CN101241114A - 动物源性食品中磺胺类药物残留的基质固相分散-高效液相色谱测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及“动物源性食品中磺胺类药物残留的基质固相分散－高效液相色谱测定方法”属于食品安全－兽药残留领域。该测定方法包括基质固相分散和高效液相色谱检测步骤，其特征在于：所述高效液相色谱测定方法中所用流动相为50mmol/L磷酸二氢钠－乙腈，磷酸二氢钠与乙腈的体积比为70∶30，由于磷酸二氢钠溶液是缓冲溶液，具有一定的pH缓冲能力，使pH不易变化，从而保证了HPLC流动相pH的稳定性，保证了分析结果的重复性和重现性，同时简化了经典样品处理方法中提取、分离、浓缩、净化过程，操作简单、消除乳化现象，具有理想的准确度和灵敏度，采用毒性较小的有机溶剂洗脱分析物使本发明方法更环保。

Description

动物源性食品中磺胺类药物残留的基质固相分散-高效液相色谱测定方法

技术领域

本发明属于食品安全-兽药残留领域，特别是动物源性食品中磺胺类药物残留检测的一种方法。

背景技术

磺胺类药物(sulfonamides，SAs)是指具有对氨基苯磺酰胺结构的一类药物的总称，是一类传统的人工合成抗菌药物。它与对氨基苯甲酸(PABA)的化学结构相似，二者竞争二氢叶酸合成酶，抑制细菌二氢叶酸的合成，影响细菌核酸生成，进而阻止了细菌的生长繁殖。磺胺药物抗菌谱较广，对大多数革兰阳性菌和某些革兰阴性菌有抑制作用。在动物饲养过程中，磺胺类药物常用于治疗家畜子宫炎、呼吸道和消化道感染、猪萎缩性鼻炎、禽霍乱、伤寒、副伤寒和球虫感染。磺胺类药物在动物体内的作用时间和代谢时间较长，往往造成动物可食性组织中有磺胺类药物残留，而长期食用有磺胺类药物残留的食品，就可能引起磺胺类药物在体内的逐渐蓄积，对人类的健康有害[李俊锁，邱月明，王超，兽药残留分析[M]，2002，228-251；段振娟，张鸿雁，王硕，动物性食品中磺胺类药物残留分析研究进展[J]，食品研究与开发，2007，28(6)：149-153]，主要表现为***反应与过敏反应、细菌耐药性、致畸作用、致突变作用、致癌作用以及激素样作用。而且食品、饲料中的残留极易引发细菌的耐药性和环境污染。动物***物中的抗菌药物和耐药性菌株被释入环境后，将污染水源和土壤，在污泥中细菌可长期保持耐药性。同时，磺胺类药物残留也是目前动物性产品贸易的主要技术问题，严重影响了畜牧业的正常发展。

为了保障动物用药的安全性和有效性，以及人类摄食动物性食品后的安全性，许多国家规定了磺胺类药物的最高残留限量(maximum residue limits，MRL)，加拿大、欧盟、美国规定动物组织中磺胺类药物总量的最大残留量是100μg/kg，日本为20μg/kg。根据我国农业部1998年制定的“兽药及其他化学物质在动物可食性组织中残留检测方法”，磺胺类药物在可食性动物组织中的允许残留标准为100μg/kg～300μg/kg。几十年来，国内外对SAs残留的分析进行了深入全面的研究，出现了许多检测磺胺类药物的方法。目前有高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、薄层色谱法(TLC)、高效毛细管电泳法(HPCE)、酶联免疫分析法(ELISA)、微生物法、生物传感器免疫分析法(BIA)、分光光度法(UV)、荧光法(FL)、气相色谱-质谱法(GC/MS)、液相色谱-质谱法(HPLC/MS)和超临界流体色谱法(SFC)等方法。研究最多的动物性食品有肌肉、肝脏、肾、皮和脂肪，最常见的分析物为磺胺二甲基嘧啶(SMZ)、磺胺嘧啶(SDZ)、磺胺甲基嘧啶(SMR)和磺胺噻唑(STZ)[段振娟，张鸿雁，王硕，动物性食品中磺胺类药物残留分析研究进展[J]，食品研究与开发，2007，28(6)：149-153]。在磺胺类药物的诸多检测方法中，HPLC方法具有灵活、通用、选择性强、灵敏度高、检测限低等优点。HPLC方法主要用C₁₈和C₈反相柱，有时也用离子对柱。常用的流动相为磷酸-乙腈梯度洗脱[刘宏程，黎其万，佴注，等，HPLC测定动物组织中己烯雌酚、呋喃唑酮、磺胺类药物残留[L]，化学通报，2006，(1)：66-69；万春花，龙洲雄，胡海山，等，RP-HPLC法同时测定动物组织中十五种磺胺类药物残留[J]，食品科学，2007，28(10)：493-496；曹芳，王茜，谢世红，高效液相色谱法测定鸡肉中的磺胺类药物残留[J]，江西饲料，2005，(1)：25-26]，甲酸-乙腈梯度洗脱[陈振桂，占春瑞，郭平，等，高效液相色谱法同时测定水产品中13种磺胺类药物残留的研究[J]，食品科学，2007，28(10)：448-451]，甲醇-磷酸盐缓冲液-三乙胺[刘芃岩，姜宁，王洪宇，固相萃取-高效液相色谱法同时测定猪肉中磺胺类和氟喹诺酮类兽药残留量[J]，化学通报，2006，(8)：572-576]，甲醇-乙腈-水-乙酸[张艳，吴银良，固相萃取-高效液相色谱法测定动物肉组织中磺胺类药物的残留[L]，色谱，2005，23(6)：636-638；林红英，陆桂萍，沈子龙，猪肉中磺胺二甲基嘧啶残留量的高效液相色谱法测定[L]，江苏农业学报，2006，22(3)：285-288]，甲醇-乙酸[宋艳红，王冉，刘铁铮，高效液相色谱法测定蛋清和蛋黄中五种磺胺类药物残留[L]，浙江农业学报，2007，19(1)：42-45]；甲醇-甲酸梯度洗脱[吴宗贤，沈崇钰，陈惠兰，等，高效液相色谱-串联质谱法测定肠衣中17种磺胺类药物残留量[L]，分析试验室，2007，26(5)：96-99]等。流动相的pH值对磺胺类药物的保留时间影响很大，因为磺胺类药物结构式中含有氨基，具有弱碱性，调节流动相中的pH，可以抑制弱碱的离解，从而导致保留时间的改变，因此在HPLC检测中，必须保持流动相pH的稳定，pH变化则可能引起分析结果和分离效果的变化。例如用RP-HPLC法同时测定动物组织中十五种磺胺类药物残留时[万春花，龙洲雄，胡海山，等.RP-HPLC法同时测定动物组织中十五种磺胺类药物残留[J]，食品科学，2007，28(10)：493-496]，结果表明在乙腈-水中加入磷酸，可有效地抑制色谱峰拖尾，且有利于磺胺噁唑与磺胺二甲嘧啶的分离，但加入磷酸多了，磺胺甲氧哒嗪、磺胺甲噻二唑很难分开。HPLC方法常用的检测器有紫外-可见检测器(UV)、荧光检测器(FLD)、光二极管阵列检测器(DAD)和质谱(MS)。紫外-可见的检测波长通常选为270nm～280nm，有时为255nm。荧光检测的激发波长为405nm～420nm，发射波长为485nm～495nm。光二极管阵列通常选267nm、268nm或263nm的波长。MS具有高特异性并且可以确证被分析物。

在进行HPLC色谱分析前，通常需要对样品进行净化和浓缩，以避免样品基质中的复杂组分损害色谱仪器和对目标分析物的干扰。常用的方法是用甲醇或乙腈提取药物，再经正己烷液-液分配除脂肪，浓缩后过SPE柱净化；常用的SPE柱包括Alumina B SPE、阳离子MCXSPE柱、ENVI-18 SPE柱、氨基SPE柱和C₁₈SPE柱等。

基质固相分散(Mat rix solid phase dispersion，MSPD)是另一种样品前处理方法。MSPD是由Barker在1989年首次提出并给予理论解释的一种样品处理技术。MSPD将常规的固相分散技术与反相键合填料相结合，组织匀浆、提取和净化在同一操作中完成，分析环节大为减少、操作简化，所以具有简便快捷、样品和溶剂用量少等优点。国内这方面的研究资料比较少，报道的有猪肌肉组织中磺胺类药物的MSPD净化和HPLC测定[张素霞，李俊锁，钱传范，猪肌肉组织中磺胺类药物的MSPD净化和HPLC测定[J]，畜牧兽医学报，1999，30(6)：531-535]，方法是将0.5g肌肉组织与2g C₁₈填料混合，研磨30s，制成半固态装取于5mL玻璃注射器内，填装高度为4.2mL，用8mL正己烷洗涤，真空抽干后，磺胺类药物用12mL二氯甲烷洗脱药物于鸡心瓶中，加0.1mL乙二醇，旋转蒸发除去二氯甲烷，残留物用0.4mL流动相溶解，转入玻璃离心管中，2000g离心10min；上清液进经C₁₈柱分离，0.017mol/L磷酸-乙腈(80：20)为流动相，UV检测波长270nm下用反相HPLC测定。在0.1～0.5mg/kg添加浓度范围内7种磺胺类药物的平均回收率为70.6％±20.3％，检测限为0.01～0.1mg/kg。同样耿志明等采用基质固相分散-高效液相色谱法测定鱼肉中磺胺类药物残留进行了研究[耿志明，李鹏，陈明，等，基质固相分散-高效液相色谱法测定鱼肉中磺胺类药物残留[J]，江苏农业学报，2006，22(3)：310-312]，即0.5 g鱼肉样品和2.0g C₁₈填料放入研钵中，轻轻研磨5min，使样品和C₁₈填料混合均匀，装于10mL注射器，填装高度为4mL左右，用8mL正已烷洗涤1次，真空抽干，再用8mL二氯甲烷洗脱，真空抽干；洗脱液在35℃水浴中用氮气吹干，残渣用1mL 40％(体积比)甲醇水溶液溶解，旋涡振荡，过0.45μm滤膜，供HPLC分析；色谱柱W为ODS-3 C₁₈，柱温35℃，UV检测波长270nm，流动相为0.5％乙酸-甲醇，采用梯度洗脱，即为0～2min 76∶24(体积比)、2～20min由76∶24(体积比)改变为60∶40(体积比)、20～30min为60∶40(体积比)，流速为1.0mL/min。在0.05～0.20mg/kg的添加浓度范围内，磺胺类药物的回收率为70.2％～93.7％，变异系数为2.5％～9.9％，磺胺类药物的检测限0.020mg/kg～0.030mg/kg。

HPLC方法是分析磺胺类药物残留的国际公认的较为普遍的方法，有关的研究较多，但是为了实现简单、快速、安全的分析目的，上述方法还存在以下问题：

1)HPLC分析时，流动相多采用酸(甲酸、乙酸、磷酸等)-有机溶剂，其中磷酸、甲酸、乙酸等由于具有挥发性，放置过久浓度或含量会发生变化，所以不同时间里很难配制相同的精确pH值，影响不同分析时间内分析结果的重复性，导致保留时间的变化，甚至使分析物不能彼此分开。

2)MSPD洗脱是采用毒性有机溶剂二氯甲烷，对环境和操作者具有危害。

3)以上这种提取-净化的前处理方式经常使用有毒的有机溶剂(甲醇、乙腈)作提取剂；同时又有液-液分配、浓缩等过程，由于磺胺类药物耐热性差，这些过程都会造成损失，使回收率降低；而且这种传统样品处理方法包括提取、分离、浓缩、净化等烦琐、冗长的操作步骤，需耗用大量溶剂，限制了分析效率的提高。

发明内容

本发明针对上述HPLC方法中的缺陷，提出了一种动物源性食品中磺胺类药物残留的基质固相分散-高效液相色谱测定方法，该方法采用稳定的化合物磷酸二氢钠配制HPLC的流动相，由于磷酸二氢钠溶液是缓冲溶液，具有一定的pH缓冲能力，使pH不易变化，从而保证了HPLC流动相pH的稳定性，保证了分析结果的重复性和重现性，同时简化了经典样品处理方法中提取、分离、浓缩、净化过程，操作简单、消除乳化现象，具有理想的准确度和灵敏度，采用毒性较小的有机溶剂洗脱分析物会使MSPD方法更环保。

一种动物源性食品中磺胺类药物残留的基质固相分散-高效液相色谱测定方法，包括基质固相分散和高效液相色谱检测步骤，其特征在于：所述高效液相色谱测定方法中所用流动相为50 mmol/L磷酸二氢钠-乙腈，磷酸二氢钠与乙腈的体积比为70∶30。

所述高效液相色谱测定方法中所用色谱柱为ODS-C₁₈柱，规格为4.6mm×250mm×5μm。

所述基质固相分散包括研磨、装柱、除脂肪、洗脱药物和制备上样溶液步骤，所述洗脱药物采用乙酸乙酯溶剂。

所述制备上样溶液是在35℃水浴，洗脱液中加入0.1mL乙二醇后，旋转蒸发至0.2mL-0.3mL，氮气吹至0.1mL，加入0.9mL流动相定容1.0mL，涡旋混合10s，过0.22μm微孔滤膜即可。

本发明建立了以磷酸二氢钠-乙腈为流动相的HPLC的方法，其中以磷酸二氢钠代替磷酸、甲酸、乙酸等酸性组分，使流动相的配制更加方便和准确，使溶液的pH值更容易控制和稳定，而且本方法具有较好的重复性和重现性。

在洗脱药物提取磺胺类化合物时采用乙酸乙酯溶剂，减少了有毒试剂的应用，在制备上样溶液时，在低温水浴下，利用乙二醇作保护剂，防止旋转蒸发时高温蒸干对磺胺类化合物的影响。

本发明的HPLC测定方法中色谱柱：ODS-C₁₈柱(4.6mm×250mm×5μm)，柱温为室温；流动相：50mmol/L磷酸二氢钠-乙腈(色谱纯)(V/V)＝70∶30；恒流模式；检测器：紫外检测器，检测波长为270nm。

检测的磺胺类药物包括：磺胺二甲基嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺嘧啶、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺喹噁啉。八种磺胺类药物在0.010mg/kg～1.000μg/mL范围内，线性相关系数均为0.9999以上；回收率为76.0％～115.0％；仪器检测限均为0.010μg/mL；方法检测限为0.020μg/g。

本发明建立了以磷酸二氢钠-乙腈为流动相的HPLC的方法，使流动相的配制更加方便和准确，使溶液的pH值更容易控制，具有较好的重复性和重现性。同时采用环保型溶剂取代有毒溶剂，使本发明方法更环保。

附图说明

图18种药物标准色谱图(0.100μg/mL)

图2鱼肉样品添加浓度0.200mg/Kg的色谱图

图3猪肉样品添加浓度0.200mg/Kg的色谱图

具体实施方式

下面通过实例对本发明作进一步的详细说明。

实施例1：鱼肉样品检测

1、主要仪器设备、药品

仪器：

1)玻璃研钵；

2)玻璃注射器5mL

3)SPE固相萃取装置

4)具恒温水浴锅的氮吹仪

5)移液管1mL、0.5mL

6)容量瓶10mL

7)电子天平(分度值0.001g)

8)计时器

9)旋涡混合器

10)液相色谱仪

药品：

1)标准物质(纯度≥98.5％)：磺胺嘧啶(sulfadiazine)、磺胺甲基嘧啶(sulfamerazine)、磺胺二甲基嘧啶(sulfamethazine)、磺胺间甲氧嘧啶(sulfamonomethoxine)、磺胺邻二甲氧嘧啶(sulfadoxine)、磺胺甲噁唑(sulfamethoxazole)、磺胺喹噁啉(sulfaquinoxzline)、磺胺间二甲氧嘧啶(sulfadimethoxine)标准溶液。

2)乙腈、乙酸乙酯、甲醇(色谱纯)

3)正己烷、磷酸二氢钠(分析纯)

4)无水硫酸钠(分析纯)，使用前在450℃烘干4h，干燥器中放置备用。

5)C₁₈填料，使用前用双倍体积的正己烷、乙酸乙酯、甲醇(色谱纯)预洗C₁₈，最后抽干。

6)流动相：将50mmol/L磷酸二氢钠缓冲水溶液与色谱纯的乙腈按体积比70∶30(V/V)混合而获得。

2、标准溶液配制

标准储备液：精确称取适量的磺胺类药物，分别用甲醇配成1mg/mL的标准储备液，储于-20℃冰箱中。有效期一年。

标准工作液：将储备液用流动相稀释为0.01μg/mL～1.0μg/mL，存放在2～8℃冰箱中备用。有效期6个月。

混合标准工作液：准确量取磺胺类药物标准储备液各0.5mL，用甲醇定容10mL，配制成50μg/mL的磺胺类药物混合标准储备液，再用流动相稀释成0.01μg/mL～1.0μg/mL的混合标准工作液，存放在2～8℃冰箱中备用。有效期6个月。

3、鱼肉样品的制备

将2kg鱼肉样品用组织绞碎机匀浆处理，称取500g样品，实验室备用，4℃储存。

4、MSPD方法

称取2g预处理的C₁₈填料，放于玻璃研钵中，准确称取0.50g匀浆处理好的鱼肉样品于研钵，研磨30s，混合均匀。将研碎的肉样装入5mL的玻璃注射器中(预先在底部装入滤纸片，并装有0.1mL柱体积的无水硫酸钠)，上面再装入一片滤纸，压紧到柱体积为4.2mL。用8mL正己烷淋洗小柱，以进一步去掉脂肪，流速为1滴/s，真空抽干，除去正己烷，弃去淋洗液。再用15mL乙酸乙酯洗脱小柱，控制流速为1滴/s，真空抽干，收集洗脱液于试管中。

5、浓缩：

洗脱液中加入0.1mL乙二醇，在35℃水浴中旋转蒸发0.2mL左右，氮气吹至0.1mL，加入0.9mL流动相定容1.0mL，涡旋混合10s，过0.22μm微孔滤膜，待测。

6、C18填料空白实验

在研钵中不加鱼肉样品，按照上述相同的MSPD和浓缩方法做C₁₈填料空白实验。

7、样品空白实验

在研钵中加入经验证不含有磺胺药物的鱼肉样品，按照上述相同的MSPD和浓缩方法做鱼肉样品空白实验。

8、样品添加实验

在研钵中加入经验证不含有磺胺药物的鱼肉样品，然后添加一定量的磺胺药物的混合标准溶液，按照上述相同的MSPD和浓缩方法做鱼肉样品添加实验。

9、实际样品测定实验

在研钵中加入实际鱼肉样品，按照上述相同的MSPD和浓缩方法做鱼肉实际样品测定实验。

10、HPLC测定

将上述处理制得的样品试液50μL注入色谱***，室温下，以50mmol/L磷酸二氢钠-乙腈(色谱纯)(V/V)＝70∶30为流动相，流速为0.7mL/min，在C₁₈(4.6mm×250mm×5μm)色谱柱上分离，紫外检测器，波长为270nn。(见图1、图2)

11、实验结果

1)方法的标准曲线

浓度范围在0.010～1.000μg/mL时的标准曲线方程和相关系数见表1。

表18种药物的标准曲线方程和相关系数

药物名称	线性方程	相关系数
			磺胺嘧啶(sulfadiazine)磺胺甲基嘧啶(sulfamerazine)磺胺二甲基嘧啶(sulfamethazine)磺胺间甲氧嘧啶(sulfamonomethoxine)磺胺邻二甲氧嘧啶(sulfadoxine)	A＝338.69c-0.033A＝333.74c-0.133A＝297.78c-0.106A＝263.21c-0.010A＝273.47c-0.178	0.99990.99990.99990.99991.0000

磺胺甲噁唑(sulfamethoxazole)磺胺喹噁啉(sulfaquinoxzline)磺胺间二甲氧嘧啶(sulfadimethoxine)

A＝299.76c-0.016A＝260.00c-0.138A＝276.03c-0.506

1.00000.99991.0000

A-色谱峰面积；c-浓度

2)回收率

添加浓度为0.200μg/g和0.100μg/g时的鱼肉样品的回收率见表2。

表28种药物的回收率(n＝6)

3)方法的检出限

根据仪器响应值与噪音的比值为3来计算方法的检出限，则仪器检测限均为0.010μg/mL；方法检测限为0.020μg/g。

从上述结果可知本实验建立的鱼肉中磺胺类药物多残留分析的MSPD/HPLC方法，采用MSPD技术进行样品处理，提取、净化一步完成，简化了经典样品处理方法中提取、分离、浓缩、净化等烦琐步骤，操作简单、方法稳定，具有理想的准确度和灵敏度；同时采用低毒溶剂乙酸乙酯代替二氯甲烷，减少了实验过程中有机溶剂对操作者和环境的污染。同时采用50mmol/L NaH2PO4-乙腈(V/V：70∶30)为流动相，在恒流模式下进行，简化色谱操作，选用磷酸二氢钠调节流动相的pH时，由于磷酸二氢钠溶液是缓冲溶液，具有一定的pH缓冲能力，pH不易变化，是测定的重现性好。同时分离检测8种磺胺类药物，不仅能够满足水产品磺胺类残留量的常规的检测，也可用于其他样品中的磺胺类药物的测定。

实施例2猪肉样品检测

操作步骤同上，猪肉样品HPLC检测结果见图3.

在本发明所建立的分析条件下，得到猪肉样品和鱼肉样品及8种磺胺药物标准品的色谱图(图3、图2和图1)，从这些色谱图分离效果可见，没有基质干扰影响药物的测定，分离效果非常好。

Claims (4)

1、一种动物源性食品中磺胺类药物残留的基质固相分散-高效液相色谱测定方法，包括基质固相分散和高效液相色谱检测步骤，其特征在于：所述高效液相色谱测定方法中所用流动相为50mmol/L磷酸二氢钠-乙腈，磷酸二氢钠与乙腈的体积比为70∶30。

2、根据权利要求1所述的测定方法，所述高效液相色谱测定方法中所用色谱柱为ODS-C18柱，规格为4.6mm×250mm×5μm。

3、根据权利要求1所述的测定方法，所述基质固相分散包括研磨、装柱、除脂肪、洗脱药物和制备上样溶液步骤，所述洗脱药物采用乙酸乙酯溶剂。

4、根据权利要求3所述的测定方法，所述制备上样溶液是在35℃水浴，洗脱液中加入0.1mL乙二醇后，旋转蒸发0.2mL-0.3mL，氮气吹至0.1mL，加入0.9mL流动相定容1.0mL，涡旋混合10s，过0.22μm微孔滤膜即可。

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