CN103665124B - 一种植物抗冻基因及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种植物抗冻基因及其应用。本发明公开的一种蛋白，为如下（1）或（2）所示：（1）SEQ？ID？No.2所示的蛋白；（2）将SEQ？ID？No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质。本发明公开的青杄云杉PicW基因可显著提高植物的抗冻性，为植物抗寒育种工作提供了重要的理论基础和基因资源。

Description

一种植物抗冻基因及其应用
技术领域
本发明涉及一种植物抗冻基因及其应用。
背景技术
冻害（coldinjury）是农业气象灾害的一种，即0℃以下的低温使植物体内结冰，导致对植物的伤害。在低温逆境下，植物的个体形态及细胞形态、结构及生理生化过程都会发生一系列变化。从宏观上来说，植物表面有斑点产生，植物组织由内而外发生了颜色的变化，且相关机能下降，容易发生病害感染，停止生长或逐步死亡。一些变化还会出现在木本植物上，如顶枯，芽枯，自顶端向下部逐渐枯萎，树皮破损胶质外流以及脱叶的现象。从微观上来说，植物在越冬期间，如果遭遇零下低温，在细胞内、细胞间隙、木质部导管及管胞中就会形成小冰晶。细胞内的冰晶可使质膜发生不可逆的损伤，膜***变得不稳定且失去半透性，在细胞间隙形成的小冰晶会造成细胞内的水分外流，从而使细胞失水，蛋白质变性，导致细胞发生收缩凹陷，最终导致植物冻害的发生（Burkeetal.1976;PearceR.S.,2001）。此外，植物长时间遭受冷冻状态，冰晶会自发经历重结晶过程，以减少表面积，同样产生了植物冻害（KnightC.A.etal.,1995）。“世界上气温每降低1℃,粮食就会减产40%”，全世界每年因为冻害造成的经济损失达到10亿美元。1999年，我国广东、广西、福建三省的低温冻害造成经济损失150亿元左右,受害面积在1500万亩以上；2009年冬天大雪和2010年倒春寒等气候的影响,使得石家庄市100万亩小麦出现不同程度的死苗死粟现象,减产幅度在2-3成左右。水稻在幼苗期与分蘖期，遇到持续低温的天气，常发生白苗和节节白的症状。棉花种子受害后仍能吸胀发芽，但胚根尖端不能生长，幼苗根的皮层破坏。
植物抗寒性研究及抗寒育种一直是植物学研究领域的热点之一。通过改造植物的遗传特性,使其具有抵御冻害的胁迫，从而最大限度免受冻害的影响。常规杂交育种方法由于周期长、费用高等局限性，很难满足生产上对抗寒抗冻品种的需要。近年来，随着分子生物学技术的发展，越来越多的基因被发掘，利用基因工程技术培育转基因植株成为培育新品种的有效途径，这一方式具有可控性强、培育周期短、成本低等优点。
植物在低温胁迫下，相应的抗性基因网络得意启动，以维护细胞的正常功能。目前有关植物抗寒性相关的基因可以分为调节因子基因和功能基因两大类。其中与抗寒功能相关的基因包括维持细胞膜结构相关的基因、渗透调节相关基因、抗冻蛋白等。
（1）维持细胞膜结构相关的基因
生物膜是植物细胞及细胞器与周围环境间的一个界面结构，它能够接受和传递环境信息，对环境胁迫做出反应。研究表明，生物膜是低温冷害作用的首要部位，而且低温伤害的原初反应发生在生物膜***类脂分子的相变上。一般认为，膜脂不饱和脂肪酸含量增高，膜脂相变温度会降低，增加了膜的流动性，从而使植物的抗寒性相应提高。反之，冷敏感植物的膜脂相变可能是由于膜脂脂肪酸的不饱和程度较低，低温下膜脂由液晶相向凝胶相转变，造成细胞膜膜相分离，从而引起细胞代谢紊乱。
Steponkus的研究表明，冷敏感植物与抗冷植物相比，饱和脂肪酸含量要高。宋洪伟等在研究小浆果资源的抗寒性时发现，膜脂不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸比值与抗寒性正相关。
（2）渗透调节相关基因
植物体内会产生一些具有保水作用的渗透调节物质来降低植物体内的水势，维持体内的水分平衡。这类渗透调节物质有脯氨酸、甜菜碱、可溶性糖和醇类物质等，对提高细胞内渗透压，降低细胞质冰点起重要作用。
（3）抗冻蛋白
抗冻蛋白(antifreezeprotein，AFP)最早是在极地海鱼中发现的（Devne，1969），在鱼类和昆虫类中研究比较深入。抗冻蛋白能够阻止体液内冰核的形成与生长，维持体液的非冰冻状态，是一类具有热滞效应和冰晶生长抑制效应的蛋白质，能以非线性形式降低水溶液的冰点，但对熔点影响甚微，从而导致水溶液的熔点和冰点之间出现差值。它们在受低温环境胁迫时能使有机体抵御冰冻环境。1987年，Davies等将抗冻基因AFPs转化郁金香、烟草和油菜等，获得一定抗冻力。Curler等用AFP真空浸润马铃薯、欧洲油菜和拟南芥叶片，可使叶片自发冰点显著降低；用AFP处理雀麦草及其悬浮培养细胞，可降低任何给定温度下冰冻的可冻水量。王艳等将小胸鳖甲抗冻蛋白基因MPAFP149转入烟草中，-1℃处理48h，转基因烟草的相对电导率和表型明显优于野生型烟草。室温恢复试验表明，转基因烟草可存活并恢复生长，而野生型烟草受到了不可逆的低温冻害。黄永芬等采用花粉管通道法及子房注射法将美洲拟鲽AFP基因导入番茄，田间抗寒性实验表明，在春季平均气温低于正常年份4.4℃的条件下，转基因植株生长优于对照，致死温度也比对照降低了2℃。
目前，有关抗冻抗寒基因工程育种的研究还非常有限，主要原因在于缺乏高效的基因资源，相应的基因结构、功能上的认识也较为浅显，发掘更多的基因资源已成为必然。
发明内容
本发明的目的是提供一种植物抗冻基因及其应用。
本发明提供的一种蛋白，为如下（1）或（2）所示：
（1）SEQIDNo.2所示的蛋白；
（2）将SEQIDNo.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质。
上述蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。
上述编码基因中，所述编码基因为如下中至少一种：
1）SEQIDNo.1所示的DNA分子；
2）在严格条件下与1）限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白质的DNA分子；
3）与1）或2）限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码所述蛋白质的DNA分子。
含有上述任一所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。
一种制备转基因植物的方法也属于本发明的保护范围，包括如下步骤：将上述蛋白的编码基因导入出发植物中，得到转基因植物；与出发植物相比，转基因植物的抗冻性增强。
上述方法中，所述编码基因是通过重组表达载体导入所述植物中的；
所述重组表达载体是将所述编码基因***出发载体PEZR(K)-LC的多克隆位点得到的；
所述抗冻具体是指抗-5℃处理的冻害。
上述任一所述的方法中，所述编码基因的核苷酸序列如SEQIDNo.1中所示。
上述任一所述的方法中，所述植物为烟草。
上述蛋白或上述任一所述的编码基因在增强植物抗冻性中的应用也属于本发明的保护范围；
和/或，
上述蛋白或上述任一所述的编码基因在提高植物脯氨酸含量中的应用也属于本发明的保护范围；
和/或，
上述蛋白或上述任一所述的编码基因在提高植物可溶性糖含量中的应用也属于本发明的保护范围；
和/或，
上述蛋白或上述任一所述的编码基因在降低植物相对电导率中的应用也属于本发明的保护范围；
和/或，
上述蛋白或上述任一所述的编码基因在降低植物丙二醛含量中的应用也属于本发明的保护范围。
上述应用中，所述植物为烟草。
本发明提供的青杄PicW基因可显著提高植物的抗冻性，为植物抗寒育种工作提供了重要的理论基础和基因资源。
附图说明
图1为青杄PicW基因的PCR扩增结果。
图2为PicW蛋白的氨基酸序列及其编码基因序列。
图3为PEZR(K)-LC-PicW质粒的构建示意图。
图4为转PicW基因的烟草分化出的抗性芽。
图5为转基因烟草cDNA的PicW基因检测。
图6为烟草在-5℃处理3h前后的表型差异。
图7为烟草的生理指标测定。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
云杉属青杄（Piceawilsonii）在文献“曹一博,刘亚静,张凌.青杄中sPPa1的cDNA序列克隆及其生物信息学分析,植物科学学报,2012，30(4):394-401”中公开过，该植物种植于北京林业大学。
pEASY-BluntSimple载体购自北京全式金生物技术有限公司，产品目录号为CB111-01。
PEZR(K)-LC质粒在文献“EiriniKaiserli,StuartSullivan,MatthewA.Jones,KevinA.FeeneyandJohnM.Christie.DomainSwappingtoAssesstheMechanisticBasisofArabidopsisPhototropin1ReceptorKinaseActivationandEndocytosisbyBlueLight(2009).ThePlantCell.21(10):3226-3244.”中公开过，公众可从北京林业大学获得。
芽分化培养基按照如下方法制备：向MS培养基中添加6-BA、萘乙酸、蔗糖和琼脂，使6-BA在芽分化培养基中的浓度为2mg/L，萘乙酸在芽分化培养基中的浓度为0.1mg/L，蔗糖在芽分化培养基中的浓度为3g/100ml，琼脂在芽分化培养基中的浓度为0.8g/100ml。
筛选分化培养基按照如下方法制备：向MS培养基中添加6-BA、萘乙酸、卡那霉素、头孢霉素（Cef）、蔗糖和琼脂，使6-BA在筛选分化培养基中的浓度为2mg/L，萘乙酸在筛选分化培养基中的浓度为0.1mg/L，卡那霉素在筛选分化培养基中的浓度为50mg/L，头孢霉素（Cef）在筛选分化培养基中的浓度为200mg/L，蔗糖在筛选分化培养基中的浓度为3g/100ml，琼脂在筛选分化培养基中的浓度为0.8g/100ml。
生根培养基按照如下方法制备：向MS培养基中添加萘乙酸、卡那霉素、头孢霉素（Cef）、蔗糖和琼脂，使萘乙酸在生根培养基中的浓度为0.1mg/L，卡那霉素在生根培养基中的浓度为50mg/L，头孢霉素（Cef）在生根培养基中的浓度为200mg/L，蔗糖在生根培养基中的浓度为3g/100ml，琼脂在生根培养基中的浓度为0.8g/100ml。
实施例1、青杄PicW基因的克隆及分析
一、以云杉属青杄（Piceawilsonii）为材料，分别于2010年12月（冬季，0℃以下）和2011年6月（夏季，约30℃左右）取其针叶提取RNA，并逆转录成cDNA。同时，提取青杄针叶的基因组DNA。
二、设计如下引物。
PicwF：5’-ATGGCTGAAAATGTATCG-3’；
PicwR：5’-TCATTCCTTGTTCTGGGC-3’。
三、分别以步骤一得到的冬季青杄的cDNA、夏季青杄的cDNA以及青杄的基因组DNA为模板，以PicwF和PicwR为引物，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
PCR程序：94℃预变性5min；94℃30s，55℃40s，68℃1min，35个循环。
结果如图1所示。
图1中，1：青杄基因组DNA的PCR扩增产物；2：冬季青杄的cDNA的PCR扩增产物；3：夏季青杄的cDNA的PCR扩增产物；4：DNAMarker。
图1表明，青杄的基因组DNA和冬季青杄的cDNA均扩增出大小约700bp左右的片段，预示该基因没有内含子存在。而在夏季青杄的cDNA中并未扩增目的片段，说明该基因片段受低温诱导，将扩增得到的该基因命名为PicW。
四、PicW基因的序列分析
分别回收以青杄的基因组DNA和冬季青杄的cDNA为模板，经步骤三得到的PCR扩增片段，将其克隆到pEASY-BluntSimple载体，得到重组质粒，将其命名为pEASY-BluntSimple-PicW，并转化Trans1-T1PhageResistantChemicallyCompetentCell(购自北京全式金生物技术有限公司)，对阳性克隆提质粒并测序。测序结果表明，PicW基因在青杄的基因组DNA和冬季青杄的cDNA中序列完全一致，确认该基因在基因组中没有内含子存在。
PicW基因的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，PicW蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。
PicW蛋白分子量大小约为24kD，pI值为4.71，其编码基因以及氨基酸序列如图2所示。
实施例2、植物表达载体及重组农杆菌的构建
一、设计并合成如下引物：
PicwLCF：5'-CCCAAGCTTATGGCTGAAAATGTATCG-3'；
（下划线所示序列为HindⅢ酶切识别位点）
PicwLCR：5'-CCGGAATTCTCATTCCTTGTTCTGGGC-3'。
（下划线所示序列为EcoRⅠ酶切识别位点）
二、以pEASY-BluntSimple-PicW质粒为模板，以PicwLCF和PicwLCR为引物进行PCR扩增，获得PicW基因。
三、HindⅢ和EcoRⅠ双酶切PicW基因，得到基因片段；HindⅢ和EcoRⅠ双酶切PEZR(K)-LC质粒，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，得到重组质粒，将其命名为PEZR(K)-LC-PicW，将该质粒测序，结果正确。该质粒的构建示意图如图3所示。
图3中，Kan：卡那霉素；GFP：绿色荧光蛋白；35S：花椰菜病毒启动子；PicW：PicW基因。
四、将PEZR(K)-LC-PicW导入LBA4404农杆菌中，得到重组农杆菌。以农杆菌菌斑为模板，以PicwLCF和PicwLCR为引物进行PCR扩增，验证重组质粒是否转入农杆菌中，结果正确，重组农杆菌构建成功。
同时，将对照质粒PEZR(K)-LC转入LBA4404农杆菌中，得到对照农杆菌。
实施例3、转基因烟草的获得以及PicW基因功能分析
一、转基因烟草的制备
（一）挑取实施例2得到的含有PEZR(K)-LC-PicW的重组农杆菌单菌落，接种于含利福平（Rif,50mg/L）和卡那霉素（Kan,50mg/L）的LB液体培养基中，28℃振荡培养36-48h。
（二）吸取适量培养的菌液于不含抗生素的LB液体培养基中，振荡培养3-12h至菌液OD600=0.4。
（三）选取烟草无菌苗幼嫩叶片剪2-3刀，放入步骤（二）制备的菌液中浸泡10min，进行侵染。
（四）将侵染过的叶片接种到芽分化培养基上，28℃暗培养2d后，把叶片转移到筛选分化培养基上，约20-40d分化出抗性芽，如图4所示。待不定芽达到1-2cm时，转接到生根培养基上，7-15d后长出不定根，得到转PicW基因烟草苗。
同时将含有PEZR(K)-LC质粒的对照农杆菌进行上述实验，得到转空载体对照烟草苗。
图4中，左盘为转PicW基因烟草苗，右盘为转空载体对照烟草苗。
图4表明，转PicW基因烟草和转空载体对照烟草初步鉴定构建成功。
二、转基因烟草的鉴定
提取8株经步骤一鉴定为卡那霉素抗性的转PicW基因烟草苗的RNA，逆转录成cDNA。分别以转PicW基因烟草苗的cDNA、PEZR(K)-LC-PicW质粒和野生型烟草的cDNA（阴性对照）为模板，利用PicW基因特异引物PicwLCF和PicwLCR进行PCR扩增，结果如图5所示。
图5中，1-8：转PicW基因烟草；9：PEZR(K)-LC-PicW质粒；10：阴性对照；11：DNAMarker。
图5表明，标号为1、2、3、6、7、8号的转PicW基因烟草苗中成功转入并表达PicW基因，为阳性转PicW基因烟草。
三、转基因烟草的抗冻性分析
（一）对步骤二鉴定为阳性的转PicW基因烟草苗、野生型烟草苗以及转空载体对照烟草苗分别进行无性繁殖，生根并长到3-4片叶时，开瓶炼苗2-3d，然后移到盆钵土壤中。
（二）2周后，选大小相近（每株约12-15个叶片），长势一致的转PicW基因烟草苗、野生型烟草苗以及转空载体对照烟草苗各三盆，放置于-5℃下处理3h，取出后进行形态和生理指标分析，结果如图6所示。
图6中，a：处理前；b：处理后；c：恢复生长2d（左为野生型烟草的叶片，右为转PicW基因烟草的叶片）；
LC：转空载体对照烟草；1，2，3，6，7，8：转PicW基因烟草；wt：野生型烟草。
图6表明，从外观上看，低温处理后所有烟草均遭受不同程度的伤害，叶片出现萎蔫现象。与转空载体对照烟草和野生型烟草相比，转PicW基因烟草表现出明显的抗冻性。将低温处理的烟草重置于室温下恢复生长2d，转PicW基因烟草的恢复生长态势也明显比野生型烟草好，而野生型烟草顶芽死亡，叶片褐化并出现斑点，呈衰败趋势。
四、转基因烟草生理指标测定
对-5℃处理3h前后的转基因烟草、野生型烟草以及转空载体对照烟草进行生理指标测定，包括相对电导率、脯氨酸含量、可溶性糖含量、丙二醛（MDA）含量。
四个生理指标中，相对电导率与生物膜通透性有关，细胞受伤害越大，膜通透性增加，相对电导率随之增加；细胞膜脂过氧化物丙二醛（MDA）与细胞中的氧化体系有关，其大量的积累，可导致细胞膜***受到损伤；脯氨酸含量高，在细胞内可调节细胞渗透压，防止细胞脱水，保护酶类空间结构及其活性，因此植物中脯氨酸的积累，有助于植物抵御低温对植物细胞的伤害；细胞中的可溶性糖具有调节细胞渗透压和保护细胞中蛋白质的作用，细胞间隙的糖类物质通过影响冰晶形成可减轻低温的伤害。
四个生理指标的检测结果如图7所示。
图7中，A：相对电导率；B：丙二醛含量；C：脯氨酸含量；D：可溶性糖含量。
“*”和“**”分别表示与野生型烟草间呈显著差异(P＜0.05)或极显著差异(P＜0.01)。
LC：转空载体对照烟草；1,2,3,6,7,8：转PicW基因烟草；WT：野生型烟草。
图7表明，经过低温处理后，标号为1,2,3,6,7,8的6个转PicW基因烟草苗在测定的4个生理指标表现上均好于野生型烟草和转空载体对照烟草（与野生型烟草和转空载体对照烟草相比，转PicW基因烟草的脯氨酸含量和可溶性糖含量高，电导率和MDA含量低）。
方差分析显示，低温处理前各个转PicW基因烟草株系与野生型烟草之间在四个指标表现上均无显著差异。低温处理之后，转基因株系与野生型烟草之间的相对电导率、MDA含量均呈极显著差异，脯氨酸和可溶性糖含量两个指标除个别株系外，或者呈显著差异或者呈极显著差异，而转空载体对照烟草与野生型烟草间在四个指标上均没有显著差异。
抗冻性实验证明，转PicW基因烟草在生长状态和生理指标表现上明显优于野生型烟草和转空载体对照烟草，显示该基因的表达可显著提高植物的抗冻性。

Claims (8)

1.一种蛋白，为如SEQIDNo.2所示的蛋白。
2.权利要求1所述蛋白的编码基因。
3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因为如SEQIDNo.1所示的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述编码基因的重组载体、表达盒或重组菌。
5.一种制备转基因烟草的方法，包括如下步骤：将权利要求1所述蛋白的编码基因导入出发烟草中，得到转基因烟草；与出发烟草相比，转基因烟草的抗冻性增强。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述编码基因是通过重组表达载体导入所述烟草中的；
所述重组表达载体是将所述编码基因***出发载体PEZR(K)-LC的多克隆位点得到的。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述编码基因的核苷酸序列如SEQIDNo.1中所示。
8.权利要求1所述的蛋白或权利要求2或3所述的编码基因在增强植物抗冻性中的应用；
和/或，
权利要求1所述的蛋白或权利要求2或3所述的编码基因在提高植物脯氨酸含量中的应用；
和/或，
权利要求1所述的蛋白或权利要求2或3所述的编码基因在提高植物可溶性糖含量中的应用；
和/或，
权利要求1所述的蛋白或权利要求2或3所述的编码基因在降低植物相对电导率中的应用；
和/或，
权利要求1所述的蛋白或权利要求2或3所述的编码基因在降低植物丙二醛含量中的应用；
所述植物为烟草。
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