CN104388312B - 一种石油降解菌的筛选方法及由其筛选的菌制备石油降解菌菌剂的方法和该菌剂的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种石油降解菌的筛选方法，所述方法中使用的富集培养基、筛选培养基和驯化培养基是以石油作为唯一碳源的培养基，具体的是在培养基中加入石油和聚山梨酯‑80的增溶液。本发明的有益效果是:本发明以非离子表面活性剂聚山梨脂‑80作为增溶剂，能够提高石油在水中的溶解效果，解决石油在培养基中溶解难的问题；本发明真正做到以石油为唯一碳源，在石油降解菌的初筛、驯化及纯化等过程中培养基均以石油聚山梨酯‑80增溶液为碳源；本发明专利中石油降解菌的筛选包括初筛、驯化及纯化等过程，菌株在石油浓度梯度逐渐升高的驯化培养基中，逐渐被驯化，适应以石油为单一碳源的生长繁殖，提高其对石油的耐受力及其降解效率。
Description
技术领域
本发明涉及石油污染土壤微生物修复技术领域，特别涉及一种石油降解菌的筛选方法及由其筛选的菌制备石油降解菌菌剂的方法和该菌剂在石油污染土壤修复中的应用。
背景技术
石油是一种含有多种烃类(正烷烃、支链烷烃、芳香烃、脂环烃)及少量其他有机物(硫化物、氮化物、环烷酸类等)的复杂混合物，是人类最主要的能源之一。在石油的开采与运输过程中常伴随石油的泄漏，造成环境污染。特别是多环芳烃(Polycyclic AromaticHydrocar-bon，PAHs)，由于其生物可利用度差、半衰期较长，并且大多具有致畸、致癌和致突变效应，因此成为人类健康的巨大威胁。我国石油工业发展迅速，但也随之带来严重的环境污染问题，有近千万亩的耕地受到不同程度的石油烃污染。因此，对石油烃污染土壤进行修复、恢复其生态功能以保障农产品安全是一项十分迫切的任务。
石油污染土壤的修复技术已经成为当前环保领域一个新的研究热点。近年来，国内外已在物理法、化学法、生物法治理石油污染方面取得了一定的进展，传统的物理法、化学法不仅费用昂贵，且易造成二次污染，其应用受到一定限制。生物法具有处理效果好、费用低、对环境影响小、无二次污染及应用范围广等优点倍受关注。生物法主要包括微生物修复、植物修复及植物—微生物联合修复三种。微生物修复技术是利用土壤中的土著微生物或向污染环境补充经驯化的高效微生物，在优化的环境条件下，加速分解污染物，修复被污染的土壤。生物法是迄今为止修复石油污染土壤比较好的一种方法，其具有广阔市场和发展前景。
近年来，利用微生物修复石油污染土壤的技术得到了研究者的重视，该技术的关键点是提高微生物的降解活性，其一是增强自然界固有的但速度缓慢的微生物降解过程，其二是通过生物反应器使污染物与微生物接触，强化降解过程，提高降解速率。目前，实验室的研究工作集中在针对某类油份，筛选高效降解菌群，优化降解条件和降解手段的探索上，对于实际石油污染场地也已进行了部分应用研究。王卓颖等(王卓颖,王磊,桂晓琳,等.高效降解机油微生物的筛选及除油效果初探[J].工业微生物,2006,36(1):26-29,33.)从多处受石油及其制品污染的土壤中筛选到六株对高浓度机油等相关石油制品具有降解能力的微生物菌种，对该六株菌种的单独和混合降解机油的效果进行了研究，并考察了营养成分对机油降解的影响。胡长庆等(胡长庆,鲍玉婷,徐伟,等.丝状石油降解真菌的筛选及其降解特性研究[J].安徽农业科学,2010,38(4):1664-1666,1742.)从宁波象山港及镇海炼化厂卸油区域受原油污染的海水和土壤中筛选丝状石油降解真菌，并对其降解原油的速度、耐油性、接种量、氮磷营养需求等进行了探讨。邱清华等(邱清华,哈尼帕,邓绍云,等.石油降解混合菌剂的筛选及降解条件研究[J].中国农学通报,2013,29(3):184-189.)从油污土壤、含油废水及原油中经富集驯化分离得到细菌68株、真菌15株，放线菌6株；将所分离的菌株通过初筛、复筛及两两混合拮抗实验，筛选得到两组石油高效降解混合菌剂，其对石油的降解率均超过60％。姚伟静(姚伟静.高效除油微生物菌株的筛选及表面活性剂增强生物降解石油烃的研究[D].重庆:重庆大学,2007.)从长期被石油烃类污染的土壤中经过富集培养、驯化分离筛选出一株降解能力超过60％的菌株，对其进行鉴定、紫外诱变实验、优化培养基，使其对石油烃的降解率明显提高，并研究了微生物降解石油烃的最适条件和表面活性剂Tween80、SDS、APG、JFC对石油烃生物降解的影响及机理。
国外主要针对海洋沉积物石油污染物、原油泄漏造成的环境污染等方面，进行了大量的研究工作。有关报道指出，阿拉斯加王子海湾油轮泄漏事件造成了大面积污染，JonE.Llidstrom等对其投加高效降解菌进行生物修复，使得环境质量明显提高，此事件被誉为生物修复最成功的例子。同时，美国各环保局、重要机构都大力倡导推行生物修复技术。R.Margesin(R.Margesin.Potential of cold-adapted microorganisms forbioremediation of oil-polluted alpine soils.Biodeterioration&Biodegradation2000(46):3～10.)从高山污染的土壤中筛选出石油降解菌种进行驯化。欧洲各国非常重视生物修复技术，认为生物修复技术是治理大面积污染区域的一种非常有效的方法。Salanitro经研究发现大多数被石油污染的土壤对生物均有毒性，污染初期几乎没有动物可以生存，作物的产量只有正常产量的0～25％，但生物法修复过的土壤，动植物则均不受影响。S.S.Zinjdard(S.S.Zinjarde,A.A.Pant.Hydrocarbon degraders from torpicalmarine environment[J].Marine Pollution Bulletin,2002,44:118-121.)研究了原油浓度对菌株降解原油中饱和烃的影响，其浓度由0.5％升至3％时，饱和烃的降解率由92％降至15％，下降幅度显著。K.S.M.Rahman等(K.S.M.Rahman,J.Thahira-Rahman,P.Lakshmanaperumalsamy,et al.Towards efficient crude oil degradation by amixed bacterial consortium[J].Bioresource Technology,2002,85:257-261.)也发现当原油浓度由l％升至10％时，混和菌种对原油的降解率由78％降至52％。
发酵是微生物在人工培养环境中生长并形成代谢产物的过程，也是微生物菌剂生产的常用方法。19世纪已经出现生产酵母菌体的工业发酵过程，并采用了通气和补料的技术；20世纪70年代出现了微生物单细胞蛋白的生产。微生物修复石油污染土壤技术的大面积推广就需要大量的微生物菌剂，国内对石油降解菌剂的研究只开展了实验室小规模培养，没有实现工业化生产。目前微生物活菌制剂类产品主要有固态发酵和液态发酵两种方式。固态发酵是微生物在没有或基本没有游离水的固态基质上的发酵方式，固态基质中气、液、固三相并存，即多孔性的固态基质中含有水和水不溶性物质。固态发酵相对于液态发酵有以下缺点：限于耐低水活性的微生物，选择少；发酵速率慢，周期长；天然原料成分复杂，有时变化，影响产量质量；工艺参数难检测和控制；产品少，操作消耗劳力多，强度大。本发明专利通过液态发酵培养技术对石油降解菌剂的生产进行研究，确定了石油降解菌剂高密度液态深层发酵生产工艺技术。专利号为CN 103898000 A主要涉及一种石油降解菌剂的液态发酵方法。
虽然已有报道关于以石油烃为唯一碳源筛选石油降解菌的方法，但大多是以单一石油烃或几种石油烃及其中间产物为碳源进行筛选，其培养环境与石油污染土壤中石油烃种类繁多的实际情况相差甚远，因此该条件下筛选的菌种在实际石油污染土壤中的生存能力、降解效率不够理想，将其用于石油污染土壤的治理工程中的实际效果得不到保障。专利号为CN 102517279 A主要涉及一种利用三亲配对接合并以石油烃为唯一碳源筛选携带石油烃降解基因的可自转移广宿主质粒的方法，主要以正辛烷、苯、甲苯、水杨酸、邻苯二酚等石油烃为底物筛选微生物；专利号为CN 102533928 A主要涉及一种以多环芳烃为底物的降解菌的筛选方法，是以单一的四环多环芳烃芘或三环的多环芳烃菲等为底物筛选降解菌。
由于石油的粘度为124.12mm2/s，溶解度小，若不经处理以石油为碳源制备培养基，其溶解量较小，石油基本都粘在容器壁上。专利号为CN 102021132 A主要涉及一种石油污染土壤生物修复菌剂的筛选及修复方法，是以原油为底物。在该实验中，在100ml培养基中分别加入1、2、3g石油，在没有增溶剂的情况下，原油几乎不溶解，培养基中石油的浓度很低，石油基本都挂在培养器皿壁上，虽然石油被加入培养基中，但没有被溶解，因此石油起到的作用很小。
现有石油降解菌的筛选技术大部分以实验室研究为主，以某种单组份石油烃为底物进行菌种筛选，再以该石油烃为底物评价所筛选菌种的降解效果，也仅仅是实验室小试规模的菌种培养，而将石油降解菌实现菌剂工业化生产的技术报道较少。有专利报道(CN103898000 A)“一种石油降解菌剂的液态发酵方法”介绍了石油降解菌剂的液态发酵方法，相对于固体发酵来讲，发酵周期缩短了约60—84小时，但该方法是通过油脂类碳源和快速碳源相结合来提高菌体得率和提高菌株降油特性，在其发酵培养基中以豆油替代了石油。由于豆油更容易被微生物用作碳源，且其生物可利用度远高于石油，因此这种在发酵过程中没有石油参与的菌剂生产方法，不利于保证菌剂在石油污染土壤治理工程应用中的生存能力和降解效率。
发明内容
针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的是提供一种以石油聚山梨酯-80增溶液为唯一碳源筛选石油降解菌，并在石油浓度依次升高的驯化培养基中进行接种驯化，最后在最高石油浓度的驯化培养基中取菌种再在含油平板上划线培养，挑取单菌落转接LB斜面，直至得到形态单一的纯化石油降解菌落并由其制备石油降解菌菌剂。
本发明采用如下技术方案：
一种石油降解菌的筛选方法，所述方法中使用的富集培养基、筛选培养基和驯化培养基是以石油作为唯一碳源的培养基，具体的是在培养基中加入石油和聚山梨酯-80的增溶液。
一种石油降解菌的筛选方法，具体的步骤为：
1)菌源的采集
取炼油厂常年被石油污染的土壤作为石油降解土著菌菌源。
2)石油降解土著菌的初筛
(1)取作为石油降解土著菌菌源的土壤样品，加入盛有无菌水的锥形瓶中，置于振荡培养箱中室温振荡0.5～2h，振荡频率为200rpm；
(2)从步骤(1)的锥形瓶中取上清液，接入富集培养基，在温度30℃、转速175rpm摇床上振荡培养48h。取培养后的富集液涂布到筛选培养基平板上，30℃恒温培养48h。
3)驯化
用接种环挑取上述初筛得到的多株单一菌株在驯化培养基中进行接种驯化。
4)菌种的纯化
(1)取驯化后的培养液，在含油平板上划线，30℃培养7d；
(2)从含油平板上挑取单菌落转接LB斜面，30℃培养24h；
(3)由LB斜面再次接种含油平板；
(4)重复上述步骤，直至得到形态单一的纯化菌落；
(5)纯化后的菌落接种于菌种保藏培养基斜面上，30℃培养24h后，保存于4℃冰箱中，备用。
在上述方案的基础上，步骤3)驯化具体的为：
先用接种环挑取初筛得到的多株单一菌株分别接种到100mL驯化培养基A中，培养一个周期(在温度30℃、转速175rpm恒温振荡下培养7d为一个周期)，然后从驯化培养基A中取出10mL培养液加入到90mL的驯化培养基B中，培养一个周期。再从驯化培养基B中取出10mL培养液加入到90mL驯化培养基C中，培养一个周期。从驯化培养基C中取出10mL培养液加入到90mL驯化培养基D中，培养一个周期。从驯化培养基D中取出10mL培养液加入到90mL的驯化培养基E中，培养一个周期，从驯化培养基A到驯化培养基E，石油浓度梯度逐级升高。
在上述方案的基础上，所述富集培养基为：
含石油0.025g当量的石油聚山梨酯-80增溶液，NaCl 0.5g，(NH4)2SO4 0.1g，MgSO4·7H2O 0.025g，KNO3 0.24g，KH2PO4 0.57g，pH值7.2，蒸馏水1000mL，0.1MPa，121℃，高压蒸汽灭菌20min。
所述筛选培养基为：
含石油0.025g当量的石油聚山梨酯-80增溶液，琼脂20g，NaCl 0.5g，(NH4)2SO40.1g，MgSO4·7H2O 0.025g，KNO3 0.24g，KH2PO4 0.57g，pH值7.2，蒸馏水1000mL，0.1MPa，121℃，高压蒸汽灭菌20min。
所述驯化培养基A为：
含石油0.025g当量的石油聚山梨酯-80增溶液，NaCl 10g，NH4NO3 1g，KH2PO40.5g，K2HPO4·3H2O 1.31g，MgSO4·7H2O 1.03g，CaCl2 0.2g，微量元素溶液1mL，蒸馏水1000mL，pH值7.2，0.1MPa，121℃，高压蒸汽灭菌20min。
所述驯化培养基B为：
含石油0.050g当量的石油聚山梨酯-80增溶液，NaCl 10g，NH4NO3 1g，KH2PO40.5g，K2HPO4·3H2O 1.31g，MgSO4·7H2O 1.03g，CaCl2 0.2g，微量元素溶液1mL，蒸馏水1000mL，pH值7.2，0.1MPa，121℃，高压蒸汽灭菌20min。
所述驯化培养基C为：
含石油0.075g当量的石油聚山梨酯-80增溶液，NaCl 10g，NH4NO3 1g，KH2PO40.5g，K2HPO4·3H2O 1.31g，MgSO4·7H2O 1.03g，CaCl2 0.2g，微量元素溶液1mL，蒸馏水1000mL，pH值7.2，0.1MPa，121℃，高压蒸汽灭菌20min。
所述驯化培养基D为：
含石油0.100g当量的石油聚山梨酯-80增溶液，NaCl 10g，NH4NO3 1g，KH2PO40.5g，K2HPO4·3H2O 1.31g，MgSO4·7H2O 1.03g，CaCl2 0.2g，微量元素溶液1mL，蒸馏水1000mL，pH值7.2，0.1MPa，121℃，高压蒸汽灭菌20min。
所述驯化培养基E为：
含石油0.125g当量的石油聚山梨酯-80增溶液，NaCl 10g，NH4NO3 1g，KH2PO40.5g，K2HPO4·3H2O 1.31g，MgSO4·7H2O 1.03g，CaCl2 0.2g，微量元素溶液1mL，蒸馏水1000mL，pH值7.2，0.1MPa，121℃，高压蒸汽灭菌20min。
所述含油平板用培养基为：
含石油0.125g当量的石油聚山梨酯-80增溶液，NaCl 10g，NH4NO3 1g，KH2PO40.5g，K2HPO4·3H2O 1.31g，MgSO4·7H2O 1.03g，CaCl2 0.2g，微量元素溶液1mL，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH值7.2，0.1MPa，121℃，高压蒸汽灭菌20min。
LB斜面用培养基为：
蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 5g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH值7.0，0.1MPa，121℃，高压蒸汽灭菌20min。
微量元素溶液：MnSO4 39.9mg，ZnSO4·7H2O 42.8mg，FeCl2·4H2O15.73mg，CuSO440mg，蒸馏水1000mL。
菌种保藏培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl5g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH值7.2～7.4，0.1MPa，121℃，高压蒸汽灭菌20min。
一种石油降解菌菌剂，由上述制备的石油降解菌制备而成，具体的制备方法为：
(1)将纯化得到的石油降解菌株分别单独接种在种子培养基中，经一级种子、二级种子、种子罐逐步扩大培养后，作为液体种子；液体种子的菌体密度达到1*107cfu；
(2)将各个单一菌株的液体种子混合接入发酵培养基中，通气量为1:1，搅拌转速为80rpm，总接种量为10％(V/V)；
(3)发酵罐培养4小时起，每2小时取样一次，样品染色用显微镜观察，并用细菌计数器检测菌体密度。直至菌体密度大于1*109cfu，即得到石油降解菌菌剂。
在上述方案的基础上，一级种子采用固态培养基斜面培养，培养条件为30℃，培养24小时；二级种子为液态培养基摇床培养，培养条件为30℃，转速175rpm，培养10-12小时；种子罐培养条件为液体培养基搅拌培养，培养条件为30℃恒温，转速80rpm，通气量1:1；
其中：液体培养基为每1000ml无菌水中含有：含石油0.125g当量的石油聚山梨酯-80增溶液，牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，pH值为7，121℃灭菌20min；固体培养基是在液体培养基的基础上加入20g琼脂。
发酵培养基为：每1000ml无菌水中含有：含石油0.125g当量的石油聚山梨酯-80增溶液，葡萄糖3g；玉米浆25g；牛肉膏3.5g；KH2PO4 3g；MgSO4·7H2O 0.6g；CaCl2 0.03g，pH值为7，121℃灭菌30min。
本发明的有益效果是:
(1)本发明以非离子表面活性剂聚山梨酯-80脂-80(土温80)作为增溶剂，先制备石油聚山梨酯-80增溶液，再将一定量的石油聚山梨酯-80增溶液加入到培养基中，能够提高石油的溶解效果，解决石油在培养基中溶解难的问题。
(2)真正做到以石油为唯一碳源，在石油降解菌的初筛、驯化及纯化等过程中培养基均以石油聚山梨酯-80增溶液为碳源。在菌株驯化过程中驯化培养基中的石油浓度梯度逐渐升高，菌株逐渐驯化而适应含油培养基，因此该条件下筛选的菌种在实际土壤中的生存能力、降解效率得到提高，将其用于石油污染土壤治理工程中的实际效果得到保障。
(3)本发明专利中石油降解菌的筛选包括初筛、驯化及纯化等过程，菌株在石油浓度梯度逐渐升高的驯化培养基中，逐渐被驯化，适应以石油为单一碳源的生长繁殖，提高其对石油的耐受力及其降解效率。
(4)本发明在获得高效降解菌株后，采用液体发酵技术，并以石油碳源和高效碳源相结合的形式，实现菌剂的工业化生产。本发明真正实现了石油降解菌剂的工业化生产，从而满足石油降解菌剂在石油污染土壤治理工程中的应用。另外，这种在发酵过程中全程有石油参与的菌剂生产方法，既能节约生产时间，又能保证菌剂在石油污染土壤治理工程应用中的生存能力和降解效率。
附图说明：
图1为驯化后各菌株的菌体生长量和石油降解率。
具体实施方式
以下结合附图对本发明作进一步详细说明。
实施例1
高效石油降解菌菌株的筛选
1、石油降解土著菌菌源的采集
取山东省胜利油田炼油厂储油罐附近常年被石油污染的土壤作为石油降解土著菌菌源。采样方法：用小铁锹取厚度为10cm的土壤样品，多点采样后混合均匀，取土样3kg带回实验室备用。
2、石油聚山梨酯-80增溶液制备
表面活性剂在水溶液中达到临界胶束浓度(critical micelle concentration,CMC)后，一些水不溶性或微溶性物质在胶束溶液中的溶解度可显著增加，形成透明胶体溶液，这种作用称为增溶(solubilization)。聚山梨酯-80(聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸脂)为水溶性非离子表面活性剂，由于非离子表面活性剂不受电解质和pH值影响，不具有杀菌性能，且其HLB值(亲水亲油平衡值，hydrophile-lipophile balance,HLB)为15.0适合做增溶剂，适合做水包油(O/W)型乳化液。聚山梨酯-80可提高石油在水体中的溶解度，使其在石油聚山梨酯-80增溶液中分散更均匀，本发明以石油梨酯-80增溶液为唯一碳源制备各种微生物培养基。原油浓度和聚山梨酯-80浓度对增溶液乳化效果的影响如表1、表2所示。
表1原油浓度对增溶剂乳化效果的影响
表2聚山梨酯-80浓度对增溶剂乳化效果的影响
由表1和表2可以看出，在石油聚山梨酯-80增溶液制备过程中，当原油浓度小于3％时，且聚山梨酯-80/原油比例大于2.00时，原油在水中乳化较好；当聚山梨酯-80/原油比例小于2.00时，原油在水中不乳化，只形成球状油滴。当原油浓度等于3％时，当聚山梨酯-80/原油比例小于1.67时，原油在水中不乳化，只形成球状油滴；当聚山梨酯-80/原油比例大于2.00时，原油在水中乳化较好，但停止搅拌油水分层严重。当原油浓度大于3％时，原油在水中不乳化，只形成球状油滴。
3、石油降解土著菌的筛选；
(1)土壤样品取回后，经碎散、除杂、混匀、风干后密封储存。取石油降解土著菌菌源土壤样品5g，加入盛有100mL无菌水的锥形瓶，并置于振荡培养箱中室温振荡2h，振荡频率为200rpm；
(2)从无菌水的锥形瓶中取5mL上清液，接入250mL富集培养基，温度30℃、转速175rpm摇床振荡培养48h。取0.2mL富集液涂布到平板筛选培养基，30℃恒温培养48h。
4、驯化
用接种环挑取上述初筛得到的多株单一菌株在驯化培养基中进行接种驯化。
驯化培养基分别为A、B、C、D、E，其中石油浓度梯度逐级升高，驯化培养基用250mL的三角瓶盛装，温度30℃、转速175rpm恒温振荡培养7d为一个周期。同时以不接入菌株的驯化培养基作为空白对照。驯化时，先用接种环挑取上述初筛得到的多株单一菌株分别接种到100mL新鲜的驯化培养基A中，培养一个周期，然后从驯化培养基A中取出10mL培养液加入到90mL新鲜的驯化培养基B中，培养一个周期。再从驯化培养基B中取出10mL培养液加入到90mL新鲜的驯化培养基C中，培养一个周期。从驯化培养基C中取出10mL培养液加入到90mL新鲜的驯化培养基D中，培养一个周期。从驯化培养基D中取出10mL培养液加入到90mL新鲜的驯化培养基E中，培养一个周期。如此反复5个周期，经过驯化培养后，观察每个菌株在驯化培养基E中的石油降解情况。
5、菌种的纯化
(1)取一环最后一个周期的驯化培养液，在含油平板上划线，30℃培养7d；
(2)从含油平板上挑取单菌落转接LB斜面，30℃培养24h；
(3)由LB斜面再次接种含油平板；
(4)重复上述步骤，直至得到形态单一的纯化菌落；
(5)纯化后的菌落接种于菌种保藏培养基斜面上，30℃培养24h后，保存于4℃冰箱中，备用。
所用培养基配制：
所述富集培养基为：
含石油0.025g当量的石油聚山梨酯-80增溶液(其中石油质量浓度为2％，聚山梨酯-80质量浓度为4％，剩余为水。)，NaCl 0.5g，(NH4)2SO4 0.1g，MgSO4·7H2O 0.025g，KNO30.24g，KH2PO4 0.57g，pH值7.2，蒸馏水1000mL，0.1MPa，121℃，高压蒸汽灭菌20min。
所述筛选培养基为：
含石油0.025g当量的石油聚山梨酯-80增溶液(其中石油质量浓度为2％，聚山梨酯-80质量浓度为4％，剩余为水。)，琼脂20g，NaCl 0.5g，(NH4)2SO4 0.1g，MgSO4·7H2O0.025g，KNO3 0.24g，KH2PO4 0.57g，pH值7.2，蒸馏水1000mL，0.1MPa，121℃，高压蒸汽灭菌20min。
所述驯化培养基A为：
含石油0.025g当量的石油聚山梨酯-80增溶液(其中石油质量浓度为2％，聚山梨酯-80质量浓度为4％，剩余为水。)，NaCl 10g，NH4NO3 1g，KH2PO4 0.5g，K2HPO4·3H2O1.31g，MgSO4·7H2O 1.03g，CaCl2 0.2g，微量元素溶液1mL，蒸馏水1000mL，pH值7.2，0.1MPa，121℃，高压蒸汽灭菌20min。
所述驯化培养基B为：
含石油0.050g当量的石油聚山梨酯-80增溶液(其中石油质量浓度为2％，聚山梨酯-80质量浓度为4％，剩余为水。)，NaCl 10g，NH4NO3 1g，KH2PO4 0.5g，K2HPO4·3H2O1.31g，MgSO4·7H2O 1.03g，CaCl2 0.2g，微量元素溶液1mL，蒸馏水1000mL，pH值7.2，0.1MPa，121℃，高压蒸汽灭菌20min。
所述驯化培养基C为：
含石油0.075g当量的石油聚山梨酯-80增溶液(其中石油质量浓度为2％，聚山梨酯-80质量浓度为4％，剩余为水。)，NaCl 10g，NH4NO3 1g，KH2PO4 0.5g，K2HPO4·3H2O1.31g，MgSO4·7H2O 1.03g，CaCl2 0.2g，微量元素溶液1mL，蒸馏水1000mL，pH值7.2，0.1MPa，121℃，高压蒸汽灭菌20min。
所述驯化培养基D为：
含石油0.100g当量的石油聚山梨酯-80增溶液(其中石油质量浓度为2％，聚山梨酯-80质量浓度为4％，剩余为水。)，NaCl 10g，NH4NO3 1g，KH2PO4 0.5g，K2HPO4·3H2O1.31g，MgSO4·7H2O 1.03g，CaCl2 0.2g，微量元素溶液1mL，蒸馏水1000mL，pH值7.2，0.1MPa，121℃，高压蒸汽灭菌20min。
所述驯化培养基E为：
含石油0.125g当量的石油聚山梨酯-80增溶液(其中石油质量浓度为2％，聚山梨酯-80质量浓度为4％，剩余为水。)，NaCl 10g，NH4NO3 1g，KH2PO4 0.5g，K2HPO4·3H2O1.31g，MgSO4·7H2O 1.03g，CaCl2 0.2g，微量元素溶液1mL，蒸馏水1000mL，pH值7.2，0.1MPa，121℃，高压蒸汽灭菌20min。
所述含油平板用培养基为：
含石油0.125g当量的石油聚山梨酯-80增溶液(其中石油质量浓度为2％，聚山梨酯-80质量浓度为4％，剩余为水。)，NaCl 10g，NH4NO3 1g，KH2PO4 0.5g，K2HPO4·3H2O1.31g，MgSO4·7H2O 1.03g，CaCl2 0.2g，微量元素溶液1mL，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH值7.2，0.1MPa，121℃，高压蒸汽灭菌20min。
LB斜面用培养基为：
蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 5g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH值7.0，0.1MPa，121℃，高压蒸汽灭菌20min。
微量元素溶液：MnSO4 39.9mg，ZnSO4·7H2O 42.8mg，FeCl2·4H2O 15.73mg，CuSO440mg，蒸馏水1000mL。
菌种保藏培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl5g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH值7.2～7.4，0.1MPa，121℃，高压蒸汽灭菌20min。5、石油降解菌的培养、筛选和形态鉴定结果
通过富集培养以及石油浓度梯度升高的方法进行驯化、筛选，经平板反复划线分离，纯化初筛得到7个单一菌株，如表3所示。
表3菌落及菌体形态观察结果
通过在30℃，175rpm的恒温摇床上摇床震荡培养5d后，观察这7个单一菌株及混合菌株1和混合菌株2在驯化培养基E中的生长特征并测定这7个单一菌株和2个平行混合菌株的菌体生长量及其石油降解率，其中混合菌株1为7种单一菌株的均匀混合，混合菌株2为菌株X-2和X-6均匀混合。各菌株的生长特征如表4所示，
表4各菌株的生长特征
采用光电比浊法测定培养液的光密度(OD值)来间接确定细菌的生长量。取一定量培养液经8000r·min-1离心20min后，加等量蒸馏水制成菌悬液，稀释一定倍数后，以不接种的培养液为参比，用UV-2012C型紫外-可见分光光度计于600nm处测菌悬液的OD600值，同时测得每个菌株的石油降解率，结果如图1所示。
从表4和图1综合分析可以看出，石油的乳化程度越完全，菌株的菌体生长量越大，菌株的石油降解率越高。菌体生长量同石油降解率成正相关关系。X-2和X-6菌株的石油乳化程度较完全，菌体生长量较大，石油降解率较高，因此是降解石油的优势菌株。试验结果也表明，不同菌株对石油的降解效果不同，混合菌株2比混合菌株1的降油效果更好，因此以混合菌株2为菌种制备石油降解菌剂。
实施例2
石油降解菌剂液体发酵生产
1、一级种子培养
无菌条件下取实施例1纯化的石油降解菌混合菌株2接种在试管斜面培养基中。培养基组成每1000ml无菌水：含石油0.125g当量的石油聚山梨酯-80增溶液(其中石油质量浓度为2％，聚山梨酯-80质量浓度为4％，剩余为水。)，牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂粉20g，pH值为7，121℃，灭菌20分钟。培养条件为：30℃，培养24小时，作为一级种子。
2、二级种子培养
无菌条件下取两环一级种子接入装有200ml培养基的500ml三角瓶中摇瓶培养。摇瓶培养基组成每1000ml无菌水：含石油0.125g当量的石油聚山梨酯-80增溶液(其中石油质量浓度为2％，聚山梨酯-80质量浓度为4％，剩余为水。)，牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，pH值为7，121℃，灭菌20分钟。培养条件为30℃，转速80rpm,培养9小时，作为二级种子。
3、种子罐培养
按体积10％的接种量将二级种子接入50L发酵罐中。在50L发酵罐中加入40L培养基并接入二级种子液4L。培养基组成每1000ml无菌水：含石油0.125g当量的石油聚山梨酯-80增溶液(其中石油质量浓度为2％，聚山梨酯-80质量浓度为4％，剩余为水。)，牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，pH值为7，121℃，灭菌30分钟。培养条件为搅拌转速80rpm，通气量1:1，温度30℃，培养8小时后，经细菌计数器检测菌体密度为1.2×107cfu，培养结束。
4、发酵罐培养制得菌剂产品
在500L发酵罐内加入400L培养基，培养基组成每1000ml无菌水：含石油0.125g当量的石油聚山梨酯-80增溶液(其中石油质量浓度为2％，聚山梨酯-80质量浓度为4％，剩余为水。)，葡萄糖3g；玉米浆25g；牛肉膏3.5g；KH2PO4 3g；MgSO4 0.6g；CaCl2 0.03g，pH值为7，121℃灭菌30min。将培养好的种子罐发酵液接入到500L发酵罐中。培养条件为通气量为1:1，搅拌转速为80rpm，温度30℃。500L发酵罐接种后4小时起，每隔2小时进行染色镜检及细菌计数。培养10小时后检测菌体密度为2.4×109cfu，得到石油降解活菌制剂。
Claims (4)
1.一种石油降解菌的筛选方法，其特征在于所述方法中使用的富集培养基、筛选培养基和驯化培养基是以石油作为唯一碳源的培养基，具体的是在培养基中加入石油和聚山梨酯-80的增溶液；所述石油和聚山梨酯-80的增溶液中石油质量浓度为2%，聚山梨酯-80质量浓度为4%，剩余为水。
2.根据权利要求1所述的一种石油降解菌的筛选方法，其特征在于具体的步骤为：
1）菌源的采集
取炼油厂常年被石油污染的土壤作为石油降解土著菌菌源；
2）石油降解土著菌的初筛
(1) 取作为石油降解土著菌菌源的土壤样品，加入盛有无菌水的锥形瓶中，置于振荡培养箱中室温振荡0.5～2h，振荡频率为200rpm；
(2) 从步骤（1）的锥形瓶中取上清液，接入富集培养基，在温度30℃、转速175 rpm摇床上振荡培养48h；取培养后的富集液涂布到筛选培养基平板上，30℃恒温培养48h；
3）驯化
用接种环挑取上述初筛得到的多株单一菌株在驯化培养基中进行接种驯化；
4）菌种的纯化
（1）取驯化后的培养液，在含油平板上划线，30℃培养7 d；
（2）从含油平板上挑取单菌落转接LB斜面，30℃培养24 h；
（3）由LB斜面再次接种含油平板；
（4）重复上述步骤，直至得到形态单一的纯化菌落；
（5）纯化后的菌落接种于菌种保藏培养基斜面上，30℃培养24h后，保存于4℃冰箱中，备用。
3.根据权利要求2所述的一种石油降解菌的筛选方法，其特征在于步骤3）驯化具体的为：
先用接种环挑取初筛得到的多株单一菌株分别接种到100mL驯化培养基A中，培养一个周期，在温度30℃、转速175 rpm恒温振荡下培养7d为一个周期，然后从驯化培养基A中取出10mL培养液加入到90mL的驯化培养基B中，培养一个周期；再从驯化培养基B中取出10mL培养液加入到90mL驯化培养基C中，培养一个周期；从驯化培养基C中取出10mL培养液加入到90mL驯化培养基D中，培养一个周期；从驯化培养基D中取出10mL培养液加入到90mL的驯化培养基E中，培养一个周期，从驯化培养基A到驯化培养基E，石油浓度梯度逐级升高。
4.根据权利要求3所述的一种石油降解菌的筛选方法，其特征在于：
所述富集培养基为：
含石油0.025g当量的石油聚山梨酯-80增溶液，NaCl 0.5g，(NH4)2SO4 0.1g，MgSO4·7H2O 0.025g，KNO3 0.24g，KH2PO4 0.57g，pH值7.2，蒸馏水1000mL，0.1MPa，121℃，高压蒸汽灭菌20min；
所述筛选培养基为：
含石油0.025g当量的石油聚山梨酯-80增溶液，琼脂20g，NaCl 0.5g，(NH4)2SO4 0.1g，MgSO4·7H2O 0.025g，KNO3 0.24g，KH2PO4 0.57g，pH值7.2，蒸馏水1000mL，0.1MPa，121℃，高压蒸汽灭菌20min；
所述驯化培养基A为：
含石油0.025g当量的石油聚山梨酯-80增溶液，NaCl 10g，NH4NO3 1g，KH2PO4 0.5g，K2HPO4·3H2O 1.31g，MgSO4·7H2O 1.03g，CaCl2 0.2g，微量元素溶液1 mL，蒸馏水1000 mL，pH值7.2，0.1MPa，121℃，高压蒸汽灭菌20min；
所述驯化培养基B为：
含石油0.050g当量的石油聚山梨酯-80增溶液，NaCl 10g，NH4NO3 1g，KH2PO4 0.5g，K2HPO4·3H2O 1.31g，MgSO4·7H2O 1.03g，CaCl2 0.2g，微量元素溶液1 mL，蒸馏水1000 mL，pH值7.2，0.1MPa，121℃，高压蒸汽灭菌20min；
所述驯化培养基C为：
含石油0.075g当量的石油聚山梨酯-80增溶液，NaCl 10g，NH4NO3 1g，KH2PO4 0.5g，K2HPO4·3H2O 1.31g，MgSO4·7H2O 1.03g，CaCl2 0.2g，微量元素溶液1 mL，蒸馏水1000 mL，pH值7.2，0.1MPa，121℃，高压蒸汽灭菌20min；
所述驯化培养基D为：
含石油0.100g当量的石油聚山梨酯-80增溶液，NaCl 10g，NH4NO3 1g，KH2PO4 0.5g，K2HPO4·3H2O 1.31g，MgSO4·7H2O 1.03g，CaCl2 0.2g，微量元素溶液1 mL，蒸馏水1000 mL，pH值7.2，0.1MPa，121℃，高压蒸汽灭菌20min；
所述驯化培养基E为：
含石油0.125g当量的石油聚山梨酯-80增溶液，NaCl 10g，NH4NO3 1g，KH2PO4 0.5g，K2HPO4·3H2O 1.31g，MgSO4·7H2O 1.03g，CaCl2 0.2g，微量元素溶液1 mL，蒸馏水1000 mL，pH值7.2，0.1MPa，121℃，高压蒸汽灭菌20min；
所述含油平板用培养基为：
含石油0.125g当量的石油聚山梨酯-80增溶液，NaCl 10g，NH4NO3 1g，KH2PO4 0.5g，K2HPO4·3H2O 1.31g，MgSO4·7H2O 1.03g，CaCl2 0.2g，微量元素溶液1 mL，琼脂20g，蒸馏水1000 mL，pH值7.2，0.1MPa，121℃，高压蒸汽灭菌20min；
LB斜面用培养基为：
蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 5g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH值7.0，0.1MPa，121℃，高压蒸汽灭菌20min；
微量元素溶液：MnSO4 39.9mg，ZnSO4·7H2O 42.8mg，FeCl2·4H2O 15.73mg，CuSO440mg，蒸馏水1000mL；
菌种保藏培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl5g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH值7.2～7.4，0.1MPa，121℃，高压蒸汽灭菌20min。
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