CN102242070A - 一种蝉拟青霉人工培养的方法及其培养产物的应用 - Google Patents
一种蝉拟青霉人工培养的方法及其培养产物的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种蝉拟青霉人工栽培的方法及其培养物的应用，经过菌种制备、配料装盒、灭菌、接种、固体发酵、采收等步骤大规模人工培养蝉拟青霉，采用玉米粉、麸皮、小麦、大麦、大米、粟、高粱等谷物与甘蔗渣、蔗糖、贝壳粉、蚕蛹粉、硝酸钾为培养基培养蝉拟青霉，就地取材节约了大量生产成本，缩短了培养周期，而且培养所得的蝉花具有质量高、稳定性好等优点。本发明所得的培养物可用于制备具有抗肿瘤、调节免疫、降血糖、降血脂、降血压、明目、抗辐射、解热镇痛、镇静催眠、滋补强壮、改善肾功能等功能的食品、保健品、药品、化妆品等。
Description
技术领域
本发明属于药用真菌的人工栽培技术领域，具体涉及一种蝉拟青霉人工培养的方法及其培养产物的应用。
背景技术
蝉花，学名蝉拟青霉(Paecilomyces cicadae)，是某些蝉若虫受蝉拟青霉菌寄生后的产物，是一种菌虫复合体。此菌于1838年由Miquel定名为蝉棒束孢霉Isaria cicadae。此后出现多种同物异名。如蝉草Cordyceps cicadae，基生棒束孢Isaria basili，辛克莱球壳孢Sphaeria sinclairii，丛生虫壳菌Torrubia caespitosa，辛克莱虫草Cordyceps sinclairii，哈里棒束孢Isaria hariottii，小蝉茸Cordyceps sobolifera，辛克莱棒束孢Isaria sinclairii，蒙克苏棒束孢Isaria mokanshawii和多枝棒束孢Isaria arbuscu/a等等。医学认为蝉花是一种与冬虫夏草相近的珍贵药材。
蝉拟青霉的有性阶段，有学者认为是大蝉草Cordyceps cicadae。大蝉草子座棒状或角状，10-80mm×3-5mm，从寄主头部发出，单生或丛生，褐色，子囊壳拟卵状，埋藏，子囊孢子柱状。在自然界广为分布的是蝉拟青霉，大蝉草稀少。
蝉花含有肝糖、虫草酸、多种必需氨基酸、D-甘露醇、多种生物碱、麦角甾醇等有效成分。蝉花中所含的17种氨基酸、多糖、甘露醇均与冬虫夏草相近，且重金属As、Hg、Pb的含量均比冬虫夏草低，其中Hg在蝉花未检出，说明蝉花比冬虫夏草更具安全性。通过蝉花与冬虫夏草的成分比较，可以看出蝉拟青霉与冬虫夏草具有相似的活性成分。
人工栽培蝉拟青霉具有不依赖自然条件、培养周期短、产品质量有保证、可大批量生产等优点，为解决野生蝉花资源短缺问题提供了新途径，研究表明，人工栽培的蝉花主要活性成分不低于野生蝉花，特别是多糖含量很高，很高的活性成分总量预示其功效可能会比野生蝉花更好。然而现有技术中，人工培养蝉拟青霉的方法往往存在培养周期较长，因此成本较高的问题，而且蝉拟青霉有准性生殖现象，菌株优化是生产关键。
发明内容
本发明的目的在于通过改进现有技术的培养方法，提供一种蝉拟青霉人工培养的方法及其培养产物的应用。
为实现上述目的，本发明采取如下技术方案：
一种蝉拟青霉人工培养的方法，包括如下步骤：
1)菌种制备：包括斜面种制备和一级种制备过程；
其中，斜面种制备包括如下步骤：将蝉拟青霉菌株(Paecilomyces cicadae)移植到PSA培养基(马铃薯蔗糖琼脂培养基)斜面试管中，在22℃～25℃下培养5～7天，挑选长势好的种保存备用；
所述蝉拟青霉菌株可采用常规方法从自然界分离纯化获得，也可以采用现有已保藏或可市购的蝉拟青霉菌株。
一级种制备包括如下步骤：将斜面种接入马铃薯蔗糖培养液中，在22℃～25℃，振荡频率为130～150r/min的条件下培养3～7天，至锥形瓶内出现大量菌丝球后作为一级种备用；
2)接种：将步骤1)中制得的一级种接入到固体培养基中；
3)发酵：接种后的培养盒移至培养室内，在20℃～25℃，相对湿度60％～80％的条件下培养30天～50天；
4)孢梗束的采收：当培养物的孢梗束高度达9cm左右、表面有少量分生孢子出现时即可采收。
较佳的，步骤1)中，所述PSA培养基中含有如下组分(每1000ml培养基中含有)：马铃薯200g、蔗糖20g、琼脂20g，其制备方法为：将去皮马铃薯切丁置于容器内加水1000ml，煮沸20min～30min，过滤，加入蔗糖与琼脂，补足水至1000ml，加热溶解，然后分装至试管内，装量为试管长的1/5～1/4，塞上棉塞，置于灭菌锅内0.15MPa压力下灭菌30min，趁热将试管摆放在斜面板上冷却。
较佳的，步骤1)中，所述马铃薯蔗糖培养液中含有如下组分(每1000ml培养液中含有)：马铃薯200g、蔗糖20g；其制备方法为：将去皮马铃薯切丁置于容器内加水1000ml，煮沸15min～30min，过滤，加入蔗糖，补足水至1000ml，加热溶解，然后分装至锥形瓶内，装量为锥形瓶容量的20％～30％，塞上棉塞，再用牛皮纸包裹，置于灭菌锅内0.15MPa压力下灭菌30min，取出冷却至20℃以下。
较佳的，步骤2)中，所述接种的步骤为：当培养盒中的固体培养基的温度冷却至20℃以下后，在无菌条件下接种，按照3～5％的接种量将一级种接入培养盒中。
较佳的，步骤2)中，所述固体培养基中含有的组分名称及各组分的重量份为：
基质 42～46重量份；
甘蔗渣 2～10重量份；
贝壳粉 0.1～0.5重量份；
蚕蛹粉 2～5重量份；
硝酸钾 0.1～0.5重量份；
水 44～56重量份；
其中，所述基质选自如下组合中的一种：玉米粉、麸皮和蔗糖的混合物；小麦；大麦；粟和蔗糖的混合物；大米和蔗糖的混合物；高粱和蔗糖的混合物。
优选的，所述玉米粉、麸皮和蔗糖的混合物中，以所述玉米粉、麸皮和蔗糖的混合物的总重量计，玉米粉、麸皮和蔗糖的重量百分比分别为：玉米粉43％～55％、麸皮44％～55％、蔗糖1％～2％。
优选的，所述粟和蔗糖的混合物中，以所述粟和蔗糖的混合物的总重量计，粟和蔗糖的重量百分比分别为：粟98％～99％、蔗糖1％～2％。
优选的，所述大米和蔗糖的混合物中，以所述大米和蔗糖的混合物的总重量计，大米和蔗糖的重量百分比分别为：大米98％～99％、蔗糖1％～2％。
优选的，所述高粱和蔗糖的混合物中，以所述高粱和蔗糖的混合物的总重量计，高粱和蔗糖的重量百分比分别为：高粱98％～99％、蔗糖1％～2％。
优选的，所述固体培养基的制备方法为：先将玉米粉、麸皮或小麦、大麦、粟、大米、高粱煮熟，将蔗糖、硝酸钾在水中溶解，再与甘蔗渣、贝壳粉，蚕蛹粉按照比例混合均匀。
优选的，所述固体培养基中还含有蛋白胨(鱼粉)，且所述蛋白胨(鱼粉)的重量份为0.5重量份。
优选的，步骤2)中，所述固体培养基的碳氮比为80～98。
较佳的，步骤3)中，在固体发酵后期孢梗束生长阶段要求采光，且环境温度相较前期菌丝体生长阶段需低2～3℃，培养过程中需保持空气流通。
较佳的，步骤4)中，所述采收的具体步骤为：去掉透气封口膜，用工具将培养物取出分离孢梗束，烘干分级，干燥后用薄膜袋真空包装，菌质置于-20℃贮存。
本发明栽培所得的产物由孢梗束、分生孢子、菌丝体与培养基剩余物质的混合物三部分组成，可用于制备具有抗肿瘤、调节免疫、降血糖、降血脂、降血压、明目、抗辐射、解热镇痛、镇静催眠、滋补强壮、改善肾功能等功能的食品或保健品或药品或化妆品；所述的食品包括饼干、营养粉等产品，所述的保健品包括保健酒、口服液等产品，所述的药品包括具有抗肿瘤、增强免疫力等作用的药物，所述的化妆品包括面膜、洗面奶、防晒霜或油、肥皂、沐浴露、洗发水等产品。
本发明的方法所制得的培养产物可以用于制备如下物质：蝉花茶、蝉酒、蝉花酱油、蝉花氨基酸调味品、蝉花咖啡、蝉花奶制品、蝉花糖果、蝉花蜂制品、蝉花膨化食品、蝉花口香糖、蝉花药膳、蝉花孢子油、蝉花胶囊、蝉花饮片、蝉花冲剂、蝉花保健化妆品、或蝉花饲料。
1、蝉花茶：蝉花茶的制备方法是将孢梗束切割成片状，加适量温热水即可冲泡成蝉花茶。也可将孢梗束打碎，包装成茶包式样，加适量温热水冲泡而成，冲茶时能在较短时间内将原料内的营养成分充分释出。除了上述制备方法，还可以用传统的烘炒等方法制备，但这种方法易破坏原有的有效成分。
2、蝉酒：传统制备酒的方法有渗滤法和冷浸法。冷浸法是将孢梗束直接常温浸泡在酒基中，一般需要6个月左右，浸出物少，若提高浸泡温度可减少浸泡时间提高浸出物量，其具体方法：孢梗束和菌质粉碎->投入容器->加入酒基->一定温度热浸数小时并不断搅拌->换液再次热浸->合并浸出液->加入一定比例的澄清剂->搅拌均匀->过滤->成品。还可以在热浸的基础上超声波提取，此法比仅热浸可得到的更多的浸出物有效成分。具体实施步骤如下：孢梗束和菌质粉碎->浸泡于饮用酒中->超声波提取->调酒。温度时间、超声波提取温度时间和酒基的酒精浓度均需实验确定其最佳条件。酒基可以是白酒、大麦酒、古道酒、黄酒、红葡萄酒等，从营养成分、药用价值考虑认为红葡萄酒为酒基可以与蝉花本身的药理作用相辅相成。蝉酒制备中还可以添加中药材，如肉苁蓉、首乌、元肉、人参、枸杞、黄芪等。
3、调味品：
1)蝉花酱油：蝉花酱油的制备方法是将已制成的酱油原液与人工培养的孢梗束和菌质的提取液按一定比例混合，其步骤为：①黄豆/豆粕、面粉/小麦/麸皮原料处理->接种->发酵制得酱油原液。②粉碎后的人工培养的孢梗束和菌质->超声热水提取->过滤得提取液；残渣再进行超声热水提取->过滤得提取液；合并提取液->真空浓缩③将发酵制得的酱油原液与浓缩后的提取液按一定比例混合->焦糖色配料->加配料甜味剂、增鲜剂->灭菌->过滤->灌装->成品。
2)蝉花氨基酸调味品：近年来发明了具有保健功能的合成味精或复合调味品，大多是在谷氨酸钠味精的基础上添加微量元素和维生素等，从而改变味精单一的调味功能，但大多数保健功能的调味品保健功能单一，蝉花氨基酸调味品从添加单一成分的情况下能起到多种保健功能。技术方案为粉碎人工培养的孢梗束和菌质->于适量水中煎煮过滤，真空浓缩->得浓缩液后与味精混合搅拌或喷涂干燥->成品。用混合搅拌或喷涂的方法使浓缩液渗透着附，将白色晶体颗粒味精或粉状味精研制成蝉花氨基酸调味品，工艺简单、成本低，大大增强了其保健功能。
4、保健食品：
1)蝉花咖啡、奶制品和糖果：蝉花咖啡、奶制品和糖果的配制方法包括直接制取法、精制提取法。这些产品具有调节机体功能，增强体质，消除人体代谢废产物，延缓衰老及美容保健的功效。配制方法如下：直接制取法，将人工培养的孢梗束粉碎后与一定比例的咖啡制成品、奶粉和原糖等相复配，混匀后散装或袋装。精制提取法，用乙醇(一定浓度的酒)热回流法提取已粉碎人工培养的孢梗束和菌质，收取回流液至无醇味时，过滤后备用或干燥蒸发水分后备用，残渣经反复三次乙醇热回流提取后收取全部提取液，将残渣丢弃，将干燥蒸发水分后的提取物粉碎与咖啡制成品、奶制品和原糖复配，制成各种袋装、瓶装、盒装的蝉花咖啡、奶粉、奶、酸奶、钙奶、奶酪、冷饮奶制品和糖果。
2)蝉花蜂制品：蜂制品即蜂蜜做的，蜂蜜、蜂胶、蜂王浆和花粉等产品统称蜂制品。现今市场上蜂蜜的种类除了纯蜂蜜外，还有椴树蜜、紫云英蜜、洋槐蜜等，大多为植物提取物与蜂蜜结合。本发明是将中药成分与蜂蜜结合，更具有药食用价值，具有调节机体功能、增强体质、清除人体代谢废产物、延缓衰老及美容保健等功效。其配制方法是：提取人工培养的孢梗束和菌质内的活性成分，将其以一定比例加入到蜂蜜中，即可得到成品。
3)蝉花膨化食品：膨化食品松脆香甜、口味多样，是很多年轻人、尤其是小朋友的最爱。它主要原料是玉米、面粉、小米、马铃薯、豌豆等粮食，经膨化后表面喷上油脂、盐和调味品等配料而制成。若将蝉花活性成分添加到膨化食品内，在休闲娱乐时也可以做到养生保健功效。具体方法可以将人工培养蝉花孢梗束和菌质中提取的提取物真空浓缩喷涂在膨化食品成品表面后干燥，也可以用上述发明中蝉花调味品代替普通调味品，如蝉花氨基酸调味品代替一般味精、蝉花酱油代替一般酱油等以一般膨化食品的工艺生产蝉花膨化食品。
4)蝉花口香糖：市面上有售的基本大多是果香型而没有中药成分的口香糖。若在口香糖中添加中药成分不仅可以清洁口腔、促进消化、促进血液循环和锻炼面部肌肉外，还能起到滋补强壮、抗疲劳抗应激、解热镇痛、免疫调节等作用。将人工培养的孢梗束和菌质中的有效成分提取出来，与树胶混合，加入糖浆(粉)、薄荷、甜味剂等调和压制而成。也有文献记载，可以将各个有效成分纯化后分别制成多糖层、虫草酸层和核苷酸层，虫草酸层在中间分别将多糖层和核苷酸层粘合得口香糖成品。
5)蝉花药膳：普遍的蝉花药膳为蝉花杞子猪肝汤，制备方法一般是将野生蝉花、枸杞等药材洗净，按比例放入锅内，加猪肝汤内煮沸煎汤，熟烂后加碘盐即可。由于野生蝉花资源的稀缺，可以用营养价值甚至高于野生的蝉花人工培养品孢梗束代替，除了一般用到的猪肝、枸杞外，还可以与植物类、动物类、药食兼用类和中药类配伍。植物类食物包括：海产品类、粮食类半成品、瓜果籽实类、药用食用菌类、蔬菜类、山野菜类和豆及制品类，动物类包括鼠类、海产品类、如制品类、淡水鱼类、山禽类、家禽类、畜产品类、野兽野味类、昆虫类和蛙类，药食兼用类有山药、蕙苡仁、黑芝麻、赤小豆、扁豆、龙眼肉、山楂、大枣等，中药类包括人参、西洋参、藏红花、三七、天麻、丹参、白术等。药膳所需调料类除了碘盐外还有葱、姜、大蒜、酱油、料酒、胡椒、辣椒、味精、醋和红糖等。本发明的蝉花药膳成本低廉、是集滋补、保健、预防、治疗、美容、护肤、减肥、壮阳于一体的药膳系列，并具有抗疲劳、抗衰老、抗病毒、抗辐射、抗缺氧、增强免疫力、增强记忆力、提高生活质量、恢复性功能、双向调节身体器官机能等作用。
6)蝉花孢子油：蝉花孢子油的制备方法是蝉花人工培养品孢子粉经破壁后、萃取孢子粉中有效成分，去除杂质及无效成分，即得蝉花孢子油。其有效成分有多糖、总三萜和腺苷等。
5、保健药品：
蝉花胶囊、饮片、冲剂的制备方法如下：将人工培养的孢梗束和菌质粉碎，冻干干燥后与药用辅料混合分装得胶囊剂。从人工培养的孢梗束和菌质中分离提取有效成分的提取物，与辅料和功能因子混合后得饮片，辅料选择：甜味剂为蔗糖粉、麦芽糖、果糖、饴糖、蛋白糖、海藻糖、乳糖与半乳糖、棉籽糖、木糖醇、蜂蜜、甘露糖醇、甜聚糖、磨芋粉、甘草、山楂、三七、人参、灵芝；酸味剂为柠檬酸、苹果酸、酒石酸；其他添加剂为CMC、明胶、琼脂、糊精、分子蒸馏单苷酯、蔗糖脂肪酸酯、食用滑石粉；功能因子为植物多糖、核酸、黄酮、维生素C、锌、钙、硒。本发明具有成本低、食用方便、营养与保健价值高、口感佳等优点。冲剂是从人工培养的孢梗束和菌质中分离提取有效成分的提取物，将过滤后的残渣烘干粉碎后与提取物混合，再烘干与其他辅料混合后分装或灌装，此法能去除原料中无效的成分。
6、保健化妆品：
在洗涤剂和护肤品的制作工艺中加入蝉花人工培养品孢子粉、孢梗束和菌质内提取的提取液，可减少洗涤剂和护肤品对皮肤的刺激。由于提取液本身是黄色透明的，因此在制备彩妆基础油、色膏、珠光等工艺上需要考虑到色彩问题。蝉花的活性成分具有滋补、美容、抗衰老等功效，增进了洗涤剂和护肤品的功效，也降低了爱美人士长期使用彩妆后的产生的肤质粗糙、暗沉，有色素沉淀等问题。
7、其他产品：
1)蝉花饲料：蝉花饲料的制备方法是将次品菌质烘干捣碎后作为添加剂按一定比例直接加入饲料中成蝉花饲料，需要做动物实验。本法降低了无效成分和成本，不需要提取多糖和浓缩处理。
医家认为蝉花是一种与冬虫夏草相近的珍贵药材，用成本低廉的蝉花人工培养品(孢子粉、孢梗束和菌质)代替资源稀缺的野生蝉花并开发其深加工产品，使人们都能享用到胜比野生蝉花且价格相对低廉的人工蝉花带来的药食兼用价值。
和现有技术相比，本发明具有以下优点：本发明的所采用的人工栽培蝉拟青霉方法简便、生产成本低、栽培周期短，所得产品具有质量高、稳定性好等优点。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
1、菌种的制备和培养：
(1)菌种制备：制备马铃薯蔗糖琼脂培养基或马铃薯蔗糖培养液备用；
①斜面种制备：从云南三江源头采集的野生蝉花通过组织分离纯化获得，转管后，在22℃下培养5天，挑选长势好的备用；
②一级种制备：将马铃薯蔗糖培养液装入锥形瓶中，置于灭菌锅内0.15MPa压力下灭菌30min，冷却后在无菌条件下把备用的斜面种接入锥形瓶中，在22℃，振荡频率为130r/min的条件下培养5天，至锥形瓶内出现大量菌丝球后备用；
本实施方式采用的PSA培养基配比为每1000ml培养基：马铃薯200g、蔗糖20g、琼脂20g，其制备方法为将去皮马铃薯切丁置于容器内加水1000ml，煮沸20min，过滤，加入蔗糖与琼脂，补足水至1000ml，加热溶解，然后分装至试管内，装量为试管长的1/4，塞上棉塞，置于灭菌锅内0.15MPa压力下灭菌30min，趁热将试管摆放在斜面板上冷却。
本实施方式采用的马铃薯蔗糖培养液配比为每1000ml培养液：马铃薯200g、蔗糖20g，其制备方法为将去皮马铃薯切丁置于容器内加水1000ml，煮沸30min，过滤，加入蔗糖，补足水至1000ml，加热溶解，然后分装至锥形瓶内，装量为锥形瓶容量的30％，塞上棉塞，再用牛皮纸包裹，置于灭菌锅内0.15MPa压力下灭菌30min，取出冷却至20℃以下。
配料装盒：配制固体培养基，将配好的培养基装入培养盒中，装料量为15％，用透气封口膜封口；本实施方式所述的固体培养基配比为基质42重量份，甘蔗渣2重量份，贝壳粉0.1重量份，蚕蛹粉2重量份，硝酸钾0.1重量份，蛋白胨(鱼粉)为0.5重量份，水为56重量份，其中基质由玉米粉、麸皮和蔗糖组成，且以基质的总重量计，玉米粉的重量百分比为55％、麸皮的重量百分比为44％、蔗糖的重量百分比为1％。其制备方法为：先将玉米粉、麸皮煮熟，将蔗糖、硝酸钾在水中溶解，再与甘蔗渣、贝壳粉、蚕蛹粉按照比例混合均匀。
(2)灭菌：将培养盒放入灭菌锅中，于0.15MPa压力下灭菌30min；
(3)接种：在固体培养基冷却至20℃以下后，在无菌条件下接种，每300ml一级种接50-60只培养盒；
(4)发酵：接种后的培养盒移至培养室在20℃-25℃，相对湿度60％-80％下培养30d-50d，后期孢梗束生长阶段要求采光，且环境温度相较前期菌丝体生长阶段需低2～3℃，每天需适时通气，保持培养室内空气新鲜；
(5)采收：当培养物的孢梗束高度达9cm左右、表面有少量分生孢子出现时即可采收；采收时，去掉封口膜，用工具将培养物取出分离孢梗束，烘干分级，冷却后用薄膜袋真空包装，菌质置于-20℃贮存。
2、产量及性质检测：
本实施例中所得的培养产物由孢梗束、分生孢子、菌丝体与培养基的剩余物质混合物三部分组成，产量为孢梗束100g-110g(含水率8％以下)/1kg固体培养基。经药理学实验证明，本实施例中蝉拟青霉的培养产物具有改善肾功能的作用。与天然蝉花相比，由于天然蝉花对生长环境要求较高，产量较少，而本实施例的蝉拟青霉在人工可控条件下的培养产品价格相对低廉，因此可用于大规模蝉拟青霉人工培养。
3、培养产物的应用：
本实施例中制得的培养产物用于制备蝉花茶，蝉花茶的制备方法是将孢梗束切割成片状，加适量温热水即可冲泡成蝉花茶。
实施例2
1、菌种的制备和培养：
(1)菌种制备：制备马铃薯蔗糖琼脂培养基或马铃薯蔗糖培养液备用；
①斜面种制备：从云南三江源头采集的野生蝉花通过组织分离纯化获得，转管后，在25℃下培养7天，挑选长势好的备用；
②一级种制备：将马铃薯蔗糖培养液装入锥形瓶中，置于灭菌锅内0.15MPa压力下灭菌30min，冷却后接入锥形瓶中，在25℃，振荡频率为150r/min的条件下培养3天，至锥形瓶内出现大量菌丝球后备用；
本实施方式采用的PSA培养基配比为每1000ml培养基：马铃薯200g、蔗糖20g、琼脂20g，其制备方法为将去皮马铃薯切丁置于容器内加水1000ml，煮沸20min-30min，过滤，加入蔗糖与琼脂，补足水至1000ml，加热溶解，然后分装至试管内，装量为试管长的1/5-1/4，塞上棉塞，置于灭菌锅内0.15MPa压力下灭菌30min，趁热将试管摆放在斜面板上冷却。
本实施方式采用的马铃薯蔗糖培养液配比为每1000ml培养液：马铃薯200g、蔗糖20g，其制备方法为将去皮马铃薯切丁置于容器内加水1000ml，煮沸15min-30min，过滤，加入蔗糖，补足水至1000ml，加热溶解，然后分装至锥形瓶内，装量为锥形瓶容量的20％～30％，塞上棉塞，再用牛皮纸包裹，置于灭菌锅内0.15MPa压力下灭菌30min，取出冷却至20℃以下。
(2)配料装盒：配制固体培养基，将配好的培养基装入培养盒中，装料量为15％-25％，用封口膜封口；本实施方式所述的固体培养基配比为基质46重量份，甘蔗渣5重量份，贝壳粉0.4重量份，蚕蛹粉2.5重量份，硝酸钾0.1重量份，水为44重量份；其中基质为小麦。
其制备方法为：先将小麦煮熟，将蔗糖、硝酸钾在水中溶解，再与甘蔗渣、贝壳粉，蚕蛹粉按照比例混合均匀。
(3)灭菌：将培养盒放入灭菌锅中，于0.15MPa压力下灭菌30m in-60min；
(4)接种：在固体培养基冷却至20℃以下后，在无菌条件下接种，每300ml一级种接50-60只培养盒；
(5)固体发酵：接种后的培养盒移至培养室在20℃-25℃，相对湿度60％-80％下培养30d-50d，前期菌丝体生长阶段需遮光，后期孢梗束生长阶段要求采光，且环境温度相较前期菌丝体生长阶段需低2～3℃，每天需适时通气，保持培养室内空气新鲜；
(6)采收：当蝉花培养物的孢梗束高度达9cm左右、表面有少量分生孢子出现时即可采收；采收时，去掉封口膜，用工具将培养基培养物取出分离孢梗束，烘干分级，冷却后用薄膜袋真空包装，菌质置于-20℃贮存。
本发明的所采用的人工栽培蝉拟青霉方法简便、生产成本低、栽培周期短，所得产品具有质量高、稳定性好等优点。
2、产量及性质检测：
本实施例中所得的培养产物由孢梗束、分生孢子、菌丝体与培养基的剩余物质混合物三部分组成，产量为孢梗束100g-110g(含水率8％以下)/1kg固体培养基。经药理学实验证明，本实施例中蝉拟青霉的培养产物具有抗肿瘤、调节免疫、降血糖、降血脂、降血压、明目、抗辐射、解热镇痛、镇静催眠、滋补强壮、改善肾功能的作用。与天然蝉花相比，由于天然蝉花对生长环境要求较高，产量较少，而本实施例的蝉拟青霉在人工可控条件下的培养产品价格相对低廉，因此可用于大规模蝉拟青霉人工培养。
3、培养物的应用：
本实施例中制得的培养产物用于制备蝉花胶囊，其制备方法如下：将人工培养的孢梗束和菌质粉碎，冻干干燥后与药用辅料混合分装得胶囊剂。
实施例3
1、菌种的制备和培养：
(1)菌种制备：制备马铃薯蔗糖琼脂培养基或马铃薯蔗糖培养液备用；
①斜面种制备：从云南三江源头采集的野生蝉花通过组织分离纯化获得，转管后，在22℃下培养5天，挑选长势好的备用；
②一级种制备：将马铃薯蔗糖培养液装入锥形瓶中，置于灭菌锅内0.15MPa压力下灭菌30min，冷却后接入锥形瓶中，在23℃，振荡频率为130r/min的条件下培养5天，至锥形瓶内出现大量菌丝球后备用；
本实施方式采用的马铃薯蔗糖琼脂培养基配比为每1000ml培养基：马铃薯200g、蔗糖20g、琼脂20g，其制备方法为将去皮马铃薯切丁置于容器内加水1000ml，煮沸20min-30min，过滤，加入蔗糖与琼脂，补足水至1000ml，加热溶解，然后分装至试管内，装量为试管长的1/5-1/4，塞上棉塞，置于灭菌锅内0.15MPa压力下灭菌30min，趁热将试管摆放在斜面板上冷却。
本实施方式采用的马铃薯蔗糖培养液配比为每1000ml培养液：马铃薯200g、蔗糖20g，其制备方法为将去皮马铃薯切丁置于容器内加水1000ml，煮沸15min-30min，过滤，加入蔗糖，补足水至1000ml，加热溶解，然后分装至锥形瓶内，装量为锥形瓶容量的20％，塞上棉塞，再用牛皮纸包裹，置于灭菌锅内0.15MPa压力下灭菌30min，取出冷却至20℃以下。
(2)配料装盒：配制固体培养基，将配好的培养基装入培养盒中，装料量为15％，用封口膜封口；本实施方式所述的固体培养基配比为基质46重量份，甘蔗渣10重量份，贝壳粉0.5重量份，蚕蛹粉5重量份，硝酸钾0.5重量份，水为44重量份；其中基质为粟和蔗糖(以粟和蔗糖的总重量计，粟的重量百分比为98％，蔗糖的重量百分比为2％)。其制备方法为：先将粟煮熟，将蔗糖、硝酸钾在水中溶解，再与甘蔗渣、贝壳粉、蚕蛹粉按照比例混合均匀。
(3)灭菌：将培养盒放入灭菌锅中，于0.15MPa压力下灭菌30min；
(4)接种：在固体培养基冷却至20℃以下后，在无菌条件下接种，每300ml一级种接80只培养盒；
(5)固体发酵：接种后的培养盒移至培养室在25℃，相对湿度80％下培养50天，后期孢梗束生长阶段要求采光，且环境温度相较前期菌丝体生长阶段需低2～3℃，每天需适时开窗通气，保持培养室内空气新鲜；
(6)采收：当蝉花培养物的孢梗束高度达9cm左右、表面有少量分生孢子出现时即可采收；采收时，去掉封口膜，用工具将培养基培养物取出分离孢梗束，烘干分级，冷却后用薄膜袋真空包装，菌质置于-20℃贮存。
2、产量及性质检测：
本实施例中所得的培养产物由孢梗束、分生孢子、菌丝体与培养基的剩余物质混合物三部分组成，产量为孢梗束100g-110g(含水率8％以下)/1kg固体培养基。经药理学实验证明，本实施例中蝉拟青霉的培养产物具有抗肿瘤、调节免疫、降血糖、降血脂、降血压、明目、抗辐射、解热镇痛、镇静催眠、滋补强壮、改善肾功能的作用。与天然蝉花相比，由于天然蝉花对生长环境要求较高，产量较少，而本实施例的蝉拟青霉在人工可控条件下的培养产品价格相对低廉，因此可用于大规模蝉拟青霉人工培养。
3、培养物的应用：
本实施例中制得的培养产物用于制备蝉酒，其制备方法如下：人工培养的孢梗束和菌质粉碎->投入容器->加入酒基->一定温度热浸数小时并不断搅拌->换液再次热浸->合并浸出液->加入一定比例的澄清剂->搅拌均匀->过滤->成品
实施例4实施例1-3中制得的培养产物中多糖含量的测定：
1、试剂
A液：0.1％葡萄糖标准液
精确称量烘干后葡萄糖0.1g，用蒸馏水定容到100ml，浓度为0.1％。
B液：5％苯酚溶液。
精取称取5g重蒸酚，用蒸馏水定容到100ml。
2、样品的前处理
精确称取野生蝉花、实施例1-3中制得的人工培养蝉拟青霉孢梗束各0.5g，加入10ml蒸馏水，超声萃取10min，然后放入90℃水浴锅，热水浸提2h，4000r/min离心10min，获得上清液。重复上述步骤一次，合并上清液，用于多糖检测。
3、样品多糖测定
1)样液稀释12.5倍。
2)用加样抢精确吸取1ml稀释后样液，加入1ml蒸馏水，再加入5％苯酚溶液，摇匀。加入5ml98％浓硫酸。摇匀。冷却至室温后检测。
3)采用紫外可见分光光度计检测，波长490nm。
4、标准曲线绘制
精确吸取0.1％葡萄糖标准液(A液)0.0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0ml到试管中，试管编号为1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，其中1号试管为空白对照液。分别加水至2.0ml，分别精确加入5％苯酚溶液1.0ml，摇匀迅速加入浓硫酸5.0ml，摇匀，冷却至室温，用紫外可见分光光度法在490nm的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，葡萄糖的浓度为横坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程：y＝0.1475＊x+0.0226，R2＝0.9915。质量浓度在0.1-0.6mg/ml范围内相关性较好.
5、计算公式
多糖含量＝a·C·V/W
a：稀释倍数，C：由回归方程计算得到的浸提液中糖浓度(mg·mL。)，V：体积(ml)；W：为样品的重量(mg)。
6、检测结果
表1样品测试结果
表1中的结果证明：本实施例中制得的蝉花培养产物中的多糖含量比野生蝉花高，且产物质量稳定，具有很高的实际应用价值。
实施例5、蝉拟青霉人工培养培养物对5/6肾切除大鼠模型的肾功能影响
受试物：实施例1的培养物(人工蝉花)。
阳性对照药：科素亚，杭州默沙东制药有限公司生产；天然蝉花，产地为浙江。
实验动物：
SPF级雄性SD大鼠70只，2月龄，体重200±10g，由上海中医药大学实验动物中心提供。
分组与造模：
SD大鼠适应性喂养1周后，随机分成2组：空白组(假手术组)8只和实验组(手术组)62只。采用5/6肾大部分切除方法建立实验大鼠模型：第1次手术，手术组大鼠左肾总切除肾皮质重量占左肾重量的2/3；7d后进行第2次手术，右肾全切。两次手术供切除两肾总重量的5/6。假手术组SD大鼠采用同样步骤暴露肾脏，分离肾包膜，但不予肾切除。手术组动物存活54只，假手术组全部存活8只。于第2次手术后2周，所有动物行目内眦动静脉丛采血，进行血肌酐(Scr)检测。并将54只手术组大鼠，根据Scr分层随机分成5组：模型对照组(模型组)12只，科素亚组10只，天然蝉花组11只，人工蝉花大剂量组(A组)10只，人工蝉花小剂量组(B组)11只。科素亚组，天然蝉花组，人工蝉花大剂量组(A组)，人工蝉花小剂量组(B组)大鼠在第2次手术后4周开始喂药，治疗时间为42d。实验结束时大鼠存活44只，假手术组、人工蝉花大剂量组(A组)各8只，模型组、科素亚组、天然蝉花组、人工蝉花小剂量组(B组)各7只。
给药剂量：
天然蝉花组、人工蝉花大剂量组(A组)大鼠按4g·kg-1·d-1用量，人工蝉花小剂量组(B组)按2g·kg-1·d-1用量，加入饲料中给药，并每日用生理盐水灌胃1次；科素亚组大鼠采用灌胃法，按30mg·kg-1·d-1用量，溶于生理盐水中，每日灌胃1次。所有大鼠分组分笼饲养，每笼4-5只大鼠，实验期间全部大鼠自由饮水，进食市售块状颗粒普通饲料。
测试仪器及方法：
实验结束时检测所有大鼠的Scr、尿素氮(BUN)、白蛋白(Alb)；收集24h尿液，测定尿蛋白定量。以上指标采用日立7170型自动生化分析仪测定。
以HE染色和PAS染色肾组织病理片检查肾小球硬化，其中，肾小球硬化定义为毛细血管腔塌陷和/或玻璃样变。采用Rajj等的半定量方法只评估肾小球硬化程度。在光镜(×200)视野下，每张切片至少观察40个肾小球，根据肾小球硬化灶所占肾小球比例分为0-++++，0表示肾小球无硬化，+表示1个肾小球的25％受损，++表示26％-50％受损，+++表示51％-75％受损，++++表示76％-100％受损。然后计算肾小球硬化指数(GSI)。
采用SPSS Version 11.0 for Windows进行数据统计，以均数±标准差
表示，组间比较采用One-Way ANOVA分析，统计显著性水平为P＜0.05。
试验结果：
结果发现，大鼠的Scr、BUN值，各治疗组较模型组显著降低(P＜0.05)，人工蝉花各组(大剂量组、小剂量组)与天然蝉花相比无统计学差异(P＞0.05)，大鼠的血白蛋白值，假手术组、科素亚组、天然蝉花组、人工蝉花大剂量组(A组)显著升高(P＜0.05)，而人工蝉花大剂量组(A组)与天然蝉花组及假手术组相比无统计学差异(P＞0.05)；大鼠的24h尿蛋白量，各组与假手术组相比，均明显增加(P＜0.05)，但科素亚组、天然蝉花组、人工蝉花大剂量组(A组)与模型组相比较，则有明显减少(P＜0.05)。见表1。
表1模型大鼠血液学及尿液检测结果比较
注：与假手术组比较，ΔP＜0.05；与模型组比较，*P＜0.05；与天然蝉花组比较，#P＜0.05常规HE及PAS染色，光镜下观察肾组织病理学变化：假手术组大鼠肾小球血管开放，结构清晰，PAS染色后肾小球胶原呈细线状分布；模型组大鼠肾小球系膜区基质中重度增多伴系膜细胞中重度增生，部分毛细血管襻受压闭塞，玻璃样病变，并伴间质淋巴细胞浸润，部分肾小管内见蛋白管型。各治疗组肾小球硬化程度比模型组明显减轻(P＜0.05)，依次为B组＞A组＞科素亚组＞天然蝉花组，A组、B组和天然蝉花组相比无统计学差异(P＞0.05)。
见表2
表2各组肾小球硬化指数及基质阳性面积比值比较
注：与假手术组比较，ΔP＜0.05；与模型组比较，*P＜0.05；与天然蝉花组比较，#P＜0.05
实施例6急性经口毒性试验
A.样品名称：实施例1的培养物
B.样品配制：称取样品10000mg，加蒸馏水至40ml，充分混匀后作为受试样品。
C.实验动物：昆明种小鼠20只，雌雄各半，体重19-22克，由上海斯莱克实验动物有限公司提供。生产许可证号：SCXK(沪)2007-0005。饲养室温度20-25℃，相对湿度：40-70％。
实验室动物使用许可证号：SYXK(沪)2007-0008。小鼠饲料由苏州双狮实验动物饲料科技服务有限公司提供，登记证号：苏E饲生字(2002)006。
D.实验方法：
1.动物禁食(不禁水)16小时后，按体重要求选用雌、雄小鼠各10只，分放于两鼠笼内，同性别小鼠之间体重差不超过3g。
2.将受试样品采用最大耐受剂量法对实验动物染毒，小鼠逐只称重，灌胃容量按每次0.4ml/20g体重计，在24小时内二次对小鼠灌胃，灌胃间隔时间为6小时。
3.染毒后，观察动物的一般状态、体重变化、中毒症状和死亡情况等。观察期为一周。
4.实验末再次对动物称重。对死亡动物及到期处死的动物进行尸体解剖，肉眼观察大体病理改变情况。
5.实验全过程及观察内容均做详细记录，按最大耐受剂量法试验结果，求得小鼠急性经口MTD。
E.结果：
表6雌雄小鼠急性经口毒性试验结果
1.主要体征表现：
试验期间各组动物活动正常，毛色光泽度好，未见任何中毒体征和死亡；到期处死动物，大体解剖肉眼观察各脏器情况，未见异常。
2.雌性小鼠：MTD＞10000mg/kg
雄性小鼠：MTD＞10000mg/kg
F.结论：
样品对雌雄小鼠急性经口毒性试验的最大耐受剂量MTD均大于10000mg/kg。属于实际无毒级。
Claims (15)
1.一种蝉拟青霉人工培养的方法，包括如下步骤：
1)菌种制备：包括斜面种制备和一级种制备过程；
2)接种：将步骤1)中制得的一级种接入到固体培养基中；
3)发酵：接种后的培养盒移至培养室内，在20℃～25℃，相对湿度60％～80％的条件下培养30天～50天；
4)孢梗束和菌质的采收。
2.如权利要求1中所述的蝉拟青霉人工培养的方法，其特征在于，步骤2)中，所述接种的步骤为：当培养盒中的固体培养基的温度冷却后，在无菌条件下接种，按照3～5％的接种量将一级种接入培养器皿中。
3.如权利要求1中所述的蝉拟青霉人工培养的方法，其特征在于，步骤2)中，所述固体培养基中含有的组分名称及各组分的重量份为：
基质 42～46重量份；
甘蔗渣 2～10重量份；
贝壳粉 0.1～0.5重量份；
蚕蛹粉 2～5重量份；
硝酸钾 0.1～0.5重量份；
水 44～56重量份；
其中，所述基质选自如下组合中的一种：玉米粉、麸皮和蔗糖的混合物；小麦；大麦；粟和蔗糖的混合物；大米和蔗糖的混合物；高粱和蔗糖的混合物。
4.如权利要求3中所述的蝉拟青霉人工培养的方法，其特征在于，所述玉米粉、麸皮和蔗糖的混合物中，以所述玉米粉、麸皮和蔗糖的混合物的总重量计，玉米粉、麸皮和蔗糖的重量百分比分别为：玉米粉43％～55％、麸皮44％～55％、蔗糖1％～2％。
5.如权利要求3中所述的蝉拟青霉人工培养的方法，其特征在于，所述粟和蔗糖的混合物中，以所述粟和蔗糖的混合物的总重量计，粟和蔗糖的重量百分比分别为：粟98％～99％、蔗糖1％～2％。
6.如权利要求3中所述的蝉拟青霉人工培养的方法，其特征在于，所述大米和蔗糖的混合物中，以所述大米和蔗糖的混合物的总重量计，大米和蔗糖的重量百分比分别为：大米98％～99％、蔗糖1％～2％。
7.如权利要求3中所述的蝉拟青霉人工培养的方法，其特征在于，所述高粱和蔗糖的混合物中，以所述高粱和蔗糖的混合物的总重量计，高粱和蔗糖的重量百分比分别为：高粱98％～99％、蔗糖1％～2％。
8.如权利要求3-7中所述的蝉拟青霉人工培养的方法，其特征在于，所述固体培养基的碳氮比为80～98。
9.如权利要求3-7中所述的蝉拟青霉人工培养的方法，其特征在于，所述固体培养基中还含有蛋白胨，且所述蛋白胨的重量份为0.5重量份。
10.如权利要求3-7中所述的蝉拟青霉人工培养的方法，其特征在于，所述固体培养基的制备方法为：先将玉米粉、麸皮或小麦、大麦、粟、大米、高粱煮熟，将蔗糖、硝酸钾在水中溶解，再与甘蔗渣、贝壳粉，蚕蛹粉按照比例混合均匀。
11.如权利要求1中所述的蝉拟青霉人工培养的方法，其特征在于，步骤3)中，在固体发酵后期孢梗束生长阶段要求采光，且环境温度相较前期菌丝体生长阶段需低2～3℃，培养过程中需保持空气流通。
12.一种蝉拟青霉的培养产物，由蝉拟青霉经权利要求1～11中任一权利要求中所述方法培养制得。
13.权利要求12中所述的蝉拟青霉的培养产物在制备食品、保健品、药品和化妆品中的应用。
14.权利要求13中所述蝉拟青霉的培养产物的应用，其特征在于，所述食品、保健品、药品和化妆品包括：蝉花茶、蝉酒、蝉花酱油、蝉花氨基酸调味品、蝉花咖啡、蝉花奶制品、蝉花糖果、蝉花蜂制品、蝉花膨化食品、蝉花口香糖、蝉花药膳、蝉花孢子油、蝉花胶囊、蝉花饮片、蝉花冲剂、蝉花保健化妆品或蝉花饲料。
15.如权利要求13或14中任一权利要求中所述蝉拟青霉的培养产物的应用，其特征在于，所述食品、保健品、药品和化妆品具有抗肿瘤、调节免疫、降血糖、降血脂、降血压、明目、抗辐射、解热镇痛、镇静催眠、滋补强壮或改善肾功能的功能。
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