CN101078720A - 一种改进的用于对白细胞进行分类的试剂及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种改进的用于对白细胞进行分类的试剂，所述试剂包括a.选自阳离子表面活性剂、两性表面活性剂以及它们的组合的表面活性剂；b.含苯环或其他杂环的有机化合物，且当表面活性剂为阳离子表面活性剂时，有机化合物带有阴离子基团，当表面活性剂为两性表面活性剂或两性与阳离子表面活性剂的组合时，有机化合物带阴离子或带阳离子基团；c.调节pH值的缓冲剂。本发明的试剂及方法不仅能进行白细胞的四分类，并且，所分出单核细胞集团聚类性明显，分界清晰；试剂处理后的血样经散射光检测后，对不同比例的单核细胞均能形成独立的散点区，位置固定。

Description

一种改进的用于对白细胞进行分类的试剂及方法
技术领域
本发明涉及细胞分类所用的试剂及分类方法，特别是涉及一种对血液中的白细胞进行分类时所用的试剂及分类方法。
背景技术
在临床检查领域中，用患者的全血对白细胞进行分类计数工作，在诊断各种疾病时是极其常见并且非常重要的。
迄今为止，用于白细胞分类的装置及方法的专利发表了许多。其中，中国专利CN95115317.X公开了一种通过两种试剂完成白细胞的五分类的方法。该两种试剂除都含有非离子表面活性剂和缓冲剂外，第一试剂至少含一种离子表面活性剂和一种带阴离子的有机化合物，将血细胞分成淋巴细胞、单核细胞、嗜酸细胞以及嗜碱细胞加中性粒细胞四类，第二试剂至少含一种离子表面活性剂，将血细胞分成嗜碱细胞和其他细胞类群。该方法通过综合两种结果将白细胞五分类。检测***为激光散射法。
另外，美国专利5,677,183、5,618,733、5,731,206，以及申请号为88101677、审定号为CN1018586B的中国专利，均公开了利用光散射法结合两个通道对白细胞进行5分类的方法。
但是，在利用这些现有方法对白细胞进行分类的过程中，单核细胞常常介于淋巴细胞与中性粒细胞之间，聚类性不明显，与淋巴细胞及中性粒细胞的分界不明显，导致分类结果与实际结果出现偏差。
发明内容
本发明的目的就是为了针对现有技术中的问题，提供一种能在一个通道内快速溶解红细胞并对白细胞进行分类，并且提高单核细胞的聚类性，增强单核细胞分类效果，使分类结果更为准确的试剂及方法。
为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
本发明公开了一种改进的用于对白细胞进行分类的试剂，所述试剂包括：
a、可以溶解红细胞，且使白细胞的细胞膜部分损失的表面活性剂，所述表面活性剂选自阳离子表面活性剂、两性表面活性剂以及它们的组合；
b、含有苯环或杂环的有机化合物，并且当所述表面活性剂为阳离子表面活性剂时，所述有机化合物为带有阴离子基团的有机化合物，当所述表面活性剂为两性表面活性剂或者两性表面活性剂与阳离子表面活性剂的组合时，所述有机化合物为带阴离子基团或带阳离子基团的有机化合物；
c、调节pH值的缓冲剂。
所述试剂进一步包括醇类，其在本发明的试剂中一方面发挥助溶剂的作用，另一方面对反应的过程起到促进与加速作用。
所述试剂进一步包括酸性有机物或色素。
优选的，所述缓冲剂是能够将pH值调整在2～6范围内的缓冲剂。
所述阳离子表面活性剂优选具有式I所示结构的季铵盐型阳离子表面活性剂，
其中R1为C原子数6-14的烷基或链烯基，优选辛基、癸基或月桂基；R2及R3为C原子数1-4的烷基或链烯基，优选甲基、乙基或丙基；R4为C原子数为1-4的烷基或链烯基或苄基；X为卤素原子。
所述两性表面活性剂优选具有式II所示结构的两性表面活性剂，
其中，R5为C原子数6-14的烷基或链烯基，优选辛基、癸基或月桂基；R6及R7为原子数1-4的烷基或链烯基，优选甲基、乙基或丙基。
本发明还公开了一种采用上述的试剂对白细胞进行分类的方法，所述方法包括步骤，将所述的试剂加入到全血样本中，使白细胞分成与淋巴细胞、单核细胞、嗜酸粒细胞分别对应的3个集团以及与中性粒细胞和嗜碱粒细胞相对应的1个集团共计4个集团，然后通过测定细胞大小和形态信息对所分成的四个集团进行分类计数。
所述测定细胞大小信息利用激光散射法采用低角度散射光完成，测定角度为2-6度；所述测定细胞形态信息利用激光散射法采用高角度散射光完成，测定角度为8-20度。
由于采用了以上的方案，使本发明具备的有益效果在于：
利用本发明的试剂及方法进行白细胞分类时，不仅能够将白细胞分成与淋巴细胞、单核细胞、嗜酸细胞分别对应的3个集团，以及与中性粒细胞和嗜碱细胞相对应的1个集团共计4个集团，并且，所分出单核细胞集团聚类性明显，与淋巴细胞、中性粒细胞的分界清晰；试剂处理后的血样经散射光检测后，对不同比例的单核细胞均能形成独立的散点区，且位置固定，不受细胞核左(右)移的影响，使分类结果更符合实际情况。
附图说明
图1是利用本发明实施例1的试剂对A血样进行白细胞四分类计数时的低角度散射光及高角度散射光的散射图。
图2是利用本发明实施例2的试剂对B血样进行白细胞四分类计数时的低角度散射光及高角度散射光的散射图。
图3是利用本发明实施例3的试剂对C血样进行白细胞四分类计数时的低角度散射光及高角度散射光的散射图。
图4(A)(B)(C)是利用对比例中的试剂分别对A、B、C血样进行白细胞四分类计数时的低角度散射光及高角度散射光的散射图。
具体实施方式
本发明的试剂与方法不仅可用于对全血中的白细胞进行四分类(将白细胞分成与淋巴细胞、单核细胞、嗜酸细胞分别对应的3个集团，以及与中性粒细胞和嗜碱细胞相对应的1个集团共计4个集团)，并且利用本发明的试剂和方法进行白细胞分类时还能够提高单核细胞分类结果的准确性。
将本发明的试剂加入全血中后，试剂中的成分能够迅速溶解红细胞，并使不同类型的白细胞发生形态与大小方面的差异，分成与淋巴细胞、单核细胞、嗜酸粒细胞相对应的3个集团以及与中性粒细胞和嗜碱粒细胞相对应的1个集团共4个集团。再使用激光散射法，采用低角度散射光测定细胞的大小信息以及采用高角度散射光测定细胞的形态信息，并通过对散射光进行检测，从而能够对四个集团的白细胞分别进行分类计数。其中，所分出单核细胞集团聚类性明显，与淋巴细胞、中性粒细胞的分界清晰；试剂处理后的血样经散射光检测后，对不同比例的单核细胞均能形成独立的散点区，且位置固定，不受细胞核左(右)移的影响，分类结果更符合实际情况。
本发明试剂的主要成分包括：
a、可以溶解红细胞，且使白细胞的细胞膜部分损失的表面活性剂，所述表面活性剂选自阳离子表面活性剂、两性表面活性剂以及它们的组合；
b、含有苯环或杂环的有机化合物，并且当所述表面活性剂为阳离子表面活性剂时，所述有机化合物为带有阴离子基团的有机化合物，当所述表面活性剂为两性表面活性剂或者两性表面活性剂与阳离子表面活性剂的组合时，所述有机化合物为带阴离子基团或带阳离子基团的有机化合物；
c、调节pH值的缓冲剂。
作为上述的阳离子表面活性剂，优选季铵盐型表面活性剂，其结构式可以如下式I所示：
式I表示C原子总数为9-26的阳离子表面活性剂，其中R1为C原子数6-14的烷基或链烯基；R2及R3为C原子数1-4的烷基或链烯基；R4为C原子数为1-4的烷基或链烯基或苄基；X为卤素原子。作为R1的原子数6-14的烷基或链烯基，可以是己基、辛基、癸基、月桂基、十四烷基等，特别优选辛基、癸基、月桂基等的直链烷基。作为R2及R3的C原子数1-4的烷基或链烯基可以是甲基、乙基、丙基、丁基、丁烯基等，特别优选甲基、乙基、丙基。
作为上述的两性表面活性剂，优选具有式II所示结构的两性表面活性剂：
Figure A20061002102800072
其中，R5为C原子数6-14的烷基或链烯基；R6及R7为原子数1-4的烷基或链烯基。作为R5的原子数6-14的烷基或链烯基，可以是己基、辛基、癸基、月桂基、十四烷基等，特别优选辛基、癸基、月桂基等的直链烷基。作为R6及R7的C原子数1-4的烷基或链烯基可以是甲基、乙基、丙基、丁基、丁烯基等，特别优选甲基、乙基、丙基。
上述表面活性剂，其用量应足以溶解红细胞，并造成白细胞的细胞膜部分损失。表面活性剂在本发明的试剂***中的具体用量为50-6000mg/L，优选200-5000mg/L，最优选500-4000mg/L。具体用量也可以根据使用的表面活性剂的种类作适当调整。
这种组合能使单核细胞和淋巴细胞从大小上完全分离，且位置固定，同时从形态上和粒细胞完全分离并且方便对细胞的数量进行识别。
表1列举了能够用于本发明的一些表面活性剂的种类及其最适用量。
         表1表面活性剂的最适用量
  表面活性剂名称   最适用量
  癸基三甲基溴化铵(DTAB)   1000-2500mg/L
  十二烷基三甲基氯化铵   1000-2000mg/L
  十二烷基三甲基溴化铵   1000-1500mg/L
  十二烷基氯化吡啶   500-1500mg/L
  十四烷基三甲基氯化铵   500-1000mg/L
  十四烷基三甲基溴化铵   500-1000mg/L
  癸基谷氨酸   500-5000mg/L
  十二烷基谷氨酸   500-4000mg/L
  十四烷基谷氨酸   500-3000mg/L
  癸基甘氨酸   500-5000mg/L
  十二烷基甘氨酸   500-4000mg/L
  十四烷基甘氨酸   500-3000mg/L
无论使用哪一种表面活性剂，其对白细胞的溶解力，只要能使白细胞膜开孔到胞质可以部分溢出，与阳离子结合的有机化合物能够进入的程度即可，最好使用远远少于使细胞完全裸核时的用量。表面活性剂的溶血效果与所带侧链(阳离子表面活性剂中的R1、两性表面活性剂中的R5)的链长是成正比的，侧链的C原子数越多，溶血能力越强，所需要的浓度就越低。
本发明的主要成分除表面活性剂外，还包括一种含有苯环或杂环的有机化合物，并且当所用的表面活性剂为阳离子表面活性剂时，该有机化合物选用带有阴离子基团的有机化合物，当所用的表面活性剂为两性表面活性剂或者两性表面活性剂与阳离子表面活性剂的组合时，该有机化合物可以选用带阴离子基团有机化合物，也可以选用带阳离子基团的有机化合物。所述的杂环为C原子数大于6的杂环。
本发明中使用的阴离子或阳离子有机化合物，可以和细胞内不同离子结合导致细胞类群间形态差异。这种有机化合物，带有苯环或C原子数大于6的杂环，以及阴离子基团(如羧基、磺酸基等)或阳离子基团(如N+，NH4+等)。阳离子有机化合物如吡啶、吡咯、2-吡啶基硫尿、2-萘胺等，阴离子有机化合物如1-萘乙酸、1，4，5，8-萘四甲酸、对苯二甲酸、邻苯二甲酸、铬变酸、萘磺酸及其衍生物和盐类等。有机化合物在本发明的试剂***中的使用量通常为50-1000mg/L，优选100-500mg/L。
本发明中，还含有调整PH用的缓冲剂。对于缓冲剂的种类没有特定的要求，可以为常用缓冲体系如甲酸、邻苯二甲酸、乙酸、磷酸、TRIS、硼酸、碳酸等。本发明中PH范围对四分类也没有绝对影响，但通过调节PH可以改变单核细胞的分类效果。在本发明中，分类单核细胞的最适PH为2-6。缓冲剂的使用量为10-200mM。
此外，本发明中还可以含有一定量的醇类。醇类在本发明的试剂中一方面发挥助溶剂的作用，另一方面对反应的过程起到促进与加速作用。本发明对醇类的种类没有特别要求，甲醇、乙醇、异丙醇、2-苯氧乙醇等均可用于本发明。醇类占本发明的试剂的体积百分比浓度通常为0.05-5％左右。
此外，为了改善将嗜酸细胞从粒细胞中分离出来的效果，在本发明的试剂***中加入一定量的酸性有机物或色素如酸性蓝系列、直接蓝、酸性绿、酸性黄、酸性橙、甲基红、甲基橙、苯胺蓝、茜素黄等。使用量为50-1000mg/L，优选100-500mg/L。
在本发明的试剂***中，还可以加入一定量的NaCl以调整溶液的渗透压至合适范围。
本发明的试剂***可以配制为一种试剂，也可以配制为两种试剂组合使用。作为两种试剂组合使用时，两种试剂的pH值可以相同，也可以不同。
利用本发明的方法对白细胞进行分类的具体过程包括，将本发明的上述试剂加入全血中混合一定时间后，检测细胞的形态和大小信息，根据细胞形态与大小的不同将细胞分成与淋巴细胞、单核细胞、嗜酸细胞相对应的3个集团以及与中性粒细胞和嗜碱细胞相对应的1个集团共4个集团，检测***同时对四类细胞进行分类计数。
血样与本发明试剂的混合比例没有特别的限制，但通常按照血样与本发明试剂的体积比为1∶10～100的比例混合。通常在两者混合10～30秒后就可以进行检测。
本发明检测细胞的形态和大小信息的方法优选使用激光检测法。该方法可以采用测定角度为2-6度的低角度散射光来测定细胞的大小信息，并采用测定角度为8-20度的高角度散射光测定细胞的形态信息。而散射光的检测可以通过常用的光电二极管传感器完成。
下面列举具体的实施例。
实例1
一种用于白细胞四分类的试剂，该试剂包括以下成分：
NaCl                     0.3g
乙醇                     2.0g
丙三醇                   0.75g
癸基三甲基溴化铵         6.1g
1-萘乙酸                 0.4g
乙酸                     1.95g
酸性蓝                   0.15g
补水到                   1L
PH                       3.8
按上述配方配制的试剂将PH调整到3.8，渗透压120mOsm。
取A血样30μl，在其中加入0.98ml上述试剂。混合13秒后开始用激光检测法检测白细胞。采用测定角度为2-6度的低角度散射光测定细胞的大小信息，并采用测定角度为8-20度的高角度散射光测定细胞的形态信息。
结果如图1所示，单核细胞能形成独立的散点区，且位置固定，聚类性明显，与淋巴细胞、中性粒细胞的分界清晰；同时白细胞被分成淋巴细胞、单核细胞、嗜酸细胞及中性粒细胞+嗜碱细胞四类。
实例2
一种用于白细胞四分类的试剂，该试剂包括以下成分：
NaCl                     0.2g
十二烷基谷氨酸           1g
十二烷基三甲基氯化铵     2.8g
2-苯氧乙醇               3g
邻苯二甲酸               1g
酸性蓝                   0.4g
补水到                   1L
PH                       2.5
按上述配方配制的试剂将PH调整到2.5，渗透压100mOsm。
取B血样30μl，在其中加入2ml上述试剂。混合15秒后开始用激光检测法检测白细胞。采用测定角度为2-6度的低角度散射光测定细胞的大小信息，并采用测定角度为8-20度的高角度散射光测定细胞的形态信息。
所得到结果如图2所示，单核细胞能形成独立的散点区，且位置固定，聚类性明显，与淋巴细胞、中性粒细胞的分界清晰；同时白细胞被分成淋巴细胞、单核细胞、嗜酸细胞及中性粒细胞+嗜碱细胞四类。
实例3
一种用于白细胞四分类的试剂，该试剂包括以下成分：
NaCl                     0.3g
十二烷基甘氨酸           1g
甲醇                     5g
2-萘胺                   0.5g
磷酸二氢钠               2.9g
磷酸氢二钠               2.3g
酸性蓝                   0.4g
补水到                   1L
PH                       5.8
按上述配方配制的试剂将PH调整到5.8，渗透压200mOsm。
取C血样30μl，在其中加入1.5ml上述试剂。混合18秒后开始用激光检测法检测白细胞。采用测定角度为2-6度的低角度散射光测定细胞的大小信息，并采用测定角度为8-20度的高角度散射光测定细胞的形态信息。
所得到结果如图3所示，单核细胞能形成独立的散点区，且位置固定，聚类性明显，与淋巴细胞、中性粒细胞的分界清晰；同时白细胞被分成淋巴细胞、单核细胞、嗜酸细胞及中性粒细胞+嗜碱细胞四类。
上述实施例中所用的A、B、C三份血样分别含有不同比例单核细胞，上述实施例表明，利用本发明的试剂及方法进行白细胞分类时，不仅能够将白细胞进行四分类，并且，对不同比例的单核细胞均能形成独立的散点区，且位置固定，不受细胞核左(右)移的影响，使分类结果更符合实际情况。
对比例
一种用于白细胞四分类的试剂，该试剂由以下成分组成：
NaCl                     0.2g
甲醇                     3g
聚氧乙烯(23)十六烷基醚(Brij 35)
(非离子表面活性剂)       1.4g
十二烷基磺酸钠(SDS)
(阴离子表面活性剂)       1.2g
甲酸                     1.3g
酸性蓝                   0.15g
补水到                   1L
PH                       3.8
按上述配方配制的试剂将PH调整到3.8，渗透压130mOsm。
取上述实施例中所用的A、B、C三份血样各30μl，分别在其中加入1.5ml上述试剂。混合15秒后开始用激光检测法检测白细胞。采用测定角度为2-6度的低角度散射光测定细胞的大小信息，并采用测定角度为8-20度的高角度散射光测定细胞的形态信息。
结果如图4中(A)、(B)、(C)所示，图中显示虽然白细胞被分成淋巴细胞、单核细胞、嗜酸细胞及中性粒细胞+嗜碱细胞四类，但单核细胞介于淋巴细胞与中性粒细胞之间，聚类性不明显，与淋巴细胞及中性粒细胞的分界不明显，且位置不稳定。

Claims (10)

1、一种改进的用于对白细胞进行分类的试剂，其特征在于：所述试剂包括
a、可以溶解红细胞，且使白细胞的细胞膜部分损失的表面活性剂，所述表面活性剂选自阳离子表面活性剂、两性表面活性剂以及它们的组合；
b、含有苯环或杂环的有机化合物，并且当所述表面活性剂为阳离子表面活性剂时，所述有机化合物为带有阴离子基团的有机化合物，当所述表面活性剂为两性表面活性剂或者两性表面活性剂与阳离子表面活性剂的组合时，所述有机化合物为带阴离子基团或带阳离子基团的有机化合物；
c、调节pH值的缓冲剂。
2、根据权利要求1所述的一种改进的用于对白细胞进行分类的试剂，其特征在于：所述试剂进一步包括醇类。
3、根据权利要求2所述的一种改进的用于对白细胞进行分类的试剂，其特征在于：所述试剂进一步包括酸性有机物或色素。
4、根据权利要求1所述的一种改进的用于对白细胞进行分类的试剂，其特征在于：所述缓冲剂是能够将pH值调整在2～6范围内的缓冲剂。
5、根据权利要求1～4任意一项所述的一种改进的用于对白细胞进行分类的试剂，其特征在于：所述阳离子表面活性剂为具有式I所示结构的季铵盐型阳离子表面活性剂，
Figure A2006100210280002C1
其中R1为C原子数6-14的烷基或链烯基；R2及R3为C原子数1-4的烷基或链烯基；R4为C原子数为1-4的烷基或链烯基或苄基；X为卤素原子。
6、根据权利要求5所述的一种改进的用于对白细胞进行分类的试剂，其特征在于：所述R1为辛基、癸基或月桂基，所述R2及R3为甲基、乙基或丙基。
7、根据权利要求1～4任意一项所述的一种改进的用于对白细胞进行分类的试剂，其特征在于：所述两性表面活性剂为具有式II所示结构的两性表面活性剂，
Figure A2006100210280003C1
其中，R5为C原子数6-14的烷基或链烯基；R6及R7为原子数1-4的烷基或链烯基。
8、根据权利要求7所述的一种改进的用于对白细胞进行分类的试剂，其特征在于：所述R5为辛基、癸基或月桂基，所述R6及R7为甲基、乙基或丙基。
9、一种采用权利要求1～4中任意一项所述的试剂对白细胞进行分类的方法，其特征在于：所述方法包括步骤，将所述的试剂加入到全血样本中，使白细胞分成与淋巴细胞、单核细胞、嗜酸粒细胞分别对应的3个集团以及与中性粒细胞和嗜碱粒细胞相对应的1个集团共计4个集团，然后通过测定细胞大小和形态信息对所分成的四个集团进行分类计数。
10、根据权利要求9所述的一种对白细胞进行分类的方法，其特征在于：所述测定细胞大小信息利用激光散射法采用低角度散射光完成，测定角度为2-6度；所述测定细胞形态信息利用激光散射法采用高角度散射光完成，测定角度为8-20度。
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