CN101851586A

CN101851586A - 一种高效分解合成染料的真菌及其用途

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Publication number: CN101851586A
Application number: CN201010167953A
Authority: CN
Inventors: 林永慧; 何兴兵; 肖竹平; 陈亮; 何瑶庆; 胡文勇; 田启建
Original assignee: 林永慧
Priority date: 2010-05-11
Filing date: 2010-05-11
Publication date: 2010-10-06

Abstract

本发明的针对现有有关染料污染及毒害防治技术的不足，提供一整套微生物法防止染料污染环境的工程技术，从而有效降低蒽醌染料、偶氮染料、三芳基甲烷染料、酞菁等染料对环境的污染，有效保护环境，是一项清洁工程技术。

Description

一种高效分解合成染料的真菌及其用途

技术领域

本发明属于环境保护、防治污染技术领域，具体涉及使用微生物法高效降合成染料方法及其用途。

背景技术

1、染料污染的特点

合成染料是印染工业废水中常见的水体污染物，组分复杂、浓度高(COD为1000～10万mg/L)、色度深(500～50万倍)。废水中的有机组分大多以芳烃及杂环化合物为母体，并带有显色基团(如-N＝N-、-N＝O)及极性基团(如-SO₃Na、-OH、-NH₂)。废水中还含有较多的原料和副产品，如卤化物、硝基物、苯胺、酚类等，以及无机盐如NaCl、Na₂SO4、Na₂S，还有如蒽醌染料、偶氮染料、三芳基甲烷染料、酞菁染料等，这些染料大多数是具有毒性、致突变、致癌的。

2、染料废水的脱色方法

物理化学方法和生物方法都可以用于染料废水的脱色处理，如絮凝沉淀、吸附、离子交换、超滤、渗析、化学氧化、光氧化、电解及生物处理方法。目前工业上常用的方法有絮凝沉淀(气浮)、电解、吸附、生物降解、离子交换、膜过滤臭氧化等方法，染料废水的处理难点：一是COD高，而BOD/COD值较小，可生化性差；二是色度高，且组分复杂。COD的去除与脱色有相关性，但脱色问题困难更大。然而由于这些方法大多数存在成本高、耗时长等问题，没有被广泛地应用。目前，许多研究开始集中到具有高效脱色与分解染料的微生物方面。

本菌种分离于海南省吊罗山热带雨林地区，我们研究了Cladosporium cladosporioidesTXJ13021对不同的化学合成染料如橙黄G、甲基橙、茜素红、孔雀石绿等的脱色能力。目前还没有关于Cladosporium cladosporioides TXJ13021能降解上述染料的报道，我们利用真菌Cladosporium cladosporioides TXJ13021重点对茜素红与甲基橙色两种染料进行了降解分析，研究pH值，碳源、氮源对脱色的影响，找出该菌的最优脱色条件，期望使用这种真菌来降解含有茜素红或甲基橙和其他有关结构染料的工业废水。

发明内容

本发明的针对现有有关染料污染及毒害防治技术的不足，采用微生物法处理降解化学合成染料的污染，有效保护环境，是一项清洁工程。此外还可以为环境保护相关研究者提供参考。

1、本发明获得一株能高效降解染料的微生物菌种，该微生物为枝孢样枝孢霉，拉丁名Cladosporium cladosporioides TXJ13021，分离于海南省吊罗山热带雨林地区，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2007年3月，保藏号为CGMCC No.1987。

2、本发明优化出培养枝孢样枝孢霉，Cladosporium cladosporioides TXJ13021最优条件和方法。其中条件包括：

(1)最适宜的培养基配方，碳氮比为5∶1～25∶1；碳源最佳为蔗糖，其次为葡萄糖，淀粉，浓度为1～10％；氮源可以是硝酸铵、氯化铵、硫酸铵、尿素1～10％。

(2)最适宜的培养温度为28℃-32℃。

(3)菌体培养最适pH值为pH4.0-pH6.0。

(4)培养培养方法为“两级菌体发酵培养”。一级菌体发酵培养“种子”，按上述培养基配方生产大量能进行色素降解活菌体；二级菌体发酵培养，实质为菌体进一步扩大培养，同时兼顾染料降解脱色。

在一个具体的实施方案中，用土豆汁葡萄糖液体培养基(每1000mL培养基含200g土豆的浸出液、20g葡萄糖)，获得一级发酵的菌体(菌膜)，在将菌膜处理化学合成色素茜素红和甲基橙，二者在此条件下脱色率均达到90％以上。

3、本发明提供一系列枝孢样枝孢霉Cladosporium cladosporioides TXJ13021降解不同染料色素的条件和方法。即“菌体发酵、染料降解两步法”。其中第一步为菌体发酵纯培养，按上述培养菌体方法生产大量能进行色素降解活菌体；第二步为菌体染料降解脱色，同时兼顾菌体扩大培养。

在一个具体的实施方案中，首先将该枝孢样枝孢霉Cladosporium cladosporioidesTXJ13021接种于装有土豆汁葡萄糖液体培养基的平板中，培养出菌膜，利用菌膜针对该菌的pH值、碳源及其浓度、氮源及其浓度进行单因素试验，测出其最优的培养条件，结果显示，经过96h的培养，对于茜素红，当pH值为3，以蔗糖为碳源(5g/L)，硝酸铵为氮源(0.2g/L)时，脱色效果达到最佳状态，脱色率达到90％以上。

在另一个具体的方案中，当pH值为9，以蔗糖为碳源(7g/L)，尿素为氮源(0.8g/L)时，对于甲基橙脱色效果达到最佳，脱色率达到90％以上。

技术效果

本发明的优点及效果：本发明真菌对蒽醌、三苯基甲烷及偶氮类染料有很好的降解效果，尤其对偶氮染料甲基橙可以在碱性条件下达到很好的脱色效果，这是很多真菌所不具备的。由于含有偶氮染料的工业废水很多都是碱性的，所以使用此种真菌降解具有很大的优越性，不仅可以为工业生产节约降低废水pH值所耗费的时间，而且可以减少工业成本，具有很高的应用价值。

具体实施实例

实施例1：枝孢样枝孢霉的筛选

从各地采集土壤样品，采用不同的培养基进行筛选，筛选到多个菌株，逐一进行降解染料实验，得到降解染料菌株，进行菌种签定。

实施例2：枝孢样枝孢霉的保藏

保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2007年3月，保藏号为CGMCC No.1987。

实施例3：枝孢样枝孢霉的培养和降解染料的条件优化

菌种培养：按200g/L土豆浸出液、20g/L葡萄糖的比例配制液体土豆培养基，并在121℃、0.1MPa条件下灭菌25min。取灭菌培养皿，向每个培养皿中无菌操作加入液体土豆培养基10mL。待培养基冷却到室温，将分离的Cladosporium cladosporioides TXJ13021菌种接种到培养皿中培养6～7d，形成菌膜后以备随后实验使用。

降解所选用的染料：实验选用常用染料如甲基橙(特征波长476nm)、甲基红(特征波长430nm)、孔雀石绿(特征波长617nm)、结晶紫(特征波长583nm)、苯胺蓝(特征波长585nm)、茜素红(特征波长420nm)、橙黄G(特征波长478nm)等，进行广谱降解试验，所用培养基为染料-Kirk液体培养基(组成(g/L)：葡萄糖，5；酒石酸铵，0.22；KH₂PO₄，0.2；MgSO₄·7H₂O，0.05；CaCl₂，0.01；维生素B1，1mg/L；10mg/L的10％吐温80；10mL/L 100mM藜芦醇；10mg/L微量元素溶液(g/L：CuSO₄，0.08；H₂MoO₄，0.05；MnSO₄·4H₂O，0.07；ZnSO₄·7H₂O，0.043；Fe₂(SO₄)₃，0.05))，染料浓度为100mg/L，将菌膜接种于该培养基中进行为期5天的观察，结果表明，该菌能够分解甲基橙、甲基红、孔雀石绿、茜素红、橙黄G，5天的降解率均超过85％，而对结晶紫、苯胺蓝具较弱降解仅达到30％左右。

脱色率(％)＝[(A₀-A_t)/A₀]×100％

A_t为时间t时染料的吸光值，A₀染料降解前的初始吸光值。

降解条件的优化：A-pH值、B-碳源、C-氮源

A-pH值对脱色效果的影响：取五只250mL的锥形瓶，分别标记为：A、B、C、D、E、F。向五只锥形瓶中分别量取100mL浓度为0.1g/L的茜素红-Kirk培养基，并用0.1mol/LHCl/NaOH进行调节，使其pH值依次为1、3、5、7、9、11。另取五只250mL的锥形瓶，分别标记为：a、b、c、d、e。向五只锥形瓶中分别量取100mL的0.1g/L甲基橙-Kirk培养基，并用0.1mol/L HCl/NaOH进行调节，使其pH值依次为1、3、5、7、9、11。将培养好的菌膜接种到各组锥形瓶中，恒温培养96h，取各组溶液进行过滤，测出各组滤液的吸光值；得出在不同pH值的情况下，各组的脱色率如表一所示：

表一 pH对茜素红和甲基橙脱色的影响

pH	1	3	5	7	9	11
pH	1	3	5	7	9	11	脱色率％(茜素红)	40	92	80	68	53	61
脱色率％(甲基橙)	41	73	66	90	90	82	脱色率％(茜素红)	40	92	80	68	53	61

B-不同碳源对脱色效果的影响：分别取十二只250mL的锥形瓶，分别标记为：A₁ A₂ A₃、B₁ B₂ B₃、C₁ C₂ C₃、D₁ D₂ D₃。以蔗糖，果糖，麦芽糖等量取代Kirk培养基中的葡萄糖配制0.1g/L茜素红-Kirk培养基。用0.1mol/L HCl/NaOH调节培养基，使其达到最优pH 3。另取十二只250mL锥形瓶，分别标记为：E₁ E₂ E₃、F₁ F₂ F₃、G₁ G₂ G₃、H₁ H₂ H₃。以蔗糖，果糖，麦芽糖等量取代Kirk培养基中的葡萄糖配制0.1g/L甲基橙-Kirk培养基，并用0.1mol/L HCL/NaOH调节培养基，使其达到最优pH 9。向A_1～3，B_1～3，C_1～3，D_1～3锥形瓶中对应加入含有葡萄糖，蔗糖，果糖，麦芽糖的茜素红-Kirk培养基100mL；向E_1～3、F_1～3、G_1～3、H_1～ ₃锥形瓶中对应加入含有葡萄糖，蔗糖，果糖，麦芽糖的甲基橙-Kirk培养基100mL。将分装好的培养基在121℃，0.1MPA的条件下灭菌12～15min。待灭菌好的培养基冷却到室温，将培养好的菌膜接种到各组锥形瓶中，恒温培养96h后，取各瓶溶液过滤，测得各组脱色率如表二所示：

表二不同碳源对茜素红和甲基橙脱色的影响

碳源(5g/L)	葡萄糖	蔗糖	果糖	麦芽糖
碳源(5g/L)	葡萄糖	蔗糖	果糖	麦芽糖	脱色率％(茜素红)	89	93	89	88
脱色率％(甲基橙)	93	95	86	92	脱色率％(茜素红)	89	93	89	88

B-碳源(蔗糖)浓度对脱色效果的影响

取五只250mL的锥形瓶，分别标记为：T₁、T₃、T₅、T₇、T₉。配制0.1g/L茜素红，蔗糖浓度分别为1g/L、3g/L、5g/L、7g/L、9g/L的Kirk培养基，并用0.1mol/L HCl/NaOH进行调节，使得培养基的pH值为3。6.2另取五只250mL的锥形瓶，分别标记为C₁、C₃、C₅、C₇、C₉。配制0.1g/L甲基橙，蔗糖浓度分别为1g/L、3g/L、5g/L、7g/L、9g/L的Kirk培养基，并用0.1mol/L HCl/NaOH进行调节，使得培养基的pH值为9。分别量取100mL的各组培养基加到各组对应的锥形瓶中，在121℃，0.1MPa条件下灭菌15min。冷却后将菌膜接种到各组培养基中，恒温培养96h，取各组溶液进行过滤，测出各组的吸光值，得出不同碳源浓度下的脱色率如表三所示：

表三不同蔗糖浓度下对茜素红与甲基橙脱色的影响

蔗糖浓度	0.1％	0.3％	0.5％	0.7％	0.9％
蔗糖浓度	0.1％	0.3％	0.5％	0.7％	0.9％	脱色率％(茜素红)	88	87	92	89	90
脱色率％(甲基橙)	83	87	91	96	91	脱色率％(茜素红)	88	87	92	89	90

C-不同氮源对脱色效果的影响：取十五只250mL的锥形瓶，分别标记为：a₁ a₂ a₃、b₁ b₂ b₃、c₁ c₂ c₃、d₁ d₂ d₃、e₁ e₂ e₃。以蔗糖为碳源，并分别用硝酸铵，硫酸铵，蛋白胨，尿素等量取代酒石酸铵为氮源配制0.1g/L茜素红-Kirk培养基，用0.1mol/L HCl/NaOH调节培养基，使其pH值为3。另取十五只250mL的锥形瓶，分别标记为f₁ f₂ f₃、g₁ g₂ g₃、h₁ h₂ h₃、m₁ m₂ m₃、n₁ n₂ n₃。以蔗糖为碳源，并分别用硝酸铵，硫酸铵，蛋白胨，尿素等量取代酒石酸铵为氮源配制0.1g/L甲基橙-Kirk培养基，并用0.1mol/L HCl/NaOH调节培养基，使其pH值为9。向a_1～3、b_1～3、c_1～3、d_1～3、e_1～3分别对应加入含有酒石酸铵、硝酸铵、硫酸铵、蛋白胨、尿素的茜素红-Kirk培养基100mL；向f_1～3、g_1～3、h_1～3、m_1～3、n_1～3分别对应加入含有酒石酸铵、硝酸铵、硫酸铵、蛋白胨、尿素的甲基橙-Kirk培养基100mL。将分装好的培养基在121℃，0.1MPa条件下，灭菌12～15min。待灭菌好的培养基冷却到室温，将培养好的菌膜接种到各组锥形瓶中，恒温培养96h后，取各瓶溶液过滤，测得各组脱色率如表四所示：

表四不同氮源对茜素红和甲基橙脱色的影响

氮源(0.22g/L)	酒石酸铵	硝酸铵	硫酸铵	蛋白胨	尿素
氮源(0.22g/L)	酒石酸铵	硝酸铵	硫酸铵	蛋白胨	尿素	脱色率％(茜素红)	90	93	92	91	82

氮源(0.22g/L)	酒石酸铵	硝酸铵	硫酸铵	蛋白胨	尿素
氮源(0.22g/L)	酒石酸铵	硝酸铵	硫酸铵	蛋白胨	尿素	脱色率％(甲基橙)	86	69	85	85	93

C-氮源(尿素)浓度对脱色效果的影响：

取五只250mL的锥形瓶，分别标记为：N_0.05、N_0.1、N_0.2、N_0.4、N_0.8。配制尿素浓度分别为0.1g/L、0.2g/L、0.4g/L、0.8g/L的0.1g/L茜素红-Kirk培养基，并用0.1mol/L HCl/NaOH进行调节，使得培养基的PH值为3。另取7只250mL的锥形瓶，分别标记为n_0.1、n_0.2、n_0.4、n_0.8、n_1.2、n_1.6、n_2.0。配制尿素浓度分别为0.1g/L、0.2g/L、0.4g/L、0.8g/L的0.1g/L甲基橙-Kirk培养基，并用0.1mol/L HCl/NaOH进行调节，使得培养基的PH值为9。分别量取100mL的各组培养基加到各组对应的锥形瓶中，封口；在121℃，0.1MPa灭菌25min。将菌膜接种到各组培养基中，恒温培养96h，取各组溶液进行过滤，测出各组的吸光值，得出不同氮源浓度下的脱色率如表五所示：

表五不同尿素浓度对茜素红和甲基橙脱色的影响

尿素浓度	0.1g/L	0.2g/L	0.4g/L	0.8g/L
尿素浓度	0.1g/L	0.2g/L	0.4g/L	0.8g/L	脱色率％(茜素红)	90	92	90	89
脱色率％(甲基橙)	79.5	80	89	93.8	脱色率％(茜素红)	90	92	90	89

实施例4：

从印染厂取废水(色度约为50000倍，pH 9.5)200公斤，直接将预先培养好的Cladosporiumcladosporioides TXJ13021菌膜“种子液”20L(干菌体含量1％)倒入其中，自然条件下处理15天，温度20～35℃，脱色率为67％，色度降为8100倍。而没有加入Cladosporium cladosporioidesTXJ13021的对照组，脱色率仅为5％左右，色度仅降为43000倍。

实施例5：

从印染厂取废水(色度约为50000倍，pH 9.5)200公斤，直接将预先培养好的Cladosporiumcladosporioides TXJ13021菌膜“种子液”80L(干菌体含量1％)倒入其中，自然条件下处理15天，温度20～35℃，脱色率为67％，色度降为2100倍。而没有加入Cladosporium cladosporioidesTXJ13021的对照组，脱色率仅为5％左右，色度仅降为43000倍。

实施例6：

从印染厂取废水(色度约为50000倍，pH 9.5)200公斤，直接将预先培养好的Cladosporiumcladosporioides TXJ13021菌膜“种子液”60L(干菌体含量1％)倒入其中，自然条件下处理15天，温度20～35℃，脱色率为67％，色度降为3500倍。而没有加入Cladosporium cladosporioidesTXJ13021的对照组，脱色率仅为5％左右，色度仅降为43000倍。

实施例7：

从印染厂取废水(色度约为50000倍，pH 9.5)200公斤，直接将预先培养好的Cladosporiumcladosporioides TXJ13021菌膜“种子液”40L(干菌体含量1％)倒入其中，自然条件下处理15天，温度20～35℃，脱色率为67％，色度降为4000倍。而没有加入Cladosporium cladosporioidesTXJ13021的对照组，脱色率仅为5％左右，色度仅降为43000倍。

Claims

1.本发明获得一株能高效降解染料的微生物菌种，该微生物为枝孢样枝孢霉，拉丁名Cladosporium cladosporioides TXJ13021，分离于海南省吊罗山热带雨林地区，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2007年3月，保藏号为CGMCC No.1987。

2.一种包含权利要求1所述枝孢样枝孢霉的微生态染料降解菌剂。

3.权利要求2所述的微生态染料降解菌剂，其中还包括：该菌株所代谢的产物。

4.权利要求1所述的芽孢杆菌或权利要求2或3所述的染料降解菌剂在生产加工中用于染料降解的用途。

5.权利要求4所述的用途，其中用微生态染料降解菌剂与印染废水适量混合工艺，自然条件下处理，可降解染料，使其废水色度显著下降。