CN101125140B

CN101125140B - 二氢青蒿素在制备增强化疗药物抗肿瘤疗效的药物中的应用

Info

Publication number: CN101125140B
Application number: CN2007100711855A
Authority: CN
Inventors: 周慧君; 李傲; 王增
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2007-09-18
Filing date: 2007-09-18
Publication date: 2011-04-13
Anticipated expiration: 2027-09-18
Also published as: CN101125140A

Abstract

本发明提供二氢青蒿素在制备增强化疗药物抗肿瘤疗效药物中的应用。该药物制剂含有制剂允许的药物赋形剂或载体。其制剂形式为固体制剂。本发明提供的药物制剂可增强化疗药物抗肿瘤疗效，可用于肿瘤化疗过程中的辅助治疗。本发明以血管生成抑制剂能改变肿瘤微环境的理论为背景，研究并阐明中药有效单体增强化疗药物抗肿瘤作用和机制，为青蒿素类药物新的用途开发提供药理学依据，为发掘血管生成抑制剂新的临床价值提供重要依据，是发展中医药理论新的研究方向。

Description

二氢青蒿素在制备增强化疗药物抗肿瘤疗效的药物中的应用

技术领域

本发明属药物用途，涉及二氢青蒿素在增强化疗药物抗肿瘤疗效方面的药物用途。

背景技术

恶性肿瘤是威胁人类健康最严重的疾病之一，其治疗失败的主要原因是肿瘤细胞对化疗药物产生耐药性。恶性肿瘤对化疗药物产生耐药性除了癌细胞本能地变异外，另一个重要原因是肿瘤组织微环境结构和功能异常。这种异常的微环境形成的机制尚未完全阐明，一般认为与肿瘤组织内新生血管结构和功能严重缺陷、组织内间隙液体压升高、低氧环境和酸中毒等因素有关。最近几年，血管生成抑制剂作为化疗药物的增敏剂日益引起人们的重视，并在治疗多种肿瘤中卓有成效。一些临床研究表明，血管生成抑制剂能特异性抑制内皮细胞增生并明显抑制肿瘤的生长和转移，其联合化疗方案使非小细胞肺癌(NSCLC)的治疗有望摆脱“瓶颈区”的牵制，有可能成为晚期NSCLC的标准治疗方案。

血管生成抑制剂作为化疗增敏剂的合理之处不仅在于化疗药物和血管生成抑制剂可以损坏肿瘤组织不同的组成部分：肿瘤细胞和内皮细胞，而且血管生成抑制剂可以改变肿瘤血管异常的结构及功能，从而增强化疗药物的治疗效果。首先，血管生成抑制剂可以改善肿瘤血管结构紊乱、渗漏的状态，降低肿瘤内间质液体压力，增加药物输送到肿瘤内部，缓解肿瘤组织缺氧，这样就会使化疗效果大大增强。其次，血管生成抑制剂可以阻止肿瘤细胞在化疗过后的快速复苏。尽管化疗或放疗可以使大部分肿瘤出现消退，但由于化疗药物或放疗的严重不良反应而限制了其长期应用。治疗结束后肿瘤细胞可以快速地复苏、增殖，且肿瘤细胞再增殖速度并没有随着化疗或放疗次数的增加而减少。因此肿瘤消退并没有真正延长病人的生命，Hudis提出了在化疗停药期间实施抗血管生成治疗的可行办法，以阻断肿瘤细胞的快速再增殖仍需要通过邻近血管所提供的氧气和营养。再次，血管生成抑制剂可以增强化疗药物对内皮细胞的杀伤作用，化疗药物在新的血管形成期间不但对内皮细胞有直接的杀伤作用，而且对那些骨髓源性的功能性、有活力的内皮细胞也具有杀伤作用，这类细胞包括内皮祖细胞，CD54⁺单核细胞等。内皮祖细胞可分化为成熟的内皮细胞，在血管生成中发挥重要作用；CD54⁺单核细胞和其他骨髓样细胞群是血管新生的发源地。化疗药物小剂量节律性治疗方式可以直接杀伤内皮细胞，抑制循环***中的内皮祖细胞。这些内皮细胞大部分可以分泌VEGF，因此在治疗过程中化疗药物和一些以VEGF为靶点的药物合用可以发挥协同或累加的治疗效果。临床研究显示，化疗药物小剂量节律性治疗和血管生成抑制剂长期合用可以发挥明显的抗肿瘤效果。

青蒿素(artemisinin)是我国科学家在1971年首次从菊科植物黄花蒿(Artemisia annua Linn)中提出的具有新型结构的倍半萜内酯，它具有十分优良的抗疟作用。二氢青蒿素(dihydroartemisinin，DHA)为青蒿素类药物体内的主要活性代谢产物，与青蒿素相比，具有水溶性好，抗疟疗效更强等特点。本课题组前期研究表明，青蒿素类药物能显著抑制人卵巢癌裸鼠移植瘤组织及恶性血液肿瘤细胞株K562、RPMI8226中VEGF的表达，具有明确的抗肿瘤血管生成作用。

发明内容

本发的明目的是提供二氢青蒿素在制备增强化疗药物抗肿瘤疗效药物中的应用。即作为一种靶向肿瘤血管生成抑制剂增强化疗药物在抗肿瘤疗效方面的作用。所述二氢青蒿素的分子式为C₁₅H₂₄O₅。

本发明所制备的药物为抗肿瘤化疗药物。含有制剂允许的药物赋形剂或载体。所述药物的制剂形式为固体制剂。给药方式为口服给药。

本发明具有以下优点：

(1)二氢青蒿素是传统的的青蒿素类抗疟药中最具有代表性的药物，一直以来用于抗疟治疗，本发明的特点是首次提出二氢青蒿素作为一种靶向肿瘤血管生成抑制剂增强化疗药物抗肿瘤的治疗效果。恶性肿瘤是威胁人类健康最严重的疾病之一，化学治疗仍将是肿瘤治疗的主要手段，二氢青蒿素能在肿瘤治疗中通过阻断肿瘤血管生成，克服化疗药物靶向不明确，副作用较大的不足。因此，联合化疗增强抗肿瘤治疗效果将会得到重要应用。

(2)本发明为二氢青蒿素开发成为化疗药物增敏剂提供药效学及其作用机制的研究依据，具有将青蒿素类药物开发成为肿瘤靶向治疗药物的价值。

(3)本发明初步探讨二氢青蒿素增强化疗药物抗肿瘤疗效的给药方案研究，为临床联合化疗方案合理化给药提供药理学依据。

附图说明

图1a为二氢青蒿素(DHA)与环磷酰胺(CTX)联合治疗方案I肿瘤生长曲线。

图1b为DHA与CTX联合治疗方案II肿瘤生长曲线。

图2a为DHA与CTX联合治疗方案I肿瘤实体图。

图2b为DHA与CTX联合治疗方案II肿瘤实体图。

图3为DHA联合CTX对荷瘤小鼠肿瘤重量的影响

图4a为DHA与CTX联合治疗方案I小鼠肺组织转移灶实体图。

图4b为DHA与CTX联合治疗方案II小鼠肺组织转移灶实体图。

图5a为DHA与CTX联合治疗方案I肿瘤组织VEGF表达。

图5b为DHA与CTX联合治疗方案II肿瘤组织VEGF表达。

图6为DHA对LLC细胞增殖的影响。

图7为DHA诱导LLC细胞凋亡的形态学观察。

图8a、8b为DHA诱导LLC细胞凋亡的流式细胞术定量分析。

图9为DHA对LLC细胞KDR/flk-1蛋白表达的影响。

具体实施方式

本发明结合具体实施例和附图作进一步的说明。应理解，这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。就作用机制而言，二氢青蒿素适用于一切依赖血液供应才能生长的实体瘤(如胃癌、肝癌、肠癌和乳腺癌等)，以及血液肿瘤(白血病、多发性骨髓瘤等)的治疗。

实施例1：二氢青蒿素增强环磷酰胺对Lewis肺癌生长和转移的治疗作用

试验材料：二氢青蒿素片剂(浙江华立南湖制药有限公司)，LLC(LewisLung Carcinoma)细胞株(中科院上海细胞生物学研究所提供)，C57BL/6小鼠100只，雄性，体重20±2g，6～8周龄(中科院上海实验动物中心提供)，免疫组化Elivision^TM plus广谱试剂盒(KIT-9901/9902/9903)(福州迈新生物技术有限公司)，鼠抗人VEGF单克隆抗体(Santa Cruz公司)。

方法：

(1)Lewis肺癌生长和转移模型建立及给药方案

用含10％小牛血清的DMEM培养液培养小鼠LLC细胞，于37℃、5％CO₂细胞培养箱中孵育，待长满70-90％面积后传代。取对数生长期细胞，用无血清培养液调整细胞浓度至1×10⁷ml^-1，在6-8周龄雄性C57BL/6小鼠背部皮下接种，0.2ml/只，共两只。待肿瘤长至500mm³大小，处死小鼠，无菌条件下取出瘤块并切割成约1mm³大小，用套管针接种到新的6-8周龄雄性C57BL/6小鼠右前肢腋下，共100只。

接种后随机分为10组，每组10只，按环磷酰胺开始给药时间不同，应用两个给药方案：

给药方案I：溶剂对照组每天生理盐水灌胃，二氢青蒿素在接种后次日开始给药，每日1次，连续25次；环磷酰胺在接种后第5日开始给药，隔日1次，连续5次。参见表1。

给药方案II，溶剂对照组每天生理盐水灌胃，二氢青蒿素在接种后次日开始给药，每日1次，连续25次；环磷酰胺在接种后第7日开始给药，隔日1次，连续5次。参见表2。

表1.二氢青蒿素增强环磷酰胺对Lewis肺癌治疗作用动物实验给药方案I

组别	动物数(只)	剂量×给药次数
				DHA(mg/kg，qd，ig)×25	CTX(mg/kg，qod，ip)×5
		溶剂对照DHACTX(d5-13)DHA+CTX(d5-13)DHA+CTX(d5-13)DHA+CTX(d5-13)	101010101010			-100-50100200	--50505050

表2.二氢青蒿素增强环磷酰胺对Lewis肺市癌治疗作用动物实验给药方案II

组别	动物数(只)	剂量×给药次数
				DHA(mg/kg，qd，ig)×25	CTX(mg/kg，qod，ip)×5
		溶剂对照DHACTX(d7-15)DHA+CTX(d7-15)DHA+CTX(d7-15)DHA+CTX(d7-15)	101010101010			-100-50100200	--50505050

两个给药程序均于末次给药24h后，处死小鼠，取出瘤块，取肺部用Bouin’s液固定。

(2)肿瘤体积变化及药物的毒副作用

给药期间观察小鼠的一般情况及移植瘤生长情况，每3天测定一次肿瘤体积。测定方法为用游标卡尺测量肿瘤长轴(a)、短轴(b)，根据公式V＝0.5ab²计算肿瘤体积，绘制肿瘤体积增长曲线，同时测定小鼠体重。小鼠处死后，剖取肿瘤组织称重，并计算抑瘤率：抑瘤率＝1-(用药组平均瘤重/对照组平均瘤重)×100％。

(3)对肿瘤肺转移的治疗作用

治疗结束后处死小鼠，剖取肺组织固定于Bouin’s液，24h后检测肺表面肿瘤转移灶，肺组织呈黄色，肿瘤转移灶呈白色***。

(4)协同作用评价标准

合并用药效果按金氏公式评价：q＝Ea₊b/(Ea+Eb-Ea·Eb)，其中Ea₊b为两药合用的抑制率，Ea和Eb为各药单用时的抑制率，当q＜1.15时表示两药合用有拮抗作用，q＞1.15时，表示两药有协同作用。

(5)免疫组织化学

上述肿瘤组织取出后用多聚甲醛固定，经常规处理后制成5μm厚石蜡切片，后免疫组化，步骤按福州迈新生物技术有限公司的即用型第二代免疫组化Elivision^TM plus光谱试剂盒中提供的操作说明进行。DAB显色，梯度乙醇脱水，中性树胶封片。一抗采用鼠抗人VEGF单克隆抗体(1∶50稀释)，阴性对照组采用PBS代替特异性一抗。以棕黄色的强弱程度为观察指标。

结果

(1)抑制肿瘤生长

在小鼠Lewis肺癌移植瘤动物模型中，二氢青蒿素联合环磷酰胺用药各组的肿瘤生长速度缓慢(图1a，1b)，在治疗结束后肿瘤重量较溶剂对照组明显减少(p＜0.05)(图2a，b)。二氢青蒿素联合环磷酰胺对Lewis肺癌有较好的治疗作用：按给药方案I，50mg/kgDHA+50mg/kgCTX(d5-13)给药组、100mg/kgDHA+50mg/kgCTX(d5-13)给药组、200mg/kgDHA+50mg/kgCTX(d5-13)给药组平均瘤重分别为1.33±1.02g，0.84±0.48g，0.65±0.45g；三个剂量组的平均瘤重与溶剂对照组(2.69±1.62g)、单用二氢青蒿素组(1.67±1.22g)、单用环磷酰胺(d5-13)组(2.16±1.06g)相比均呈明显抑制(p＜0.05)。按给药方案II，50mg/kgDHA+50mg/kgCTX(d7-15)给药组、100mg/kgDHA+50mg/kgCTX(d7-15)给药组、200mg/kgDHA+50mg/kgCTX(d7-15)给药组平均瘤重分别为1.13±0.51g，0.49±0.28g，0.45±0.22g，三个剂量组的平均瘤重与溶剂对照组(2.69±1.62g)、单用二氢青蒿素组(1.67±1.22g)、单用CTX(d7-15)组(1.94±0.69g)相比均呈更明显抑制(p＜0.05)。表明二氢青蒿素确实能增强环磷酰胺对Lewis肺癌的治疗作用。同时在相同剂量的二氢青蒿素和环磷酰胺合用组，由于联合给药的时间点不同表现出对肿瘤生长抑制作用的不同，100mg/kgDHA+50mg/kgCTX(d5-13，给药方案I)的肿瘤重量与100mg/kgDHA+50mg/kgCTX(d7-15，给药方案II)的肿瘤重量相比以给药方案II的抑瘤作用更明显，同样200mg/kgDHA+50mg/kg CTX(d5-13，给药方案I)的肿瘤重量与200mg/kgDHA+50mg/kgCTX(d7-15，给药方案II)的肿瘤重量相比以给药方案II的抑瘤作用更明显(p＜0.05)(图3，表3)。

图1a中：●溶剂对照组，○ DHA(100mg/kg)单用组，▲CTX(50mg/kg，d5-13)单用组，△DHA(50mg/kg)+CTX(50mg/kg，d5-13)联合用药组，■DHA(100mg/kg)+CTX(50mg/kg，d5-13)联合用药组，□DHA(200mg/kg)+CTX(50mg/kg，d5-13)联合用药组。

图1b中：●溶剂对照组，○ DHA(100mg/kg)单用组，▲CTX(50mg/kg，d7-15)单用组，△DHA(50mg/kg)+CTX(50mg/kg，d7-15)联合用药组，■DHA(100mg/kg)+CTX(50mg/kg，d7-15)联合用药组，□DHA(200mg/kg)+CTX(50mg/kg，d7-15)联合用药组。

图2a中：(A)溶剂对照组，(B)DHA(100mg/kg)单用组，(C)CTX(50mg/kg，d5-13)单用组，(D)DHA(50mg/kg)+CTX(50mg/kg，d5-13)联合用药组，(E)DHA(100mg/kg)+CTX(50mg/kg，d5-13)联合用药组，(F)DHA(200mg/kg)+CTX(50mg/kg，d5-13)联合用药组。

图2b中：(A)溶剂对照组，(B)DHA(100mg/kg)单用组，(C)CTX(50mg/kg，d7-15)单用组，(D)DHA(50mg/kg)+CTX(50mg/kg，d7-15)联合用药组，(E)DHA(100mg/kg)+CTX(50mg/kg，d7-15)联合用药组，(F)DHA(200mg/kg)+CTX(50mg/kg，d7-15)联合用药组。

图3中：(A)溶剂对照组，(B)DHA(100mg/kg)单用组，(C)CTX(50mg/kg，d5-13)单用组，(D)DHA(50mg/kg)+CTX(50mg/kg，d5-13)联合用药组，(E)DHA(100mg/kg)+CTX(50mg/kg，d5-13)联合用药组，(F)DHA(200mg/kg)+CTX(50mg/kg，d5-13)联合用药组，(G)CTX(50mg/kg，d7-15)单用组，(H)DHA(50mg/kg)+CTX(50mg/kg，d7-15)联合用药组，(I)DHA(100mg/kg)+CTX(50mg/kg，d7-15)联合用药组，(J)DHA(200mg/kg)+CTX(50mg/kg，d7-15)联合用药组。

(2)协同治疗作用

根据金氏公式评价二氢青蒿素和环磷酰胺合用的联合治疗效果，单用100mg/kg二氢青蒿素组(DHA)的抑瘤率为37.75％，接种后第五天开始单用50mg/kg环磷酰胺(d5-13)组的抑瘤率为19.76％，合用组100mg/kgDHA+50mg/kgCTX(d5-13)的抑瘤率为68.89％，得q值为1.38；接种后第七天开始单用50mg/kg环磷酰胺(d7-15)组的抑瘤率为27.97％，合用组100mg/kgDHA+50mg/kgCTX(d7-15)的抑瘤率为81.71％，得q值为1.48，表明在两个给药程序下合用二氢青蒿素和环磷酰胺均有较好的协同作用，且以接种后第七天开始合用环磷酰胺(给药方案II)的协同作用更好。

(3)药物的毒副作用

用药期间，各组荷瘤小鼠活动良好，未见特殊不良反应，无一例死亡。用药25天后溶剂对照组及单用二氢青蒿素(100mg/kg)的去瘤体重分别为22.05±1.91g，22.15±1.59g，接种后第5天开始单用环磷酰胺(50mg/kg)组去瘤体重为22.55±2.32g，环磷酰胺在接种后第5天开始和50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg二氢青蒿素合用的各组小鼠去瘤体重分别为21.89±1.47g、20.72±0.89g、21.58±1.17g，接种后第7天开始单用环磷酰胺(50mg/kg)组去瘤体重为22.82±2.17g，环磷酰胺在接种后第7天开始和50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg二氢青蒿素合用的各组小鼠去瘤体重分别为22.03±1.32g、21.21±0.58g、21.80±1.00g。比较去瘤小鼠体重，各治疗组与溶剂对照组均无显著差异(p＞0.05，表3)。

表3、二氢青蒿素联合环磷酰胺对荷瘤小鼠肿瘤重量及小鼠去瘤体重的影响

组别	动物数(只)	剂量×给药次数		去瘤体重(g)	瘤重(g)	抑瘤率(％)
							DHA(mg/kg，qd，ig)×25	CTX(mg/kg，qod，ip)×5

溶剂对照DHACTX(d5-13)DHA+CTX(d5-13)DHA+CTX(d5-1 3)DHA+CTX(d5-13)CTX(d7-15)DHA+CTX(d7-15)DHA+CTX(d7-15)DHA+CTX(d7-15)

10101010101010101010

--100--50100200--50100200

----5050505050505050

22.05±1.9122.15±1.5922.55±2.3221.89±1.4720.72±0.8921.58±1.1722.82±2.1722.03±1.3221.21±0.5821.80±1.00

2.69±1.621.67±1.22^**2.16±1.061.33±1.02^**▲▲▲0.84±0.48^{***#▲▲▲}0.65±0.45^{***##▲▲▲}1.94±0.691.13±0.51^**▲▲▲0.49±0.28^{**##▲▲▲}0.45±0.22^{**##▲▲▲}

37.7519.7650.5468.8975.9327.9758.0081.7184.60

^*，p＜0.05；^**，p＜0.01 vs溶剂对照.^#，p＜0.05；^##，p＜0.01 vs DHA.^▲▲，p＜0.01；^▲▲▲，p＜0.001 vs CTX.

(4)对荷瘤小鼠肺转移的影响

在皮下移植瘤模型中，发现溶剂对照组小鼠大部分出现自发性肺转移，单用DHA、CTX组肺表面转移灶数较溶剂对照组有不同程度下降，二氢青蒿素联合环磷酰胺治疗则可以完全抑制肿瘤自发性肺转移(图4a，b，表4)。

表4二氢青蒿素联合环磷酰胺对荷瘤小鼠肿瘤自发性肺转移的影响

组别	剂量×给药次数		转移发生比例	平均转移灶
					DHA(mg/kg，qd，ig)×25	CTX(mg/kg，qod，ip)×5
	ControiDHACTX(d5-13)DHA+CTX(d5-13)DHA+CTX(d5-13)DHA+CTX(d5-13)CTX(d7-15)DHA+CTX(d7-15)DHA+CTX(d7-15)DHA+CTX(d7-15)	--100--50100200--50100200					----5050505050505050	8/104/104/100/100/100/104/100/100/100/10	10.11.11.30001.0000

图4a中：(A)溶剂对照组，(B)DHA(100mg/kg)单用组，(C)CTX(50mg/kg，d5-13)单用组，(D)DHA(50mg/kg)+CTX(50mg/kg，d5-13)联合用药组，(E)DHA(100mg/kg)+CTX(50mg/kg，d5-13)联合用药组，(F)DHA(200mg/kg)+CTX(50mg/kg，d5-13)联合用药组。

图4b中：(A)溶剂对照组，(B)DHA(100mg/kg)单用组，(C)CTX(50mg/kg，d7-15)单用组，(D)DHA(50mg/kg)+CTX(50mg/kg，d7-15)联合用药组，(E)DHA(100mg/kg)+CTX(50mg/kg，d7-15)联合用药组，(F)DHA(200mg/kg)+CTX(50mg/kg，d7-15)联合用药组。

(5)二氢青蒿素下调肿瘤组织中VEGF蛋白表达

免疫组织化学检测肿瘤组织VEGF蛋白的表达，以细胞内棕黄色强弱来判断肿瘤细胞内VEGF表达量的变化。结果显示，溶剂对照组表现为较强至中等的棕黄色，与溶剂对照组相比，二氢青蒿素单用组及二氢青蒿素与环磷酰胺联合治疗各组的肿瘤细胞内棕黄色明显减弱(图5a，b)。图5a中(A)溶剂对照组，(B)DHA(100mg/kg)单用组，(C)CTX(50mg/kg，d5-13)单用组，(D)DHA(50mg/kg)+CTX(50mg/kg，d5-13)联合用药组，(E)DHA(100mg/kg)+CTX(50mg/kg，d5-13)联合用药组，(F)DHA(200mg/kg)+CTX(50mg/kg，d5-13)联合用药组。图5 b中(A)溶剂对照组，(B)DHA(100mg/kg)单用组，(C)CTX(50mg/kg，d7-15)单用组， (D)DHA(50m/gkg)+CTX(50mg/kg，d7-15)联合用药组，(E)DHA(100mg/kg)+CTX(50mg/kg，d7-15)联合用药组，(F)DHA(200mg/kg)+CTX(50mg/kg，d7-15)联合用药组。

实施例2：二氢青蒿素体外诱导Lewis肺癌(LLC)细胞凋亡以及下调VEGF受体KDR/flk-1表达

二氢青蒿素：广西桂林制药厂惠赠

方法：

(1)MTT法检测细胞增殖

5×10⁴ml^-1LLC细胞接种于96孔板，以DMSO作为溶剂对照，用不同浓度二氢青蒿素作用48h后，MTT法检测，用酶标仪在570nm波长下测定吸光度(A_570nm)值，计算细胞增殖率，细胞增殖率(％)＝实验组A_570nm/溶剂对照组A_570nm×100％。采用IC₅₀计算软件计算二氢青蒿素抑制LLC细胞增殖的IC₅₀值，用SPSS10.0统计软件计算95％的置信区间。

(2)形态学检测细胞凋亡

LLC细胞接种于24孔板，加入不同浓度的二氢青蒿素作用48 h后，用无血清培养液洗两次，加入吖啶橙100mg·L^-1和溴化乙啶100mg·L^-1于暗室混合染色5min，荧光倒置显微镜下观察细胞形态。

(3)流式细胞仪测定细胞凋亡率和细胞周期

LLC细胞经过二氢青蒿素作用48 h后，离心收集，经PBS清洗2次，调整胞数至1×10⁶mL^-1，然后缓慢滴入70％冰冷乙醇固定细胞，置4℃过夜，己固定的细胞经PBS离心洗涤2次，加入50mg·L^-1碘化丙啶，0.1％Triton-X100，37g·L^-1 EDTA，50mg·L^-1Rnase A，室温下避光进行DNA染色30min，过300目尼龙网筛，24h内上流式细胞仪测定。采用Cell Quest 3.1f软件(美国Becton Dickinson)获取直方图，ModFit 3.0软件(美国Becton Dickinson)计算细胞凋亡率及分析细胞周期相分布。

(4)Western-blot法定量分析KDR/flk-1的表达

LLC细胞经不同浓度的二氢青蒿素作用48h后，离心收集，裂解细胞提取蛋白，用Bradford法测定蛋白浓度，在12％SDS-PAGE上进行电泳，每个泳道上总蛋白50μg。电泳后蛋白条带转移至PVDF膜上，膜用含5％脱脂奶粉的TPBS室温封闭1h，鼠抗人flk-1多克隆抗体(1∶500稀释)4℃放置过夜，经TPBS洗膜，辣根过氧化物酶标记的二抗室温作用1h(1∶5000稀释)，TPBS洗膜，采用ECL法对目标条带进行检测。采用同一张膜通过抗体的洗脱，重新对β-actin的蛋白条带进行检测，作为内参。

结果：

(1)抑制LLC细胞增殖

MTT实验分析表明，用二氢青蒿素处理48h后，LLC细胞增殖被明显抑制，且随药物浓度增加其抑制率呈递增趋势，二氢青蒿素抑制LLC细胞增殖的IC₅₀值为53.14μmol·L^-1，95％置信区间为48.69-58.18μmol·L^-1。以上结果表明，二氢青蒿素对LLC增殖有明显抑制作用，且呈浓度依赖性，参见图6，图中DHA对LLC细胞增殖的半数抑制浓度(IC₅₀)＝53.14μmol·L^-1，95％置信区间为48.69-58.18μmol·L^-1。

(2)二氢青蒿素诱导LLC细胞凋亡的形态学观察

LLC细胞经吖啶橙/溴化乙啶双染色后，荧光显微镜下可见，溶剂对照组细胞核呈现密度均匀的绿色荧光，表现为正常细胞的染色特征，而经二氢青蒿素作用48h后，细胞呈现出典型的凋亡形态学改变如染色质高度凝集，边缘化等，荧光观察可见橙色荧光增强，呈致密块状分布，并出现凋亡小体，参见图7，图7中：(A)溶剂对照组，(B)DHA 20μmol·L^-1，(C)DHA 40μmol·L^-1，(D)DHA 80μmol·L^-1。

(3)二氢青蒿素诱导的LLC细胞凋亡的流式定量分析

经流式细胞仪分析，根据PI荧光直方图显示，LLC细胞经20μmol·L^-1二氢青蒿素作用48h后，细胞凋亡百分率有明显增加，经40，80μmol·L^-1二氢青蒿素作用48h后，G1峰前出现了代表凋亡细胞的亚二倍体峰，细胞凋亡率分别上升至9.82％和13.86％(图8a，b)。其中图8a中：(A)溶剂对照组，(B)DHA20μmol·L^-1，(C)DHA 40μmol·L^-1，(D)DHA 80μmol·L^-1。

(4)二氢青蒿素抑制LLC细胞KDR/flk-1的表达

LLC细胞经不同浓度二氢青蒿素处理后，提取蛋白，Western-blot方法检测细胞内KDR/flk-1蛋白的表达，结果表明，随着药物浓度的增加，细胞KDR/flk-1蛋白的表达量依次下降。40、80μmol·L^-1二氢青蒿素浓度组细胞KDR/flk-1的蛋白表达量分别降为溶剂对照组的33.8％和12.6％，与溶剂对照组相比存在显著性差异(p＜0.001)，结果参见图9。

Claims

1.二氢青蒿素在制备增强化疗药物抗肺癌疗效药物中的应用，所述二氢青蒿素的分子式为C₁₅H₂₄O₅，其特征是：二氢青蒿素作为一种靶向肿瘤血管生成抑制剂在制备增强化疗药物抗肺癌疗效药物中的应用，其中化疗药物为环磷酰胺。