CN102492669A

CN102492669A - 一种植物抗逆蛋白AcNAD及其编码基因的应用

Info

Publication number: CN102492669A
Application number: CN2011104011919A
Authority: CN
Inventors: 潘洪玉; 余刚; 张世宏; 刘金亮; 陈宣明; 李敬涛; 贾承国; 李桂华
Original assignee: Jilin University
Current assignee: Jilin University
Priority date: 2011-12-07
Filing date: 2011-12-07
Publication date: 2012-06-13
Anticipated expiration: 2031-12-07
Also published as: CN102492669B

Abstract

一种植物抗逆蛋白AcNAD及其编码基因的应用属植物基因工程技术领域，本发明提供的AcNAD包含由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成、将SEQ ID NO：2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代或缺失或添加且与植物抗逆相关的由SEQ ID NO：2衍生的蛋白质；编码基因AcNAD的编码序列如下之一：a.编码序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；b.编码SEQ ID NO：2蛋白序列的核苷酸分子；c.与a核苷酸序列具有90％以上同源性且编码蛋白的核苷酸分子；d.与a的核苷酸序列杂交且编码蛋白的核苷酸分子；将AcNAD导入酿酒酵母得到的转基因酿酒酵母，可提升酵母抗高温抗干旱抗活性氧胁迫能力。

Description

一种植物抗逆蛋白AcNAD及其编码基因的应用

技术领域

本发明属植物基因工程技术领域，具体涉及运用酿酒酵母Saccharomyces cerevisiaeINVSc1菌株表达一种与植物抗逆相关的蛋白AcNAD。

背景技术

自然界中存在多种如盐、碱、高温、低温、干旱、病虫害等多种生物和非生物胁迫，限制了作物的生长发育，从而影响作物产量直接威胁到粮食安全，因此，将抗逆境胁迫的基因转入作物中进行分子育种改良作物性状引起了科研工作者的兴趣。而克隆逆境相关基因及其功能的研究能够为通过基因工程进行植物抗逆育种提供有价值的信息和材料。但是，当前很多研究主要集中在草本植物，很少对木本植物特别是盐生木本植物进行分子遗传学的研究。木本植物和草本植物应对生物和非生物胁迫时在结构、生长、发育以及生理等方面存在差异性，因此克隆和研究木本植物中与抗逆相关的基因能够为通过基因工程提高作物对生物和非生物胁迫的抗受力提供更多的候选基因。

四翅滨藜(Atriplex canescens[Pursh]Nute)是藜科，滨藜属木本植物，是干旱、半干旱地区的典型植物，在年降雨量180mm以上，年均气温5℃左右，极端最低温度-40℃的干旱、半干旱荒漠、盐碱地生长良好，种源产地海拔2377m，人工栽植区已达3150m。据报道四翅滨藜被有些国家称为“生物脱盐器”，种6.07亩四翅滨藜，一年能从土壤中吸收1t以上的盐分，是荒漠、半荒漠山旱地极有价值的优良饲料灌木，高产优质、富含营养，枝叶含12％以上的粗蛋白，生物量达15t/hm²，同时有积累硒的能力，在美国广泛用于路坡固定和水土保持，但主要还是用于牧场改良。在印度，从美国等国引进了12种滨藜品种改良了700万hm²的盐碱地，突尼斯和北非一些国家为开发盐碱地资源已有2万hm²荒漠地种植了滨藜，在澳大利亚、南非、北非、以色列和北美地区滨藜是干旱半干旱地区最主要的饲料灌木之一，也是绿化和水土保持的优良树种。近几年先后在我国甘肃、青海、新疆、宁夏等地进行了区域性引种栽培试验，显示了极强的抗干旱、抗低温、贫瘠、抗盐碱等优良特性。

酿酒酵母菌Saccharomyces cerevisiae不仅具有生长快、容易培养和易于遗传操作等优点，而且具有典型真核***的特性，具有糖基化、二硫键形成以及蛋白质折叠等翻译后加工等过程，其表达模式与植物表达模式更为接近，所以用酵母筛选植物抗逆基因具有原核表达***不可替代的优越性。采用酵母突变体筛选植物的不同cDNA文库来鉴定和挖掘新基因的方法已经广泛应用于植物功能基因的研究。用酵母的2种不同氨基酸转运缺陷突变体筛选拟南芥cDNA文库，Frommer等和Hsu等(1993年)成功地克隆到相应的编码相同氨基酸透过酶的NAT2/AAP1。酵母表达***还被广泛地应用到植物抗盐基因功能研究中，Yamada等(2002年)利用酵母表达体系验证了丙二烯环化氧化酶(AOC)基因大大增强转化子的抗盐性，从而表明AOC基因在真核表达***中增强抗盐胁迫的功能。唐玉林等(2007年)利用酵母表达***研究大豆SAL I3-2蛋白功能，将大豆SAL I3-2蛋白cDNA及其缺失片段构建到酵母表达载体pYES2上，并转化酵母菌INVScl，检测酵母重组子在胁迫条件下的生长状况，结果表明，SALI3-2基因可明显提高酵母转化子的抗盐能力。酿酒酵母菌株INVSc1(基因型为MATa his3D1leu2 trp1-289 ura3-52)是一种二倍体，并且生长迅速的理想酵母表达菌株，该菌株是人工改造的尿嘧啶营养缺陷型菌株，运用SC-U培养基筛选转化子，假阳性率低，能够保证转化效率。

乙醇脱氢酶是一种底物广泛性酶，能够以NAD+为辅酶，催化伯醇和醛之间的可逆反应。在辅酶存在的条件下，它催化包括乙醇在内的某些一级或二级醇、醛和酮的脱氢反应，脱下的氢由NAD+接受，使之成为还原型辅酶I。ADH基因的研究最初是在玉米中开始的，研究人员先后从玉米中克隆了两个ADH同工酶基因ZmADH1和ZmADH1，在玉米中，两个ADH基因在核苷酸上有82％的相似性，氨基酸序列有87％的相似性，两者的近似关系表明它们可能有同一祖先进化而来，但是定位于不同的染色体，ZmADH1定位于第1号染色体，ZmADH2定位于第4号染色体。迄今为止，葡萄、马铃薯、水稻、小麦的ADH1和ADH2基因均已有报道。乙醇脱氢酶(ADH)是一种重要的含锌酶，在植物体中，ADH在无氧或缺氧状态下(如洪涝灾害)发挥着重要的作用，对抗旱、低温以及病原菌入侵等生物逆境胁迫的应答也有着紧密的关联为一种逆境因子一直以来被人们高度关注，高等植物的需氧组织在土壤渍水的情况下会因为氧气利用率受阻而迅速死亡。在涝渍条件下，植物处于根系缺氧状态，乙醇发酵是厌氧胁迫时根系的主要产能途径，而乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase，ADH)是该代谢途径中起关键性作用的酶。抗涝植物通过调节ADH、PDC等基因表达，增强乙醇发酵速率，促进ATP的生成，被认为是提高植物抗涝能力的有效方法。

其中，转化pYES-AcNAD重组载体的酵母INVSc1菌株在抗干旱和抗活性氧胁迫中表现出较强抗性，在众多的研究中，还未看到有关含短链乙醇脱氢酶功能域的四翅滨藜基因在酵母抗逆和植物的抗逆生理功能方面的相关报道。

发明内容

本研究采用盐生灌木植物四翅滨藜(Atriplex canescens)作为研究材料，通过构建低温(-10℃)和盐(400mM NaCl)胁迫下四翅滨藜的全长运用Invitrogen公司

Full-LengthcDNA Library Construction Kit构建全长cDNA文库，并通过Gateway技术LR重组到酵母表达载体pYES-DEST52中，混合质粒转化酵母菌株INVSc1，通过多种模拟逆境胁迫(盐碱、冻害、高温、SOS胁迫、干旱胁迫)筛选出与逆境胁迫相关的基因，为今后利用抗盐碱、干旱、冻害、SOS胁迫基因获得抗相应逆境胁迫的转基因农作物和林木奠定基础，同时也为四翅滨藜抗盐碱和抗低温分子机制研究提供依据。

本发明使用酵母表达载体pYES-DEST52(购自Invitrogen公司)，***本发明AcNAD蛋白核苷酸编码序列以及得到重组表达载体pYES-AcNAD，它除了携带有AcNAD蛋白核苷酸编码序列外，还有T7启动子、GAL1启动子、CYC1终止转录信号、URA3基因、f1复制基因、pUC复制基因、酵母2μ复制序列、氨苄青霉素抗性基因、attR1和attR2用于LR重组的重组位点、致死基因ccdB用于逆向筛选转化子、氯霉素抗性基因用于对阳性转化子的双重筛选、V5 epitope便于重组后蛋白表达检测、6xHis Tag用于重组基因纯化，以及为外源蛋白高效表达所需的各种调控元件。

本发明采用盐生灌木植物四翅滨藜(Atriplex canescens)作为研究材料，通过构建低温(-10℃)和盐(400mM NaCl)胁迫下四翅滨藜的全长运用Invitrogen公司

Full-LengthcDNA Library Construction Kit构建全长cDNA文库，并通过Gateway技术LR重组到酵母表达载体pYES-DEST52中。AcNAD基因由927个碱基组成，含有一个完整的开放阅读框架(Open Reading Frame)459bp，同时还提供5’-UTR和3’-UTR序列，AcNAD为序列表中的SEQ ID NO：1序列。开放读码框的起始密码子为ATG，终止密码子为TAG。

本发明的一个目的是提供含乙醇脱氢酶功能域的四翅滨藜中与植物抗逆相关的蛋白及其编码基因，并进行应用。

本发明提供一种植物抗逆相关蛋白抗Na₂CO₃，NaHCO₃和干旱等胁迫，名称为AcNAD(Atriplex canescens short chain alcohol dehydrogenase-like protein)，来源于四翅滨藜。

一种植物抗逆相关蛋白AcNAD包含如下两类蛋白质：

(a)由序列表中SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列表中SEQ ID NO：2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代或缺失或添加且与植物耐逆相关的由序列表中SEQ ID NO：2衍生的蛋白质。

植物抗逆性相关蛋白AcNAD的编码基因AcNAD的编码序列为序列表中SEQ ID NO：1的5’端第289-751位脱氧核苷酸，序列表中的SEQ ID No：1由927个脱氧核苷酸组成。

序列表中SEQ ID NO：2由153个氨基酸残基组成，其中，92个疏水氨基酸，61个亲水氨基酸，14个碱性氨基酸，14个酸性氨基酸，蛋白质分子量为16.3kD，等电点为5.47。四翅滨藜AcNAD蛋白未见报道。

植物抗逆相关蛋白AcNAD的编码基因AcNAD的编码序列为下列之一：

1)编码序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示；

2)编码序列表中SEQ ID NO：2蛋白序列的核苷酸分子；

3)与1)所述的核苷酸序列具有90％以上的同源性且编码植物抗逆相关蛋白AcNAD的核苷酸分子；

4)在高严谨条件下与1)所述的核苷酸序列杂交且编码植物抗逆相关蛋白AcNAD的核苷酸分子。

以上4)中所述高严谨条件是指可为在0.1XSSC，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜的条件。

一种重组表达载体含有植物抗逆相关蛋白AcNAD的编码基因AcNAD。

一种重组菌含有植物抗逆相关蛋白AcNAD的编码基因AcNAD(以下简称编码基因AcNAD)。

为了使(a)中的AcNAD便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或梭基末端连接上如表1所示的标签。

表1.标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

重组酿酒酵母表达载体含有编码基因AcNAD，重组酵母表达载体转化的宿主细胞为酿酒酵母INVSc1。重组酿酒酵母菌株表现出抗逆性，所述酵母抗逆性具体可为对非生物胁迫的抗逆性，特别是对干旱和高温、活性氧胁迫的抗逆性。

将AcNAD导入酿酒酵母得到的转基因酿酒酵母，可提升酵母抗高温抗干旱抗活性氧胁迫能力。

附图说明

图1为四翅滨藜总RNA提取图片

其中：NaCl为400mM NaCl处理四翅滨藜后提取叶片和茎部总RNA电泳图；MW为1kb Plus核苷酸Ladder Marker由核苷酸片段10000bp、8000bp、6000bp、5000bp、4000bp、3000bp、2000bp、1500bp、1000bp、800bp、500bp、以及300bp构成，其中3000bp的核苷酸量为100ng，其余条带核苷酸量约为50ng；Cold为-10℃处理四翅滨藜后提取叶片和茎部总RNA电泳图。

图2为cDNA文库***片段长度PCR检测图片

其中：1-8，9-16为挑取阳性菌落进行菌落PCR鉴定结果；MW为1kb Plus核苷酸LadderMarker由核苷酸片段10000bp、8000bp、6000bp、5000bp、4000bp、3000bp、2000bp、1500bp、1000bp、800bp、500bp、以及300bp构成，其中3000bp的核苷酸量为100ng，其余条带核苷酸量约为50ng。

图3为重组pYES-AcNAD质粒PCR扩增电泳图

其中：M：marker自上到下大小为：2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp1，2：目的条带

图4为AcNAD在GenBank中功能域比对结果

图5为AcNAD与其他物种Dehydrin蛋白***进化树

图6为pYES-AcNAD和pYES-DEST52酵母转化图

其中A为INVSc1酵母菌株；B为重组质粒pYES-AcNAD转化INVSc1酵母菌株；C为INVSc1酵母菌株；D为pYES-DEST52质粒转化INVSc 1酵母菌株。

图7为pYES-AcNAD酵母阳性转化子PCR鉴定图

其中：M：marker自上到下大小为：2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp1，2，3：阳性转化子目的条带

图8为pYES-AcNAD酵母阳性转化子加入半乳糖诱导后生长曲线图

其中：横坐标表示加入半乳糖后生长时间；纵坐标表示吸光度OD₆₀₀值。

图9为pYES-AcNAD酵母阳性转化子生长中全蛋白表达量曲线图

其中：横坐标表示生长时间；纵坐标表示pYES-AcNAD酵母全蛋白量。

图10为pYES-AcNAD酵母和pYES-DEST52酵母胁迫处理效果的照片I

其中：A为4M KCl处理酵母效果；B为5M NaCl处理酵母效果；C为高温处理酵母效果；D为低温处理酵母效果。

图11为pYES-AcNAD酵母和pYES-DEST52酵母胁迫处理效果的照片II

其中：A为6％NaHCO₃处理酵母效果；B为8％NaHCO₃处理酵母效果；C为6％Na₂CO₃处理酵母效果；D为8％Na₂CO₃处理酵母效果。

图12为pYES-AcNAD酵母和pYES-DEST52酵母胁迫处理效果的照片III

其中：A为40％PEG6000处理酵母效果；B为5M山梨醇处理酵母效果；C为4mM百草枯处理酵母效果。

具体实施方式

实施例一：编码基因AcNAD全长cDNA的获得及序列分析

1.胁迫处理四翅滨藜：

将生长三个月的四翅滨藜植株从-10℃野地移栽到植物培养室，种植10d，待植株存活，发出新叶。每天用500mL 400mM NaCl处理每株四翅滨藜植株。处理4d，采摘叶片，茎部和根清洗干净用液氮速冻，-80℃冻存，以备建库。

2.构建cDNA文库：

将-10℃条件下采集和用400mMNaCl处理四翅滨藜植株的叶片，茎和根同时提取总RNA(图1)，然后使用Invitrogen公司的cap antibody module针对含有完整帽子结构的一链cDNA进行富集，然后按照Invitrogen公司SuperScript

Full-Length cDNA LibraryConstruction Kit构建cDNA全长uncut文库(图2)，并通过Gateway技术LR重组到酵母表达载体pYES-DEST52中，PCR检测***片段长度，将片段长度超过1000bp的300个文库克隆测序，进行氨基酸比对和生物信息学分析，获得四翅滨藜抗性ESTs序列。

2.1 Total RNA的提取：

2.1.1取100mg组织样品，在预冷的研钵中用液氮研成粉末，然后转入1.5mL离心管中；

2.1.2加入1ml的Trizol试剂，振荡混匀，室温静置10min充***解细胞；

2.1.3加入200μL的氯仿，剧烈震荡15sec，室温静置5min；

2.1.4在4℃，12,000rpm高速冷冻离心15min；

2.1.5取上清于新1.5mL离心管中，加入0.5mL异丙醇，颠倒混匀，室温静置10min；

2.1.6在4℃，12,000rpm高速冷冻离心10min；

2.1.7去上清，加入1mL的75％乙醇洗涤沉淀，7,500rpm高速冷冻离心5min；

2.1.8重复步骤2.1.7一次；

2.1.9去上清，空气中干燥RNA沉淀，然后溶解于50μL DEPC水中。

3.筛选编码基因AcNAD片段的克隆：

根据四翅滨藜ESTs序列中找出的编码基因AcNAD的cDNA序列，LR重组到酵母表达载体pYES-DEST52中得到重组酵母表达载体pYES-AcNAD，将重组酵母表达载体pYES-AcNAD转化大肠杆菌感受态DH5α，挑取单菌落之后，LB(Amp抗性)摇培后提取质粒。根据载体上的序列设计PCR引物，并进行PCR扩增，验证cDNA序列和测序结果。

上游(T7)：5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’

下游(R)：5’-AGGGTTAGGGATAGGCTTACCTTC-3’

PCR反应体系：克隆PCR反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性30sec；56℃退火30s；72℃延伸3min，30个循环；72℃延伸10min。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，在1400bp位置上有一特异性的条带(图3)。

实施例二：编码基因AcNAD的序列分析

经测序编码基因AcNAD cDNA序列开放阅读框包含459bp，由153个氨基酸残基组成，根据核苷酸MAN分析编码基因AcNAD不含信号肽。其中，92个疏水氨基酸，61个亲水氨基酸，14个碱性氨基酸，14个酸性氨基酸，蛋白质分子量为16.3kD，等电点为5.47。四翅滨藜AcNAD蛋白未见报道。结果表明获得全长基因的cDNA序列，其GenBank登录号为JN974249。

利用NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)对该基因编码的氨基酸进行保守区域分析(图4)，结果表明：该蛋白属于乙醇脱氢酶家族蛋白。在NCBI网站上对编码基因AcNAD编码的氨基酸序列进行BLAST，与已确定功能的其他物种氨基酸序列进行进化分析和同源性分析，并用clustalX和MEGA4软件绘制进化树：编码基因AcNAD与其他物种乙醇脱氢酶处于平行进化关系(图5)。

实施例三：重组酵母的转化及检测

酿酒酵母INVSc1是尿氨酸营养缺陷型(Ura^-)，在不含尿氨酸的SC基本培养基(SC-Ura^-)上，该酵母不能繁殖和生长。pYES2-DEST52质粒上含有URA3基因，使重组酵母能够在SC-Ura^-培养基上正常生长。因此，可以用SC-Ura^-选择培养基进行筛选转化阳性酵母和非阳性酵母。分别将质粒pYES-AcNAD和pYES-DEST52转化酵母菌INVSc1菌株中，转化酵母涂布在SC-Ura^-固体选择培养基上，以未转化的酵母做对照，进行培养，2d后除了空酵母外均有菌落长出，说明酵母转化成功(图6)。

1.运用Lithium acetate化学转化法转化酿酒酵母INVSc1，其具体转化步骤：

1.1在10mLYPD液体培养基中加入一个酵母菌株单克隆(INVSc1)，30℃过夜摇培；

1.2检测培养菌液的OD₆₀₀，在50mL YPD培养基中加入过夜培养的酵母菌液，稀释至OD₆₀₀为0.4，再摇培2-4h；

1.3 2500rpm冷冻离心5min沉淀收集菌体，之后用40mL1xTE重悬菌体；

1.4 2500rpm冷冻离心5min沉淀收集菌体，之后用2mL1xLiAc/0.5xTE重悬菌体；

1.5分装成100μL/1.5mLEP管；

1.6将酵母细胞置于室温孵育10min；

1.7每个转化体系(100μL)中，加入1μg质粒核苷酸，100μg变性鲑鱼精核苷酸，混匀；

1.8加入700μL 1x LiAc/40％PEG-3350/1x TE，混匀；

1.9 30℃孵育步骤8中的混合液30min；

1.10加入88μLDMSO，混匀，42℃热击7min；

1.11 5000rpm冷冻离心1min，移除上清；

1.12用1mL1xTE重悬菌体，5000rpm冷冻离心1min，移除上清；

1.13用100μL 1xTE重悬菌体，涂布于筛选培养基上。

2.阳性转化子的鉴定

从筛选培养基上随机挑取3个INVSc1(pYES2-AcNAD)单克隆，30℃，200r·min^-1振荡培养过夜，取过夜培养物，沸水浴5min，冰上放置5min破碎细胞，以细胞破碎液离心浓缩作为模板进行菌液PCR以引物T7和R进行PCR扩增，PCR反应体系(20μL)为：PCR Buffer2μL，dNTP 1μL，T7 Primer 0.5μL，R Primer 0.5μL，Template 1μL，ddH₂O 14.5μL。扩增产物在1％的琼脂糖凝胶上电泳，其扩增片段与预期的1400bp长度相吻合(图7)。证明重组质粒pYES2-AcNAD已经转化进入到酵母中。

实施例四：转基因酵母生长及蛋白表达

在实验室使用酿酒酵母菌株INVSc1中，GAL1启动子会被葡萄糖抑制，而在半乳糖作为碳源的情况下能够诱导转录(图8)。其中蛋白在12h左右表达量最高(图9)。

1.蛋白诱导表达步骤

1.1将含有目标基因的pYES-DEST52-Genes接种于含有2％葡萄糖的SC-U培养基中，30℃，过夜摇培；

1.2测算过夜菌液的OD₆₀₀，保证能够使接种于50mL SC-U(含半乳糖)培养基中OD₆₀₀等于0.4；

1.3吸出步骤2中计算的酵母细胞体积，3500rpm，5min，4℃离心，弃上清；

1.4将步骤3中的细胞重悬于50mL诱导培养基(SC-U，半乳糖)中，30℃摇培；

1.5分别在0，4，8，12，16，和24h处取出相同体积的诱导细胞，并且测量OD₆₀₀值；

1.6将取出的细胞3500rpm，5min，4℃离心，收集菌体；

1.7弃上清，将细胞重悬于500μL无菌水中；

1.8将细胞转移到灭菌的1.5mL的离心管中，12000rpm，30s，弃上清；

1.9将细胞保存在-80℃，备用。

2.重组蛋白定量

将酵母细胞用裂解Buffer裂解之后，运用Bradford法进行总蛋白量的测定，模拟酵母细胞生长曲线和总蛋白表达曲线

2.1准备好细胞裂解液，在准备实验之前最好能够了解裂解细胞的OD₆₀₀；

2.2将细胞重悬于500μl裂解缓冲液中，3500rpm，5min，4℃离心，收集菌体；

2.3取出上清，然后加入适量(计算加入裂解缓冲液的体积)裂解缓冲液，使OD₆₀₀至50-100；

2.4加入等量的酸洗玻璃珠；

2.5将步骤4中的处理液放在涡旋仪上涡旋1min，冰上放置1min，重复该步骤20次，裂解细胞。细胞能被机械剪切力裂解，可以显微镜下边观察裂解效果；

2.6将步骤5中裂解之后混合液，12000rpm，10s，4℃离心；

2.7将上清转移到新的1.5mLEP管中，可以用BSA进行蛋白质定量。

实施例五：阳性转化酵母逆境胁迫处理

1.逆境胁迫前处理

吸取酵母INVSc1(pYES-DEST52)和验证正确的INVSc1(pYES2-AcNAD)的保存菌液或者挑取单菌落，接种于SC-U液体培养基(加入终浓度2％的葡萄糖)中，30℃摇床振荡培养24h，测量其OD₆₀₀值，并用SC-U液体培养基(葡萄糖)将菌液浓度调整OD₆₀₀为0.4，体积为5mL，8000g离心1min，加入2mL诱导培养基(SC-U+2％半乳糖)重悬菌体，接于5mL的诱导培养基中，30℃振荡培养24h，测量INVSc1(pYES-DEST52)和INVSc1(pYES2-AcNAD)的OD₆₀₀值，并将两种重组酵母的浓度统一调整到OD₆₀₀值为2，取等量的酵母，8000rpm离心1min，弃上清。对这两种酵母进行不同的胁迫处理，比较(pYES-DEST52)和INVSc1(pYES2-AcNAD)的抗性，每种实验重复3次。

2.模拟逆境胁迫处理

植物存在于自然界中要面对各种生物和非生物逆境，其中最主要的有以下几种：盐害(NaCl、KCl等)，碱害(Na₂CO₃、NaHCO₃等)，干旱胁迫，冻害低温胁迫，高温胁迫以及植物病原菌胁迫。

在实验室条件下，运用高浓度NaCl和KCl模拟盐胁迫，高浓度Na₂CO₃和NaHCO₃模拟碱胁迫，PEG6000和山梨醇模拟干旱胁迫，低温(-20℃)模拟冷冻胁迫，高温(53℃)模拟高温胁迫，百草枯可以产生活性氧模拟植物病原微生物侵染植物过程中产生的活性氧物质从而模拟植物病原菌等生物胁迫。运用以上处理，模拟生物和非生物胁迫对转基因酿酒酵母的影响，从而评价基因对各种胁迫的应答效果(图10)。

2.1 NaCl处理：将上述菌体重悬于5mol/L NaCl溶液，混匀后30℃振动放置24h，然后将不稀释的菌体和分别稀释10、100、1000、10000倍的菌体，取2μL点样在SC-U(含2％葡萄糖)的固体培养基上，30℃培养48h，比较两种菌的菌落的生长差异。

2.2 KCl处理：将菌体重悬于4mol/L KCL溶液中混匀，30℃振动胁迫24h，然后将不稀释的菌体和分别稀释10、100、1000、10000倍的菌体，取2μL点样在SC-U(含2％葡萄糖)的固体培养基上，30℃培养48h，比较两种菌的菌落的生长差异。

2.3 Na₂CO₃处理：将菌体分别重悬于6％和8％的Na₂CO₃溶液，混匀30℃振动胁迫2h，将然后将不稀释的菌体和分别稀释10、100、1000、10000倍的菌体，取2μL直接点样在SC-U(含2％葡萄糖)的固体培养基上，30℃恒温培养48h，比较两种菌的菌落的生长差异。

2.4 NaHCO₃处理：将菌体重悬于6％和8％的NaHCO₃溶液，混匀后，30℃振动胁迫2h，将然后将不稀释的菌体和分别稀释10、100、1000、10000倍的菌体，取2μL直接点样在SC-U(含2％葡萄糖)的固体培养基上，30℃培养48h，比较两种菌的菌落的生长差异。

2.5 40％PEG6000处理：将菌体重悬于40％的PEG6000和5mol/L的山梨醇中，30℃振动胁迫24h，然后将不稀释和分别稀释10、100、1000、10000倍的菌体，取2μL点样在SC-U(含2％葡萄糖)的固体培养基上，30℃恒温培养48h，比较两种菌的菌落的生长差异。

2.6 5mol/L山梨醇(Sorbitol)处理：将菌体重悬于5mol/L的山梨醇中，30℃振动胁迫24h，然后将不稀释和分别稀释10、100、1000、10000倍的菌体，取2μL点样在SC-U(含2％葡萄糖)的固体培养基上，30℃恒温培养48h，比较两种菌的菌落的生长差异。

2.7冷冻处理：将菌体重悬于SC-U液体培养基，冷冻(-20℃)胁迫48h，其间每隔6h把菌体冻融一次。将不稀释和分别稀释10、100、1000、10000倍的菌体，取2μL点样在SC-U(含2％葡萄糖)的固体培养基上30℃培养48h，比较两种菌的菌落的生长差异。

2.8高温处理：将菌体重悬于SC-U液体培养基，53℃胁迫1h。将不稀释和分别稀释100、1000、10000倍的菌体，取2μL点样在SC-U(含2％葡萄糖)的固体培养基上30℃培养48h，比较两种菌的菌落的生长差异。

2.9百草枯(Paraquat)：将菌体重悬于4mM百草枯溶液中，30℃胁迫2h。将不稀释和分别稀释10、100、1000、10000倍的菌体，取2μL点样在SC-U(含2％葡萄糖)的固体培养基上30℃培养48h，比较两种菌的菌落的生长差异。

其中，pYES-AcNAD转化酵母对于4M KCl、5M NaCl、6％NaHCO₃、8％NaHCO₃、6％Na₂CO₃、8％Na₂CO₃、40％PEG6000、5M山梨醇等逆境效果明显强于空白质粒pYES-DEST52转化酵母。

Claims

1.一种植物抗逆相关蛋白AcNAD，其特征在于其中包含如下两类蛋白质：

(a)由序列表中SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列表中SEQ ID NO：2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代或缺失或添加且与植物耐逆性相关的由序列表中SEQ ID NO：2衍生的蛋白质。

2.按权利要求1所述植物抗逆相关蛋白AcNAD的编码基因AcNAD，其特征在于所述的编码基因AcNAD的编码序列为序列表中SEQ ID NO：1的5’端第289-751位脱氧核苷酸。

3.按权利要求2所述植物抗逆性相关蛋白AcNAD的编码基因AcNAD，其特征在于所述编码基因AcNAD的编码序列为下列之一：

1)编码序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示；

2)编码序列表中SEQ ID NO：2蛋白序列的核苷酸分子；

3)与1)所述的核苷酸序列具有90％以上的同源性且编码权利要求1所述植物抗逆相关蛋白AcNAD的核苷酸分子；

4)在高严谨条件下与1)所述的核苷酸序列杂交且编码权利要求1所述植物抗逆相关蛋白AcNAD的核苷酸分子。

4.一种重组表达载体，其特征在于含有权利要求2或3所述植物抗逆相关蛋白AcNAD的编码基因AcNAD。

5.一种重组菌，其特征在于含有权利要求2或3所述植物抗逆相关蛋白AcNAD的编码基因AcNAD。