CN101245318B - 大白栓菌的人工培养方法及用途 - Google Patents
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Abstract
一种大白栓菌的人工培养方法及用途，本发明通过菌种的纯化，分别以固体培养基和液体培养基对大白栓菌进行培养，得到人工培养大白栓菌。本发明可实现大白栓菌大规模人工培养；以大白栓菌或其提取物为主的药物具有较好的提高免疫力、并具有抗的肿瘤的作用，通过本发明得到的大白栓菌也可作为一种添加剂加入饲料中畜禽生长，增强其免疫力，减少疾病。
Description
技术领域
本发明涉及一种大白栓菌的人工培养方法，本发明还涉及大白栓菌在制备增强免疫力功能的药物、制备抗肿瘤的药物、制备促生长的药物中的应用。
背景技术
大白栓菌Trametes lactinea(Berk.)Pat.是一种多孔菌目多孔菌科栓菌属的大型真菌，生于阔叶树木材上。在亚洲各国广为分布有，但国内外对大白栓菌的研究极少，特别是在人工纯化、培养以及用大白栓菌或其提取物在制备增强免疫力功能的药物、抗肿瘤的药物、促生长的药物中的应用未见详细报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种大白栓菌的人工纯化、培养的方法，本发明的另一个目是提供大白栓菌在制备增强免疫力功能的药物、制备抗肿瘤的药物、制备促生长的药物中的应用。
本发明的目的是这样实现的：
1、一种大白栓菌的人工培养方法，其特征在于：
菌种的纯化
a、培养基配制：
先将梨木屑用水加热提取得梨木汁，将玉米粉、石膏和白糖以按35g∶2g∶1g混匀，然后加入梨木汁700ml，即每700ml梨木汁中混合有玉米粉35g、石膏2g和白糖1g；再加入物料重量2％琼脂，搅拌均匀后加热至沸，0.1-0.15MPa蒸汽高压灭菌30min；
b、平板的制作及接种：
培养皿各趁热倒入培养基，冷却后即得平板，于无菌操作台上进行接种，将野生大白栓菌菌丝放到75％酒精中冲洗，然后剪碎放入装有无菌水的小三角瓶中，充分摇匀制成孢子悬浮液后涂布到平板上；
c、菌体培养：
置28℃恒温培养箱中培养120h，培养皿中分别长出了2-4个菌落，通过电子显微镜镜检，确定了大白栓菌；
d、菌种的斜面保藏：
向玻璃试管中趁热倒入培养基，包扎平放，冷却后即成斜面；c步骤中培养皿中的各个菌落于无菌操作台上分别接种到试管中，28℃恒温培养72h，挑选上述生长良好的试管斜面菌种于冰箱中冷冻保藏；
固体培养基培养
e、固体培养基的制备：
以重量份计：梨木屑40-70，玉米粉10-40，石膏1-3和白糖1-3混合制固体培养基，将经过纯化的大白栓菌置于培养基内于28℃恒温培养箱中培养7天。
2、根据权利要求1所述的大白栓菌的人工培养方法，其特征在于：固体培养基中各组分以重量份计为：梨木屑70，玉米粉35，石膏2和白糖1。
3、一种大白栓菌的人工培养方法，其特征在于：
菌种的纯化
a、培养基配制：
先将梨木屑用水加热提取得梨木汁，将玉米粉、石膏和白糖以按35g∶2g∶1g混匀，然后加入梨木汁700ml，即每700ml梨木汁中混合有玉米粉35g、石膏2g和白糖1g；再加入物料重量2％琼脂，搅拌均匀后加热至沸，0.1-0.15MPa蒸汽高压灭菌30min；
b、平板的制作及接种：
培养皿各趁热倒入培养基，冷却后即得平板，于无菌操作台上进行接种，将菌丝放到75％酒精中冲洗，然后剪碎放入装有无菌水的小三角瓶中，充分摇匀制成孢子悬浮液后涂布到平板上；
c、菌体培养：
置28℃恒温培养箱中培养120h，培养皿中分别长出了2-4个菌落，通过电子显微镜镜检，确定了大白栓菌；
d、菌种的斜面保藏：
向玻璃试管中趁热倒入培养基，包扎平放，冷却后即成斜面；c步骤中培养皿中的各个菌落于无菌操作台上分别接种到试管中，28℃恒温培养72h，挑选上述生长良好的试管斜面菌种于冰箱中冷冻保藏；
液体培养基培养
e、液体培养其的制备：
将梨木屑70g水煮1.5h后过得到的梨木汁；将得到的梨木汗与滤玉米粉35g，石膏2g和白糖1g和混合并加自来水稀释至700ml，梨木汁用量为5g/100ml，用玻棒搅拌均匀加热至沸，最后用0.1-0.15MPa蒸汽高压灭菌30min得到液体培养基；
f、三角瓶装入适量培养基灭菌后，于无菌操作台上接种，28℃恒温培养10d天得到大白栓菌。
大白栓菌在制备增强免疫力功能的药物中的应用。
大白栓菌在制备抗肿瘤的药物中的应用。
大白栓菌在制备饲料添加剂中的应用。
本发明提供的大白栓菌的人工培养方法，通过固体培养基和液体培养基得到了大白栓菌，可实现大白栓菌大规模人工培养；以大白栓菌或其提取物为主的药物具有较好的提高免疫力、促进生长的功效，并具有抗肿瘤作用。
附图说明
图1是本发明中大白栓菌粉末特征图。
图中：1.营养菌丝 2.骨架菌丝，3.缠绕菌丝，4.生殖菌丝，5.担孢子
具体实施方式
通过本发明提供的制备方法得到的大白栓菌保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市武汉大学内，邮编：430072，保藏日期：2008年1月31日，保藏编号：CCTCCNO：M208019，提供请求的培养物名称：大白栓菌Trametes lactinea。
人工培养的大白栓菌的显微特征：人工培养大白栓菌，取不同生长时期的菌丝体水装片，显微镜下观察菌丝形态。子实体成熟后，取子实体粉末过80目筛，分别用水、稀甘油、水合氯醛透化装片，显微镜下观察粉末特征。
营养菌丝纤细，直滑，可见横膈膜及分枝。常交织成白色的绒絮状菌丝体。直径3-10μm。生殖菌丝近透明，薄壁，有或无锁状联合，直径7-13μm。缠绕菌丝无色，厚壁，狭窄，多分枝，不发达，在菌肉内***其他菌丝之间。直径4-15μm。骨架菌丝近无色或淡黄色，厚壁，细胞腔狭窄或实心，不分枝，组成一个坚硬的子实体骨架。直径11-34μm。担孢子类圆形至近椭圆形，半透明，薄壁，平滑，直径8-27μm。电子显微镜下可见孢子表面有众多皱纹及凹陷。
大白栓菌主要含有糖类和三萜类化合物，3-氢化松苓酸B是大白栓菌的主要成分。其结构式如下：
本发明的制备方法：
一、用固体培养基培养大白栓菌：
菌种的纯化
a、培养基配制：
先将梨木屑用水加热提取得梨木汁，将玉米粉、石膏和白糖以按35g∶2g∶1g混匀，然后加入梨木汁700ml，即每700ml梨木汁中混合有玉米粉35g、石膏2g和白糖1g；再加入物料重量2％琼脂，搅拌均匀后加热至沸，0.1-0.15MPa蒸汽高压灭菌30min；
b、平板的制作及接种：
培养皿各趁热倒入培养基，冷却后即得平板，于无菌操作台上进行接种，将野生大白栓菌菌丝放到75％酒精中冲洗，然后剪碎放入装有无菌水的小三角瓶中，充分摇匀制成孢子悬浮液后涂布到平板上；
c、菌体培养：
置28℃恒温培养箱中培养120h，培养皿中分别长出了2-4个菌落，通过电子显微镜镜检，确定了大白栓菌；
d、菌种的斜面保藏：
向玻璃试管中趁热倒入培养基，包扎平放，冷却后即成斜面；c步骤中培养皿中的各个菌落于无菌操作台上分别接种到试管中，28℃恒温培养72h，挑选上述生长良好的试管斜面菌种于冰箱中冷冻保藏；
固体培养基培养
e、固体培养基的制备：
以重量份计：梨木屑40-70，玉米粉10-40，石膏1-3和白糖1-3混合制固体培养基，将经过纯化的大白栓菌置于培养基内于28℃恒温培养箱中培养7天。
固体培养基中各组分中优选配比为：梨木屑70，玉米粉35，石膏2和白糖1。
二、以液体培养基培养大白栓菌：
菌种的纯化
a、培养基配制：
先将梨木屑用水加热提取得梨木汁，将玉米粉、石膏和白糖以按35g∶2g∶1g混匀，然后加入梨木汁700ml，即每700ml梨木汁中混合有玉米粉35g、石膏2g和白糖1g；再加入物料重量2％琼脂，搅拌均匀后加热至沸，0.1-0.15MPa蒸汽高压灭菌30min；
b、平板的制作及接种：
培养皿各趁热倒入培养基，冷却后即得平板，于无菌操作台上进行接种，将菌丝放到75％酒精中冲洗，然后剪碎放入装有无菌水的小三角瓶中，充分摇匀制成孢子悬浮液后涂布到平板上；
c、菌体培养：
置28℃恒温培养箱中培养120h，培养皿中分别长出了2-4个菌落，通过电子显微镜镜检，确定了大白栓菌；
d、菌种的斜面保藏：
向玻璃试管中趁热倒入培养基，包扎平放，冷却后即成斜面；c步骤中培养皿中的各个菌落于无菌操作台上分别接种到试管中，28℃恒温培养72h，挑选上述生长良好的试管斜面菌种于冰箱中冷冻保藏；
液体培养基培养
e、液体培养其的制备：
将梨木屑70g水煮1.5h后过得到的梨木汁；将得到的梨木汗与滤玉米粉35g，石膏2g和白糖1g和混合并加自来水稀释至700ml，梨木汁用量为5g/100ml，用玻棒搅拌均匀加热至沸，最后用0.1-0.15MPa蒸汽高压灭菌30min得到液体培养基；
f、三角瓶装入适量培养基灭菌后，于无菌操作台上接种，28℃恒温培养10d天得到大白栓菌。
大白栓菌在制备增强免疫力功能的药物中的应用
1实验材料
1.1实验动物
昆明种封闭群小鼠：雌雄各半，体重20±2g，SPF级。购自湖北省实验动物中心。
1.1主要药品与试剂
大白栓菌95％乙醇提取物、大白栓水提物，人参水煎液
环磷酰胺(CTX)粉针剂，200mg/支，灭菌生理盐水稀释至一定浓度，分装后避光常温保存(用于造模型)；人参水煎液用作阳性对照药。
1.3主要仪器
自动平衡离心机，电子天平，中药粉碎机，超声波清洗机
2方法与结果
2.1药物制备
大白栓菌95％醇提物、大白栓水提物，配制为大白栓菌醇提物高剂量1.8g/kg，大白栓菌醇提物低剂量0.9g/kg；大白栓菌水提物高剂量0.9g/kg，大白栓菌水提物低剂量0.45g/kg；人参水煎两次浓缩致生药1.5g/kg。4℃冰箱保存。
环磷酰胺(CTX)在超净工作台避光条件下，无菌生理盐水稀释至4mg/ml后分装于EP管并用锡纸遮盖保存于4℃冰箱。
2.2免疫力抑制模型：动物于1、2、4、6天腹腔注射环磷酰胺4mg/ml造模。
2.3动物分组及给药
昆明小鼠分笼饲养，自由摄食与饮水。造模后随机分组，自造模之日起，给药组每只小鼠按体重灌胃给药，连续6天；同时给予模型组，空白对照组灌胃等体积生理盐水。
2.4测定结果
于末次给药半小时后，摘眼球取血，分离血清，检测血清免疫力球蛋白。取胸腺、脾脏，用电子天平称重。计算胸腺指数(胸腺指数＝胸腺重量(mg)/小鼠体重(g))，脾脏指数(脾脏指数＝脾脏重量(mg)/小鼠体重(g))。结果见表1
表1大白栓菌提取物对免疫力抑制小鼠胸、脾脏指数及免疫力球蛋白的影响
| 组别 | 胸腺指数 | 脾脏指数 | IgA | IgG | IgM |
| 空白模型人参醇提高剂量醇提低剂量水提高剂量水提低剂量 | 2.101±0.632*0.578±0.1360.634±0.2040.763±0.2300.888±0.3440.739±0.2360.763±0.455 | 4.042±0.724*2.637±0.7843.162±0.9422.760±0.7862.670±0.5563.042±0.3222.549±0.479 | 0.245±0.108*0.177±0.0700.176±0.1080.211±0.070*0.166±0.0770.251±0.018*0.194±0066 | 1.150±0.028**0.257±0.0400.468±0.1550.503±0.052*0.482±0.1500.806±0.201**0.554±0.140* | 0.419±0.127*0.337±0.0770.653±0.124**0.764±0.121**0.650±0.020**0.911±0.031**0.909±0.073** |
*与模型组p＜0.05 **与模型组p＜0.01
结果显示大白栓菌醇提取物和水提物对环磷酰胺所致的免疫力功能低下小鼠的免疫力功能有增强作用，能显著提高免疫力球蛋白的含量。
大白栓菌在制备抗肿瘤的药物中的应用
1.1实验材料
1.1实验动物
昆明种封闭群小鼠：雌雄各半，体重20±2g，SPF级。购自湖北省实验动物中心。
1.2主要药品与试剂
大白栓菌95％醇提物，大白栓菌水提物，丝裂霉素
1.3主要仪器
自动平衡离心机；电子天平；中药粉碎机
2方法与结果
2.1药物制备
大白栓菌95％乙醇提取物高剂量1.8g/kg；大白栓菌95％乙醇提取物低剂量0.9g/kg。大白栓菌水提物高剂量0.9g/kg，大白栓菌水提物低剂量0.45g/kg。保存于4℃冰箱。
丝裂霉素：在超净工作台避光条件下，无菌生理盐水稀释丝裂霉素针剂至9mg/ml后分装于EP管并用锡纸遮盖保存于4℃冰箱。
2.2动物模型的制作
H22实体瘤模型：小鼠肉瘤H22细胞株昆明小鼠体内连续传代，5～7天传代一次，传代3次后，抽取接种7天左右种鼠腹水，生理盐水洗涤离心(800rpm×5min)3次，调整细胞浓度至5.0×107个/ml，台盼蓝拒染法检测存活率≥95％，用无菌注射器抽取腹水瘤细胞悬液注射至昆明小鼠右前腋皮下，每鼠0.2ml。全程严格无菌操作，30分钟内完成。
2.3动物分组及给药
昆明小鼠分笼饲养，自由摄食与饮水。造模后随机分组，于造模后第二天起，按体重灌胃给药，连续10天；丝裂霉素组每只小鼠按90mg/kg体重腹腔注射给药；同时给予模型组，空白对照组灌胃等体积生理盐水。于末次给药后半小时，完整剥离肿瘤组织，取胸腺、脾脏，电子天平上称重。计算抑瘤率，胸腺指数，脾脏指数。结果见表2。
表2大白栓菌提取物对小鼠肉瘤H22生长的影响
| 组别 | 胸腺指数 | 脾脏指数 | 瘤重 | 抑瘤率 |
| 空白模型丝裂霉素醇提高剂量醇提低剂量水提高剂量水提低剂量 | 1.3298±0.631**0.558±0.3300.745±0.3270.895±0.5140.842±0.3680.936±0.4460.736±0.547 | 3.336±0.4973.160±0.3882.0109±0.468*3.612±0.6973.3613±0.8634.414±0.422*3.320±0.619 | /0.916±0.2960.464±0.255**0.465±0.256**0.639±0.157**0.644±0.168**0.737±0.228* | //49349.230.229.719.5 |
*与模型组p＜0.05 **与模型组p＜0.01
2.4体外抗癌实验
将处于对数生长期的白血病细胞(HL60)、***细胞(Hela)、鼻咽癌细胞(CNE)，调整细胞浓度为1.0×105个/ml。将细胞悬液接种于96孔培养板，每孔加200μl。实验组分别加入不同浓度的大白栓醇提物，另设阴性对照组和空白调零组，阳性对照组为丝裂霉素，每组处理均设6个复孔，再培养48小时。加入5mg/mL的MTT液(15微μl/孔)，继续培养4小时。取出96孔培养板于1000转/分离心8分钟，吸出孔内培养液后，在微型振荡仪中振荡10分钟，使结晶物溶解，再加DMSO 100ul将培养板置于微孔板振荡器上振荡10分钟。用全自动酶联免疫检测仪于492nm处测定吸光度(OD)值，计算抑制率(％)。结果见表3、4。
表3大白栓菌对肝癌细胞(HepG-2)的抑制作用结果
| 组别 | OD值 | 抑制率 |
| 阴性对照组丝裂霉素(160ug/ml)醇提物(1.2mg/ml)醇提物(0.6mg/ml)醇提物(0.3mg/ml)醇提物(0.15mg/ml) | 0.7160±0.40200.1330±0.0190**0.2974±0.1306**0.2044±0.0244**0.2535±0.0210**0.3668±0.0894** | 81.43％58.47％71.45％64.60％48.78％ |
表4大白栓菌对***细胞(Hela)的抑制作用结果
| 组别 | OD值 | 抑制率 |
| 阴性对照组丝裂霉素(160ug/ml)醇提物(0.32mg/ml)醇提物(0.16mg/ml)醇提物(0.08mg/ml)醇提物(0.04mg/ml) | 0.5891±0.26530.1482±0.2653**0.0843±0.0178**0.1293±0.0301**0.1747±0.0405**0.3823±0.1381* | 74.84％85.68％78.04％70.34％35.11％ |
表5大白栓菌对鼻咽癌细胞(CNE)的抑制作用结果
| 组别 | OD值 | 抑制率 |
| 阴性对照组丝裂霉素(160ug/ml)醇提物(0.32mg/ml)醇提物(0.16mg/ml)醇提物(0.08mg/ml)醇提物(0.04mg/ml) | 0.3943±0.1132**0.1273±0.00670.1816±0.02500.2162±0.0153*0.2007±0.0129*0.2155±0.0243* | 67.71％53.94％45.15％49.09％45.36％ |
结果显示大白栓菌醇提取物和水提物对H22实体瘤，大白栓菌醇提取物对白血病细胞(HL60)、***细胞(Hela)、鼻咽癌细胞(CNE)等生长具有抑制作用。
大白栓菌在制备饲料添加剂中的应用
大白栓菌作为饲料添加剂的制备：取米糠以重量份计，加入l/2菌种，20％玉米芯，1％的石膏，28℃培养7-10天，搅拌均匀后再培养7-10天。长满大白栓菌丝体后混匀80℃干燥后作饲料添加剂用。
选择体重20kg左右的杜洛克猪，随机分成试验组和对照组每组10头。预试期7天，群饲，充分饲喂(4次/天)，自由饮水。试验期40d，试验结束时，测定增重及饲料转化率。对照组饲料配方为豆粕25％，麸皮15％，鱼粉3％，玉米50％。沸石粉2％，食盐0.3‰、磷酸氢钙1.5％，赖氨酸0.2％，蛋氨酸0.05％、维生素及矿物质预混剂0.7％，试验组1饲料配方为豆粕20％，饲料添加剂10％，麸皮10％，鱼粉3％，玉米50％。沸石粉2％，食盐0.3‰、磷酸氢钙1.5％，赖氨酸0.2％，蛋氨酸0.05％、维生素及矿物质预混剂0.7％。试验组2饲料配方为豆粕15％，饲料添加剂20％，麸皮5％，鱼粉3％，玉米50％。沸石粉2％，食盐0.3‰、磷酸氢钙1.5％，赖氨酸0.2％，蛋氨酸0.05％、维生素及矿物质预混剂0.7％。
表6大白栓菌作为饲料添加剂对仔猪生长的影响
| 组别 | 始重 | 末重 |
| 试验组对照组1对照组2 | 20.86±1.3520.52±1.2320.71±1.24 | 50.37±2.5657.82±3.14*63.79±3.53** |
与试验组比*P＜0.05，**P＜0.05。
实验表明大白栓菌作为饲料添加剂对仔猪生长具有明显的促进作用。
大白栓菌作为饲料添加剂对鸡生长的影响
选用20日龄肉鸡随机分为3组，每组20只，对照组使用六合药业提供的全价颗粒饲料，试验组在全价饲料中分别加入10％，20％饲料添加剂(制备方法同上述猪饲料)制备成颗粒，鸡群网上平养，常规消毒，防疫。各组饲养管理条件完个相同，饲养30天称重。
表7大白栓菌作为饲料添加剂对鸡生长的影响
| 组别 | 始重 | 末重 |
| 试验组对照组1对照组2 | 0.306±0.0130.298±0.0120.301±0.011 | 1.46±0.0371.74±0.047*1.98±0.049** |
与试验组比*P＜0.05，**P＜0.05。
实验表明大白栓菌作为饲料添加剂对鸡生长具有明显的促进作用。
Claims (3)
1.大白栓菌在制备增强免疫力功能的药物中的应用，所述的大白栓菌保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号:CCTCC NO:M208019。
2.大白栓菌在制备抗肿瘤的药物中的应用，所述的大白栓菌保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号:CCTCC NO:M208019。
3.大白栓菌在制备饲料添加剂中的应用，所述的大白栓菌保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号:CCTCC NO:M208019。
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2008
- 2008-02-28 CN CN2008100469697A patent/CN101245318B/zh not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 王俊英等.《红栓菌粗多糖抗肿瘤及对荷瘤小鼠免疫功能影响的研究》.《社区科学杂志》.2006,第4卷(第6期),4-7. * |
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| Publication number | Publication date |
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