CN114644994A - 一种石油烃降解复合微生物菌剂及其制备方法和应用 - Google Patents

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宋繁永
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Abstract

本发明公开了一种石油烃降解复合微生物菌剂及其制备方法和应用，由包括保藏编号CGMCC No.20664的活不动杆菌KJ‑1，CGMCC No.16526的雷氏普罗维登斯菌L1、GMCC No.1950的芽孢杆菌SWH‑1和CGMCC No.1951的鞘氨醇杆菌SWH‑2组成。本发明制备的石油烃降解复合微生物菌剂能够有效降解土壤及油泥砂中的石油烃类物质，可有效应用于石油污染土壤生物降解处理，且不会对土壤的生态环境造成二次污染，充分利用活不动杆菌KJ‑1、雷氏普罗维登斯菌L1、芽孢杆菌SWH‑1和鞘氨醇杆菌SWH‑2间的协同作用，提高最终石油烃的降解效率，且固体菌剂制备过程简单易操作，成本低廉，在石油污染土壤及石油产品泄露事故场地的生物修复领域具有广阔的应用前景。

Description

一种石油烃降解复合微生物菌剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于微生物及土壤修复技术领域，具体涉及一种石油烃降解复合微生物菌剂及其制备方法和应用。
背景技术
石油污染已成为全球性的环境问题。据统计，我国油田石油污染土壤面积超过3亿m2，每年新增石油污染土壤超过100万t，各种含油污泥超过1000万t，形成了非常严重的土壤石油污染。各大油田区生态环境质量持续下降，石油类有毒有害污染物不断累积，生态风险日益增大。由于土壤介质的复杂性，石油污染土壤修复已成为国际上油田环境保护的瓶颈性难题，是衡量一个国家污染土壤治理技术水平的标志。
土壤石油污染修复是世界各国环保技术相继集中研发主战场，为了快速去除土壤中的石油污染物，国内外常规方法包括物理、化学修复，如浓缩干化法、固液分离法、萃取分离法、冲洗法、热处理与热解吸、化学破乳回收法等。这些方法早期主要是针对油泥中原油回收处理而建立的。物理、化学的修复方式难以避免二次污染，以致于破坏了原有的生境，并且对大面积、中低浓度的石油污染治理难以奏效和应用，而且费用昂贵。因此，原有的物理、化学方法有待进一步改进、提升、优化或辅以/联合生物学方法。生物修复通常利用污染场地内生的或人工加入的微生物或菌剂、修复植物及特异性酶作为强化/加速石油烃降解。与物理、化学方法相比，它更环境友好，可在污染物去除的同时尽量降低对土壤生态***的破坏，是可持续的修复手段。
发明内容
针对现有技术中的不足，本发明提供了一种石油烃降解复合微生物菌剂及其制备方法和应用，该复合微生物菌剂能够有效降解土壤及油泥砂中的石油烃类物质，可有效应用的石油污染土壤生物降解处理。
本发明通过以下技术方案实现：
一种石油烃降解复合微生物菌剂，包括保藏编号CGMCC No.20664的活不动杆菌KJ-1，CGMCC No.16526的雷氏普罗维登斯菌L1、GMCC No.1950的芽孢杆菌SWH-1和CGMCCNo.1951的鞘氨醇杆菌SWH-2。
进一步地，所述的复合微生物菌剂由发酵菌液和载体草炭土组成，发酵菌液与草炭土的质量比为1:5~15。
进一步地，所述的发酵菌液中活不动杆菌KJ-1的有效活菌数为107-109个/ml、雷氏普罗维登斯菌L1的有效活菌数为107-109个/ml、芽孢杆菌SWH-1的有效活菌数为108-109个/ml、鞘氨醇杆菌SWH-2的有效活菌数为107-109个/ml。
本发明中，所述石油烃降解复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将CGMCC No.20664的活不动杆菌KJ-1、CGMCC No.16526的雷氏普罗维登斯菌L1、GMCC No.1950的芽孢杆菌SWH-1和CGMCC No.1951的鞘氨醇杆菌SWH-2分别在NB固体培养基上活化16-48h，转接单菌株至NB液体培养基中摇瓶活化16-48h，作为初始种子液；
（2）将石油降解菌活不动杆菌KJ-1、雷氏普罗维登斯菌L1、芽孢杆菌SWH-1和鞘氨醇杆菌SWH-2初始种子液按照3-6%的总接种量置于发酵培养基中发酵培养至石油降解菌群总数量为109CFU/mL以上，得石油降解菌群发酵I级种子液；
（3）将步骤（2）中的石油降解菌群发酵I级种子液按照体积比3~6%的比例再次转接发酵培养基，通空气培养至石油降解菌群总数量为109CFU/ml以上，得到石油降解菌群发酵II级种子液，逐级扩大培养，石油降解菌群总数量为109CFU/ml以上；
（4）以草炭土为载体，将步骤（2）中所得的发酵菌液与草炭土混合，质量比为1:5~15，晾干后含水率为10~15%，得石油烃降解复合微生物菌剂。
进一步地，步骤（1）中所述的NB培养基为每升培养基中含有蛋白胨 10g，牛肉粉3g，氯化钠 5g，琼脂 18.0 g，蒸馏水定容至1000 mL，pH值7.0~7.4；步骤（2）和步骤（3）中所述的发酵培养基为每升发酵培养基中含有KH2PO4 1g，K2HPO4 1g，MgSO4 0.2g，CaCl2 0.03g，FeCl3 0.002g，Na2CO3 0.2g，(NH4)2SO4 0.8g，营养肉汤20 g，余量为水；所述的发酵温度为28-37℃，培养时间为18-24h，培养转速为120～150rpm。
进一步地，步骤（2）中所述的石油降解菌活不动杆菌KJ-1、雷氏普罗维登斯菌L1、芽孢杆菌SWH-1和鞘氨醇杆菌SWH-2四种菌株的有效活菌数之比为1.5-2:1:1-2:2。
本发明中，所述的石油烃降解复合微生物菌剂在处理石油污染物中的应用。
进一步地，所述的石油污染物为被石油污染的土壤或经处理后的含油污泥。
进一步地，所述的石油烃降解复合微生物菌剂在处理被石油污染的土壤时，添加石油烃污染物质量2~4%的复合微生物菌剂，加入石油烃污染物质量0.05~0.5%、氮磷比为3~5:1的氮肥和磷肥，保持水分含量在15~25%之间，处理30~90天。
进一步地，所述的复合微生物菌剂分两次加入土壤中，两次加入间隔时间为一周。
有益效果
本发明石油烃降解复合微生物菌剂能够有效降解土壤及油泥砂中的石油烃类物质，可有效应用于石油污染土壤生物降解处理，且不会对土壤的生态环境造成二次污染，充分利用活不动杆菌KJ-1、雷氏普罗维登斯菌L1、芽孢杆菌SWH-1和鞘氨醇杆菌SWH-2间的协同作用，提高最终石油烃的降解效；且固体菌剂制备过程简单易操作，成本低廉，在石油污染土壤及石油产品泄露事故场地的生物修复领域具有广阔的应用前景。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
（1）将保藏编号CGMCC No.20664的活不动杆菌KJ-1，CGMCC No.16526的雷氏普罗维登斯菌L1、CGMCC No.1950的芽孢杆菌SWH-1和CGMCC No.1951的鞘氨醇杆菌SWH-2菌株进行平板培养，摇瓶活化培养、活化，活化后按照体积比5%的总接种量（活不动杆菌、雷氏普罗维登斯菌L1、芽孢杆菌SWH-1和鞘氨醇杆菌SWH-2的有效活菌数之比为1.5:1:1.5:2）接种于500ml的锥形三角摇瓶中，每瓶含有发酵培养基100ml，30℃，150rpm摇床培养至石油降解菌群总数量为109CFU/ml以上，得到石油降解菌群发酵I级种子液；
（2）向装有高温灭菌的发酵培养基的10L发酵罐中，按照体积比5%的接种量接种步骤（1）中的石油降解菌群发酵I级种子液，30℃,120rpm通空气培养，每隔2h检测菌的生长活性，培养至石油降解菌群总数量在109CFU/ml以上，得到石油降解菌群发酵II级种子液；随后逐级扩大培养，最终至500L发酵罐进行高密度发酵培养，采用简单染色法进行镜检，接种8h后第一次取样，以后每隔4h取样镜检一次，最终得石油烃降解菌发酵液（其中活不动杆菌KJ-1有效活菌数为1.8×108个/ml、雷氏普罗维登斯菌L1有效活菌数为1.3×108个/ml、芽孢杆菌SWH-1有效活菌数为2.0×108个/ml、鞘氨醇杆菌SWH-2有效活菌数为1.9×109个/ml）；
（3）以草炭土为石油降解菌剂的载体，将步骤（2）中得到的发酵菌液与草炭土按照质量比1:10的比例混合，阴凉处自然风干2h晾干至含水率为12%，最终得石油烃降解复合微生物菌剂。
10L种子罐控制发酵参数为：温度30℃，搅拌转速120 r/min，通气量按1：0.5-1，培养种子罐压力0.04-0.06 Mpa，培养时间根据生长情况而定约为24 h；
500L发酵罐控制发酵参数为：温度30℃，搅拌转速120 r/min，通气量按1：0.6-1，培养种子罐压力0.04-0.06 Mpa，培养时间约18-24 h；
发酵培养基成分：每升发酵培养基中含有KH2PO4 1g，K2HPO4 1g，MgSO4 0.2g，CaCl20.03g，FeCl3 0.002g，Na2CO3 0.2g，(NH4)2SO4 0.8g，营养肉汤20 g，余量为水；
本实施例中得到的菌剂室温下保存，检测菌分别保存3、6、9个月，并计算存活率，存活率检测结果见表1。由表1可以看到，实施例1制备的石油降解菌剂在常温下存放，三个月时存活率达到75%，半年后存活率在58%。因此，该菌剂存活期达到了生物菌剂的标准；
表1 石油降解菌剂不同保存期的存活率
Figure 362474DEST_PATH_IMAGE001
。
对比例1
按照实施例1石油烃降解复合微生物菌剂的制备方法，分别制备含雷氏普罗维登斯菌L1、芽孢杆菌SWH-1和鞘氨醇杆菌SWH-2的复合菌剂（复合菌剂1），含芽孢杆菌SWH-1和鞘氨醇杆菌SWH-2的复合菌剂（复合菌剂2），总活菌数与实施例1复合菌剂相差不大。
应用例1：
取实施例1中的石油烃降解复合微生物菌剂行石油污染土壤修复试验，具体方法如下：
取东营孤岛地区石油污染土壤，采用重量法检测土壤含油量，该土样含油率为2.948%，每公斤土壤中添加6.7g硝酸铵和1.8g磷酸二氢钾，按照表2参数对石油污染土壤进行样品处理，定期补水，翻耕，补水方式为称重后计算缺水量，翻耕时喷洒补水；
表2 石油污染土壤生物修复试验样品处理
Figure 434335DEST_PATH_IMAGE002
。
每隔15天进行菌数（有效活菌数）及石油含量测定，其中菌体菌数测定采用逐级稀释，平板计数方法，菌数测定结果见表3，根据表3可以看到，土壤样品中添加草炭、秸秆等物质有利于菌量的增加，在添加菌剂一致的情况下，土壤样品中同时添加5%秸秆和草炭菌量增长情况效果较好，其次是添加2%草炭，试验45天就达到了2.20×108 CFU/g，2.15×108CFU/g，1.63×108 CFU/g，随后菌数均呈现降低趋势，至试验90天，处理7中的菌含量只有3.11×107 CFU/g，2.79×107 CFU/g，19.1×107 CFU/g；
表3 不同试验天数菌数含量测定
Figure 654969DEST_PATH_IMAGE003
；
石油含量测定采用如下方法：石油污染土壤中添加一定量的二氯甲烷，利用索氏提取仪萃取土壤中的剩余石油，向萃取液中加入足量的无水硫酸钠进行脱水，过滤后进行旋蒸，使二氯甲烷完全挥发，利用二氯甲烷定容，稀释至一定倍数，利用气相色谱内标法测定土壤中石油烃含量，根据标准曲线计算土壤中石油含量，采用下列公式计算石油降解率：
石油降解率（%）=（Wo-Wx）/Wo×100%
其中，Wo表示对照土壤中石油含量，Wx表示处理土壤中石油含量；
上述处理90天后，发现样品编号4、5、6效果较好，石油含量由原来的2.411%下降至1.343%，1.326%和1.241%，其石油烃降解率分别为52.65%，53.23%和56.24%。而不添加外源菌的对照组，石油降解率只有14.98%；另外，在添加一定菌剂的情况下，添加草炭或者秸秆，有利于保证土壤的通透性，对石油烃的降解具有促进作用。
应用例2
取实施例1中的石油烃降解复合微生物菌剂进行石油污染土壤修复试验，具体方法如下：取东营孤岛地区石油污染土壤，采用重量法检测土壤含油量，土壤石油含量为6.729%。每公斤土壤中添加6.7g硝酸铵和1.8g磷酸二氢钾，按照表4参数对石油污染土壤进行样品处理，定期补水，翻耕，补水方式为称重后计算缺水量，翻耕时喷洒补水。对有效活菌数测定结果如表5所示；
表4 石油污染土壤生物修复试验样品处理
Figure 786873DEST_PATH_IMAGE004
；
表5 不同试验天数菌数含量测定
Figure 328844DEST_PATH_IMAGE005
；
由表5可以看到，土壤样品中添加草炭有利于菌量的增加，在菌剂添加量均为2%情况下，土壤中菌群数量增长情况效果较好，试验45天就达到了3.08×108 CFU/g，随后菌数均呈现降低趋势，至试验90天，处理4中的菌含量只有4.16×107 CFU/g，而对照中只有2.35×107 CFU/g，处理2和3中的菌量分别为2.62×107 CFU/g和3.85×107 CFU/g。可以看出，保持一定的含水率对菌株生长具有重要的意义；
采用气相色谱检测石油降解率，处理4样品中石油含量由6.411%下降至3.651%，石油烃降解率为43.05%，没有添加外源菌剂的阴性对照石油降解率则为6.22%。
应用例3
取实施例1中的石油烃降解复合微生物菌剂进行石油烃降解（东营孤岛地区石油污染土壤，每公斤土壤中添加6.7g硝酸铵和1.8g磷酸二氢钾，含水保持20-25%，翻耕）模拟试验，探索了菌剂添加量、温度、固定载体对石油烃降解的影响。
（1）菌剂添加量对石油烃降解的影响
以0%、2%、4%的菌剂添加量作为试验自变量，观察降解效果，结果见表6，发现在以菌剂添加量为自变量时，结果表明添加4%的初始菌剂，降解性能表现更好，其50天的降解率达到了60%以上；
表6 菌剂添加量对石油烃降解的影响
Figure 204396DEST_PATH_IMAGE006
；
试验一周后，对含有2%菌剂的土壤中按照表7补加不同浓度的菌剂，检测补加菌剂对石油烃降解的影响，结果见表7，由表7可以看到，试验7D后，添加2%的菌剂使降解效率远高于其他两组试验，补加56天后，其菌剂对石油烃的降解率达到了89.13%；
表7 补加菌剂对石油烃降解的影响
Figure 233532DEST_PATH_IMAGE007
。
（2）温度对石油烃降解的影响
温度作为影响菌活性的重要因素，需要设置对照确定菌生长的最适温度。本实验在处理补加菌剂的同时，进行了室温（5-10℃）和恒温（25℃）的对比关于温度作为因变量的试验曾以室温和恒温室（25℃）作为对照进行试验（表8）。试验表明，在只以温度作为自变量时，25℃时微生物的降解效率明显好于室温条件下的试验组；
表8 不同温度对石油烃降解的影响
Figure 54114DEST_PATH_IMAGE008
。
（3）固定载体添加量
固定微生物可以保持微生物的生物活性，再适宜条件下可以使微生物快速大量增殖，不同载体对于微生物的的影响有较大影响，同时使用相同载体的前提下，不同的载体添加量也有影响，本实验以草炭和秸秆为固体载体，研究不同载体对其降解率的影响，结果见表9。实验表明，在添加量一致的情况下，秸秆更有利于微生物降解石油烃；
表9 不同固体载体添加量对石油烃降解的影响
Figure 801490DEST_PATH_IMAGE009
。
应用例5
分别以实施例1和对比例1中制备的石油烃降解菌菌剂进行石油烃降解模拟试验（东营孤岛地区石油污染土壤，每公斤土壤中添加6.7g硝酸铵和1.8g磷酸二氢钾， 5%秸秆，翻耕），其中复合菌剂1为含CGMCC No.20665的芽孢杆菌KJ-2、CGMCC No.1950的芽孢杆菌SWH-1和CGMCC No.1951的鞘氨醇杆菌SWH-2的复合菌剂，复合菌剂2为含CGMCC No.1950的芽孢杆菌SWH-1和CGMCC No.1951的鞘氨醇杆菌SWH-2的复合菌剂，菌剂的添加量为石油烃污染物质量的4%，保持待处理土壤的含水率为15~20%，温度为25℃，记录降解率，结果如下表10所示。实施例1中的复合菌剂对石油烃的降解效果好于复合菌剂1和复合菌剂2，进一步证明了活不动杆菌KJ-1、雷氏普罗维登斯菌L1、芽孢杆菌SWH-1和鞘氨醇杆菌SWH-2之间的协同作用；
表10 不同菌剂对石油烃降解的影响
Figure 215154DEST_PATH_IMAGE010
。

Claims (10)

1.一种石油烃降解复合微生物菌剂，其特征在于，包括保藏编号CGMCC No.20664的活不动杆菌KJ-1，CGMCC No.16526的雷氏普罗维登斯菌L1、GMCC No.1950的芽孢杆菌SWH-1和CGMCC No.1951的鞘氨醇杆菌SWH-2。
2.根据权利要求1所述复合微生物菌剂，其特征在于，所述的复合微生物菌剂由发酵菌液和载体草炭土组成，发酵菌液与草炭土的质量比为1:5~15。
3.根据权利要求2所述复合微生物菌剂，其特征在于，所述的发酵菌液中活不动杆菌KJ-1的有效活菌数为107-109个/ml、雷氏普罗维登斯菌L1的有效活菌数为107-109个/ml、芽孢杆菌SWH-1的有效活菌数为108-109个/ml、鞘氨醇杆菌SWH-2的有效活菌数为107-109个/ml。
4.一种权利要求1- 3任一项所述的石油烃降解复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将CGMCC No.20664的活不动杆菌KJ-1、CGMCC No.16526的雷氏普罗维登斯菌L1、GMCC No.1950的芽孢杆菌SWH-1和CGMCC No.1951的鞘氨醇杆菌SWH-2分别在NB固体培养基上活化16-48h，转接单菌株至NB液体培养基中摇瓶活化16-48h，作为初始种子液；
（2）将石油降解菌活不动杆菌KJ-1、雷氏普罗维登斯菌L1、芽孢杆菌SWH-1和鞘氨醇杆菌SWH-2初始种子液按照3-6%的总接种量置于发酵培养基中发酵培养至石油降解菌群总数量为109CFU/mL以上，得石油降解菌群发酵I级种子液；
（3）将步骤（2）中的石油降解菌群发酵I级种子液按照体积比3~6%的比例再次转接发酵培养基，通空气培养至石油降解菌群总数量至109CFU/ml以上，得到石油降解菌群发酵II级种子液，逐级扩大培养，石油降解菌群总数量为109CFU/ml以上；
（4）以草炭土为载体，将步骤（2）中所得的发酵菌液与草炭土混合，质量比为1:5~15，晾干后含水率为10~15%，得石油降解菌剂。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述的NB固体培养基为每升培养基中含有蛋白胨 10g，牛肉粉 3g，氯化钠 5g，琼脂 18.0 g，蒸馏水定容至1000 mL，pH值7.0~7.4；步骤（2）和步骤（3）中所述的发酵培养基为每升发酵培养基中含有KH2PO4 1g，K2HPO4 1g，MgSO4 0.2g，CaCl2 0.03g，FeCl3 0.002g，Na2CO3 0.2g，(NH4)2SO4 0.8g，营养肉汤20 g，余量为水；所述的发酵温度为28-37℃，培养时间为18-24h，培养转速为120～150rpm。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述的活不动杆菌KJ-1、雷氏普罗维登斯菌L1、芽孢杆菌SWH-1和鞘氨醇杆菌SWH-2四种菌株的有效活菌数之比为1.5-2:1:1-2:2。
7.一种权利要求1-3任一项所述的石油烃降解复合微生物菌剂在处理石油污染物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的石油污染物为被石油污染的土壤或经处理后的含油污泥。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的石油烃降解复合微生物菌剂在处理被石油污染的土壤时，添加石油烃污染物质量2~4%的复合微生物菌剂，加入石油烃污染物质量0.05~0.5%、氮磷比为3~5:1的氮肥和磷肥，保持水分含量在15~25%之间，处理30~90天。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的复合微生物菌剂分两次加入土壤中，两次加入间隔时间为一周。
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