿、肉桂、首乌、石菖蒲等)以温肾助阳生髓,临床症状明显改善,神志渐清,记忆恢复,总有效率达94.1%。邵念方等用补肾活血法,针对肾虚血瘀、脑络受阻,以补肾通络开窍治疗。治疗后血脂及部分血液流变学指标亦较治疗前明显改善。其方用益智胶囊(首乌、枸杞子、人参、石菖蒲、川芎、赤芍)。孙继铭的补肾豁痰法认为该病是以肾精气虚损为根本,痰瘀闭窍为发病关键。提出治呆必补肾,肾精足则脑髓充;治呆必开窍,开窍得神明,故以益肾豁痰开窍恢复神明。其方用益肾豁痰汤(熟地、肉苁蓉、山萸肉、制南星、僵蚕、法夏、竹茹)。周乐全等比较补肾益智方(由枸杞子、何首乌、人参、牡丹皮、冰片等组成)及双益平对痴呆模型大鼠学***。
发明人在文献调研时,发现有很多中药复方治疗老年性痴呆的临床报道。为了继承和发扬中医药学特色和优势,积极开发具有自主知识产权的抗老年性痴呆新药,拟对贵州省中医的保密经验方进行抗老年痴呆活性物质的研究。该处方具有补脾益气、补肾填精、养血安神、平肝息风、活血化瘀、豁痰开窍等功效。临床用于治疗老年人记忆力减退、疲劳、多梦等症。本发明在此经验方的基础上,充分利用科学理论和先进技术手段,以中医理论为指导优化组方,运用现代化技术研制预防和治疗老年痴呆的传统中药复方制剂。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是在抗衰老保密经验方的基础上,以中医理论为指导,利用科学理论和先进技术,研制一种疗效好、毒副作用小的治疗老年痴呆的中药制剂及其制备方法。
为了解决上述技术问题,本发明采用如下的技术方案:
按照重量份计算,治疗老年痴呆的中药制剂是由中药原料人参50~70份、炙黄芪100~140份、淫羊藿80~100份、延胡索80~100份、天麻100~140份、当归80~100份、制何首乌100~140份、黄精100~140份和石菖蒲100~140份制备而成。
优选的,它是由中药原料人参60份、炙黄芪120份、淫羊藿90份、延胡索90份、天麻120份、当归90份、制何首乌120份、黄精120份和石菖蒲120份制备而成。
本发明还提供了前述治疗老年痴呆的中药制剂的一种优选制备方法,包括如下步骤:
(1)醇提:取人参、天麻、炙黄芪、淫羊藿、延胡索五味药材用85%乙醇回流提取,滤过,得醇提液,减压回收乙醇,药液备用;
(2)水煮:取当归、制何首乌、黄精、石菖蒲四味药材加水煎煮,滤过,滤液减压浓缩备用;
(3)制剂成型:合并醇提药液和水煮药液,浓缩至稠膏,真空干燥,按常规制剂工艺制成药剂学意义上的各种剂型。
具体为:
(1)醇提:取人参、天麻、炙黄芪、淫羊藿、延胡索五味药材用8~20倍量85%乙醇回流提取1~3次,每次1~3h,滤过,得醇提液,减压回收乙醇,药液备用;
(2)水煮:取当归、制何首乌、黄精、石菖蒲四味药材用8~16倍量水煎煮1~3次,每次1~3h,滤过,滤液减压浓缩备用;
(3)制剂成型:合并醇提药液和水煮药液,浓缩至稠膏,于60~80℃真空干燥,按常规制剂工艺制成药剂学意义上的各种剂型。
进一步的,治疗老年痴呆的中药制剂的制备方法:
(1)醇提:取人参、天麻、炙黄芪、淫羊藿、延胡索五味药材用85%乙醇回流提取2次,每次2h,第一次加16倍量乙醇,第二次加14倍量乙醇,滤过,得醇提液,减压回收乙醇,药液备用;
(2)水煮:取当归、制何首乌、黄精、石菖蒲四味药材用水煎煮3次,每次2h,第一次加14倍量水,第二次和第三次加12倍量水,滤过,滤液减压浓缩备用;
(3)制剂成型:合并醇提药液和水煮药液,浓缩至稠膏,于70℃真空干燥,按常规制剂工艺制成药剂学意义上的各种剂型。
方解:本处方中的人参、制何首乌、天麻、石菖蒲为君药,具有补气益精固气,息风开窍宁神之功;黄精、制黄芪、当归为臣药,具有补脾益气升阳,养血活血化淤之效;淫羊藿、延胡索为佐药,能补肝益肾壮骨,活血行气解郁。诸药合用,使气血得补肝肾得养,淤化气行,心神安宁,脑窍遂醒。故能抗衰老,防治老年痴呆等证。
本发明在保密经验方的基础上,进行了大量的实验,具体如下:
一、制备工艺及其研究
1、工艺路线的设计
1.1工艺路线设计
经过对各药材活性部位或成分的相关文献调研,综合各药味的有效成分或有效部位的理化性质和提取方法,初步设定天参益智胶囊的提取制备工艺可按以下几条设计路线进行:
(1)该复方各药材的主要活性成分或活性部位都具有一定的水溶性,按传统工艺一起加水煎煮,滤过,回收浓缩,干燥,得浸膏样品。
(2)据文献报道该复方中人参、天麻、炙黄芪、淫羊霍、延胡索发挥益智功效的主要活性成分或活性部位在一定的醇水中的提取率最好,选择人参、天麻、炙黄芪、淫羊霍、延胡索五味药材以一定浓度的醇水提取,而制何首乌、当归、黄精、石菖蒲四味药材一起加水煎煮,然后醇提液和水煎液分别回收浓缩至稠膏后合并,干燥得浸膏样品。
(3)据文献报道人参、天麻、炙黄芪所含多糖具有一定的抗氧化、增强免疫力的功能,故选择人参、天麻、炙黄芪、淫羊霍、延胡索五味药材先以一定浓度的醇水提取,其药渣再与制何首乌、当归、黄精、石菖蒲四味药材一起加水煎煮,然后醇提液和水煎液分别回收浓缩至稠膏后合并,干燥得浸膏样品。
1.2益智作用相关活性筛选
发明人参照以上三条工艺路线制备样品,进行了对抗beta淀粉样肽毒性作用、对细胞胆碱酯酶活性影响、对细胞α7尼古丁受体蛋白表达的影响的活性筛选,结果如下(方法学见后“本发明胶囊剂治疗AD的分子作用机制研究”):
1.2.1对抗beta淀粉样肽毒性作用
结果表明,各样品均能不同程度对抗beta淀粉样肽引起的MTT还原率的下降;其对抗性比较:2≈3>1。与空白组相比,*P<0.05;**P<0.01,与模型组相比,#P<0.05;##P<0.01。
1.2.2对细胞胆碱酯酶活性影响
结果表明不同工艺所制备的样品都能抑制细胞胆碱酯酶活性,其抑制活性:2>3>1。与空白组相比,*P<0.05;**P<0.01。
1.2.3对细胞α7尼古丁受体蛋白表达的影响
结果表明,不同工艺所制备的样品均能不同程度的上调细胞α7尼古丁受体蛋白的表达,上调能力依次为:2≈3>1。与空白组相比,*P<0.05;**P<0.01。
1.3工艺路线优选
根据1.2益智作用相关活性筛选结果,工艺2和3制备的样品在抗beta淀粉样肽毒性作用、抑制细胞胆碱酯酶活性能力、上调细胞α7尼古丁受体蛋白表达能力上无差别,结合生产的实际情况,工艺2制备路线较工艺3简洁。故选择按工艺路线2来制备样品,即方中人参、天麻、炙黄芪、淫羊霍、延胡索五味药材醇提,制何首乌、当归、黄精、石菖蒲四味药材一起水提。视出膏情况及实验实际情况选择精制工艺,并根据成型性确定其辅料种类及加入量。
2、工艺条件筛选
2.1醇提工艺条件筛选
2.1.1药材吸水率的考察
称取3份1/10处方量的药材:人参6g、天麻12g、炙黄芪12g、淫羊藿9g、延胡索9g置于容器中,加入水600mL,浸泡至心,将多余水滤去,称重,按下式计算吸水率。结果醇提部分药材的平均吸水率为218.1%,结果见表1,故在醇提工艺中第一次提取时比第2次多加2倍量的提取溶媒。
表1 醇提工艺吸水率试验
2.1.2醇提次数的选择
称取2/50处方量醇提药材,第一次按16倍量85%乙醇回流提取2.0h,第二次14倍量2.0h,第三次14倍量1.5h,每次醇提液单独滤过,分次测定淫羊藿苷、天麻素、紫堇碱的含量及醇浸膏得率,结果见表2。
表2 醇提次数的选择
回流次数 | 醇浸膏得率(%) | 淫羊藿苷提取量(mg) | 天麻素提取量(mg) | 紫堇碱提取量(mg) |
第一次、第二次 | 20.58 | 23.10 | 21.43 | 4.016 |
第三次 | 1.66 | 0.49 | 0.57 | 0.105 |
第三次所占比例*(%) | 7.46 | 2.08 | 2.59 | 2.58 |
*指第三次醇提取占总醇浸膏量、淫羊藿苷提取量、总黄酮提取量的比例。
试验结果表明,以浸膏得率为指标,第三次醇提所占比例为7.46%;以淫羊藿苷提取量为考察指标,第三次醇提所占比例为2.08%;以天麻素提取量为考察指标,第三次醇提所占比例为2.59%;以紫堇碱提取量为考察指标,第三次醇提所占比例为2.58%,说明两次醇提已基本完全,故采用醇提两次的工艺。
2.1.3正交试验优选提取工艺
根据文献资料和试验结果,提取时间、加醇量、乙醇浓度是影响提取率的主要因素,按每个因素3水平,用L9(34)正交表安排试验(表3)。以醇浸膏得率、淫羊藿苷提取量、天麻素提取量、紫堇碱提取量为评价指标,对醇提工艺进行探讨。
2.1.3.1材料与仪器
仪器:HP1100高效液相色谱仪(包括HP1100泵,HP1100紫外检测器,HP1100柱温箱,HP1100/WND-3D工作站),旋转蒸发仪(东京理化),紫外分光光度仪(岛津UV-2401)。
材料:淫羊藿苷对照品、天麻素对照品(由中国药品生物制品检定所提供。批号:110737-200312,110807-2002205),紫堇碱对照品(由贵阳医学院药学院分析化学教研室提供,经波谱数据鉴定为紫堇碱,由HPLC面积归一化法测定其纯度大于98.5%,乙腈(色谱纯),纯净水(乐百氏纯净水),甲醇(色谱纯),其他试剂均为分析纯。
2.1.3.2方法与结果
表3 因素水平表
a.醇浸膏得率的测定
按L9(34)正交表安排试验,称取2/50处方量药材,按设定方案进行提取,滤过,滤液合并,测定总体积V总;精密吸取50mL的醇提液于已干燥至恒重的蒸发皿中,水浴挥干,于105℃干燥3小时,置干燥器中冷却30min,迅速称重。按下式计算浸膏得率,结果见表4。
b.淫羊藿苷、天麻素和紫堇碱的含量测定
按L9(34)正交表安排试验,称取2/50处方量药材,按设定方案进行提取,滤过,滤液合并,定容至一定体积;照高效液相色谱法(《中国药典》(2005年版一部附录33页VID)测定淫羊藿苷、天麻素的含量,计算淫羊藿苷、天麻素和紫堇碱的提取量,结果见表4。
色谱条件:①淫羊藿苷:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,乙腈∶水(30∶70)为流动相,流速:1mL·min-1,波长:270nm;柱温:40℃。②天麻素:色谱柱:DiamonsilTMC18(5μm,250×4.6mm);流动相:乙腈-水(2∶98);柱温:40℃;检测波长:220nm;流速:1mL·min-1;进样量:10μL。③紫堇碱:DiamonsilTMC18柱(5μm,250×4.6mm),柱温:30℃;检测波长:280nm,流动相:0.1%的磷酸(三乙胺调pH=6)∶乙睛(48∶52),流速1mL/min。
对照品溶液的制备:分别精密称定淫羊藿苷对照品、天麻素对照品、紫堇碱对照品,置于容量瓶中,溶解,定容,摇匀,淫羊藿苷对照品溶液浓度为129μg·mL-1,天麻素对照品溶液浓度为209μg·mL-1,紫堇碱对照品溶液浓度为65.6μg·mL-1。
样品溶液的制备:按正交实验设计方案进行提取,滤过,滤液合并,定容至一定体积,即得各样品溶液。
测定法:取各样品溶液过0.45μm微孔滤膜,滤液即为供试品液。分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液各10μL,注入液相色谱仪,测定,即得。
表4 醇提工艺正交试验设计表及结果
注:醇提工艺采用4个评价指标,采用综合评分进行数据分析,淫羊藿苷权重系数为0.3,紫堇碱权重系数为0.3,天麻素权重系数为0.3,浸膏得率权重系数为0.1。综合评分=(淫羊藿苷/淫羊藿苷最大量×0.3+紫堇碱/紫堇碱最大量×0.3+天麻素/天麻素最大量×0.3+浸膏得率/浸膏得率最大量×0.1)×100
方差分析
将正交试验结果进行方差分析,结果见表5。
表5 醇提工艺评价指标方差分析表
*P<0.05,F0.05(2,2)=19.00
从表4结果直观分析,各因素影响提取工艺中的各评价指标的顺序为A>B>C,其中醇提浓度的影响最大;表5方差分析结果表明,以提取工艺中的天麻素为评价指标,乙醇浓度和乙醇倍量均有显著性意义(P<0.05);以浸膏得率为评价指标,乙醇倍量具有显著性意义(P<0.05);对各评价指标进行综合评价,乙醇浓度具有显著性意义(P<0.05);最佳工艺条件为A3B1C1。
验证试验
称取2/50处方量药材,按最佳方案A3B1C1进行验证试验,结果与正交试验结果吻合。说明该工艺稳定,可行,结果见表6。因此,确定醇提工艺为14倍量85%乙醇回流提取2次(第一次用16倍量的85%乙醇),每次2h。
表6 醇提工艺验证结果
序号 | 淫羊藿苷(mg) | 紫堇碱(mg) | 天麻素(mg) | 浸膏得率(%) |
1 | 23.79 | 4.204 | 22.43 | 22.41 |
2 | 24.17 | 4.116 | 22.38 | 21.69 |
3 | 24.08 | 4.243 | 22.60 | 22.27 |
平均 | 24.01 | 4.188 | 22.47 | 22.12 |
2.2.水煎煮工艺条件筛选
2.2.1药材吸水率的考察
称取3份1/10处方量的药材:当归9g、制何首乌12g、黄精12g、石菖蒲12g于容器中,加入10倍量水,浸泡至透心,将多余的水滤去,称重,按上文药材吸水率公式进行计算吸水率。结果煎煮工艺中水煮药材的平均吸水率为171.9%,结果见表7,即相当于煎煮工艺中第一次提取时多加2倍量的水。
表7 醇提工艺吸水率试验
样品序号 | 药材干重(g) | 药渣湿重(g) | 吸水率(100%) | 平均吸水率(100%) |
1 | 45.2 | 127.5 | 182.1 | 171.9 |
2 | 45.3 | 121.6 | 168.4 | |
3 | 44.8 | 118.8 | 165.2 |
2.2.2正交试验优选煎煮工艺
根据文献资料和预试验结果,煎煮次数、加水量、煎煮时间是影响煎煮工艺的主要因素,按每个因素3水平,用L9(34)正交表安排试验(表8)。以总糖、二苯乙烯苷、浸膏得率为评价指标,对煎煮工艺进行探讨。
2.2.2.1材料与仪器
仪器:HP1100高效液相色谱仪(包括HP1100泵,HP1100紫外检测器,HP1100柱温箱,HP1100/WND-3D工作站),旋转蒸发仪(东京理化),紫外分光光度仪(岛津UV-2401)、HHS电热恒温水浴锅(上海医疗器械三厂)。
材料:D-无水葡萄糖、二苯乙烯苷对照品(由中国药品生物制品检定所提供。批号:110833-200503,0844-200503),其他试剂均为分析纯
2.2.2.2方法与结果
表8 因素水平表
a.浸膏得率的测定
按L9(34)正交表安排试验,称取1/25处方量药材:当归3.6g、何首乌4.8g、黄精4.8g、石菖蒲4.8g,按设定方案进行煎煮,滤过,测定滤液总体积V总。同上文“醇浸膏得率测定法”处理,计算浸膏得率,结果见表9。
b.总糖测定(硫酸苯酚法)
样品处理称取1/25处方量药材,按L9(34)正交表安排试验,得煎煮液,滤过,滤液,量取溶液体积,为样品液,参照《中国药典》(2005年版一部58页)玉竹多糖测定法测定。
葡萄糖对照品溶液的制备:精密称取0.0305g无水葡萄糖标准品,置于50mL容量瓶中,加水稀释至刻度,摇匀即得(每1mL含0.61mg葡萄糖)。
标准曲线制备:分别精密吸取标准对照储备液0mL、0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL、3.0mL于50mL容量瓶中,加蒸馏水稀释至刻度,摇匀,再分别精密量取各浓度的对照品溶液2mL于具塞试管中,精密加入4%的苯酚液1mL,迅速加入浓硫酸7mL,摇匀,置40℃水浴中保温30min,取出,置冰浴中冷却5min,取出,在波长为485nm处测定吸收度值,得回归方程为:Y=0.04074 X+0.0041,r=0.9995,本品在范围内呈线性关系。
样品液测定:精密吸取样品液0.1mL,置于50mL容量瓶中,加水稀释至刻度,摇匀,分别精密吸取各样品液2mL于具塞试管中,照标准曲线项下方法自“精密加入4%的苯酚液1mL”起,依法测定吸光度,随行空白,计算总糖量。结果见表9。
c.二苯乙烯苷的含量测定
按L9(34)正交表安排试验,称取1/25处方量药材,按设定方案进行提取,滤过,滤液合并,定容至一定体积;照高效液相色谱法(《中国药典》(2005年版一部附录33页VID)测定二苯乙烯苷的含量,计算二苯乙烯苷的提取量,结果见表9。
色谱条件:DiamonsilTMC18柱(5μm,250×4.6mm),柱温:30℃;检测波长:320nm,流动相:乙睛∶水(25∶75),流速1mL/min。
对照品溶液的制备:精密称定二苯乙烯苷对照品0.0106g,置于50mL容量瓶中,稀乙醇溶解,定容,避光保存,对照品液浓度为212.0μg·mL-1。
样品溶液的制备:按正交实验设计方案进行提取,滤过,滤液合并,定容至一定体积,即得各样品溶液。
测定法:取各样品溶液过0.45μm微孔滤膜,滤液即为供试品液。分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液各10μL,注入液相色谱仪,测定,即得。
表9 煎煮工艺正交试验设计表及结果
注:煎煮工艺采用3个评价指标,采用综合评分进行数据分析,总糖权重系数为0.4,二苯乙烯苷权重系数为0.4,浸膏得率权重系数为0.2。综合评分=(总糖/总糖最大量×0.4+二苯乙烯苷/二苯乙烯苷最大量×0.4+浸膏得率/浸膏得率最大量×0.4)×100
方差分析
将正交试验结果进行方差分析,结果见表10。
表10 煎煮工艺评价指标方差分析表
*P<0.05,F0.05(2,2)=19.00
从表9 结果直观分析,以煎煮工艺中总糖为评价指标,各因素影响的顺序为A>B>C;以煎煮工艺中二苯乙烯苷为评价指标,各因素影响的顺序为A>B>C;以煎煮工艺中浸膏得率为评价指标,各因素影响的顺序为A>C>B;各评价指标综合评分的结果显示各因素影响的顺序为A>B>C,其中煎煮次数的影响最大;表10的方差分析结果表明,分别以煎煮工艺中总糖、二苯乙烯苷、浸膏得率为评价指标以及各评价指标综合评分,煎煮次数均有显著性意义(P<0.05),最佳工艺条件为A3B3C2。
验证试验
称取2/50处方量药材:当归3.6g、何首乌4.8g、黄精4.8g、石菖蒲4.8g按最佳工艺A3B3C2进行验证试验,结果与正交试验结果吻合。说明该工艺稳定,可行,结果见表11。因此,确定水提工艺为14倍量水煎煮3次(第一次为16倍量水),每次2小时。
表11 水提工艺验证结果
序号 | 总糖(g) | 二苯乙烯苷(mg) | 浸膏得率(%) |
1 | 8.521 | 27.248 | 34.87 |
2 | 8.497 | 27.314 | 34.29 |
3 | 8.490 | 27.348 | 35.11 |
平均 | 8.502 | 27.303 | 34.76 |
2.2.3水煎液除杂工艺的选择
中药水提液中常含有淀粉、多糖、蛋白质、果胶等,使制得的固体制剂服用剂量过大,一般应对提取液进行纯化,减少服用剂量,多采用一定浓度的醇进行醇沉除杂。因此,我们对水煎液进行了纯化工艺研究,分别考察了不同浓度的乙醇进行醇沉、对水煎液进行离心及静置后取上清液等除杂方法,通过测定浸膏、二苯乙烯苷及总糖的转移率,从而确定所采用的除杂工艺,结果见表12。
表12 除杂工艺结果
从表12结果可知,经不同浓度的乙醇醇沉后,浸膏转移率降低的同时总糖和二苯乙烯苷的转移率亦在降低,而总糖的转移率变化较二苯乙烯苷显著。当乙醇浓度高于40%时,其总糖的转移率低于50%,而经离心法和静置法处理后浸膏得率、二苯乙烯苷和总糖转移率均无明显变化。而总糖是本产品中的功效成分之一,以及结合人每天口服给药的剂量来考虑,如经除杂后仍需加入一定的辅料制成成品,而除杂中要除去的淀粉、蛋白质、果胶等均可作天然的辅料,可减少辅料的加入量。因此,在保证药效的基础上,从经济和能源投入节约的角度出发,水煎液经过滤处理后不进行除杂工艺处理。
2.3浓缩、干燥工艺的优选
中药提取液在浓缩、干燥过程中,由于受热时间较长,其所含某些有效成分可能会不同程度地被破坏而使含量降低。减压浓缩具有效率高,耗时短的优点,同样真空干燥具有干燥时间短,所得干燥制品疏松易碎等优点,故本工艺选择减压浓缩真空干燥。以天麻素、淫羊藿苷、总糖的转移率为评价指标,对不同温度条件下的干燥工艺进行了考察。结果天麻素、淫羊藿苷、总糖的转移率随温度的增高而降低,60℃和70℃的差异较小,但60℃干燥的效率较70℃低,从生产效率出发,确定真空70℃进行干燥(真空度应控制在-0.08MPa以下),
见表13。
表13 浓缩、干燥考察结果
二、急性毒性实验
1、受试药物处理
试验前用5‰羧甲基纤维素钠(CMC)配置成相应浓度的混悬液
2、受试动物
昆明种小鼠,体重:20±2g,雌雄各半,由贵阳医学院实验动物中心提供,合格证号:SCXK(黔)2002-0001,清洁级,普通饲料饲养。
3、实验方法
预实验表明本制剂毒性较低,测不出LD50,故进行最大耐受量测定。取小鼠40只(雌雄各半),随机分为2组,每组20只。禁食(不禁水)12h。空白对照组按0.4ml/10g给予5‰CMC灌胃;制剂组按0.4ml/10g灌胃给药,2h后重复给药一次,剂量为15.2g/kg。末次给药后1h恢复供食、供水,观察4h内、14天内动物反映情况及死亡情况,实验结束处死动物,解剖动物观察主要脏器改变。
4、实验结果
给药后小鼠在2h内活动稍有减少,约4h左右活动恢复正常。在观察14天内,动物外观、行为、进食及大小便正常,体重增加(表14),观察期无动物死亡。实验结束处死动物,解剖,肉眼观察主要脏器无异常改变。小鼠最大耐受量为15.2g/kg·d。
表14 对小鼠急性毒性实验体重变化的影响(x±s,n=20)
组别 | 给药前 | 7天 | 14天 | 死亡数 |
对照组 | 20.2±2.6 | 27.2±2.3 | 31.5±2.4 | 0 |
制剂组 | 20.0±1.6 | 27.4±2.2 | 31.6±3.4 | 0 |
5、结论
本实验研究结果表明,最大耐受量为15.2g/kg·d,观察期内未见动物出现毒性反应及死亡,表明本药口服用药安全。
三、药效学实验部分:
(一)、本发明胶囊剂健脑实验及与老化相关酶和老化代谢产物测定
1、实验材料
1.1实验动物
SD大鼠:雌雄均有,2-3月龄,体重200-220g,由贵阳医学院实验动物中心提供,合格证号:SCXK(黔)2002-0001,清洁级,普通饲料饲养。
1.2主要药品和试剂
本发明胶囊剂:棕褐色粉末,批号:040908。脑复康:吡拉西坦Piracetam,天津红日药业股份有限公司,规格:0.4g/片,批号:050102。AlCl3.6H2O:分析纯,广东汕头西陇化工厂,批号:040308。ANTI-ChAT:武汉BOSTER公司,批号:050125。ANTI-β-Amyloid(1-40):武汉BOSTER公司,批号:050125。TUNEL法细胞凋亡检测试剂盒:武汉BOSTER公司,批号:050204。ANTI-Glutamate:武汉BOSTER公司,批号:050125。即用型SABC试剂盒:武汉BOSTER公司,批号:050308。DAB显色试剂盒:武汉BOSTER公司,批号:050401。TBS缓冲液试剂:武汉BOSTER公司,批号:041116。抗体稀释液:武汉BOSTER公司,批号:040117。AchE试剂盒:南京建成生物工程有限公司,批号20050513。SOD试剂盒:南京建成生物工程有限公司,批号20050520。MDA试剂盒:南京建成生物工程有限公司,批号20050430。冰醋酸:分析纯,上海化学试剂有限公司,批号:041010。
1.3剂量设置
本发明胶囊剂和阳性对照药脑复康用药剂量均按实验动物与人临床用药剂量的折算系数法计算:
胶囊剂剂量:小鼠急性毒性实验最大耐受量为15.2g/kg,则大鼠等效量为10.8g/kg,以大鼠等效量的1/10,1/25,1/50作为大鼠的高、中、低剂量,分别为:1.08g/kg、0.43g/kg、0.22g/kg。
脑复康剂量:临床成人用量:每次2-4片(按3片计),每日3次。成人体重以60kg计算,则成人每日用量为0.06g/kg,则大鼠每日用药量为0.40g/kg。
2.实验方法
2.1造模
用Morris水迷宫将筛选合格大鼠,随机分为正常对照组(n=10)和造模组(若干只)。正常对照组给等容的生理盐水灌胃,饮用自来水。造模组给AlCl3溶液,浓度为50g.L-1,按500mg.kg-1.d-1,每日上午九时灌胃,持续2个月。造模组自第三个月开始自由饮用浓度为1.6g.L-1的AlCl3溶液,持续3个月。定期进行水迷宫实验测定大鼠学习记忆的变化情况。
2.2分组及治疗
造模5个月时经Morris水迷宫检测,造模组大鼠学***明显下降,与正常对照组有显著差异。造模成功后,进一步将造模组大鼠随机分为痴呆模型组(5‰CMC 0.6mL.kg-1.d-1)、本发明胶囊剂低(0.22g.kg-1.d-1)、中(0.43g.kg-1.d-1)、高(1.08g.kg-1.d-1)剂量组及阳性对照组(脑复康0.4g.kg-1.d-1)。正常对照组(5‰CMC 0.6mL.kg-1.d-1),各组灌胃给药,每日一次,连续3个月。
2.3检测指标及方法
2.3.1学习记忆能力检测
指标:逃避潜伏期、搜索距离、空间探索时间和探索距离。
方法:于造模前,造模过程中第50天、100天和150天,以及治疗结束时进行行为学检测,观察大鼠造模前后和TSYZ治疗后的学习记忆变化情况。
2.3.2脑组织指标检测
2.3.2.1标本制作:治疗结束后,以10%水合氯醛300mg.kg-1腹腔注射麻醉大鼠后,迅速断头取出大脑,置于冰盘上,精确称重。以失状面为界将大脑均分为两半,其中一半脑组织按每克组织加10mL冷的生理盐水用匀浆器制成10%的组织匀浆,于-80℃低温冰箱保存,用于检测AChE和SOD活性及MDA含量。另一半脑组织,取视交叉后5mm后的冠状位脑片(包含海马),用4%中性甲醛溶液4℃保存过夜,次日石蜡包埋,连续作冠状切片,片厚3μm,每例标本取连续5张切片分别作HE(Hematoxylin-eosin staining)染色及免疫组化染色,用于病理学检查及分析大鼠海马神经细胞Aβ1-40、ChAT、Glu的表达水平,TUNEL法检测大鼠海马神经细胞凋亡水平。
2.3.2.2大脑组织生化指标检测:检测大脑组织AChE和SOD活性及MDA含量,均按试剂盒说明操作,光化学方法测定。
2.3.2.3大脑海马组织病理学检测:海马组织病理切片HE染色,进行细胞形态学观察。
2.3.2.4大脑海马组织免疫组化指标检测
Aβ1-40表达、ChAT活性、Glu含量检测:(1)切片脱蜡入水;(2)3%H2O2浸泡15min,蒸馏水洗3次×3min;(3)高压煮沸3min(pH6.0,0.01M枸橼酸缓冲液),冷却至室温;(4)0.01MPBS(pH7.2-7.4)冲洗3次×3min,加入5%BSA,室温15min封闭;(5)加入稀释后的一抗50μl(Aβ1-401∶50、ChAT 1∶50、GLU 1∶35),于4℃冰箱过夜;(6)0.01M PBS(pH7.27.4)冲洗3次×3min,加入即用型二抗,37℃湿盒中孵育20min;(7)0.01M PBS(pH7.2-7.4)冲洗3次×3min,加入1∶100SABC复合物,37℃湿盒中孵育20min;(8)0.01M PBS(pH7.2-7.4)冲洗3次×3min,DAB显色10min;(9)苏木素复染;(10)1%盐酸酒精分化3min,水洗;(11)0.5%氨水返蓝,水洗;(12)梯度酒精脱水;(13)二甲苯透明;(14)中性树胶封片,镜下观察并分析。
细胞凋亡检测(TUNEL法):(1)切片脱蜡入水;(2)3%H2O2浸泡15min,蒸馏水洗3次×3min;(3)37℃胰酶消化10min;(4)0.01M PBS(pH7.2-7.4)冲洗3次×3min,加入标记缓冲液20μl,弃去多于标记缓冲液,加入混合液20μl(TdT 1μl+d-UTP 1μl+标记缓冲液18μl),于湿盒中37℃反应90min;(5)0.01M TBS(pH7.2-7.4)冲洗3次×3min,加入5%BSA,室温10min封闭;(6)甩去切片上多余液体,加入1∶100生物素地高辛抗体;(7)0.01M TBS(pH 7.2-7.4)冲洗3次×3min,加入1∶100SABC复合物,37℃湿盒中孵育20min;(8)0.01M TBS(pH7.2-7.4)冲洗3次×3min,DAB显色10min;(9)苏木素复染;(10)1%盐酸酒精分化3min,水洗;(11)0.5%氨水返蓝,水洗;(12)梯度酒精脱水;(13)二甲苯透明;(14)中性树胶封片,镜下观察并分析。
病理切片图像分析:在10×40光学显微镜下,通过SONY摄像头将动物组织免疫组化图像采集并输入BIOMIAS-99图像分析***进行图像分析。
平均灰度值(MG)测定:每张切片(每例动物标本)随机选取5个400倍视野,每个视野选取5个阳性表达区域,测量MG,以5个视野的MG的平均值表示其阳性表达率,切片染色越浅,MG数值越大,阳性表达率越低。
2.3.3脑指数(cerebral coefficient)的测定
2.3.4数据处理:
数据处理采用均数±标准差(x±s)表示,组间均数比较采用单因素方差分析检验。P<0.05为有显著性差异。
3、实验结果
3.1.正常大鼠Morris水迷宫学习成绩
造模前对筛选合格的60只大鼠进行定向航行训练并记录其学习成绩,大鼠的学习成绩明显提高,到第6天时经检验其成绩与第5天无明显差异,停止训练。
3.2.AlCl3诱导AD模型大鼠的学***及海马组织病理学改变
大鼠染铝5个月后,模型组在定向航行实验中的逃避潜伏期以及搜索距离明显延长,空间探索实验中在原安全岛所在象限的搜索时间以及探索距离明显减少,与正常对照组比较有显著性差异(P<0.01)。提示造模组大鼠出现空间学习记忆障碍,造模成功。(见表15、16)
表15 AlCl3诱导AD模型大鼠定向航行的成绩(逃避潜伏期,搜索距离,x±s)
*P<0.05,**P<0.01 vs Control
表16 AlCl3诱导AD模型大鼠空间探索的成绩(空间探索时间,探索距离,x±s)
*P<0.05,**P<0.01 vs Control
3.3对AlCl3诱导AD模型大鼠的治疗作用
3.3.1对AlCl3诱导AD模型大鼠学习记忆的影响
与模型组比较,胶囊剂组灌胃三个月后,明显缩短大鼠在定向航行实验中的逃避潜伏期和搜索距离;大鼠在空间探索实验中在原安全岛象限的探索时间及探索距离明显延长,表明胶囊剂对痴呆大鼠学习记忆能力有明显的改善作用(见表17、18)
表17 对AlCl3诱导AD模型大鼠定向航行成绩的影响(x±s,n=10)
组别 | 剂量(g.kg-1) | 潜伏期(秒) | 搜索距离(厘米) |
对照组 | 14.23±2.87 | 432.86±224.50 | |
模型组 | 56.38±42.04 | 1755.9±784.6 | |
低剂量 | 0.22 | 25.83±15.79 | 595.73±521.12# |
中剂量 | 0.43 | 10.39±1.89# | 431.61±362.06# |
高剂量 | 1.08 | 9.04±6.14# | 195.45±46.92# |
脑复康 | 0.40 | 13.38±8.01# | 270.13±296.89# |
*P<0.05,**P<0.01 vs Control;#P<0.05,##P<0.01 vs Model
表18对AlCL3诱导AD模型大鼠空间探索成绩的影响(x±s,n=10)
组别 | 剂量(g.kg-1) | 探索时间(秒) | 搜索距离(厘米) |
对照组 | 43.55±5.43 | 1327.90±98.66 | |
模型组 | 36.77±2.51 | 1172.77±138.64 | |
低剂量 | 0.22 | 36.96±2.49 | 1191.79±61.92 |
中剂量 | 0.43 | 40.02±3.60 | 1293.71±65.54 |
高剂量 | 1.08 | 44.31±1.44# | 1348.31±74.56# |
脑复康 | 0.40 | 42.78±2.74# | 1343.40±58.66# |
*P<0.05,**P<0.01 vs Control;#P<0.05,##P<0.01 vs Model
3.3.2对AlCl3诱导AD模型大鼠大脑AChE、SOD、MDA的影响
与正常组比较,模型组大鼠脑组织AChE活性明显增高,SOD活性降低,MDA含量增高(P<0.05,P<0.01)。与模型组比较,胶囊剂组大鼠脑内AChE活性有不同程度的下降,SOD活性升高,MDA含量降低(P<0.05,P<0.01)。提示TSYZ对AlCl3引起AChE活性升高具有明显的抑制作用和明显的抗氧化作用(见表19。
表19对AlCl3诱导AD模型大鼠脑组织SOD、MDA的影响
组别 | 剂量(g.kg-1) | SOD(U/mgprot) | MDA(nmol/mgprot) |
对照组 | 280.82±41.44 | 13.92±4.70 | |
模型组 | 200.30±62.56* | 21.92±4.77* | |
低剂量 | 0.22 | 275.70±64.74# | 15.90±5.77 |
中剂量 | 0.43 | 275.15±49.49# | 13.99±3.90# |
高剂量 | 1.08 | 289.98±53.35# | 12.78±3.79## |
脑复康 | 0.40 | 283.61±43.64# | 9.49±4.37## |
*P<0.05,**P<0.01 vs Control;#P<0.05,##P<0.01 vs Model
3.3.3对AlCl3诱导AD模型大鼠海马组织病理学的影响
在光镜下观察大鼠海马组织HE染色切片,结果显示:
正常对照组神经细胞大小、形态及排列正常,胞体为圆形或多角形;细胞结构完整,胞膜、胞核轮廓清楚;神经细胞无肿胀及坏死。
模型组神经细胞大小、形态不一,排列紊乱;明显神经细胞空泡变性改变:细胞浆染色变浅,其内有大小不等圆形或类圆形空泡;有明显的神经元坏死表现:核体积增大,核结构模糊、固缩、碎裂或消失。
低、中、高剂量组及脑复康组神经细胞大小、形态及排列恢复正常,细胞结构完整,胞膜、胞核轮廓清晰可辨;细胞无明显肿胀;少量神经细胞空泡变性;无明显神经细胞坏死特征。
3.3.4对AlCl3诱导AD模型大鼠海马ChAT的影响
测定结果显示:模型组大鼠海马神经元胞浆染色浅,大量神经元结构破坏消失,MG值较正常组明显增高(P<0.01)。胶囊剂组大鼠海马神经元胞浆染色为较深的黄褐色,神经元结构清晰,MG值明显降低(P<0.01),提示胶囊剂能有效的激活AD大鼠海马ChAT活性,对AlCl3引起ChAT活性降低具有明显的抑制作用,从而促进ACh的合成(见表20)。
表20TSYZ对AlCl3诱导AD模型大鼠海马ChAT的影响
组别 | 剂量(g.kg-1) | MG (hippocampus) |
对照组 | 94.48±2.38 | |
模型组 | 190.78±1.02** | |
低剂量 | 0.22 | 138.901.04## |
中剂量 | 0.43 | 113.87±1.49## |
高剂量 | 1.08 | 90.27±1.87## |
脑复康 | 0.40 | 109.13±2.02## |
*P<0.05,**P<0.01vs Control;#P<0.05,##P<0.01 vs Model
3.5对AlCl3诱导AD模型大鼠海马Aβ1-40表达的影响
经图像分析测定结果表明,模型对照组切片中可见明显的胞膜及胞浆黄染,细胞核结构模糊,大小、形态不一,神经元消失,与正常组比较,MG明显降低(P<0.01),提示模型组脑内Aβ1-40含量增高。与模型组比较,胶囊剂组海马胞膜及胞浆染色较浅,神经元轮廓清晰,排列恢复正常,MG均明显增高(P<0.01),提示胶囊剂组Aβ1-40含量减少,对AlCl3引起的大鼠脑内Aβ1-40增多具有明显的抑制作用(见表21)。
表21对AlCl3诱导AD模型大鼠海马Aβ1-10的影响(x±s,n=10)
组别 | 剂量(g.kg-1) | MG(hippocampus) |
对照组 | 192.54±1.42 | |
模型组 | 86.49±1.45** | |
低剂量 | 0.22 | 169.59±1.49## |
中剂量 | 0.43 | 179.74±1.45## |
高剂量 | 1.08 | 188.60±1.36## |
脑复康 | 0.40 | 170.38±1.62## |
*P<0.05,**P<0.01 vs Control;#P<0.05,##P<0.01 vs Model
3.6对AlCl3诱导AD模型大鼠海马Glu表达的影响
结果表明,模型组大鼠海马神经元胞浆染色较深,大量神经元消失,MG值较正常组明显减少(P<0.01),提示模型组大鼠海马兴奋性Glu含量增高。与模型组比较,胶囊剂组海马神经元胞浆染色较浅,神经元结构清晰,排列恢复正常,MG值均明显增高(P<0.01),提示胶囊剂可降低AD大鼠海马中兴奋性Glu含量,对AlCl3引起的大鼠脑内Glu增多具有明显的抑制作用(见表22)。
表22TSYZ对AlCl3诱导AD模型大鼠海马Glu表达的影响(x±s,n=10)
组别 | 剂量(g.kg-1) | MG(hippocampus) |
对照组 | 191.44±4.14 | |
模型组 | 91.04±1.59** | |
低剂量 | 0.22 | 160.98±1.46## |
中剂量 | 0.43 | 171.74±1.92## |
高剂量 | 1.08 | 171.86±1.41## |
脑复康 | 0.40 | 177.753.00## |
*P<0.05,**P<0.01 vs Control;#P<0.05,##P<0.01 vs Model
3.7对AlCl3诱导AD模型大鼠海马神经细胞凋亡的影响
TUNEL法检测神经细胞结果表明:与正常组比较,模型对照组切片中神经细胞核内呈深染的棕黄色颗粒,即凋亡小体,神经元消失,MG值明显减少(P<0.01),提示模型组神经细胞凋亡增加。与模型组比较,胶囊剂组神经细胞染色较浅,大小、形态及排列恢复正常,MG值均明显增高(P<0.01),提示制剂组神经细胞凋亡减少,对AlCl3引起的大鼠脑内神经细胞凋亡具有明显的抑制作用,见表23。
表23TSYZ对AlCl3诱导AD模型大鼠海马神经细胞凋亡的影响(x±s,n=10)
组别 | 剂量(g.kg-1) | MG(hippocampus) |
对照组 | 195.64±1.81 | |
模型组 | 97.73±2.11** | |
低剂量 | 0.22 | 168.43±1.75## |
中剂量 | 0.43 | 169.37±1.52## |
高剂量 | 1.08 | 199.19±45.02## |
脑复康 | 0.40 | 160.66±3.36## |
*P<0.05,**P<0.01 vs Control;#P<0.05,##P<0.01 vs Model
3.8对AlCl3诱导AD模型大鼠脑指数的影响
结果表明,模型组大鼠脑指数较正常组显著降低,提示模型组大鼠大脑明显萎缩,脑重减轻;与模型组比较,TSYZ可显著增加脑指数(P<0.05),对脑萎缩有拮抗作用,从而增强脑功能,延缓其衰退(见表24)。
表24对AlCl3诱导AD模型大鼠脑指数影响(x±s,n=10)
组别 | 剂量(g.kg-1) | 脑指数(g/kg) |
对照组 | 0.350.063 | |
模型组 | 0.280.039* | |
低剂量 | 0.22 | 0.310.060 |
中剂量 | 0.43 | 0.340.064# |
高剂量 | 1.08 | 0.350.070# |
脑复康 | 0.40 | 0.400.131# |
*P<0.05,**P<0.01 vs Control;#P<0.05,##P<0.01 vs Model
5、结论
胶囊剂对AlCl3诱导的AD大鼠模型学习记忆能力有较好的改善作用,其治疗AD的可能作用机制为:1.提高ChAT活性、降低AChE活性,从而提高Ach含量,保护和增强中枢胆碱能***功能。2.抑制脑内兴奋性Glu的表达,拮抗Glu介导的神经毒性作用。3.抑制脑内Aβ的沉积,干预Aβ神经毒性。4.抑制大脑神经细胞凋亡,保护神经细胞功能。5.清除自由基,抗氧化应激。
(二)本发明胶囊剂抗衰老作用机制研究
1.实验材料:
1.1.实验动物
昆明种小鼠:雌雄各半,体重22±2g,由贵阳医学院实验动物中心提供,合格证号:SCXK(黔)2004-0001。普通饲料饲养,清洁级,光照时间12/12,室温2223℃。
1.2主要药品和试剂
本发明胶囊剂:棕褐色粉末。D-半乳糖:美国Amresco公司。健脑胶囊(JNJN):青岛国风药业股份有限公司。
2.剂量设置
胶囊剂小鼠急性毒性实验最大耐受量为:0.076g·10g-1,即7.6g·kg-1,取最大耐受量的1/3,1/6,1/12分别作为高、中、低剂量(2.5g·kg-1、1.25g·kg-1、0.63g·kg-1)。
3.统计方法:实验数据用x±s表示,组间比较采用t检验。
4.实验方法:
昆明种小鼠(雌、雄各半)进行Morris水迷宫实验,直到定向航行实验成绩稳定为止(连续两天成绩差异无显著性)。将经Morris水迷宫筛选合格的84只小鼠随机分为6组(n=14),正常对照组(NS 14mL·kg-1)、模型组(NS 14mL·kg-1)、复方高、中、低(2.50g·kg-1、1.25g·kg-1、0.63g·kg-1)剂量组及阳性对照组(健脑胶囊,简写JNJN,0.03g·kg-1)。除正常对照组外,其余各组均采用皮下注射5%D-半乳糖溶液0.5mL·kg-1造模,同时连续灌胃给药45天。采用Morris水迷宫实验,检测学习记忆能力,小鼠眼眶采血,分离血清,置-80℃超低温冰箱中保存备用,测定小鼠血清GSH-PX、SOD、AChE、ChAT活性及MDA含量。
5.实验结果:
5.1对D-半乳糖衰老模型小鼠学习记忆的影响
各给药组与模型组、阳性对照组间无显著性差异(P>0.05)。灌胃给药后大鼠定向航行实验成绩及空间探索实验成绩显示,大鼠灌胃后学***提高,探索时间缩短、搜索距离减小,与模型组比较有显著性差异(P<0.05或0.01)。(见表25)
表25抗痴呆灌胃后小鼠空间探索实验成绩(x±s)
组别 | n | 剂量(g/kg) | 探索时间(s) | 探索空间/总空间(%) |
空白对照组 | 11 | - | 17.73±10.42 | 647.63±476.85 |
模型组 | 13 | - | 57.02±36.31* | 1403.18±1047.37* |
高剂量 | 11 | 2.5 | 24.35±23.39△ | 635.21±364.46△ |
中剂量 | 14 | 1.25 | 25.47±21.68△ | 660.97±484.46△ |
低剂量 | 11 | 0.63 | 12.77±11.33△△ | 262.27±206.63△△ |
JNJN | 11 | 0.03 | 46.80±39.16△ | 1278.76±1310.17△△ |
*P<0.05,**P<0.01 vs NS △P<0.05,△△P<0.01 vs Model
5.2对D-半乳糖衰老模型小鼠血清GSH-PX活性的影响
模型组大鼠血清中GSH-PX活性降低,与正常对照组有显著性差异(P<0.05),灌胃给药后大鼠血清中GSH-PX活性升高,与模型组比较有显著性差异(P<0.05),见表26。
表26对D-半乳糖衰老模型小鼠血清GSH-PX活性的影响(x±s)
*P<0.05,**P<0.01 vs NS △P<0.05,△△P<0.01 vs Model
5.3对D-半乳糖衰老模型小鼠血清SOD活性和MDA含量的影响
表27显示,模型组小鼠脑组织中SOD活性降低,MDA含量升高,与正常对照组有显著性差异(P<0.05或0.01),灌胃给药后小鼠脑组织中SOD活性升高,MDA含量降低,与模型组比较有显著性差异(P<0.05或0.01)。
表27对D-半乳糖衰老模型小鼠血清中SOD活性和MDA含量的影响(x±s)
组别 | n | Dose(g/kg) | SOD(nmol/mg prot) | MDA(nmol/mg prot) |
空白对照组 | 11 | - | 108.04±16.41 | 3.12±0.44 |
模型组 | 13 | - | 93.49±13.40* | 4.67±0.88** |
高剂量 | 11 | 2.5 | 116.00±14.01△△ | 3.77±1.04△ |
中剂量 | 14 | 1.25 | 136.34±24.47△△ | 3.61±1.12△ |
低剂量 | 11 | 0.63 | 126.33±17.88△△ | 3.91±0.55△ |
JNJN | 11 | 0.03 | 119.93±14.13△△ | 3.05±2.44△ |
*P<0.05,**P<0.01 vs NS △P<0.05,△△P<0.01 vs Model
5.4对D-半乳糖衰老模型小鼠血清AChE、ChAT活性的影响
表28显示,模型组小鼠脑组织中ChAT活性降低,AChE活性升高,与正常对照组有显著性差异(P<0.05或0.01),灌胃给药后小鼠脑组织中ChAT活性升高,AChE活性降低,与模型组比较有显著性差异(P<0.05或0.01)。
表28对D-半乳糖衰老模型小鼠血清中AChE、ChAT活性的影响(x±s)
*P<0.05,**P<0.01 vs NS △P<0.05,△△P<0.01 vs Model
6.结论:本发明胶囊剂高、中、低剂量组小鼠学习记忆成绩均较模型组有不同程度提高;血清GSH-PX、SOD和ChAT活力均升高,AChE活力降低,MDA含量降低;结论:复方胶囊剂对AD有较好的防治作用。
(三)本发明胶囊剂补肾作用的实验研究
1.实验材料:
1.1.实验动物
实验动物及实验条件同“抗衰老”实验
1.2主要药品和试剂
本发明胶囊剂,棕褐色粉末。修正牌肾宝合剂,国家准字:Z36021192,江西汇仁药业。***注射液,批号20021016,漯河***全威制药有限公司。
2.剂量设置
同“抗衰老”实验
3.统计方法:实验数据用x±s表示,组间比较采用t检验。
4.实验方法:
72只小鼠随机分为6组(n=12),正常对照组(NS 14mL·kg-1)、模型组(NS 14mL·kg-1)、复方高、中、低(2.50g·kg-1、1.25g·kg-1、0.63g·kg-1)剂量组及阳性对照组(修正牌肾宝合剂0.03g·kg-1)。除正常对照组外,其余各组均采用灌胃给予***0.2mg/10g,30天建立小鼠肾虚模型,灌胃给药14天,末次给予受试物30min后,将小鼠放在爬杆架的有机玻璃棒上,使其肌肉处于紧张状态,记录小鼠由于肌肉疲劳从有机玻璃上跌落下来的时间,第3次跌落时终止实验,累计三次的时间作为爬杆时间。继续灌胃给药1天,于末次给药后3分钟,将小鼠放入盛有15g钠石灰的广口瓶内,每次每组1只,用凡士林将瓶口密封,立即计时,以停止呼吸为标准小鼠存活时间;实验结束,称量小鼠体重、胸腺、脾、肾、肾上腺、子宫、卵巢、睾丸、精囊重量并计算各内脏系数。
5.实验结果:
5.1对小鼠内脏系数的影响
对小鼠内脏系数无明显影响,各给药组与模型组比较无显著性差异(P>0.05)(见表29)。
表29对小鼠内脏系数的影响(mg/10g,x±s)
脏器 | 模型 | 正常对照 | 低剂量 | 中剂量 | 高剂量 | 阳性对照 |
脾 | 0.09±0.02* | 0.41±0.11 | 0.09±0.040 | 0.10±0.06 | 0.09±0.03 | 0.11±0.04 |
肾 | 1.14±0.21 | 1.09±0.18 | 1.33±0.24 | 1.35±0.16 | 1.32±0.12 | 1.36±0.18 |
肾上腺 | 0.01±0.01* | 0.02±0.01 | 0.02±0.01 | 0.03±0.01 | 0.02±0.01 | 0.02±0.01 |
胸腺 | 0.11±0.08** | 0.25±0.10 | 0.16±0.13 | 0.10±0.02 | 0.10±0.05 | 0.08±0.03 |
睾丸 | 0.77±0.19 | 0.69±0.10 | 0.61±0.25 | 0.49±0.17 | 0.87±0.16 | 0.72±0.09 |
精囊 | 0.67±0.30 | 0.64±0.19 | 1.10±0.39 | 0.67±0.10 | 0.86±0.23 | 0.54±0.26 |
子宫 | 0.51±0.38 | 0.42±0.17 | 0.31±0.10 | 0.28±0.18 | 0.29±0.12 | 0.23±0.07 |
卵巢 | 0.08±0.06 | 0.13±0.05 | 0.12±0.09 | 0.08±0.03 | 0.12±0.06 | 0.05±0.01 |
*P<0.05,**P<0.01 vs正常对照;△P<0.05,△△P<0.01 vs模型组
5.2对小鼠爬杆时间的影响
高剂量给药组爬杆时间延长,较模型组差异显著,P<0.05(见表30)。
表30对小鼠爬杆时间的影响(x±s)
项目 | 模型 | 正常对照 | 低剂量 | 中剂量 | 高剂量 | 阳性对照 |
动物数(n) | 10 | 11 | 10 | 10 | 11 | 11 |
爬杆时间(s) | 32.72±22.84 | 59.36±29.78* | 48.35±32.65 | 67.41±34.17△ | 35.48±24.51 | 60.94±36.49△ |
*P<0.05,**P<0.01 vs正常对照;△P<0.05,△△P<0.01 vs模型组
5.3对小鼠常压耐缺氧存活时间的影响
各给药组常压耐缺氧时间延长,较模型组差异极为显著,P<0.01(见表31)
表31对小鼠常压耐缺氧存活时间的影响(x±s)
项目 | 模型 | 正常对照 | 低剂量 | 中剂量 | 高剂量 | 阳性对照 |
动物数(n) | 10 | 11 | 10 | 10 | 11 | 11 |
耐缺氧时间(s) | 26.30±3.59 | 35.82±12.52* | 34.70±5.70△△ | 34.40±5.08△△ | 33.82±5.02△△ | 33.50±8.20△ |
*P<0.05,**P<0.01 vs正常对照;△P<0.05,△△P<0.01 vs模型组
6.结论:复方胶囊剂可提高机体的抗疲劳和抗应激能力,对肾虚有较好的治疗作用。
四、本发明胶囊剂治疗AD的分子作用机制研究
(一)、对beta淀粉样蛋白引起的神经细胞中尼古丁受体表达降低及细胞毒性损害的拮抗作用
1材料和主要化学试剂:
本发明胶囊剂。源于人脑的神经母细胞瘤细胞株(SH-SY5Y细胞)(购自GermanCollection of Microorganisms and Cell Cultures公司)。Aβ25-35(购自Sigma公司)。DMEM培养液(购自Gibco Introvagen公司)。小牛血清(购自华美公司)。MTT比色法主要试剂(购自Sigma公司)。羊抗a3、a7及鼠抗b-肌动蛋白(b-Actin)多克隆抗体及HRP标记的抗羊及抗鼠二抗购自Santa Cruz Biotechnology公司。聚乙烯二氟(PVDF)膜(购自Amersham公司)。ECL-Plus发光试剂(购自Amersham公司)。高效显影胶片(购自Amersham公司)。Trizol(购自Sigma公司)。MMLV逆转录酶、RNA酶抑制剂、无RNA酶的DNA酶(购自Premega公司)。OligodT、引物、TaqDNA聚合酶、dNTP等(均购自上海生工公司)。TBA比色法试剂盒(购自南京建成公司)。其它化学试剂(均购自Sigma公司)。
2方法
2.1细胞培养:
用含10%小牛血清、双抗(青霉素25U/ml,链霉素25U/ml)的DMEM作为培养基,5%CO2、饱和水汽、37℃恒温培养。
2.2MTT比色法筛查中药安全浓度:
向96孔细胞培养板中加入一定数量(约1×104/孔)待检测细胞,待细胞生长稳定后加入本发明胶囊剂,终浓度分别为:0mg/ml,0.005mg/ml,0.025mg/ml,0.05mg/ml,0.1mg/ml,0.25mg/ml,0.5mg/ml,1mg/ml,5mg/ml,10mg/m,l培养24小时后测定MTT水平。
2.3细胞分组诱导及相应的药物干预:
(1)正常对照组:不经药物处理,培养期为48小时。(2)Aβ处理组:在培养的细胞中加入10μM Aβ25-35,培养时间为48小时(Aβ25-35用PBS溶解后,37℃孵育3~4小时)。(3)单纯VE处理组:加入20μM VE,培养期为48小时。(4)VE和Aβ处理组:先加入20μMVE培养24小时后,按照Ab处理组的方法处理。(5)单纯中药处理组:加入中药培养48小时。(6)中药和Aβ处理组:先加入中药预培养24小时后,再按照Ab处理组方法进行处理。
2.4药物处理后MTT还原率测定:
向96孔细胞培养板中,加入一定数量(约1×104/孔)待检测细胞,分组药物处理细胞后测定MTT水平。
2.5尼古丁受体亚单位蛋白表达测定:
参照Guan等的方法进行提取细胞膜蛋白及用蛋白印迹(Western blotting)方法检测尼古丁受体亚单位α3、α7亚单位蛋白水平。以Labworks软件分析结果时以β-Actin蛋白条带作为内参照,计算α3、α7蛋白条带与βA-ctin蛋白条带像素灰度的百分比值作为α3、α7基因蛋白质表达的相对水平比。
2.6尼古丁受体亚单位mRNA的表达水平测定:
Trizol法提取细胞总RNA,并用无RNA酶的DNA酶消化DNA杂质(按照试剂说明书进行)。采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法测定mRNA水平。用Labworks软件检测时以环孢素亲和素(Cyc)基因作为RT-PCR产物的内参照,计算α3、α7基因与Cyc基因扩增条带表达量像素灰度的百分比值作为α3、α7基因mRNA表达的相对水平。nAChR受体亚单位a3、a7和环孢素亲和素引物序列见表32。
表32.RT-PCR引物序列
亚单位 | 引物序列 | 片段长度 |
α3 | 上游:5′-TTCAGCCGTGCAGACTCCA-3′下游:5′-GGCAACGTACTTCCAATCATC-3′ | 271bp |
α7 | 上游:5′-CGCCACATTCCACACTAAC-3′下游:5′-ACCTTTCACTCCTCTTGCC-3′ | 257bp |
β2 | 上游:5′-GCCTGCGCCTGCGGCGACGCC-3′下游:5′-CCTCACTCACGCTCTGGTCAT-3′ | 270bp |
Cyc | 上游:5′-Agaaaattttcgtgctctgagca-3′下游:5′-Aacacaagtcaaactttattcgag-3′ | 482bp |
2.7脂质过氧化水平测定:
收集培养神经细胞的培养液,测定丙二醛(脂质过氧化的中间产物)含量,操作按照试剂盒说明书进行。
2.8统计学分析:
将每组所得结果用均数±标准差表示,结果用SPSS12.0统计软件进行单因素方差分析。
3.结果
3.1.中药安全浓度筛查:
本发明胶囊剂浓度>0.5mg/ml时SH-SY5Y神经细胞MTT还原率出现下降趋势,浓度>1mg/ml时细胞MTT还原率明显降低,表明该浓度对细胞有毒性作用。因此选择0.25mg/ml作为本次研究本发明胶囊剂的安全浓度。
3.2药物处理后MTT还原率测定:
药物处理后MTT还原率测定发现,10mM Aβ25-35处理细胞后引起MTT还原率明显降低;0.25mg/ml胶囊剂及20μM VE处理不影响细胞功能;而用胶囊剂及VE预处理细胞后可明显减弱Ab对细胞的毒性作用,Aβ组与VE+Aβ组和X+Aβ组之间的差异有统计学意义(P<0.01);胶囊剂与VE对抗Ab细胞毒性的作用强度类同,其间的差异无统计学意义。
3.3尼古丁受体蛋白表达水平
尼古丁受体α7和α3亚单位蛋白质表达水平半定量结果表明,10mM Aβ25-35处理细胞后引起尼古丁受体α7和α3亚单位蛋白质表达水平明显降低;单纯0.25mg/ml胶囊剂处理细胞可上调尼古丁受体α7亚单位蛋白质表达水平;而20μM VE处理不影响该受体蛋白水平;用胶囊剂及VE预处理细胞后可减弱Ab对细胞α7和α3亚单位蛋白质表达水平的下调作用,Aβ组与VE+Aβ组和X+Aβ组之间的差异有统计学意义(P<0.01或P<0.05);胶囊剂对抗Aβ降低α7亚单位蛋白质表达水平的作用强于VE,VE+Aβ组与X+Aβ组之间的差异有统计学意义(P<0.05)。胶囊剂与VE对抗Aβ引起的下调α3亚单位蛋白质表达水平作用类同,VE+Aβ组与X+Aβ组之间的差异无统计学意义。
3.4尼古丁受体mRNA表达水平
尼古丁受体α7和α3亚单位mRNA表达水平半定量结果表明,10mM Aβ25-35处理细胞后引起尼古丁受体α7和α3亚单位mRNA表达水平明显降低;0.25mg/ml胶囊剂和20μM VE处理不影响该受体mRNA表达水平;用胶囊剂及VE预处理细胞后可减弱Ab对细胞α7和α3亚单位mRNA表达水平的下调作用,Aβ组与VE+Aβ组和X+Aβ组之间的差异有统计学意义(P<0.01);胶囊剂与VE对抗Aβ引起的α7亚单位mRNA表达水平下调作用相当,VE+Aβ组与X+Aβ组之间的差异无统计学意义。而用胶囊剂对抗Aβ引起的α3亚单位无此作用,Aβ组与X+Aβ组之间的差异没有统计学意义,VE+Aβ组与X+Aβ组之间的差异有统计学意义(P<0.05)。
3.5脂质过氧化代谢产物MDA水平:
结果表明,10mM Aβ25-35处理细胞后引起细胞脂质过氧化水平明显升高;用0.25mg/ml胶囊剂和20μM VE处理不影响MDA含量;而胶囊剂和VE预处理细胞后可减弱Ab所引起的脂质过氧化水平升高,但是胶囊剂的此种作用比VE弱(表33)。
表33.TBA法测定MDA(x±s)
组别 | 对照组 | Aβ | VE | VE+Aβ | 胶囊剂 | 胶囊剂+Aβ |
MDA(nmol/ml) | 4.19±0.44 | 5.825±0.70** | 4.16±0.46 | 4.38±0.43 | 4.26±0.29 | 4.93±0.46* |
4、结论
安全浓度的胶囊剂对α7在蛋白质表达水平有上调作用;能对抗Aβ引起的α3和α7尼古丁受体亚单位蛋白质水平降低及α7亚单位mRNA表达低下、但对α3亚单位无明显影响;能减弱Aβ引起的细胞损伤和脂质过氧化水平升高。提示胶囊剂能在蛋白质水平上调尼古丁受体α7亚单位,对抗Aβ引起的尼古丁受体表达降低及神经毒性作用。
(二)、对SH-SY5Y神经细胞胆碱酯酶的影响
1.材料与试剂
复方胶囊剂;SH-SY5Y细胞株购于German Collection of Micro organisms and CellCultures公司(德国);小牛血清购自华美公司;DMEM培养基、无酚红DMEM培养基购自HyClone公司;Aβ1-42购自Sigma公司;考马斯亮蓝法蛋白定量试剂购自南京建成公司;胆碱酯酶测定试剂硫代乙酰胆碱(ATC)、硫代丁酰胆碱(BTC)、5,5’-联硫代-双-2-硝基苯甲酸(DTNB)、BW284C51(AChE的抑制剂)、iso-OMPA(BuChE的抑制剂),均购自Sigma公司;细胞蛋白提取试剂苯甲酰磺酰氟(PMSF)、复合蛋白酶抑制剂(Complete completion)购自Sigma公司。
2.细胞培养及分组处理
细胞培养同上,当细胞长到培养瓶底约70%时换无酚红的DMEM处理12小时,再分为5组处理:A组:空白对照组;B组:Aβ单独处理组:在培养的细胞中加入Aβ1-42,其终浓度为10mmol/L,培养时间为48小时;C组:复方制剂单独处理组,其终浓度为0.5g/L,培养24小时;D组:先加复方制剂预处理再加Aβ1-42处理组:先加复方制剂处理24小时后,再按照B组操作;E组:先加Aβ1-42预处理再加复方制剂处理组:先加Aβ1-42处理48小时后,再按照C组操作。
3.细胞蛋白定量
细胞处理完毕时分别收集培养基及细胞于1.5mL EPP管中。往收集细胞的管中加入细胞裂解液约300mL及PMSF和复合蛋白酶抑制剂于冰上裂解1小时后离心40分钟(12000g,4℃),收集上清,采用考马斯亮蓝法对各组细胞进行蛋白定量,按照试剂盒说明书进行操作。
4.细胞培养基胆碱酯酶的测定
ChE的测定参考Fllman比色法及参考文献,测定时使加入的培养基含有相同的蛋白质克数。
5.统计学处理
每组所得结果用x±s表示,结果用单因素方差分析方法进行统计分析,以P<0.05认为差别有统计学意义。
6.结果
6.1各处理组AChE活性值
Aβ1-42单独处理组AChE活性值(24.69±1.41nmol·min-1·mL-1)较空白对照组(16.86±0.41nmol·min-1·mL-1)升高46.44%,差别存在统计学意义(P<0.05);先加复方胶囊剂再加Aβ1-42处理组(17.73±0.59nmol·min-1·mL-1)、先加Aβ1-42再加复方胶囊剂处理组(17.02±1.13nmol·min-1·mL-1)分别与Aβ1-42单独处理组相比,其AChE活性值分别降低39.26%、45.06%,差别存在统计学意义(P<0.05);复方胶囊剂单独处理组(11.08±1.05nmol·min-1·mL-1)AChE活性值也较空白对照组降低,差别存在统计学意义(P<0.05)。说明了复方制剂具有胆碱酯酶抑制剂的功能。
6.2.各处理组BuChE活性值
各处理组BuChE活性值分别为:空白对照组11.88±0.33nmol·min-1·mL-1,Aβ1-42单独处理组13.21±2.49nmol·min-1·mL-1,复方胶囊剂单独处理组10.36±1.83nmol·min-1·mL-1,先加复方胶囊剂再加Aβ1-42处理组12.45±2.54nmol·min-1·mL-1、先加Aβ1-42再加复方胶囊剂处理组10.98±0.93nmol·min-1·mL-1,而BuChE活性值在各组间差别无统计学意义(P>0.05)。
7.结论
复方胶囊剂能降低Aβ诱导的类AD细胞AChE活性,具有类似胆碱酯酶抑制剂的功能。
与现有技术相比,本发明在抗衰老保密经验方的基础上,以中医理论为指导,利用科学理论和先进技术,研制出了一种疗效好、毒副作用小的治疗老年痴呆的中药制剂,经实验研究证明,该中药制剂对AlCl3诱导的AD大鼠模型学***上调尼古丁受体α7亚单位,对抗Aβ引起的尼古丁受体表达降低及神经毒性作用,减弱Aβ引起的细胞损伤和脂质过氧化水平升高,降低Aβ诱导的类AD细胞AChE活性。
同时本发明还提供了一种适合工业生产的、优选的制备方法。
具体实施方式
实施例1:人参60g、炙黄芪120g、淫羊藿90g、延胡索90g、天麻120g、当归90g、制何首乌120g、黄精120g和石菖蒲120g
制备方法:(1)醇提:取人参、天麻、炙黄芪、淫羊藿、延胡索五味药材用85%乙醇回流提取2次,每次2h,第一次加16倍量乙醇,第二次加14倍量乙醇,滤过,得醇提液,减压回收乙醇,药液备用;
(2)水煮:取当归、制何首乌、黄精、石菖蒲四味药材用水煎煮3次,每次2h,第一次加14倍量水,第二次和第三次各加12倍量水,滤过,滤液减压浓缩备用;
(3)制剂成型:合并醇提药液和水煮药液,浓缩至稠膏,于70℃真空干燥,即得治疗老年痴呆的中药制剂的活性成分,在活性成分中加入淀粉适量,制粒,装胶囊,制成胶囊1000粒,每粒0.35g。
功能主治:补气健脑、扶正固本、开窍益智、活血化瘀;用于预防和治疗老年痴呆症所致记忆力减退。
用法用量:口服,一日3次,一次4粒。
实施例2:人参50g、炙黄芪100g、淫羊藿100g、延胡索100g、天麻140g、当归80g、制何首乌100g、黄精100g和石菖蒲140g
(1)醇提:取人参、天麻、炙黄芪、淫羊藿、延胡索五味药材用20倍量85%乙醇回流提取1次,提取3h,滤过,得醇提液,减压回收乙醇,药液备用;
(2)水煮:取当归、制何首乌、黄精、石菖蒲四味药材用10倍量水煎煮3次,每次1h,滤过,滤液减压浓缩备用;
(3)制剂成型:合并醇提药液和水煮药液,浓缩至稠膏,于60℃真空干燥,即得治疗老年痴呆的中药制剂的活性成分,在活性成分中加入辅料,混匀,压片,制成片剂1000片。
用法用量:口服,一日3次,每次4片。
实施例3:人参70g、炙黄芪140g、淫羊藿80g、延胡索80g、天麻100g、当归100g、制何首乌140g、黄精140g和石菖蒲1000g
(1)醇提:取人参、天麻、炙黄芪、淫羊藿、延胡索五味药材用10倍量85%乙醇回流提取3次,每次1h,滤过,得醇提液,减压回收乙醇,药液备用;
(2)水煮:取当归、制何首乌、黄精、石菖蒲四味药材用16倍量水煎煮1次,煎煮3h,滤过,滤液减压浓缩备用;
(3)制剂成型:合并醇提药液和水煮药液,浓缩至稠膏,于80℃真空干燥,即得治疗老年痴呆的中药制剂的活性成分,在活性成分中加入辅料,按常规工艺制成软胶囊1000粒。
用法用量:口服,一日3次,每次4粒。
Claims (5)
1. 一种治疗老年痴呆的中药制剂,其特征在于:按照重量份计算,它是由中药原料人参50~70份、炙黄芪100~140份、淫羊藿80~100份、延胡索80~100份、天麻100~140份、当归80~100份、制何首乌100~140份、黄精100~140份和石菖蒲100~140份制备而成。
2. 按照权利要求1所述治疗老年痴呆的中药制剂,其特征在于:按照重量份计算,它是由中药原料人参60份、炙黄芪120份、淫羊藿90份、延胡索90份、天麻120份、当归90份、制何首乌120份、黄精120份和石菖蒲120份制备而成。
3. 权利要求1或2所述治疗老年痴呆的中药制剂的制备方法,包括如下步骤:
(1)醇提:取人参、天麻、炙黄芪、淫羊藿、延胡索五味药材用85%乙醇回流提取,滤过,得醇提液,减压回收乙醇,药液备用;
(2)水煮:取当归、制何首乌、黄精、石菖蒲四味药材加水煎煮,滤过,滤液减压浓缩备用;
(3)制剂成型:合并醇提药液和水煮药液,浓缩至稠膏,真空干燥,按常规制剂工艺制成药剂学意义上的各种剂型。
4. 按照权利要求3所述治疗老年痴呆的中药制剂的制备方法,包括如下步骤:
(1)醇提:取人参、天麻、炙黄芪、淫羊藿、延胡索五味药材用8~20倍量85%乙醇回流提取1~3次,每次1~3h,滤过,得醇提液,减压回收乙醇,药液备用;
(2)水煮:取当归、制何首乌、黄精、石菖蒲四味药材用8~16倍量水煎煮1~3次,每次1~3h,滤过,滤液减压浓缩备用;
(3)制剂成型:合并醇提药液和水煮药液,浓缩至稠膏,于60~80℃真空干燥,按常规制剂工艺制成药剂学意义上的各种剂型。
5. 按照权利要求4所述治疗老年痴呆的中药制剂的制备方法,包括如下步骤:
(1)醇提:取人参、天麻、炙黄芪、淫羊藿、延胡索五味药材用85%乙醇回流提取2次,每次2h,第一次加16倍量乙醇,第二次加14倍量乙醇,滤过,得醇提液,减压回收乙醇,药液备用;
(2)水煮:取当归、制何首乌、黄精、石菖蒲四味药材用水煎煮3次,每次2h,第一次加14倍量水,第二次和第三次加12倍量水,滤过,滤液减压浓缩备用;
(3)制剂成型:合并醇提药液和水煮药液,浓缩至稠膏,于70℃真空干燥,按常规制剂工艺制成药剂学意义上的各种剂型。
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