CN103251585A - 青蒿素及其衍生物在抑制血小板衍生生长因子受体a中的作用及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及青蒿素及其衍生物在抑制血小板衍生生长因子受体A中的作用及其应用，具体地，青蒿素及其衍生物直接作用于肿瘤的分子靶标血小板衍生生长因子受体A(PDGFRα)，与细胞膜上的PDGFRα结合，抑制PDGFRRα胞内段的酪氨酸激酶的活化，抑制PDGFRα的蛋白稳定性，促进泛素依赖的蛋白酶体介导的降解过程，对于高表达PDGFRα的肿瘤细胞具有剂量依赖的细胞生长抑制和迁移侵袭抑制作用，也可以抑制信号通路PI3K/AKT和MAPK/ERK的活化。

Description

青蒿素及其衍生物在抑制血小板衍生生长因子受体A中的作用及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体地，本发明涉及青蒿素及其衍生物在抑制血小板衍生生长因子受体A中的作用及其应用。

背景技术

青蒿又名黄花蒿(Artemisia anaua L)，属菊科，是一年生草本植物。青蒿素是我国药学工作者于20世纪70年代初从中药青蒿中提取的倍半萜内酯类抗疟药物。鉴于传统的奎宁类药物普遍遇到抗药性问题，青蒿素和它的衍生物目前已取代它们，成为世界上抗疟疾的主流药物。青蒿素的大环上有一个内过氧化物桥，在亚铁离子或亚铁血红素的催化下，会放出以碳为中心的自由基。细胞内的蛋白质和核酸被这些自由基烷化后死亡。疟原虫寄生在红血球内，含有大量来自血红蛋白的亚铁血红素，因而青蒿素很易被活化，进而将疟原虫杀死。青蒿素和它的衍生物，如二氢青蒿素，蒿甲醚，蒿***及青蒿琥酯等已广泛应用于疟疾治疗，更多的青蒿素衍生物正在研制中。

青蒿素及其衍生物的抗疟活性已得到世界公认，具有起效快、药效高、毒副作用低等优点。除广泛应用于抗疟治疗外，青蒿素类药物还具有其它多种药理作用，如抗血吸虫作用、抗心律失常、平喘、抗内毒素、抗***反应、抗红斑狼疮、免疫抑制等作用。

随着对青蒿素及其衍生物活性研究的不断深入，人们发现，该类化合物对多种肿瘤细胞的生长具有抑制作用和良好的治疗效果，然而，其具体作用靶点及相关信号通路及作用机制还不明确。因此本领域迫切需要了解青蒿素及其衍生物在一直肿瘤中的作用。

发明内容

本发明的目的是提供青蒿素及其衍生物在抑制血小板衍生生长因子受体A中的作用。

本发明的另一目的是提供青蒿素及其衍生物作为血小板衍生生长因子受体A抑制剂/拮抗剂的应用。

本发明的另一目的是提供体外***的方法。

在本发明的第一方面，提供了一种青蒿素及其衍生物用于制备抑制选自下组疾病的药物或药物增敏剂的用途：PDGFRα阳性肿瘤、血管性疾病、或纤维性病变。

在另一优选例中，所述的PDGFRα阳性肿瘤细胞为PDGFRα阳性卵巢癌细胞或PDGFRα阳性肝癌细胞。

在本发明的第二部分，提供了一种青蒿素及其衍生物的用途，用于制备血小板衍生生长因子受体A(PDGFRα)的抑制剂或拮抗剂。

在另一优选例中，所述的血小板衍生生长因子受体A(PDGFRα)来自于人。

在另一优选例中，所述的抑制剂或拮抗剂还用于：

(i)抑制PDGFRα酪氨酸激酶的活化；和/或

(ii)抑制PDGFRα的蛋白稳定性；和/或

(iii)促进PDGFRα泛素依赖的蛋白酶体介导的降解；和/或

(vi)抑制PDGFRα阳性肿瘤细胞信号通路PI3K/AKT和MAPK/EPK的活化。

在另一优选例中，所述的青蒿素衍生物选自下组：蒿甲醚、二氢青蒿素、青蒿琥酯、双氢蒿甲醚、蒿***等。

在另一优选例中，所述的青蒿素衍生物为二氢青蒿素。

在本发明的第三方面，提供了一种体外非治疗性地抑制血小板衍生生长因子受体A(PDGFRα)活性的方法，包括步骤：将青蒿素和/或青蒿素衍生物与细胞接触，从而抑制或拮抗细胞中血小板衍生生长因子受体A(PDGFRα)。

在另一优选例中，所述的接触是在青蒿素和/或青蒿素衍生物存在下，培养所述细胞。

在另一优选例中，所述的细胞包括肿瘤细胞，较佳地包括PDGFRα阳性肿瘤细胞，更佳地包括PDGFRα阳性卵巢癌细胞或肝癌细胞，如卵巢癌细胞A2780、卵巢癌细胞OVCAR3、肝癌细胞Hep3B。

在另一优选例中，所述方法还用于至少以下一种应用：

体外非治疗性地抑制PDGFRα酪氨酸激酶的活化；

体外非治疗性地抑制PDGFRα的蛋白稳定性；

体外非治疗性地促进PDGFRα泛素依赖的蛋白酶体介导的降解；

体外非治疗性地抑制信号通路PI3K/AKT和MAPK/EPK的活化；和

体外非治疗性抑制PDGFRα阳性肿瘤细胞的生长。

在本发明的第四方面，提供了一种制剂组合的用途，所述制剂组合包括：

(I)含青蒿素和/或青蒿素衍生物的制剂；和

(II)含吉西他宾或卡铂的制剂，

所述制剂组合用于制备：

(a)抑制血小板衍生生长因子受体A的药物组合物或药盒；或

(b)预防和/或***的药物组合物或药盒。

在另一优选例中，所述制剂包括：片剂、胶囊、栓剂、注射剂。

在另一优选例中，所述肿瘤为PDGFRα阳性肿瘤。

在本发明的第五方面，提供了一种预防和/或治疗PDGFRα相关疾病的方法，其中所述疾病与PDGFRα的过表达或活性过高有关，所述方法包括步骤：给需要的对象施用青蒿素和/或青蒿素衍生物，或施用含青蒿素和/或青蒿素衍生物的药物组合物。

在另一优选例中，所述的PDGFRα相关疾病包括肿瘤(PDGFRα阳性肿瘤)，如卵巢癌或肝癌。

在另一优选例中，PDGFRα阳性肿瘤为PDGFRα阳性卵巢癌或PDGFRα阳性肝癌。

在另一优选例中，所述的施用包括：瘤内、静脉注射、口服片剂、腹腔注射等。

在另一优选例中，所述的对象为哺乳动物。

在本发明的第六方面，提供了一种方法，所述方法用于体内或体外抑制PDGFRα酪氨酸激酶的活化、抑制PDGFRα的蛋白稳定性、促进PDGFRα泛素依赖的蛋白酶体介导的降解、抑制信号通路PI3K/AKT和MAPK/EPK的活化、和/或抑制PDGFRα阳性肿瘤细胞的生长、迁移和侵袭，所述方法包括步骤：给需要的对象施用青蒿素和/或青蒿素衍生物。

在本发明的第七方面，提供了一种用于卵巢癌病理分级的试剂盒，所述试剂盒包含检测离体组织PDGFRα表达量的试剂。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。

图1显示PDGFRα可以作为青蒿素及其衍生物的直接作用靶标；其中，图1a为体外激酶实验，结果显示，青蒿素及其衍生物青蒿素(ART)、二氢青蒿素(DHA)、青蒿琥酯(ARM)、蒿甲醚(ARS)可以抑制PDGFRα胞内端(aa550-末端)酪氨酸激酶的活性；图1b为表面等离子共振(SPR)实验，结果显示，双氢青蒿素(DHA)可以与PDGFRα包外端(aa24-524)蛋白相互结合，索拉菲尼(Sorafenib)为阳性对照，已知其可以结合抑制PDGFRα的活性；图1c为生物素-亲和素亲和纯化实验，结果显示，标记生物素的DHA可以与A2780细胞内PDGFRα相互结合，从而被亲和纯化出来；图1d为计算机辅助同型模建及反向对接实验(ComputerAssisted Homology modeling and docking)，结果显示，双氢青蒿素(DHA)可以嵌合到PDGFRα包外端PDGF结合位点，同时也可嵌合到其包内端ATP结合位点，阻断其激酶激活；图1e-图1f显示双氢青蒿素能够有效抑制PDGFRα阳性细胞A2780和OVCAR3中PDGFRα的活性和蛋白表达，而对PDGFRβ的磷酸化和蛋白水平影响不大；图1g-图1i显示双氢青蒿素可以加速PDGFRα的蛋白降解，这一过程是泛素依赖的蛋白酶体介导的。

图2显示了青蒿素及其衍生物具有抑制PDGFRa阳性的卵巢癌细胞的生长和迁移能力；其中，图2a显示，给予药物刺激48h后，青蒿素及其衍生物对人正常卵巢上皮细胞IOSE144无明显的生长抑制能力，对于SK-OV3细胞毒性较小，但对于PDGFRa阳性的A2780和OVCAR3具有较强抑制能力，其中青蒿素和二氢青蒿素的作用最为显著；图2b为细胞迁移实验，结果显示，低浓度短时间处理(12h)卵巢癌细胞，青蒿素及其衍生物能够有效地抑制PDGFRa阳性细胞A2780的迁移能力，而对于PDGFRa阴性的细胞SK-OV3无明显抑制能力；图2c显示了不同浓度的双氢青蒿素对5种细胞系(IOSE144、A2780、OVCAR3、OVCAR5、SK-OV3)的细胞抑制作用；图2d显示了不同浓度的双氢青蒿素对3种细胞系(A2780、OVCAR3、SK-OV3)的细胞迁移的影响；图2e显示了不同浓度的双氢青蒿素对2种细胞系(A2780、OVCAR3)的细胞侵袭的影响。

图3显示青蒿素及其衍生物具有抑制PDGFRa阳性的肝癌细胞的生长和迁移能力；其中，图3a显示，在人正常的肝细胞系(7702和LO2)和肝癌细胞系(Hep3B、HepG2、7721、7404、LM3、97L、97M、Huh-7)中，只有Hep3B高表达PDGFRa；图3b显示，低浓度双氢青蒿素(3μM)短时(12h)处理Hep3B细胞，能够显著抑制其迁移和侵袭能力；图3c为细胞生长实验，结果显示，PDGFRa阳性的Hep3B细胞对于双氢青蒿素更敏感，而其他细胞对于双氢青蒿素敏感程度较低。

图4显示双氢青蒿素能抑制小鼠原位卵巢癌模型的生长和转移；其中，图4a显示双氢青蒿素给予治疗小鼠，能有有效地抑制卵巢癌的恶性进展；图4b显示，与对照组相比，双氢青蒿素治疗组小鼠的肺癌转移的情况大大降低，且随着药量的增加，治疗情况越好；图4c显示不同浓度的双青青蒿素给予治疗小鼠，肿瘤腹腔播散的情况(肺脏、肝脏、肠)得到明显的抑制；图4d为免疫组化实验，结果显示，双氢青蒿素处理的细胞其形态转换过程(EMT)得到抑制；图4e为免疫印迹实验，结果显示，双氢青蒿素能够有效抑制PDGFRa的表达和磷酸化，下游信号通路PI3K/AKT和MAPK-ERK得以抑制。

图5显示了青蒿素及其衍生物与一线化疗药的增敏作用；其中，图1a为HepG2和Hep3B细胞用青蒿素或双氢青蒿素单独处理或联合吉西他宾处理实验，结果显示，吉西他宾单独作用于HepG2和Hep3B细胞，具有一定的凋亡促进作用，青蒿素联合吉西他宾对HepG2和Hep3B细胞都具有显著凋亡促进作用作用，两药联合表现出协同作用；图5b显示，DHA和CBP联合用药24小时后对OVCAR-3细胞凋亡有增效促进作用，用1μM的DHA联合500μM CBP(1155％)作用后的细胞凋亡率显著高于单独用1μM DHA(266％)或500μM CBP(528％)的细胞凋亡率，而且超过了两种化合物的凋亡累加效应，是一种增效作用，A2780细胞对联合治疗显示了累加效应；图5c显示，当与DHA联用时，CBP显著抑制了卵巢癌细胞的活力，当细胞暴露于1μM CBP和1μM DHA时，A2780细胞的存活率就降低了69％，而OVCAR-3细胞存活则减少了72％，相比之下，IOSE144细胞则显得对治疗较不敏感，两种药物均以1μM合用时存活率只降低了约28％；图5d为肝癌细胞Hep3B和HepG2裸鼠移植瘤实验，结果显示，青蒿素和双氢青蒿素单药体内均具有抗肿瘤作用，双氢青蒿素的抑癌作用强于青蒿素，青蒿素及双氢青蒿素均能增加吉西他宾的抑癌作用，联合吉西他宾治疗效果优于单药，尤其是双氢青蒿素表现出显著的化疗致敏作用；图5e为在卵巢癌细胞A2780和OVCAR3裸鼠移植瘤实验中，结果显示，DHA(剂量为10和25mg/kg)分别导致A2780异体移植肿瘤24％和41％的生长抑制(与给生理盐水的对照组相比)(P＜0.05)，OVCAR-3模型14％和37％肿瘤生长抑制(P＜0.05)；只给单一CBP的治疗组肿瘤生长被抑制了56％(A2780)和46％(OVCAR-3)，联合用药(25mg/kgDHA)组则在A2780和OVCAR-3动物肿瘤中均产生70％肿瘤生长抑制(P＜0.05)。

图6显示PDGFRα的表达与卵巢癌病理级别和转移状态的关系；其中，图6a显示，与低级别卵巢癌相比，高级别卵巢癌病例中，肿瘤细胞及周围的***PDGFRα的表达量显著增加；图6b为PDGFRα染色结果，结果显示，在高级别卵巢癌病例中，PDGFRα的表达显著增加。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，发现青蒿素及其衍生物的用途，用于制备血小板衍生生长因子受体A(PDGFRα)的抑制剂或拮抗剂，此外，青蒿素及其衍生物还可以抑制PDGFRα酪氨酸激酶的活化、抑制PDGFRα的蛋白稳定性、促进PDGFRα泛素依赖的蛋白酶体介导的降解、抑制信号通路PI3K/AKT和MAPK/EPK的活化、抑制PDGFRα阳性肿瘤细胞的生长、迁移和侵袭、还可以用于PDGFRα阳性肿瘤治疗的增敏剂。在此基础上完成了本发明。

术语

卵巢癌

卵巢癌是全世界的妇女健康的巨大威胁。在美国，卵巢癌已成为第四位致死性的女性癌症。虽然被诊断于病发早期的卵巢癌患者的5年存活率可以达到80％-90％，但是被诊断为晚期的卵巢癌患者存活率却只有不到25％，此外，大多数卵巢癌患者在诊断出是卵巢癌是已至晚期。目前卵巢癌患者的死亡率在过去的数十年没有发生太大的改变，因此在肿瘤治疗和预后中，寻找有效的治疗方案，增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，和克服肿瘤的耐药性是研究人员和临床实践人员长期以来的目标。

肝癌

肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，我国是肝癌的高发区，其发病率已上升到恶性肿瘤的第二位。由于肝癌早期症状不明显，因此确诊的大多数病人已处于中、晚期。原发性肝癌的首选治疗是手术切除，随着治疗技术的提高，目前术后5年生存率已提高至50％-60％，但由于手术切除只适用直径不超过5cm、癌灶数目不超过3个的小肝癌。此外，是否适合直接手术切除还取决于癌灶部位的血管富集程度及病人个体差异，这些限制导致90％左右的肝癌不适合手术治疗。即使是可切除肝癌，术后实施以介入化疗为主的综合性治疗也是必要的。然而目前，鲜有药物能够有效抑制肝癌的生长和进一步恶化，肝癌对传统化疗药物的反应率低，毒副作用非常显著，因此化疗的缓慢发展是制约抗肿瘤药物临床应用的主要原因。因此对于肿瘤化疗来说，迫切需要寻求更好的化疗增效剂和更好的治疗方案，从而提高肿瘤对化疗的敏感度，降低其对化疗的耐药性。

血小板衍生生长因子及其受体

血小板衍生生长因子(Platelet derived growth factor，PDGF)是一类能够合成并分泌到细胞外基质中的生长因子，具有促进纤维细胞、平滑肌细胞等多重组织的细胞***、增殖、迁移、增加细胞的黏附能力，在人胚胎发育和正常生理活动中发挥着重要作用。PDGF以自分泌和旁分泌形式激活血小板衍生生长因子受体(PDGFR)而发挥作用。

PDGFR包含两种结构类似的酪氨酸激酶受体PDGFRα和PDGFRβ，其中PDGFRα的异常激活与多重疾病密切相关，具体地，PDGFR相关疾病可以分为三类：

1.肿瘤

由于PDGFR(特别是PDGFRα)存在于多种肿瘤中，它可能作为一个新的治疗靶点。已经发现，多种肿瘤的发生与PDGFR(特别是PDGFRα)的过度激活相关，如卵巢癌、神经胶质瘤、***癌；此外，在一些肿瘤中存在PDGFR的突变激活，如隆突性皮肤纤维肉瘤、胃肠道间质瘤、Bcr-Abl阴性的慢性髓样白血病、嗜酸细胞增多综合征等等。

2.血管性疾病

研究发现，PDGF及PDGFR等在多种血管性疾病中存在过量表达和过度激活现象，如动脉粥样硬化和再狭窄、肺动脉高压、视网膜血管病变等，抑制PDGFR信号通路的激活可以有效缓解上述疾病的症状，增加其治疗效果。

3.纤维性病变

PDGF-PDGFR信号通路在多种纤维性病变过程中发挥重要的作用，如肺纤维化、肝纤维化和肝硬化、皮肤纤维增生(硬皮病)、肾纤维化、心肌纤维化等等，其中PDGF-PDGFR信号通路介导的***的增殖是该慢性炎症的共同特征。

上述三类疾病中，PDGF-PDGFR信号通路发挥重要的作用，其中PDGFRβ主要介导了血管***病变，而PDGFRα主要介导了***和成纤维细胞驱动的病变。(Johanna Andrae，et al.Role of platelet-derived growth factors inphysiology and medicine，Genes Dev.2008；22：1276-1312；张秀华等，血小板源生长因子受体与肿瘤.生命科学，Vol.18，No.3 Jun.，2006)

青蒿素及其衍生物

青篙素是从中药青篙中提取的有过氧基团的倍半萜内酯药物，由于青蒿素是复杂的大分子，化学全人工很难合成，因此目前主要是生物合成和人工提取。

青蒿素等倍半萜类的生物合成在细胞质中进行，途径属于植物类异戊二烯代谢途径，可分为三大步：由乙酸形成FPP，合成倍半萜，再内酯化形成青蒿素，具体为：FPP→4，11-二烯倍半萜→青蒿酸→二氢青蒿酸→二氧青蒿酸过氧化物→青蒿素。

青蒿素和本领域几种常见的青蒿素衍生物的化学式见下：

青蒿素及其衍生物的应用

本发明提供了青蒿素及其衍生物用于制备血小板衍生生长因子受体A(PDGFRα)的抑制剂或拮抗剂的用途。

在另一优选例中，青蒿素及其衍生物还用于：

(i)抑制PDGFRα酪氨酸激酶的活化；和/或

(ii)抑制PDGFRα的蛋白稳定性；和/或

(iii)促进PDGFRα泛素依赖的蛋白酶体介导的降解；和/或

(vi)抑制PDGFRα阳性肿瘤细胞信号通路PI3K/AKT和MAPK/EPK的活化；和/或

(v)抑制PDGFRα阳性肿瘤细胞的生长、迁移和侵袭；和/或

(vi)制备抑制PDGFRα阳性肿瘤的药物或增敏剂；和/或

(vii)制备治疗血管性疾病和纤维性病变的药物或增敏剂。

在本发明的一个优选例中，提供了一种体外非治疗性地抑制血小板衍生生长因子受体A(PDGFRα)活性的方法，包括步骤：将青蒿素和/或青蒿素衍生物与细胞接触，从而抑制或拮抗细胞中血小板衍生生长因子受体A(PDGFRα)。

所述的接触是在青蒿素和/或青蒿素衍生物存在下，培养所述细胞。细胞包括肿瘤细胞，较佳地包括PDGFRα阳性肿瘤细胞，更佳地包括PDGFRα阳性卵巢癌细胞或肝癌细胞，如卵巢癌细胞A2780、卵巢癌细胞OVCAR3、肝癌细胞Hep3B。在另一优选例中，所述方法还用于至少以下一种应用：体外非治疗性地抑制PDGFRα酪氨酸激酶的活化；体外非治疗性地抑制PDGFRα的蛋白稳定性；体外非治疗性地促进PDGFRα泛素依赖的蛋白酶体介导的降解；体外非治疗性地抑制信号通路PI3K/AKT和MAPK/EPK的活化；和体外非治疗性抑制PDGFRα阳性肿瘤细胞的生长。

本发明还提供了一种预防和/或治疗PDGFRα相关疾病的方法，其中所述疾病与PDGFRα的过表达或活性过高有关，所述方法包括步骤：给需要的对象施用青蒿素和/或青蒿素衍生物，或施用含青蒿素和/或青蒿素衍生物的药物组合物。PDGFRα相关疾病包括肿瘤(PDGFRα阳性肿瘤)，如卵巢癌或肝癌。在另一优选例中，所述的施用包括：瘤内、静脉注射、口服片剂、腹腔注射等。所述的对象为哺乳动物(如人)。

药剂组合物及其应用

本发明还提供了药剂组合物，在一个优选例中，所述制剂组合包括：

(I)含青蒿素和/或青蒿素衍生物的制剂；和(II)含吉西他宾或卡铂的制剂，

所述制剂组合用于制备：(a)抑制血小板衍生生长因子受体A的药物组合物或药盒；或(b)预防和/或***的药物组合物或药盒。

所述制剂包括片剂、胶囊、栓剂、注射剂；所述药物制剂用于预防和治疗PDGFRα阳性肿瘤。

本发明的药剂组合物可以是固体或液体。固体制剂包括散剂、片剂、丸剂、胶囊、扁囊剂、栓剂和可分散颗粒剂，固体载体可以是一种或多种物质，它们可以作为稀释剂、矫味剂、黏合剂、防腐剂、片剂崩解剂或包囊材料。在散剂中，载体是微细分的固体，本发明的化合物与微细分的活性组份存在于混合物中。在片剂中，此化合物与所需的粘合载体以适当比例混合，并压制成所需的形状和大小。散剂和片剂中优先含有5至70％活性化合物，适宜的载体是碳酸镁、硬脂酸镁、滑石、糖、乳糖、果胶、糊精、淀粉、明胶、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、低熔点腊和可可脂等。同样，扁囊剂或锭剂、片剂、散剂、胶囊、丸剂、扁囊剂和锭剂可以是适合于口服给药的固体剂型。为了制备栓剂，可以将低熔点腊乳脂肪酸甘油脂或可可脂的混合物熔化，并通过搅拌将此活性化合物组份均匀地分散在其中，然后将熔化的均匀混合物倒入大小合适的模中让其冷却，并由此固化。溶液形式的制剂包括溶液、悬浮剂和乳剂，例如水或含水丙二醇溶液。对于非肠道注射液体制剂，可以在含水聚乙二醇溶液中制备。适于口服的含水溶液可以通过将活性组份溶解于水中，并按照需要加入适宜的着色剂、矫味剂、乳化剂和增稠剂制备。适于口服的含水混悬剂可以通过将微细分的活性组份分散于含水粘性物质中制备，如天然或合成胶、树脂、甲基纤维素、羟甲基纤维素钠及其他熟知的混悬剂。这些液体形式包括溶液、混悬剂和乳剂，除活性组份外，这些制剂可含有着色剂、矫味剂、稳定剂、缓冲剂、合成或天然甜味剂、分散剂、增稠剂和助溶剂等。此药物制剂优先是单位剂型，在此剂型中，此制剂被再分为含适量活性组份的单位剂量，此单位剂量可以是包装的制剂，该包装含有一定量的制剂，如包装的片剂、胶囊和在小瓶或胶囊中的散剂。此单位剂型还可以是胶囊、片剂、扁囊剂或锭剂本身，或其可以存在包装形式中的适当数量的任何这些散剂。

单位剂量制剂中活性组份的量可根据具体的应用和活性组份的效力而变化，对于非人哺乳动物(如小鼠)治疗，可以将0.01mg至约0.5g，较佳地0.1至约3mg的胶囊每天给药三次，必要时该组合物还可以含其他相容的治疗剂。对于人的治疗，可以根据患者的需要、被治疗病症的严重性以及使用的化合物而变化，较佳地，开始以小于该化合物最佳剂量的较小剂量治疗，此后，小量增加此剂量达到最佳效果，方便起见，如果需要可将总日剂量再细分为一天内分次给药。在本发明的一个优选例中，给予人的剂量大约为0.1/kg-0.5g/kg之间。

本发明的主要优点：

(1)青蒿素及其衍生物可以用于制备血小板衍生生长因子受体A(PDGFRα)的抑制剂或拮抗剂；

(2)青蒿素及其衍生物可以抑制PDGFRα酪氨酸激酶的活化、PDGFRα的蛋白稳定性、抑制信号通路PI3K/AKT和MAPK/EPK的活化、抑制PDGFRα阳性肿瘤细胞的生长、迁移和侵袭；

(3)青蒿素及其衍生物可以促进PDGFRα泛素依赖的蛋白酶体介导的降解；

(4)青蒿素及其衍生物可以用于PDGFRα阳性肿瘤治疗的增敏剂。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实验方法和材料

1.表面等离子共振

表面等离子共振(SPR)是一种光学现象，可被用来实时跟踪在天然状态下生物分子间的相互作用。实验中，将重组人PDGFRα胞外端(Met1-Glu524)蛋白，键合在生物传感器表面，将不同浓度的双氢青蒿素溶液和一直与PDGFRα有相互作用的化合物索拉菲尼及SU11248溶液注入并流经生物传感器表面。生物分子间的结合引起生物传感器表面质量的增加，导致折射指数按同样的比例增强，生物分子间反应的变化即被观察到，这种反应用反应单位(RU)来衡量。

2.细胞培养

人卵巢永生化的非致瘤性上皮细胞IOSE-144和卵巢癌细胞(A2780，OVCAR-3，SK-OV3，OVCAR-5)购自美国ATCC(American Type CultureCollection，Manassas，VA)。所有细胞依据ATCC的培养要求(RPMI-1640或DMEM培养液加入10％胎牛血清(GIBCO)、100IU/ml青霉素、100IU/ml链霉素)于5％CO2的37℃培养箱中培养。

3.细胞生长抑制实验

细胞生长及增殖抑制试验通过CCK-8实验测定。细胞以3×103个细胞每孔的密度铺种于96孔板中。12～18小时后，以一定浓度梯度(0、1、5、10、25μM)的青蒿素类化合物处理48小时之后，在96孔板每孔中加10μL CCK-8溶液进行药物处理后的细胞生长活性评价，实验最后通过酶标仪(SpectraMax190microplate reader；Molecular Devices，USA)测量450nm处的光吸收(OD值)(每实验浓度至少设置三个复孔，每次实验至少重复三次)。

4.细胞迁移、侵袭实验

卵巢癌细胞的迁移和侵袭能力通过transwell实验测定，低浓度青蒿素衍生物短时间(12h)处理卵巢癌细胞，然后将相同数目的细胞(5×104个)重悬在无血清的培养基中，种植到transwell(测定细胞的侵袭能力时，transwell上层铺上基质胶)上层培养室中。以10％胎牛血清培养基作为化学趋化剂。大约8-12h后，未迁移的细胞用棉签擦去，将迁移的细胞进行固定染色，并进行统计分析。

5.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白免疫印迹分析

以不同浓度的DHA处理培养细胞24小时，收集细胞并用细胞裂解液(RIPAbuffer #9806，Cell Signaling)裂解。之后以13,000转于4℃离心15min，取上清进行后续的分析检测。蛋白浓度通过Bio-Rad公司的试剂盒(protein assay kit；Hercules，CA)定量蛋白总量。之后每孔上等量蛋白进行SDS-PAGE胶电泳分离。电泳完毕，将电泳蛋白条带转移至甲醇活化过的PVDF膜(Millipore，Bedford，MA)上。转膜完毕后，膜以5％的脱脂牛奶(PBS溶解)封闭，然后后加一抗和二抗孵育(以5％的BSA配置)，之后通过蛋白条带表达差异变化以蛋白显影试剂盒(ECL plus system，Amersham Pharmacia Biotech)显影分析。

6.小鼠原位卵巢癌异体移植瘤模型体内治疗实验

四到六周龄的雌性BALB/c(nu/nu)购自上海斯莱克实验动物有限公司(Shanghai Experimental Animal Center)，并按规定饲养于SPF级动物房。所有动物实验操作均得到中科院营养所动物伦理委员会的批准。。大体步骤如下：将荧光素酶标记的A2780细胞，重悬于无血清的RPMI 1640培养基中。然后腹腔注射等量细胞(～3×106 cells/0.2ml)于小鼠的腹腔内部。利用IVIS Lumina生物荧光***实时监测肿瘤的生长情况，并记录小鼠的体重。注射5天后，根据肿瘤的荧光强度时将小鼠平均分成治疗组和对照组(每组8只老鼠)。治疗组药物DHA溶解在蓖麻油、乙醇和生理盐水的混合物(CremophorEL∶Ethanol∶Saline＝5∶5∶90，v/v/v)中，所有药物均通过腹腔给药。DHA的给药剂量为10或25mg/kg体重，给药频率为每天给药，每周停歇两天。对照组注射生理盐水。在治疗过程中利用活体成像***实时监测肿瘤的生长状况。治疗结束后，小心取出移腹部肿瘤(除掉脂肪和***)，以PIPA溶液(100mg组织加入1ml RIPA)匀浆。得到的肿瘤组织匀浆液按上述的蛋白免疫印迹分析实验要求进行处理，之后进行蛋白免疫印迹检测；或将肿瘤组织进行固定和免疫染色。

实施例1

青蒿素及其衍生物直接结合PDGFRα，抑制其磷酸化活性，促进其降解

利用PDGFRα体外激酶实验、表面等离子共振、计算机辅助同型模建及反向对接实验等分子药理学以及生物物理学等先进的生物学技术和手段，证实青蒿素类衍生物可以直接结合PDGFRα，抑制PDGFRα的受体酪氨酸激酶活性，同时研究发现双氢青蒿素可以抑制PDGFRα阳性细胞中PDGFRα的蛋白稳定性，促进其泛素依赖的降解过程。

图1表明，青蒿素及其衍生物能够直接结合PDGFRα，PDGFRα作为青蒿素及其衍生物作用的直接靶标，且能够抑制其磷酸化活性，促进其降解。体外激酶实验显示青蒿素及其衍生物：青蒿素(ART)、二氢青蒿素(DHA)、青蒿琥酯(ARM)、蒿甲醚(ARS)可以抑制PDGFRα的胞内端(aa550-末端)酪氨酸激酶的活性(图1a)。表面等离子共振(SPR)实验显示，双氢青蒿素(DHA)可以与PDGFRα包外端(aa24-524)蛋白相互结合，索拉菲尼(Sorafenib)做为阳性对照，已知可以结合抑制PDGFRα的活性(图1b)。生物素-亲和素亲和纯化实验显示标记生物素的DHA可以与A2780细胞内PDGFRα相互结合，从而被亲和纯化出来(图1c)。计算机辅助同型模建及反向对接实验(Computer Assisted Homology modeling anddocking)实验显示双氢青蒿素(DHA)可以嵌合到PDGFRα包外端PDGF结合位点，同时也可嵌合到其包内端ATP结合位点，阻断其激酶激活(图1d)。图1e-图1f显示了双氢青蒿素能够有效抑制PDGFRα阳性细胞A2780和OVCAR3中PDGFRα的活性和蛋白表达，而对PDGFRβ的磷酸化和蛋白水平影响不大。图1g-图1i实验显示双氢青蒿素可以加速PDGFRα的蛋白降解，这一过程是泛素依赖的蛋白酶体介导的。

实施例2

青蒿素及其衍生物抑制PDGFRα阳性的肿瘤细胞的生长和转移

利用裸鼠原位卵巢癌异体移植瘤模型，研究双氢青蒿素在动物体内的抗卵巢癌活性。将荧光素酶标记的人卵巢癌细胞A2780注射入Balb-c裸鼠的腹腔，建立裸鼠卵巢癌原位模型，然后给予双氢青蒿素治疗：对照组(生理盐水)，低剂量组(DHA 10mg/kg)。高剂量组(DHA 25mg/kg)每周治疗五次，停歇两天，共给予6周治疗时间。期间利用活体成像***观察小鼠卵巢癌的生长和转移情况。

通过细胞水平和动物水平的一系列研究，显示青蒿素类衍生物能够有效地抑制PDGFRα阳性的肿瘤细胞的生长、迁移和侵袭(卵巢癌和肝癌)，而对于不表达PDGFRα的肿瘤细胞生长和迁移能力的抑制能力较小。具体结果如下：

图2表明，青蒿素及其衍生物抑制PDGFRa阳性的卵巢癌细胞的生长和迁移能力。具体地，如图1e和图2a所示，PDGFRa在卵巢正常细胞上皮细胞IOSE144，卵巢癌细胞SK-OV3，OVCAR5中无表达，在卵巢癌细胞A2780和OVCAR3中高表达；给予药物刺激48h后，不同浓度的青蒿素及其衍生物人正常卵巢上皮细胞IOSE144无明显的生长抑制能力，对于SK-OV3细胞毒性较小，但对于PDGFRa阳性的A2780和OVCAR3具有较强抑制能力，其中青蒿素和二氢青蒿素的作用最为显著。细胞迁移实验显示低浓度短时间处理(12h)卵巢癌细胞，青蒿素及其衍生物能够有效地抑制PDGFRa阳性细胞A2780的迁移能力，而对于PDGFRa阴性的细胞SK-OV3无明显抑制能力(图2b)。青蒿素衍生物中双氢青蒿素对于PDGFRa阳性的细胞的生长和迁移侵袭能力抑制最为明显(图2c-图2e)。

肝癌细胞中也得到了类似的结果，图3表明，青蒿素及其衍生物能够抑制PDGFRa阳性的肝癌细胞的生长和迁移能力。具体地，在众多人正常肝细胞(7702和LO2)和肝癌细胞系(Hep3B，HepG2，7721，7404，LM3，97L，97M，Huh-7)中，Hep3B高表达PDGFRa(图3a)；低浓度双氢青蒿素(3μM)短时(12h)处理Hep3B细胞能够显著抑制其迁移和侵袭能力(图3b)；细胞生长实验同时显示PDGFRa阳性的Hep3B细胞对于双氢青蒿素更为敏感，而其他PDGFRa地表达和无表达的肝癌细胞对于双氢青蒿素敏感程度较低(图3c)。

动物实验评估结果(图4)表明，双氢青蒿素对于PDGFRa阳性细胞A2780的生长和转移的具有抑制能力。具体地，双青青蒿素给予治疗后能有有效地抑制卵巢癌的恶性进展(图4a)；与对照组别相比，给予双氢青蒿素治疗组小鼠的为转移的情况大大降低，肿瘤腹腔播散的情况也得到明显的抑制(图4b、图4c)；免疫组化和免疫印迹实验同时显示，双氢青蒿素能够有效地抑制PDGFRa的表达和磷酸化，下游信号通路PI3K/AKT和MAPK-ERK得以抑制，上皮间质形态转换过程(EMT)得到抑制(图4d、图4e)。

实施例3

青蒿素及其衍生物与一线化疗药的增敏作用

青蒿素及双氢青蒿素体外单独应用均能够显著抑制卵巢癌和肝癌细胞的生长、增殖和迁移侵袭能力。本实施例对其是否具有化疗增敏作用进行了检测，青蒿素及双氢青蒿素分别联合吉西他宾作用于人肝癌细胞HepG2和Hep3B，以及联合卡铂作用于卵巢癌A2780和OVCAR3观察联合用药对细胞生长的抑制作用。结果(图5)如下所示：

HepG2，Hep3B细胞用10μmol/L青蒿素或双氢青蒿素单独处理或联合10μg/L吉西他宾处理48小时，按上述方法进行细胞凋亡定量检测。具体地，吉西他宾单药作用于HepG2，Hep3B细胞显示出一定的凋亡促进作用(图5a)，青蒿素联合吉西他宾对HepG2，Hep3B细胞具有显著凋亡促进作用作用，两药联合表现出协同作用(图5a)。DHA和CBP联合用药24小时后对OVCAR-3细胞凋亡有增效促进作用(图5b)；用1μM DHA联合500μM CBP(1155％)作用后的细胞凋亡率显著高于单独用1μM DHA(266％)或500μM CBP(528％)的细胞凋亡率，而且超过了两种化合物的凋亡累加效应，显示出的是一种潜在的增效作用。然而，A2780细胞对联合治疗则显示的是累加效应而不是增效效应。这可能是由于它们对DHA化合物的敏感度较低的缘故(图5b，P＜0.05)。更长时间的作用可能产生更好的效果。在细胞增殖活力抑制方面，当与DHA联用时，CBP非常显著地抑制了卵巢癌细胞的活力。事实上，当细胞暴露于1μM CBP和1μM的DHA时，A2780细胞的存活率降低了69％，而OVCAR-3细胞存活则减少了72％。相比之下，IOSE144细胞则显得对治疗较不敏感，两种药物均以1μM合用时存活率只降低了约28％(图5c)。

细胞实验证明青蒿素以及双氢青蒿素在体外都显示出对于吉西他宾，卡铂处理癌细胞的杀伤和诱导凋亡的增敏作用。此外，裸鼠移植瘤实验进一步证明它们对于体内肿瘤的化疗也一样有效。具体地，如图5d显示，在肝癌细胞Hep3B和HepG2裸鼠移植瘤实验中，青蒿素和双氢青蒿素单药体内均具有抗肿瘤作用，双氢青蒿素的抑癌作用强于青蒿素。青蒿素及双氢青蒿素均能增加吉西他宾的抑癌作用，联合吉西他宾治疗效果优于单药，尤其是双氢青蒿素表现出显著的化疗致敏作用。在卵巢癌细胞A2780和OVCAR3裸鼠移植瘤实验中(图5e)，DHA(剂量为10和25mg/kg)分别导致A2780异体移植肿瘤24％和41％的生长抑制(与给生理盐水的对照组相比)(P＜0.05)，OVCAR-3模型14％和37％肿瘤生长抑制(P＜0.05)；只给单一CBP的治疗组肿瘤生长被抑制了56％(A2780)和46％(OVCAR-3)。联合用药(25mg/kg DHA)组则在A2780和OVCAR-3动物肿瘤中均产生70％肿瘤生长抑制(P＜0.05)。

以上细胞和动物水平实验显示，青蒿素及其衍生物具有良好的单独化疗和联合一线化疗药物的增敏作用，结合青蒿素类衍生化合物可以直接靶向PDGFRa发挥其抗肿瘤活性这一结果，提示青蒿素类药物可以用于临床中联合多类化疗药物来***病人，尤其是病理诊断为PDGFRa阳性的肿瘤病人

实施例4

PDGFRα与病理分级和转移相关

本实施例根据临床病理诊断信息严格选取了45例卵巢癌病人的病理样本，其中包括21例低级别卵巢癌(临床病例级别为I-II，中度或高度分化，无明显的***，腹腔和网膜等转移)；24例高级别卵巢癌病人(临床病例级别为III-IV，低分化，具有大面积的***转移，腹腔，网膜，子宫，附件及其他器官转移)。

结果显示(见图6)，与低级别卵巢癌相比，高级别卵巢癌病例中，肿瘤细胞及周围的***PDGFRα的表达量显著增加。细胞实验显示，利用慢病毒介导的基因干扰技术将卵巢癌细胞A2780和OVCAR3中PDGFRα的表达进行沉默，发现肿瘤细胞的生长和迁移侵袭能力显著降低。

实施例5

药物组合物的制备

组合物1

组合物2

讨论

已有发现表明，PDGFR基因突变或过度激活可以促进细胞的转化能力进而导致恶性肿瘤的发生，如胃肠间质瘤，肺癌，***癌和乳腺癌。PDGFR与其配体结合提高细胞间黏附分子的降解，促进肿瘤细胞的侵袭和转移，同时还能激活微环境中的VEGF，FGF等生长因子进而促进血管生成，加速了肿瘤的恶性进展过程。动物实验和临床病理研究发现，PDGFRα过度表达和激活参与了卵巢癌的发生和发展过程，与病人的病理级别和不良预后显著相关。

本发明内容表明，与低级别未发生转移的卵巢癌病人病理组织相比，高级别发生大规模转移的卵巢癌病人其癌细胞和肿瘤***中PDGFRα的表达量显著增加，这就表明，PDGFRα可以作为卵巢癌治疗的一个靶点。

本发明中发现青蒿素类衍生物，尤其是青蒿素和双氢青蒿素可以直接结合到PDGFRa分子中，既抑制PDGFRa的受体酪氨酸激酶活性，又抑制PDGFRa的蛋白稳定性，促进其泛素化降解。

分子和动物实验显示，青蒿素类的药物可以通过抑制PDGFRa进而抑制包括卵巢癌和肝癌在内的多重肿瘤的生长、迁移和侵袭转移能力。该结果表明，青蒿素类药物可以作为PDGFR的一种特殊的抑制剂，用于临床上PDGFRa突变或过度激活的肿瘤病人，包括卵巢癌、肝癌、胃肠间质瘤、急性白血病等等。青蒿素类衍生物也具有良好的抗癌增敏活性，例如青蒿素类药物可以显著提高一线化疗药卡铂，吉西他滨等对于卵巢癌和肝癌的治疗效果，尤其是双氢青蒿素对卡铂和吉西他宾具有更强的化疗致敏作用，其高效低毒的特点使之有望作为化疗增敏剂，应用于肿瘤的临床联合化疗。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.青蒿素及其衍生物用于制备抑制选自下组疾病的药物或药物增敏剂的用途：PDGFRα阳性肿瘤、血管性疾病、或纤维性病变。

2.一种青蒿素及其衍生物的用途，其特征在于，用于制备血小板衍生生长因子受体A(PDGFRα)的抑制剂或拮抗剂。

3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的抑制剂或拮抗剂还用于：

(i)抑制PDGFRα酪氨酸激酶的活化；和/或

(ii)抑制PDGFRα的蛋白稳定性；和/或

(iii)促进PDGFRα泛素依赖的蛋白酶体介导的降解；和/或

(vi)抑制PDGFRα阳性肿瘤细胞信号通路PI3K/AKT和MAPK/EPK的活化。

4.如权利要求1-2任一所述的用途，其特征在于，所述的青蒿素衍生物选自下组：蒿甲醚、二氢青蒿素、青蒿琥酯、双氢蒿甲醚、蒿***等。

5.一种体外非治疗性地抑制血小板衍生生长因子受体A(PDGFRα)活性的方法，其特征在于，包括步骤：将青蒿素和/或青蒿素衍生物与细胞接触，从而抑制或拮抗细胞中血小板衍生生长因子受体A(PDGFRα)。

6.一种制剂组合的用途，所述制剂组合包括：

(I)含青蒿素和/或青蒿素衍生物的制剂；和

(II)含吉西他宾或卡铂的制剂，

其特征在于，所述制剂组合用于制备：

(a)抑制血小板衍生生长因子受体A的药物组合物或药盒；或

(b)预防和/或***的药物组合物或药盒。

7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述肿瘤为PDGFRα阳性肿瘤。

8.一种预防和/或治疗PDGFRα相关疾病的方法，其中所述疾病与PDGFRα的过表达或活性过高有关，其特征在于，包括步骤：给需要的对象施用青蒿素和/或青蒿素衍生物，或施用含青蒿素和/或青蒿素衍生物的药物组合物。

9.一种方法，所述方法用于体内或体外抑制PDGFRα酪氨酸激酶的活化、抑制PDGFRα的蛋白稳定性、促进PDGFRα泛素依赖的蛋白酶体介导的降解、抑制信号通路PI3K/AKT和MAPK/EPK的活化、和/或抑制PDGFRα阳性肿瘤细胞的生长、迁移和侵袭，其特征在于，所述方法包括步骤：给需要的对象施用青蒿素和/或青蒿素衍生物。

10.一种用于卵巢癌病理分级的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含检测离体组织PDGFRα表达量的试剂。

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