CN101775398B - 菊花NAC蛋白基因DlNAC的耐逆性基因工程应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了菊花NAC类蛋白基因DlNAC的耐逆性基因工程应用，属于生物技术领域。DlNAC的cDNA序列见SEQ ID NO.1。DlNAC是定位于细胞核内的转录因子，mRNA表达分析表明该基因为组成性表达，在幼叶中的表达量最高，并且DlNAC的表达受干旱、高盐和高温胁迫的诱导。将构建的植物表达载体35S:DlNAC转化烟草获得过量表达DlNAC的转基因烟草，与未转基因烟草相比其耐盐性、耐热性和耐旱性都得到显著提高，表明该基因可作为目的基因导入植物，提高转基因植物的综合耐逆性。

Description

菊花NAC蛋白基因DlNAC的耐逆性基因工程应用

技术领域

本发明涉及菊花NAC蛋白基因DlNAC的耐逆性基因工程应用，属于基因工程领域，具体地讲涉及植物高盐、高温、干旱胁迫应答的NAC转录因子。

背景技术

NAC转录因子是一类植物特有的转录因子，在植物体生长发育的多个方面以及生物、非生物胁迫应答中都具有重要的作用(Aida et al.，1997；Olsen et al.，2005)。已有研究表明在拟南芥中至少存在12个NAC蛋白参与了干旱、高盐、低温和ABA应答反应(Maruyama et al.，2004；Fujita et al.，2004)。Tran等(2004)从拟南芥中分离出3个NAC基因(ANAC019，ANAC055，ANAC072)，研究表明这3个基因受高盐和ABA诱导，其中ANAC019和ANAC072受干旱诱导，后者受低温轻微诱导，但ANAC019和ANAC055不受低温诱导，转基因实验表明这3个基因的过量表达都可以提高转基因拟南芥的耐旱性。He等(2005)从拟南芥中分离出AtNAC2基因，其受高盐、ABA、ACC和NAA诱导，AtNAC2在拟南芥中的过量表达能促进侧根的发生，提高转基因植株的耐盐性。Hu等(2006)从水稻中分离了一个NAC基因SNAC1，过量表达SNAC1能显著提高转基因植株的抗旱能力，DNA芯片分析发现在SNAC1过表达的转基因植株中有大量胁迫相关基因的表达量提高。随后Hu等(2008)从水稻中又分离了一个NAC基因SNAC2，Northern杂交分析表明SNAC2受干旱、高盐、低温、机械损伤和ABA诱导，过量表达SNAC2基因的转基因植株耐寒能力和耐盐能力显著增强。Ohnishi等(2005)使用基因芯片技术发现低温处理(4℃)能强烈诱导水稻OsNAC6基因的表达，研究表明该基因也受高盐、干旱、ABA、机械损伤和茉莉酸的诱导。

本研究从甘菊中分离到一个与高盐、高温和干旱胁迫同时相关的NAC蛋白基因DlNAC，并研究了其与各种胁迫的关系，提出了利用DlNAC基因进行植物提高综合耐逆性的基因工程改良方法。

发明内容

技术问题

本发明的目的在于公开一个菊花NAC蛋白基因的耐逆性基因工程应用，该基因可作为目的基因导入植物，提高植物的综合耐逆性，以进行植物品种改良。

技术方案

菊花NAC基因DlNAC，其序列为：SEQ ID NO.1。其基因工程应用，包括：

1)菊花NAC基因DlNAC的克隆

根据菊花NAC基因DlNAC的全长序列，设计两端引物：

上游引物：5′-CTACTTATCTTTTGTACCAATAGC-3′

下游引物：5′-TTACTATTGTCACAATCGTTGT-3′

以甘菊(Dendranthema lavandulifolium)的总RNA为模板，经反转录合成cDNA第一链后，进行PCR扩增，PCR程序如下：94℃预变性4分钟，94℃变性30s，55℃复性1min，72℃延伸2min，35个循环后，72℃10min，将PCR产物进行克隆至pMD18-T载体，测序后获得具有完整编码区的菊花NAC基因DlNAC的cDNA序列SEQ ID NO.1；

2)植物表达载体的构建

根据菊花NAC基因DlNAC的cDNA序列，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在上游引物上引入Xba I限制性内切酶位点，下游引物引入BamH I限制性内切酶位点：

上游引物：5′-gctctagaATGGAGGATACTCGGTTA-3

下游引物：5′-cgggatccGTTTAAGAAAT TAAGCAT-3′

以步骤1)中获得的PCR扩增产物为模板，经PCR扩增后，将GmMADS1的cDNA克隆至中间载体pMD18-T，进一步克隆到双元表达载体pBI121；

3)转基因植株的获得

将步骤2)获得的表达载体转入农杆菌菌株EHA105，进一步转入植物烟草，对获得的转基因植株进行PCR，RT-PCR验证后进行植物的耐逆性评价：

将转基因烟草植株T1代和对照植株烟草种子消毒后，播种在含有100mM NaCl的1/2MS培养基上，转基因烟草种子中加100mg/L卡那霉素，非转基因对照不加，正常光照培养20天，处理后表现明显优于对照组的转基因烟草植株即为获得的耐盐转基因植株；

在1/2MS培养基上生长28天的T1代转基因植株和非转基因对照于45℃热胁迫处理30h后，移至25℃恢复生长14天，恢复明显优于对照组的植株即为耐热性增强的转基因植株；

耐旱性转基因植株的获得：将转基因植株和对照植株烟草种子消毒后，播种在含有0.3M甘露醇的1/2MS培养基上，转基因烟草种子中加100mg/L卡那霉素，非转基因对照不加，正常光照培养20天，处理后生长优于对照组的植株即为耐旱性增强的转基因植株。

有益效果

DlNAC基因功能是参与植物的高盐、高温和干旱胁迫应答反应，定量反转录聚合酶链式反应(Real-time RT-PCR)分析表明DlNAC基因在高盐(1M NaCl)、高温(40℃)和模拟干旱(20％PEG6000)诱导条件下表达增强，进一步的过量表达DlNAC的烟草与未转基因烟草相比，其耐盐性、耐热性和耐旱性都得到显著提高，表明该基因对提高植物的综合耐逆性方面起着重要作用。本发明的DlNAC可作为目的基因导入植物，提高植物耐盐性、耐热性和耐旱性，以进行植物品种改良，所编码的蛋白质具有耐逆功能。

使用DlNAC构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的选择性标记基因(GUS基因、萤光素酶基因等)或具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

携带有本发明DlNAC的植物表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是水稻、小麦、玉米等单子叶植物，也可以是大豆、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜蓿等双子叶植物。

下面结合附图及实施例对本发明做进一步说明。

附图说明

图1DlNAC在甘菊组织和胁迫诱导下的表达分析

A.1.根，2.茎，3.幼叶，4.花；B.高温处理(40℃)；C.高盐处理(1M NaCl)；D.干旱处理(20％PEG6000)；

图2转35S：DlNAC植株耐热性分析

转35S：DlNAC阳性株系L-31、L-32和L-33和对照烟草的种子分别播种于1/2MS培养基上，25℃环境下培养28天后，置于45℃环境下持续胁迫处理30h，取出后室温恢复14d。对照植株全部死亡，而转35S：DlNAC株系L-31、L-32和L-33的存活率分别为88.24％、72.88％和75.44％。

图3转35S：DlNAC烟草耐盐性分析

转35S：DlNAC阳性株系L-31、L-32和L-33和对照烟草植株在含有100mM NaCl的1/2MS培养基上的生长情况和根长统计结果。

图4转35S：DlNAC烟草耐旱性分析

转35S：DlNAC阳性株系L-31、L-32和L-33和对照烟草植株在含有0.3M甘露醇的1/2MS培养基上的生长情况和种子萌发率。

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明，均为常规方法。

1)菊花NAC基因DlNAC的克隆

以甘菊(Dendranthema lavandulifolium(Fisch.ex Trautv.)Makino)为材料，根据NAC蛋白的保守区域设计简并引物，以甘菊基因组DNA作为模板进行PCR扩增，获得特异性片段，测序后根据BLASTx比对结果和真核生物内含子剪切法则推测该序列中存在一个内含子，通过RACE的方法将该序列进行3′端、5’端的延伸，并进行克隆测序，序列分析后发现两端序列获得完整。根据拼接的结果设计两端引物：

上游引物：5′-CTACTTATCTTTTGTACCAATAGC-3′

下游引物：5′-TTACTATTGTCACAATCGTTGT-3′

取菊花的嫩叶，用研钵研碎，加入盛有裂解液的1.5mL EP管，充分振荡后，再移入玻璃匀浆器内。匀浆后移至1.5mL EP管中，抽提总RNA(TRIzol Reagents，Invitrogen，USA)。用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。以获得的总RNA为模板，按照美国Promega公司提供的反转录试剂盒的说明书进行反转录，合成cDNA第一链后，进行PCR扩增，PCR程序如下：94℃预变性4分钟，94℃变性30s，55℃复性1min，72℃延伸2min，35个循环后，72℃10min，将PCR产物进行克隆至pMD18-T载体，测序后获得具有完整编码区的菊花NAC基因DlNAC的cDNA序列SEQ ID NO.1；

2)基因DlNAC的组织和胁迫诱导下的表达特征

自然短日照后取根、茎、嫩叶和花，液氮速冻后置于-80℃保存。将培养的甘菊洗根后置于容器内，进行胁迫处理，低温和高温处理：材料分别置于4℃和40℃环境中。NaCl、PEG和ABA处理：材料分别置于1M NaCl、20％PEG6000和100μM ABA溶液中。取样时间均为处理后0、0.5、2、4、6、12、24h，液氮速冻后置于-80℃保存。

总RNA的提取同步骤1)。以组成性表达的延伸因子编码基因——EFla为内部参照，以来自菊花不同组织的总RNA为模板，进行RT-PCR分析。RT-PCR分析表明在DlNAC根、茎、叶和花中都表达，其中在幼叶中的表达量最高。采用定量反转录聚合酶链式反应(Real-time RT-PCR)分析了DlNAC在各胁迫条件下的表达情况，高温处理6h时，DlNAC表达量瞬间提高并且达到最大值，之后又降低到最初水平。高盐和干旱胁迫能强烈诱导其表达，在24h内mRNA存在两次峰值，分别出现在处理后的2h/12h以及6h/24h。(图1)

3)DlNAC的亚细胞定位研究

根据步骤1)得到的DlNAC的全长序列，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在上游引物上引入Xba I限制性内切酶位点，下游引物引入BamH I限制性内切酶位点(小写字母标示的是加入的酶切位点)：

上游引物：5′-gctctagaATGGAGGATACTCGGTTA-3

下游引物：5′-cgggatccGTTTAAGAAATTAAGCAT-3′

通过RT-PCR的方法我们从菊花嫩叶cDNA中分离了包含完整ORF的DlNAC，并将DlNAC的ORF与pBI221(Clontech，USA)载体中的GFP报告基因5’端融合，形成一个DlNAC-GFP的嵌合基因，构建了质粒pBIDlNAC-GFP。酶切验证后，将其和空载体pBI221分别通过冻融法转化农杆菌EHA105(Hood et al.，1993)，再通过农杆菌介导法转化洋葱表皮细胞，发现DlNAC基因产物定位在细胞核内，而pBI-GFP蛋白则分布在整个细胞内，表明菊花DlNAC为定位于细胞核内的转录因子。

4)基因DlNAC的基因工程应用

将步骤3)获得的表达载体转入农杆菌菌株EHA105，进一步转入植物烟草，对获得的转基因植株进行PCR，RT-PCR验证后进行植物的耐逆性评价。T1代转基因植株和非转基因对照植株进行耐逆性分析。

耐热性转基因植株的获得：将转基因植株和对照植株烟草种子消毒后，播种在含有0.3M甘露醇的1/2MS培养基上，转基因烟草种子中加100mg/L卡那霉素，非转基因对照不加。生长28天后置于45℃热胁迫处理30h，移至25℃恢复14天。处理后生长优于对照组的植株即为耐热性增强的转基因植株(图2)。处理之后的存活率统计结果表明对照植株经热胁迫处理后存活率为0％，而DlNAC转基因株系L-31、L-32和L-33的存活率分别为88.24％、72.88％和75.44％(图2)。

耐盐转基因植株的获得：将转基因植株和对照植株烟草种子消毒后，播种在含有100mM NaCl的1/2MS培养基上，转基因烟草种子中加100mg/L卡那霉素，非转基因对照不加。正常光照培养20天，处理后表现明显优于对照组的转基因烟草植株即为获得的耐盐转基因植株(图3)。通过盐胁迫处理之后烟草幼苗根长的测定，发现DlNAC转基因株系L-31、L-32和L-33的根长明显长于对照(图3)。

耐旱性转基因植株的获得：将转基因植株和对照植株烟草种子消毒后，播种在含有0.3M甘露醇的1/2MS培养基上，转基因烟草种子中加100mg/L卡那霉素，非转基因对照不加。正常光照培养20天后生长优于对照组的植株即为耐旱性增强的转基因植株(图4)。通过甘露醇胁迫处理下烟草发芽率的测定，发现DlNAC转基因株系L-31、L-32和L-33的发芽率显著高于对照(图4)。

定量反转录聚合酶链式反应(Real-time RT-PCR)分析表明DlNAC基因在高盐(1MNaCl)、高温(40℃)和模拟干旱(20％PEG6000)诱导条件下表达增强(图1)，进一步的过量表达DlNAC的烟草与未转基因烟草相比，其耐盐性、耐热性和耐旱性都得到显著提高(图2，图3，图4)，表明该基因对提高植物的综合耐逆性方面起着重要作用。

序列表

<110>南京农业大学

<120>菊花NAC蛋白基因DlNAC的耐逆性基因工程应用

<130>DlNAC.prj

<160>3

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>934

<212>DNA

<213>Dendranthema lavandulifolium

<220>

<221>CDS

<222>(52)..(840)

<223>

<220>

<221>primer_bind

<222>(16)..(39)

<223>

<220>

<221>primer_bind

<222>(849)..(870)

<223>

<400>1

acgcggggga atatactact tatcttttgt accaatagct agctatctta g atg gag    57

                                                         Met Glu

                                                         1

gat act cgg tta gag ctc gaa ttg cca ggc ttt cga ttt cac cct acc    105

Asp Thr Arg Leu Glu Leu Glu Leu Pro Gly Phe Arg Phe His Pro Thr

        5                   10                  15

gag gaa gag ttg ctt ggg ttc tac ctc aaa aat atg gtt ttg gga aat      153

Glu Glu Glu Leu Leu Gly Phe Tyr Leu Lys Asn Met Val Leu Gly Asn

    20                  25                  30

aat acg cgt gtt gag atc atc ggg ttt ctc aac atc tat ctc tac gat      201

Asn Thr Arg Val Glu Ile Ile Gly Phe Leu Asn Ile Tyr Leu Tyr Asp

35                  40                  45                  50

cct tgg gtt cta cca gac atg tca aag att ggg gaa aga gag tgg tac      249

Pro Trp Val Leu Pro Asp Met Ser Lys Ile Gly Glu Arg Glu Trp Tyr

                55                  60                  65

ttt ttt gtg cct agg aat aaa aag cat gga aat gga gga aga cca aac      297

Phe Phe Val Pro Arg Asn Lys Lys His Gly Asn Gly Gly Arg Pro Asn

            70                  75                  80

cga act acc aaa aac ggg ttt tgg aag gca acc ggg tca gat cgt aag      345

Arg Thr Thr Lys Asn Gly Phe Trp Lys Ala Thr Gly Ser Asp Arg Lys

        85                  90                  95

att ttc tct ttg tct gac acc agt aag cat ctt ggg ttg aag aag act      393

Ile Phe Ser Leu Ser Asp Thr Ser Lys His Leu Gly Leu Lys Lys Thr

    100                 105                 110

ctg gtg ttc tac aag ggc aga gca cct gga gga cac aaa aca gat tgg      441

Leu Val Phe Tyr Lys Gly Arg Ala Pro Gly Gly His Lys Thr Asp Trp

115                 120                 125                 130

gtc atg agc gaa tac cgg ctg cct gat tct tgc cca tta cca aag gat      489

Val Met Ser Glu Tyr Arg Leu Pro Asp Ser Cys Pro Leu Pro Lys Asp

                135                 140                 145

ata gtg ttg tgt aaa ata tac aga aag gca act tcc atc aag gtg ctg      537

Ile Val Leu Cys Lys Ile Tyr Arg Lys Ala Thr Ser Ile Lys Val Leu

            150                 155                 160

gag caa aga gca gcc atg gaa gaa gca cag cat cca cca tct cca agc      585

Glu Gln Arg Ala Ala Met Glu Glu Ala Gln His Pro Pro Ser Pro Ser

        165                 170                 175

tca atc gat agt caa cat ctt gac ttg tcg gca ccg caa cca gtg aca      633

Ser Ile Asp Ser Gln His Leu Asp Leu Ser Ala Pro Gln Pro Val Thr

    180                 185                 190

tca agc cac atg gca tct gat tca aca aac gac aca gat aag aag ccc      681

Ser Ser His Met Ala Ser Asp Ser Thr Asn Asp Thr Asp Lys Lys Pro

195                 200                 205                 210

ggc ctg aaa tta cca atg ggg gca gcg aag ata tca gag ctc cga ttg      729

Gly Leu Lys Leu Pro Met Gly Ala Ala Lys Ile Ser Glu Leu Arg Leu

                215                 220                 225

cca aaa tgt gac atg gac tgg agt cat gat tca cag tta cgc agt cca      777

Pro Lys Cys Asp Met Asp Trp Ser His Asp Ser Gln Leu Arg Ser Pro

            230                 235                 240

tgg cta cag aat ctc atc ttc acc cct cct cct tat gcc aat atg ctt      825

Trp Leu Gln Asn Leu Ile Phe Thr Pro Pro Pro Tyr Ala Asn Met Leu

        245                 250                 255

aat ttc tta aac taa ttgtgtaaaa caacgattgt gacaatagta attgcaatta      880

Asn Phe Leu Asn

    260

ttattattta tgtaaagaca gaataggaat attaacttat gccaaaatta cact          934

<210>2

<211>262

<212>PRT

<213>Chrysanthemum lavandulifolium(菊花)

<400>2

Met Glu Asp Thr Arg Leu Glu Leu Glu Leu Pro Gly Phe Arg Phe His

1               5                   10                  15

Pro Thr Glu Glu Glu Leu Leu Gly Phe Tyr Leu Lys Asn Met Val Leu

            20                  25                  30

Gly Asn Asn Thr Arg Val Glu Ile Ile Gly Phe Leu Asn Ile Tyr Leu

        35                  40                  45

Tyr Asp Pro Trp Val Leu Pro Asp Met Ser Lys Ile Gly Glu Arg Glu

    50                  55                  60

Trp Tyr Phe Phe Val Pro Arg Asn Lys Lys His Gly Asn Gly Gly Arg

65                  70                  75                  80

Pro Asn Arg Thr Thr Lys Asn Gly Phe Trp Lys Ala Thr Gly Ser Asp

                85                  90                  95

Arg Lys Ile Phe Ser Leu Ser Asp Thr Ser Lys His Leu Gly Leu Lys

            100                 105                 110

Lys Thr Leu Val Phe Tyr Lys Gly Arg Ala Pro Gly Gly His Lys Thr

        115                 120                 125

Asp Trp Val Met Ser Glu Tyr Arg Leu Pro Asp Ser Cys Pro Leu Pro

    130                 135                 140

Lys Asp Ile Val Leu Cys Lys Ile Tyr Arg Lys Ala Thr Ser Ile Lys

145                 150                 155                 160

Val Leu Glu Gln Arg Ala Ala Met Glu Glu Ala Gln His Pro Pro Ser

                165                 170                 175

Pro Ser Ser Ile Asp Ser Gln His Leu Asp Leu Ser Ala Pro Gln Pro

            180                 185                 190

Val Thr Ser Ser His Met Ala Ser Asp Ser Thr Asn Asp Thr Asp Lys

        195                 200                 205

Lys Pro Gly Leu Lys Leu Pro Met Gly Ala Ala Lys Ile Ser Glu Leu

    210                 215                 220

Arg Leu Pro Lys Cys Asp Met Asp Trp Ser His Asp Ser Gln Leu Arg

225                 230                 235                 240

Ser Pro Trp Leu Gln Asn Leu Ile Phe Thr Pro Pro Pro Tyr Ala Asn

                245                 250                 255

Met Leu Asn Phe Leu Asn

            260

Claims (1)

1.菊花蛋白NAC基因DlNAC的基因工程应用，包括：

1)菊花NAC基因DlNAC的克隆

根据菊花NAC基因DlNAC的全长序列，设计两端引物：

上游引物：5′-CTACTTATCTTTTGTACCAATAGC-3′

下游引物：5′-TTACTATTGTCACAATCGTTGT-3′

以甘菊(Dendranthema lavandulifolium)的总RNA为模板，经反转录合成cDNA第一链后，进行PCR扩增，PCR程序如下：94℃预变性4分钟，94℃变性30s，55℃复性1min，72℃延伸2min，35个循环后，72℃10min，将PCR产物进行克隆至pMD18-T载体，测序后获得具有完整编码区的菊花NAC基因DlNAC的cDNA序列SEQ ID NO.1；

2)植物表达载体的构建

根据菊花NAC基因DlNAC的cDNA序列，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在上游引物上引入Xba I限制性内切酶位点，下游引物引入BamH I限制性内切酶位点：

上游引物：5′-gctctagaATGGAGGATACTCGGTTA-3

下游引物：5′-cgggatccGTTTAAGAAAT TAAGCAT-3′

以步骤1)中获得的PCR扩增产物为模板，经PCR扩增后，将DlNAC的cDNA克隆至中间载体pMD18-T，进一步克隆到双元表达载体pBI121；

3)转基因植株的获得

将步骤2)获得的表达载体转入农杆菌菌株EHA105，进一步转入植物烟草，对获得的转基因植株进行PCR，RT-PCR验证后进行植物的耐逆性评价：

将T1代烟草转基因植株和对照植株种子消毒后，播种在含有100mM NaCl的1/2MS培养基上正常光照培养20天，处理后表现明显优于对照组的转基因烟草植株即为获得的耐盐转基因植株；

在1/2MS培养基上生长28天的T1代转基因植株和非转基因对照于45℃热胁迫处理30h后，移至25℃恢复生长14天，恢复明显优于对照组的植株即为耐热性增强的转基因植株；

耐旱性转基因植株的获得：将转基因植株和对照植株烟草种子消毒后，播种在含有0.3M甘露醇的1/2MS培养基上，正常光照培养20天，处理后生长优于对照组的植株即为耐旱性增强的转基因植株。

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