CN101050435A - 降解石油污染物及石油产品的固体微生物菌剂及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种用于石油污染物及石油产品降解的固体微生物菌剂，属于石油污染土壤及石油产品泄漏突发事故应急处理的生物修复技术领域。固体微生物菌剂是由枯草芽孢杆菌和多食鞘氨醇杆菌的一级种子液按体积比0.5～2∶1混合发酵而得的混合细菌发酵液与草炭土按重量比例0.1～1∶1混合制成，其中枯草芽孢杆菌的有效活菌数为10⁶～10¹⁰个/ml，多食鞘氨醇杆菌的有效活菌数为10⁷～10¹²个/ml。本发明的固体微生物菌剂具有在土壤中活性高，生长迅速，对环境不造成二次污染的优点，用于在石油污染土壤及石油产品泄漏事故场地的生物修复。

Description

降解石油污染物及石油产品的固体微生物菌剂及制备方法

技术领域

本发明涉及一种用于石油污染物及石油产品降解的固体微生物菌剂，属于石油污染土壤及石油产品泄漏突发事故应急处理的生物修复技术领域。

背景技术

生物修复是指在污染环境中加入一些物质(如营养、O₂、微生物)或提高这些物质的能力，使天然生物降解过程加速的生物技术。早在1976年，就已成功地使用这种生物修复手段对“玛丽王后”号在好望角造成的漏油进行了治理。1989年Exxon valdez在阿拉斯加海湾油轮泄漏事故的处理中进行的生物修复得到了社会的广泛认同，从此生物修复技术得到迅速发展。

生物修复是一类低耗、高效和环境安全的生物技术，主要依靠细菌、真菌甚至高等植物以及细胞游离酶的自然代谢过程降解，去除环境中的污染物。迄今为止，已知能降解石油烃类的微生物共100余属，200多种，它们分属于细菌、放线菌、霉菌和藻类。降解石油的细菌有假单胞菌属、不动杆菌属、小球菌属、弧菌属等属中的某些菌株。其中最常见的为假单胞菌属，已发现其含有多种降解烃类的质粒，并曾用于基因工程中，对乙烷、丙烷、丁烷等短链烷烃或长链烷烃与芳烃的降解，均有假单胞菌参与，并可使烷烃完全降解。常见的降解石油的霉菌有曲霉、青霉、枝孢霉等属中的菌株，白腐真菌对石油等有机物的降解效率很高。酵母菌中常以假丝酵母分解石油而产生酵母蛋白质。近年来又发现蓝细菌与绿藻可降解芳烃，尤其是蓝细菌似乎具有氧化多种芳烃的能力。

目前，许多学者就烃类化合物的微生物代谢途径进行了研究，他们认为细菌和真菌降解的关键步骤是在分子氧的参与下，底物被氧化酶氧化的过程。正烷烃先转化成羧酸而后靠β-氧化进行深入降解，形成二碳单位的短链脂肪酸和乙酰辅酶A，放出CO₂，烷烃也可以先转为酮，但不是其主要代谢方式。多分枝的烯烃主要转化成二羧酸再进行降解，甲基会影响降解的进行，环烷烃的降解需要两种氧化酶的协同氧化，一种氧化酶先将其氧化为环醇，接着脱氢形成二醇，随着邻苯二酚的形成，环断开，邻苯二酚继而降解为三羧环的中间产物。真菌和细菌降解石油烃类化合物降解石油烃类化合物可形成具有不同的立体化学构型的中间产物，细菌几乎总是将石油烃类化合物降解成顺式二醇，而真菌则几乎将之降解成反式二醇，许多反式二醇是潜在的致癌物，而顺式二醇则无毒性。

真菌能够分泌胞外酶，这些胞外酶能够分散到土壤环境中，直接与石油烃接触来降解污染物。真菌酶系的复杂性和能产生胞外酶的特点使得真菌更容易利用结构复杂、分子量较大的污染物。2002年李培军等人公开了一种降解石油固体菌剂的制备方法(CN1382758A)，该方法使用多株真菌制备成混合菌剂，利用真菌间的协同降解作用将其作用于石油污染土壤的生物修复。但真菌在降解有机污染物的过程中易产生有毒的中间代谢产物(如反式二醇)，对土壤造成二次污染，这就限制了其应用性。以细菌为主要组成的微生物制剂恰恰可以弥补这一缺陷。2001年Maruyama Akihiko等人公开了采用Alcanivorax属和Bacillus属的菌剂制备成混合生物制剂降解海洋或相关环境中的重油污染物的方法(JP2001037466)。细菌在对有机污染物质的生物降解过程中往往会产生一些糖脂、多糖、蛋白质及脂蛋白等生物表面活性剂，这类物质能够乳化石油烃，在一定程度上可以加强石油烃的生物可利用度，提高生物修复的有效性。

发明内容

针对现存的真菌或细菌微生物菌剂在生物修复过程存在的问题，本发明提供一种用于石油污染物及石油产品降解的固体微生物菌剂，利用混合细菌菌株在降解石油烃类过程中的相互协同作用以及在草炭载体中的高活性等特点，提高对石油污染物的降解效果。

本发明还提供该固体微生物菌剂的制备方法，包括制备该微生物菌剂的所使用的菌种，以及培养发酵方法。

一种用于石油污染物及石油产品降解的固体微生物菌剂，是由枯草芽孢杆菌和多食鞘氨醇杆菌的一级种子液按体积比0.5～2∶1混合发酵而得的混合细菌发酵液与草炭土按重量比例0.1～1∶1混合制成。

本发明的固体微生物菌剂，是由枯草芽孢杆菌和多食鞘氨醇杆菌的混合细菌发酵液与草炭土按重量比例0.1～1∶1的混合物，其中枯草芽孢杆菌的有效活菌数为10⁶～10¹⁰个/ml，多食鞘氨杆菌的有效活菌数为10⁷～10¹²个/ml。

本发明的固体微生物菌剂的制备方法，将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillus)和多食鞘氨醇杆菌的混合细菌发酵液与草炭土的按重量比例0.1～1∶1混合，其中，所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillus)和多食鞘氨醇杆菌的混合细菌发酵液的制备步骤如下：

1、菌种：

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillus)，保藏号：CGMCC No.1950，

多食鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium multivolum)，保藏号：CGMCC No.1951，

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，

保藏日期：2007年3月7日。

2、一级种子液

将上述菌种分别在牛肉膏蛋白胨斜面培养基上活化16～32h后，转接到液体LB培养基或牛肉膏蛋白胨培养基内摇瓶活化16～32h，作为一级种子液。

3、混合细菌发酵液

将上述两菌的一级种子液枯草芽孢杆菌与多食鞘氨醇杆菌按体积比0.5～2∶1，总接种量2％～10％转接到发酵培养基内摇床培养16～32h，转速为150～250rpm，培养温度为20～30℃。所述的液体发酵液中，枯草芽孢杆菌的有效活菌数为10⁶～10¹⁰个/ml，多食鞘氨醇杆菌的有效活菌数为10⁶～10¹²个/ml。

上述步骤3中的发酵培养基所选用的碳源，氮源均为廉价的原料：豆粕粉和玉米淀粉，还可以有酵母粉。

优选的，上述步骤3中的发酵培养基如下：豆粕粉为2～6g，玉米淀粉为1～3g，酵母粉为1～3g，K₂HPO₄ 0.11g，CaCl₂ 0.01g，MgSO₄·7H₂O 0.15g，MnSO₄ 0.01g，蒸馏水100ml。

本发明的固体微生物菌剂的应用，在用于石油污染物及石油产品污染场地进行降解处理时，还可添加表面活性剂和水，搅拌均匀，洒在污染场地。添加表面活性剂优选脂肪酸聚氧乙烯酯类的表面活性剂。

上述应用时，固体菌剂的添加量及表面活性剂的添加量可根据土壤污染的程度或石油产品泄漏的程度进行调整。

本发明的技术特点是将具有高效降解原油能力的两株细菌分别进行液体纯种活化，按一定比例在同一发酵条件和同一发酵培养基内进行混合培养，获得高活性的细菌发酵液，然后按照一定比例与优质草炭土混合拌匀，制成固体微生物菌剂。采用本发明所述的固体微生物菌剂，在辽河油田进行了现场中试实验，配合施用一定比例的表面活性剂(如脂肪酸聚氧乙烯酯类)，现场降解效果良好。本发明提供的固体微生物菌剂具有在土壤中活性高、生长迅速、对环境不造成二次污染的优点。

本发明所述的用于石油污染物及石油产品降解的固体微生物菌剂与现有的微生物菌剂比较，具有如下优点：采用具有高效降解原油能力的细菌菌株，避免了真菌菌剂在降解石油烃过程中产生有毒代谢物的可能性，不会对土壤生态环境造成二次污染，而且充分利用了细菌间的相同协同作用，使投加的微生物具有很高的有效活菌数，从而更有利于与自然环境中的土著菌竞争营养，另一方面所选的固体载体为富含有机质的草炭土，质地疏松，营养丰富，微生物吸附于草炭载体中可以二次增殖，使污染土壤的生物修复效果大大提高。本发明所述固体菌剂制备过程简单易操作，成本低廉，在石油污染土壤及石油产品泄漏事故场地的生物修复领域具有广阔的应用前景。

具体实施方式

本发明所述的两株细菌分别是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillus)和多食鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium multivolum)。其中一株枯草芽孢杆菌分离自我国辽河油田的泥土，另一株多食鞘氨醇杆菌分离自加拿大阿尔伯塔油田的泥土，枯草芽孢杆菌的菌种保藏号为CGMCC No.1950，多食鞘氨醇杆菌的菌种保藏号为CGMCC No.1951。

实施例1：混合细菌发酵液的制备

采用的细菌分别是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillus)和多食鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium multivolum)。将其分别经过斜面培养、摇瓶活化培养、摇瓶发酵培养得到细菌发酵液，具体操作步骤为：

(1)斜面培养基：采用常规方法制备牛肉膏蛋白胨固体培养基，具体步骤为：牛肉膏3g，蛋白胨5g，NaCl 5g，蒸馏水1000ml，pH7.2～7.4，琼脂1.5％～2％，搅拌均匀，于1.05kg/cm²，121.3℃条件下灭菌20～30min。灭菌后做成斜面，分别在超净工作台上，无菌接种保藏的菌株到试管斜面上，菌种在25～30℃条件下培养16～32h，待菌苔长满斜面备用；

(2)种子液的制备：液体培养基仍为牛肉膏蛋白胨培养基，将配制好的液体培养基分装入150～250ml三角瓶内，装液量为20～60ml，与121.3℃灭菌30min。待冷却至40℃左右，挑取一环斜面菌苔接种于三角瓶内，然后置于摇床上培养，调节摇床转速为150～250rpm，20～30℃条件下培养16～32h，待培养基混浊后装入发酵培养基内培养。

(3)混合细菌发酵液的制备：将分别活化好的两株细菌的种子液，两株细菌菌液的混合体积比例为0.5∶1，按照2％～10％(v/v)的接种量接入发酵培养基内，发酵培养基配方如下：豆粕粉为2～6g，玉米淀粉为1～3g，酵母粉为1～3g，K₂HPO₄ 0.11g，CaCl₂ 0.01g，MgSO₄·7H₂O 0.15g，MnSO₄ 0.01g，蒸馏水100ml。接种后置于摇床上培养22h，温度为20～30℃，摇床转速为150～250rpm。此条件下得到高活性的混合发酵液，枯草芽孢杆菌的有效活菌数为10⁷～10⁹个/ml，多食鞘氨醇杆菌的有效活菌数为10⁸～10¹¹个/ml。

实施例2：混合细菌发酵液的制备

如实施例1所述，所不同的是，步骤(3)中改变两株细菌的种子液的比例，枯草芽孢杆菌与多食鞘氨醇杆菌混合体积比例为2.0∶1，此条件下得到高活性的混合发酵液，枯草芽孢杆菌的有效活菌数为10⁶～10¹⁰个/ml，多食鞘氨醇杆菌的有效活菌数为10⁶～10¹²个/ml。

实施例3：两株细菌对原油的降解能力试验

将活化好的两株细菌，分别从其斜面上挑取一环菌苔，在牛肉膏蛋白胨液体培养基内活化16～32h后，制成一定浓度的菌悬液，再按照2～10％的接种量转接到原油培养基内，置于20～30℃摇床上培养5～12d，转速为150～250rpm。以不接菌的培养基为空白对照。培养结束时，向培养液中加入二氯甲烷(DCM)，离心打破水包油乳液，有机相用颗粒状无水硫酸钠过滤脱水后置于预先恒重的烧杯中，室温氮气吹脱至恒重，采用重量法测定培养液中残油含量。采用下面公式计算石油烃的生物降解率(η％)：

                η(％)＝ω₀-ω_x/ω₀×100

式中：ω₀为对照培养液中残油含量；ω_x为测试菌培养液中残油含量。

从下表可以看出，这两株细菌在液体摇瓶内对原油的降解能力均较高，其中两株细菌混合培养时的降解能力最高，达到51.73％(见下表第4行)。

             各处理样降解原油的测定实验

处理样品	初始含油量(g)	残余含油量(g)	降解率(％)
				枯草芽孢杆菌多食鞘氨醇杆菌枯草芽孢杆菌+多食鞘氨醇杆菌空白	0.32660.32540.32110.3354	0.21590.17470.15500.2922	33.8946.3151.7312.88

实施例4：固体菌剂的制备方法，具体操作步骤为：

(1)按实施例1的方法制备枯草芽孢杆菌和多食鞘氨醇杆菌的混合细菌发酵液。

(2)称取草炭土100g，装入500mL烧杯内，包扎后于121.3℃灭菌30min～2h，灭菌后待用。

(3)将步骤(1)的混合细菌发酵液与步骤(2)的草炭按比例为0.5∶1混合，于超净工作台上充分拌匀，置于室温条件下储存。两天后测定所制固体菌剂内细菌的有效活菌数，其中枯草芽孢杆菌的有效活菌数为10⁷～10⁹个/ml，多食鞘氨醇杆菌的有效活菌数为10⁸～10¹¹个/ml。

实施例5：固体菌剂的制备方法

如实施例4所述，所不同的是改变混合细菌发酵液与草炭的混合比例为1∶1时，两天后测定所制固体菌剂内细菌的有效活菌数，其中枯草芽孢杆菌的有效活菌数为10⁶～10⁸个/ml，多食鞘氨醇杆菌的有效活菌数为10⁸～10¹¹个/ml。

实施例6：固体菌剂应用效果试验

采用本发明制备的固体菌剂在辽河油田某一污染区域进行现场应用效果试验。具体试验方法为：

对现场进行模拟原位修复，挖3个边长为2m深0.5m的土坑(编号为1^#，2^#，3^#)，取含油土壤6m³，充分搅拌均匀，分成三份，1^#区域为空白对照，土壤中加入水，2^#区域为加入大约500克的固体菌剂、表面活性剂脂肪酸聚氧乙烯酯和水，3^#区域为一定量的活性污泥(主要为土著菌)和水。将拌匀的这些土壤加入挖好的坑内，每隔一周翻动土壤一次，并进行通风强化，每隔两天取样测定总石油烃含量，试验处理为三次重复，以减少试验误差。总石油烃含量的测定采用常规的重量法，计算公式为：石油总烃(g/kg)＝蒸发瓶中残留物重/鲜土重*(1-含水率％)*1000。在现场进行为期2个月的修复后。1^#空白对照的最终降解率为40.189％。2^#固体菌剂的降解率为75.826％，3^#活性污泥的降解率为45.743％。由此可以看出，固体草炭菌剂的修复效果最优，达到了70％以上。

Claims (10)

1、枯草芽孢杆菌，菌种保藏号是CGMCC No.1950。

2、多食鞘氨醇杆菌，菌种保藏号是CGMCC No.1951。

3、一种用于石油污染物及石油产品降解的固体微生物菌剂，是由权利要求1的枯草芽孢杆菌和权利要求2的多食鞘氨醇杆菌的一级种子液按体积比0.5～2∶1混合发酵而得的混合细菌发酵液与草炭土按重量比例0.1～1∶1混合制成。

4、如权利要求3所述的固体微生物菌剂，其中枯草芽孢杆菌的有效活菌数为10⁶～10¹⁰个/ml，多食鞘氨杆菌的有效活菌数为10⁷～10¹²个/ml。

5、一种固体微生物菌剂的制备方法，将枯草芽孢杆菌和多食鞘氨醇杆菌的混合细菌发酵液与草炭土按重量比例0.1～1∶1混合，其中，所述的枯草芽孢杆菌和多食鞘氨醇杆菌的混合细菌发酵液的制备，步骤如下：

(1)菌种

枯草芽孢杆菌，保藏号：CGMCC No.1950，

多食鞘氨醇杆菌，保藏号：CGMCC No.1951，

(2)一级种子液

将上述菌种分别在牛肉膏蛋白胨斜面培养基上活化16～32h后，转接到液体LB培养基或牛肉膏蛋白胨培养基内摇瓶活化16～32h，作为一级种子液，

(3)混合细菌发酵液

将上述两菌的一级种子液枯草芽孢杆菌与多食鞘氨醇杆菌按体积比0.5～2∶1，总接种量2％～10％转接到发酵培养基内摇床培养16～32h，转速为150～250rpm，培养温度为20～30℃。

6、如权利要求5所述的固体微生物菌剂的制备方法，其特征在于所述步骤(3)中的发酵培养基所选用的碳源、氮源是豆粕粉和玉米淀粉。

7、如权利要求5所述的固体微生物菌剂的制备方法，其特征在于所述步骤(3)中的发酵培养基还有酵母粉。

8、如权利要求5所述的固体微生物菌剂的制备方法，其特征在于所述步骤(3)中的发酵培养基如下：豆粕粉为2～6g，玉米淀粉为1～3g，酵母粉为1～3g，K₂HPO₄ 0.11g，CaCl₂ 0.01g，MgSO₄·7H₂O 0.15g，MnSO₄ 0.01g，蒸馏水100ml。

9、权利要求3所述的固体微生物菌剂的应用，在用于石油污染物及石油产品污染场地进行降解处理。

10、如权利要求9所述的固体微生物菌剂的应用，其中还添加有表面活性剂和水，搅拌均匀，洒在污染场地。