CN101250220A - 一种植物抗逆相关蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种植物抗逆性相关蛋白及其编码基因与应用。该植物抗逆性相关蛋白，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：1)序列表中的SEQ ID №：1；2)将序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗逆性相关的蛋白质。将本发明的植物抗逆性相关蛋白的编码基因转入石刁柏中，可增强石刁柏的抗逆性，特别是增强对盐、寒和旱的抗性。

Description

一种植物抗逆相关蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种植物抗逆相关蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

植物在自然界中经常会遭受干旱、盐碱和低温等恶劣环境的胁迫危害，使其生长发育受到抑制，甚至导致植株死亡。土壤盐渍化是影响植物生长量的一个主要的环境胁迫因子。据统计，盐碱地占地球陆地面积的7.5％，目前世界上大约有三分之一的可灌溉土壤由于含盐量较高而不再适合作物生长。我国约有15亿多亩盐渍化土地，主要分布在山东、河北、东北、新疆、甘肃等沿海及干旱和半干旱地区。随着我国人口的剧增及工业的高速发展，可耕地急剧下降，而不合理灌溉、耕作等又造成了大量良田的次生盐渍化。从而导致我国耕地逐年急剧下降，严重威胁着我国的粮食和林木生产。因此，如何利用和开发我国上亿亩盐渍化土壤，培育能够在盐渍化土壤上生长良好的耐盐新品种，尽量避免或减轻不良环境因素的危害，是当前生物和现代农业技术领域的研究热点，也是当今我国以及世界农业急需解决的重大课题。

植物对胁迫的抵抗或忍耐能力称为抗逆性，是植物在长期演化过程中形成的对不良环境适应性的结果。多年来，人们从各个角度对植物与高盐胁迫之间的关系进行了研究。从最初对生理现象的认识到生态、遗传等方面研究，在生理生化、代谢等方面己积累了丰富的资料。特别是分子生物学的发展，使人们能够在基因组成、表达调控及信号传导等分子水平上认识植物对胁迫的耐性机理，并且为利用基因工程手段改良植物抗盐胁迫性能开拓了新的途径。由于植物抗逆性状的复杂性，采用传统的育种方法提高植物的抗逆性十分困难。近年来，通过现代生物学手段为抗逆育种开辟了新的途径。先前，普遍的作法是克隆和应用单一的功能基因，如甜菜碱合成酶基因和脯氨酸合成酶基因等进行分子改良，虽然取得了一定的效果，但植物的抗逆性没有得到全面的提高。问题的关键在于高效抗逆基因的分离。

植物抗逆性受多基因控制，要使众多对植物抗逆性状产生影响的功能基因充分表达和发挥作用，才能有效地改良植物抗逆性。随着生物技术的不断发展，研究重点已从一般的功能基因转向各种专一性或高效性的调控因子(如启动子和转录因子)。由于一个DREB转录因子可以调控多个与植物胁迫耐性有关的基因表达，增强一个DREB转录因子的作用，就可使植株抗逆性状获得综合改良。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种植物抗逆相关蛋白及其编码基因与应用。

本发明所提供的植物抗逆相关蛋白，名称为AoDREB3，来源于石刁柏(Asparagus officinalis L.)，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

1)序列表中的SEQ ID №：2；

2)将序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗逆性相关的蛋白质。

其中，序列表中的序列2由240个氨基酸残基组成。

所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述植物抗逆性相关蛋白编码基因(AoDREB3)也属于本发明的保护范围。

上述植物抗逆性相关蛋白的cDNA基因或基因组基因，可具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：1的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID №：2蛋白质序列的多核苷酸；

3)与序列表中SEQ ID №：1的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；

4)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

上述高严谨条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。

其中，序列表中的SEQ ID №：1由1073个脱氧核苷酸组成，自5′端第45位至767位脱氧核苷酸为编码序列。

含有本发明基因的重组表达载体、转基因细胞系及工程菌均属于本发明的保护范围。含有本发明基因的重组表达载体具体可为p3301-BI121-AoDREB3。

在逆境条件下的表达模式实验表明，AoDREB3基因在转录水平的表达受高盐、干旱和冷的强烈诱导，而与ABA诱导没有关系。上述结果表明AoDREB3基因可能通过与ABA信号传导无关途径来提高植物对干旱、盐碱和低温胁迫的耐性。

本发明的AoDREB3基因可通过现有的方法构建到真核细胞表达载体，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入植物可选择性标记(BAR基因、GUS基因、萤光素酶基因等)或具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素，卡那霉素等)。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如：水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草或苜宿等。携带有本发明的AoDREB3基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物经组织培育成植株。

本发明的植物抗逆性相关蛋白及其编码基因可增强植物抗逆性，特别是增强石刁柏的抗逆性，特别是对盐、寒和旱的抗性。

附图说明

图1为总RNA琼脂糖凝胶电泳

图2为AoDREB3基因3’RACE结果

图3为AoDREB3基因5’RACE结果

图4为AoDREB3基因全长cDNA扩增结果

图5为AoDREB3的cDNA结构示意图

图6为AoDREB3基因的全长cDNA序列及推断的氨基酸序列。

图7为AoDREB3蛋白的结构功能预测

图8为石刁柏与其他植物DREB类蛋白编码氨基酸的多序列比较

图9为植物DREB类蛋白编码氨基酸的***进化树分析

图10为AoDREB3基因的基因组DNA结构分析

图11为AoDREB3基因的组织特异性表达分析

图12为不同胁迫条件下BpDREB2基因在转录水平的表达模式分析

图13为重组质粒p3301-BI121-AoDREB3的构建示意图

图14为p3301-BI121-AoDREB3表达载体的酶切鉴定

图15为p3301-BI121-AoDREB3表达载体的PCR鉴定

图16为转AoDREB3拟南芥的抗盐性实验照片

图17为转AoDREB3拟南芥抗旱性实验照片

具体实施方式

选择石刁柏(Asparagus officinalis L.)为材料，经高盐处理后分离、克隆DREB基因，构建植物转化载体，建立石刁柏遗传转化体系，为培育速生、丰产、高耐盐品种提供了有效的途径。

实施例1、植物抗逆相关蛋白AoDREB3及其编码基因的获得

一、AoDREB3全长cDNA的克隆

1、总RNA的提取

以石刁柏幼苗为材料，以250mM的NaCl溶液处理石刁柏幼苗的根系6小时后提取茎叶总RNA，进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示，表明所提取的总RNA有2条特别明显的电泳带，从上到下分别为28S和18S(箭头示)。

2、AoDREB3基因3′端序列的克隆

以Adaptor-dT：5′TTTTTTTTTT TTTTTTTCAG CAGCTGTCTT TAG3′为引物，用所提取的总RNA为模板，进行反转录合成第一链cDNA。以此cDNA为模板，简并引物DREB3-3′GSP1：5′TG(C/T)ATG  (G/A)(A/C)A  GG(G/T)AAAGGA GG 3′、DREB3-3′GSP2：5′TGG GG(T/C)AAA TGG GT(T/G)GC(T/A)GAG 3′分别与引物dT-Adaptor：5′TTTTTTTTTT TTTTTTTCAGCAGCTGTCTT TAG 3′配对进行套式PCR扩增。其中，

第一轮扩增程序：先94℃5min；然后94℃30s，56℃30s，72℃50s，30个循环；最后72℃10min。

反应体系(20μl)含：无菌水13.8μl，10×PCR buffer(含MgCl2)2μl，2.5mMdNTPs(Mixture)2μl，10pmol/μl引物Adaptor-dT、DREB3-3′GSP1各1μl，5units/μl Taq DNA聚合酶0.2μl，反转录得到的单链cDNA 1μl。

第二轮扩增程序：先94℃5min；然后94℃30s，55℃30s，72℃50s，30个循环；最后72℃10min。

反应体系(20μl)含：无菌水13.8μl，10×PCR buffer(含MgCl2)2μl，2.5mMdNTPs(Mixture)2μl，10pmol/μl引物Adaptor-dT、DREB3-3′GSP2各1μl，5units/μl Taq DNA聚合酶0.2μl，第一轮的PCR产物稀释100倍作为模板1μl。结果如图2所示，扩增出一段800bp左右的特异片段。图2中，泳道M为分子量标准Marker III，泳道1为3’RACE的PCR产物。回收该特异片段，与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α，进行蓝白斑筛选阳性克隆，然后进行PCR和酶切鉴定后核苷酸测序。将测序结果进行BLAST分析，结果表明该片段与植物中已知的DREB3类基因的3′端序列有较高的同源性，表明该片段可能为AoDREB3的3′端序列，长度为813bp。

3、AoDREB3基因5′端序列的克隆

根据3′端cDNA序列设计3个巢式引物：DREB3-5-gsp1：aagtcctcagtctcatc、DREB3-5-gsp2：gtcaccgaagaagaagaggaag和DREB3-5-gsp3：gcatcaacagacgagtgc，参照Invitrogen公司的5′RACE试剂盒的说明书进行反转录和PCR扩增，结果如图3所示，扩增得到500bp左右的条带，图3中，泳道M为分子量标准Marker III，泳道1为5’RACE的PCR产物。回收该条带与pMD18-T载体连接，鉴定后测序，测序结果表明该片段与3′RACE结果有218bp的重叠区，且BLAST分析表明该片段与植物中已知的DREB3类基因的5′端序列同源性较高，表明该片段为AoDREB3的5′端序列，长度为481bp。

4、AoDREB3的电子合并及全长cDNA的克隆

利用DNAMAN软件将克隆到的3′端序列和5′端序列进行拼接，将这两个片段拼接后获得cDNA的全长序列，在该序列读码框(open reading frame，ORF)的两端设计全长引物DREB3全长-1：actcctcgccatcaaactc和DREB3全长-2：aagcacaaaccagacactac，以合成的第一链cDNA为模板，进行PCR扩增。

扩增程序为：先94℃5min；然后94℃30s，56℃30s，72℃50s，30个循环；最后72℃10min。

反应体系(20μl)含：无菌水13.8μl，10×PCR buffer(含MgCl₂)2μl，2.5mMdNTPs(Mixture)2μl，10pmol/μl引物DREB3全长-1、DREB3全长-2各1μl，5units/μl Taq DNA聚合酶0.2μl，cDNA模板1μl。

结果如图4所示，扩增得到800bp左右的特异片段，图4中，泳道M为分子量标准Marker III，泳道1为PCR得到的石刁柏盐诱导基因片段。测序结果和拼接结果在扩增部分完全相同，为784bp。利用DNAMAN软件对扩增得到的片段的全长cDNA序列进行分析，该序列全长1073bp(cDNA结构示意图如图6所示)，将其命名为AoDREB3。AoDREB3具有序列表中序列1的核苷酸序列，其中，自序列1的5′端第45-764位核苷酸序列为编码序列，编码具有序列表中序列2的氨基酸残基序列，其分子量为23.804kDa，PI＝7.24。利用SMART工具对氨基酸序列进行功能预测，表明自序列2的N端第75-138位为一个典型的EREBP/AP2结构域，该结构域由64个氨基酸组成，自序列2的N端第139-240位的氨基酸为一个C-端典型转录激活区域(Activation Domain)(图6)，单线表示非翻译区，方框表示开放阅读框，黑色方框表示AP2 domain，右侧内涂阴影线的方框表示AAR区域。用SMART服务器(http://coot.embl-heidelberg.de/SMART/)分析结构域，结果如图7中A，表明在240个氨基酸的蛋白质序列中，在自序列表中序列2的氨基端75～138位之间含有一个典型的EREBP/AP2结构域。用CPHmodels-2.0 Server服务器http://genome.cbs.dtu.dk/services/CPHmodels-2_0Server-3D.htm)分析AoDREB3的蛋白质结构。结果如图7中B，AoDREB3含有一个典型的α螺旋和三个β折叠结构。结果表明AoDREB3是一种典型的转录因子，属于EREBP/AP2蛋白家族的一员，从而说明它是DREB基因家族中的一个新成员。

5、AoDREB3与植物中其它已克隆的DREB类蛋白编码氨基酸序列同源性分析

利用DNAMAN软件对石刁柏AoDREB3与植物中其它已克隆的DREB类蛋白编码氨基酸序列进行同源性分析(图8)和***进化树分析(图9)，结果表明AoDREB3与单子叶植物DREB类蛋白水稻OsDREB3、玉米ZmDBF1的同源性最高，与双子叶植物拟南芥AtRAP2.4，陆地棉GhDREB2，番茄LeDREB2，大豆GmDREB3的同源性较远。图7和图8中各植物DREB类蛋白编码氨基酸的基因的来源及GenBank序列接收号如下：AtRAP2.4，拟南芥，NP177931；OsDREB3，水稻，XP467836；ZmDBF1，玉米，AAM80486；GmDREB3，大豆，AAZ03388；GhDREB2，陆地棉，AAQ57226；LeDREB2，番茄，AAO13360。

6、AoDREB3的基因组DNA的结构分析

为了分析AoDREB3基因的结构，以石刁柏基因组DNA为模板，以DREB3全长-1和DREB3全长-2为引物进行PCR扩增。结果如图10所示，扩增得到800bp的条带，其大小与以cDNA为模板、以同样引物PCR扩增的结果相一致。图10中，泳道1为以石刁柏基因组DNA为模板的PCR产物；泳道2为以石刁柏cDNA为模板的PCR产物；泳道M为分子量标准Marker III。进一步对该特异片段进行克隆和测序，测序结果和对应的cDNA序列完全相同。说明在该基因内部没有内含子。

实施例2、AoDREB3的组织特异性表达分析

为了分析AoDREB3基因的组织特异性表达模式，分别提取地上组织和根两种组织的总RNA，利用全长引物DREB3全长-1和DREB3全长-2进行RT-PCR分析。以Actin基因作为内标，对所有cDNA模板进行半定量。分析结果表明：AoDREB3基因在两种组织中的表达存在差异(图11)，根中的表达量低，地上组织表达较强。图11中R表示根中AoDREB3的表达；S为地上部分AoDREB3的表达，以Actin作为内标。

实施例3、AoDREB3基因在不同非生物胁迫因子条件下的表达模式分析

为了分析AoDREB3基因在转录水平与一些不同非生物胁迫因子的关系，通过低温(4℃)、高盐(250mM NaCl)、干旱(20％PEG6000)及脱落酸ABA(100μM)对石刁柏幼苗分别进行不同时间处理(0；0.5；3.0；6.0；12.0；24h)。具体处理方法如下：将石刁柏幼苗的根系分别置于250mM的NaCl，100μM的ABA和20％的PEG 6000，分别处理0、0.5、3.0、6.0、12.0和24h；将整株石刁柏幼苗置于4℃分别处理0、0.5、3.0、6.0、12.0和24h。分批取材后，提取总RNA，首先利用NorternBlot方法分析了AoDREB3基因在各种处理条件下的表达模式。结果如图12所示，结果表明AoDREB3基因在转录水平明显受盐诱导，盐处理0.5h后表达量就迅速提高，随着处理时间的加长，表达量迅速增加，到6h达到最大值，之后基本保持一个很高的水平。在PEG的诱导下，该基因一开始变化比较微弱，然后表达量迅速上升，12至24h达到最高峰。在低温处理下，AoDREB3基因的转录表达量弱，但是也能看出在12h表达量增加。在ABA处理下，变化不明显。这表明AoDREB3基因的转录表达受干旱、盐和冷的诱导，而ABA对其不起作用。

实施例4、AoDREB3植物表达载体p3301-BI121-AoDREB3的构建及转AoDREB3植物的功能验证

1、p3301-BI121-AoDREB3的构建过程如图13所示，具体方法如下：

利用实施例1中所述引物DREB3全长-1和DREB3全长-2，以实施例1中所述第一链cDNA为模板，进行PCR扩增，扩增得到800bp左右的特异片段，将其与pMD18-T载体连接，得到包含AoDREB3编码序列的载体，将其命名为pMD18-AoDREB3载体，用XbaI单酶切pMD18-AoDREB3载体，补平，然后自连，从而去掉了pMD18-AoDREB3上的XbaI酶切位点，用SalI和SacI双酶切该质粒，切下来一条800bp的含有AoDREB3编码序列的小片段，同样用SalI和SacI双酶切质粒pGEX-KG(K.L.Guan and J.E.Dixon，Eukaryotic proteins expressed inEscherichia coli an improved thrombin cleavage and purification procedure of fusionproteins with glutathione S-transferase，Anal Biochem 192(1991)，pp.262-267；中国科学院植物研究所)，由于在pGEX-KG上SalI和SacI两个酶切位点相距只有6bp，切下的小片段在琼脂糖凝胶电泳中显现不出来，所以只有一条和原来大小几乎相等的条带，将其与pMD18-AoDREB3切下的小片段相连，得到含有AoDREB3编码序列的重组质粒，将其命名为pGEX-KG-AoDREB3。

用XbaI和SacI双酶切质粒pGEX-KG-AoDREB3和植物表达载体p3301-BI121(可购自cambia公司，是p3301和pBI121分别用HindIII和EcorI双酶切后连接得到，图谱如图13所示)，将从质粒pGEX-KG-AoDREB3切下的800bp的AoDREB3基因片段，与质粒p3301-BI121切下的11.4kb的大片段相连，获得重组质粒p3301-BI121-AoDREB3，构建成含有AoDREB3完整读码框架的高效植物双元表达载体。对构建好的植物表达载体进行鉴定，以质粒p3301-BI121-AoDREB3为模板，利用基因特异性引物DREB3全长-1和DREB3全长-2进行PCR扩增，扩增出一条800bp左右的条带，结果如图15所示，说明AoDREB3基因已连接到载体上，图15中，泳道M为分子量标准Marker III，泳道1为p3301-BI121-AoDREB3的PCR扩增产物。用XbaI和SacI双酶切质粒p3301-BI121-AoDREB3，结果如图14所示，同样切下一条800bp左右的条带，进一步证明植物表达载体构建正确，图14中，泳道M为分子量标准，泳道1为用XbaI和SacI双酶切过的p3301-BI121-AoDREB3。

2、转AoDREB3拟南芥(p3301-BI121-AoDREB3)的功能验证

1)转AoDREB3拟南芥的获得

花序浸泡法转化拟南芥：拟南芥(野生型columbia拟南芥)种子播种于盛满培养土(蛭石∶草碳＝1∶1)的8cm×8cm的小方盆中，每盆播四处，每处2-4棵，萌发2～3d后移至4℃光照培养箱中放置3d(进行春化)，再放到组织培养室中生长，16h光照，23℃；8小时黑暗，20℃，7d后每处只留1棵最好的苗。待植物抽苔7-8cm时进行侵染。

将步骤1构建好的植物表达载体p3301-BI121-AoDREB3通过冻融法导入农杆菌EHA105中，制备好含p3301-BI121-AoDREB3的农杆菌菌液10mL，在转化前1d转入含50mg/L卡那霉素的LB培养基的大瓶培养过夜。第2天当菌液OD600值在1.2～1.6之间时取出使用。室温下5000r·min离心15分，弃上清，沉淀悬浮于相应体积的渗透培养基(1/2×MS，蔗糖5％，Silwet L-770.005％)，制得OD600值在0.8左右的农杆菌悬浮液.将含p3301-BI121-AoDREB3农杆菌悬浮液倒在小烧杯中，将长有拟南芥的小方盆倒扣其上，保证莲座叶以上部分浸没于液体中，浸泡5min.取出植株，用保鲜膜封好以保持湿度，放在恒温室培养，黑暗培养24h，第3天去掉保鲜膜，20d后再浸染1次，培养21～28d，待种子成熟后，收取种子(转化子)，干燥器中存放14d。

转化子(T1代)的筛选：将收获的种子播种于盛满培养土(蛭石∶草碳＝1∶1)的8cm×8cm的小方盆中，待植株长到四片叶子时喷洒除草剂(ppt)30mg/L，无抗性的植株枯黄死去，有抗性的植株进行GUS及PCR检测。将阴性植株去除，阳性植株培养6周，待种子成熟后收取T2代。

T3代纯合株系的获得：T2代种子播种后的植株单株收种，分别播种在筛选培养基上，不出现分离现象的为纯合株系。

2)转AoDREB3拟南芥的抗盐性实验

以转AoDREB3拟南芥T3代纯合株系(L1，L15，L20)为试验材料，将CK(野生型columbia拟南芥)，L1，L15，L20的种子，消毒灭菌(70％乙醇5min，0.1％的升汞10min，无菌水冲洗4遍，各五分钟)后，播种于1/2MS上萌发，三周后转移至含有200mMNaCl的MS培养基，两周后拍照。结果如图16所示，结果表明转AoDREB3拟南芥T3代纯合株系(L1，L15，L20)均可在含有200mMNaCl的MS培养基上生长，而CK(野生型colombia拟南芥)在含有200mMNaCl的MS培养基上不能生长。

3)转AoDREB3拟南芥抗旱性实验

以T3代纯合株系(L1，L15，L20)为试验材料，将CK(野生型columbia拟南芥)，L1，L15，L20的种子，消毒灭菌(70％乙醇5min，0.1％的升汞10min，无菌水冲洗4遍，各五分钟)后，种于(蛭石∶草碳＝1∶1)的8cm×8cm的小方盆中，两周内正常浇水，两周后不浇水，干旱三个周后拍照。结果如图17所示，结果表明转AoDREB3拟南芥T3代纯合株系(L1，L15，L20)均可与干旱环境中生长，而CK(野生型colombia拟南芥)在干旱环境中很快萎蔫。

                     序列表

Claims (10)

1、一种植物抗逆性相关蛋白，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

1)序列表中的SEQ ID №：2；

2)将序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗逆性相关的蛋白质。

2、权利要求1所述植物抗逆性相关蛋白的编码基因。

3、根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述植物抗逆性相关蛋白的编码基因的编码序列为自序列1的5′端第45位至764位脱氧核苷酸。

4、根据权利要求2或3所述的编码基因，其特征在于：所述植物抗逆性相关蛋白的编码基因，具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：1的核苷酸序列；

2)编码序列表中SEQ ID №：2蛋白质序列的DNA；

3)与序列表中SEQ ID №：1的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；

4)在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID №：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

5、含有权利要求2-4任一所述的基因的重组表达载体。

6、含有权利要求2-4任一所述的基因的转基因细胞系。

7、含有权利要求2-4任一所述的基因的工程菌。

8、权利要求2-4任一所述的基因在培育抗逆性植物中的应用。

9、根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述抗逆性是抗盐性和/或抗旱性和/或抗寒性。

10、根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述植物为石刁柏或拟南芥。

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