CN1944626A - 微生物发酵制备银杏内酯的微生物菌及制备银杏内酯方法 - Google Patents

微生物发酵制备银杏内酯的微生物菌及制备银杏内酯方法 Download PDF

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CN1944626A CN 200610103651 CN200610103651A CN1944626A CN 1944626 A CN1944626 A CN 1944626A CN 200610103651 CN200610103651 CN 200610103651 CN 200610103651 A CN200610103651 A CN 200610103651A CN 1944626 A CN1944626 A CN 1944626A
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张怡轩
何建勇
吴春福
白秀峰
易大为
田威
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Abstract

本发明公开了一株从银杏树皮内侧分离并筛选到的真菌，利用本发明生产制备银杏内酯A、银杏内酯B和白果内酯。采用的是三线镰刀菌，保藏号CGMCC No1677。其工艺如下：(1)培养基中的营养采用碳源和氮源，其中碳源可为葡萄糖、淀粉、糊精、饴糖，氮源可为蛋白胨、花生饼粉、黄豆饼粉、牛肉膏、鱼粉，此外还需要添加无机盐，(2)发酵工艺：使用该生产菌株，可通过摇瓶二级发酵的方法，获得其代谢产物——银杏内酯，培养方法包括：原始菌种的活化、摇瓶种子的制备、摇瓶发酵、发酵液的后处理、提取纯化制备银杏内酯。本发明克服了原有银杏内酯从银杏叶或者树皮中提取所受到的银杏树资源的约束，改变了银杏内酯的生产方式，大大提高该产品的产量，并且质量稳定。

Description

微生物发酵制备银杏内酯的微生物菌及制备银杏内酯方法
技术领域：
本发明涉及生物制药技术领域，具体说是一种微生物发酵制备珍贵的中药成分—银杏内酯的方法-微生物发酵制备银杏内酯的微生物菌(Fusarium oxysporum)及制备银杏内酯方法。
背景技术：
银杏树(Ginkgo biloba L.)又名公孙树，是古老树种之一，为一科一属一种的特殊植物。银杏树能经历两百多万年的地质变迁和沧海桑田，仍能孑遗下来，必然有它独特的地方。于是，至上世纪六十年代以来国内外植化学家对银杏树组织的化学成分和药理作用做了大量的研究工作，现已明确结构的成分大约有70种左右。表1列出了银杏树中部分有生物活性的物质。目前银杏叶提取物(Ginkgo Biloba extract，GBE)被广泛运用于药品、食品补充剂、化妆品等。银杏现在虽然在欧洲、北美开始种植，但是中国仍是主要产地。2004年，中国向世界提供了2.4万吨银杏叶，销售额大概6亿元人民币，而全世界银杏制剂的总销售额达到50亿美元，98％是国外的公司生产。
              表1  银杏中有生物活性的主要成分
  种类   名称   分子式   组织来源 生物活性
  黄酮甙元   山奈酚   C15H10O6 银杏叶 扩张冠状血管，抑制血管紧张素转换酶(ACEZ)的活性。
  山奈酚-3-O-葡萄糖甙   C21H20O11
  山奈酚-3-O-芸香糖甙   C27H30O15
及黄酮甙   山奈酚-7-O-葡萄糖甙   C21H20O11
  山奈酚-3-葡萄糖-2，6-二鼠李糖甙   C33H40O19
  槲皮素   C15H10O7
  槲皮素-3-O-葡萄糖甙   C21H20O12
  槲皮素-3-O-鼠李糖甙   C21H20O11
  槲皮素-3-O-芸香糖甙   C27H30O16
  槲皮素-3-葡萄糖-2，6-二鼠李糖甙   C33H40O20
  异鼠李素   C16H12O7
  异鼠李素-3-O-葡萄糖甙   C22H22O12
  异鼠李素-3-O-芸香糖甙   C28H32O16
  双黄酮   银杏双黄酮   C32H22O10 银杏叶银杏外种皮 细胞毒作用介导抑制NO合成作用
  异银杏双黄酮   C32H22O10
  去甲基银杏双黄酮   C31H20O10
  穗花杉双黄酮   C30H18O10
  金钱松双黄酮   C33H24O10
  5-甲氧基去甲银杏双黄酮   C32H22O11
银杏萜内酯 白果内酯   C15H18O8 银杏叶根皮组织 对中枢神经的作用，抗血小板活化因子(PAF)的作用
银杏内酯A   C20H24O9
银杏内酯B   C20H24O10
银杏内酯C   C20H24O11
银杏内酯J   C20H24O10
银杏内酯M   C20H24O10   仅存于根皮中
  有机酸 6-羟基犬尿喹啉酸 C10H7O4N 银杏叶 N-甲基-D-天冬氨酸受体拮抗剂
  烷基酚酸 4-甲氧基吡哆酸   C9H13O3N   银杏果实 细胞毒素
  白果酚   C21H34O   银杏果实   抗肿瘤作用
  白果二酚   C21H34O2   银杏果实
  白果酸   C22H34O3   银杏果实   抗肿瘤作用，抑菌作用
氢化白果酸   C22H36O3   银杏果实   抗炎、抗过敏作用，抑菌作用
氢化白果亚酸   C21H34O3   银杏果实
从上表可以看出，银杏内酯类为特效血小板活化因子(PAF)拮抗剂。血小板活化因子是一种哺乳动物内源性生理活性物质，主要与过敏、溃疡、哮喘、血栓生成，某些炎症、脏器移植的异体排斥，冠心病人由于缺氧引起的心肌损伤等的发病密切相关，因此银杏内酯也主要用于上述疾病的治疗，在临床上主要用于老年痴呆、心脑血管疾病，支气管哮喘和脏器移植的异体排斥等。
目前，银杏树组织中的活性成分主要来源于银杏树叶、树皮和果实。由于银杏树受到气候、地域、收获季节的限制，更重要的是大面积砍伐银杏树会破坏生态平衡，不利于环境保护，因此必需开发其他资源来替代从银杏树中提取银杏活性成分药物。
发明内容：
本发明的目的是提供一种能发酵产生银杏内酯的微生物菌株(保藏日期：2006年04月17日，保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏单位地址：北京市海淀区中关村北一条13号，保藏编号：CGMCC No1677，菌种分类命名：Fusarium oxysporum)。该菌种是从银杏树皮内侧分离出来的菌种经过筛选获得的GB-1-3为Fusarium tricinctum(三线镰刀菌)，属半知茵亚门(Deuteromycotina)、丝孢纲(Hyphomycetes)、瘤座孢目(Tuberculariales)、瘤座孢科(Tuberculariaceae)、镰孢菌属真菌。。
本发明还提供了一种微生物发酵制备银杏内酯的方法，包括原始菌种的活化、摇瓶种子培养、发酵培养、以及后提取得各种步骤。
本发明所述的脱脂牛奶冻干管菌种，是指生产菌种的一种保存方式。它是在培养好的斜面试管中加入所需要比例的无菌脱脂牛奶溶液，使用接菌环轻轻刮下菌丝体并尽量打散，使之均匀分散成悬浮液。用无菌长滴管将悬浮液分装入无菌洁净安瓿管底部(0.9毫升/每支)。然后将分装好的安瓿管在-25至-40℃之间的干冰酒精中预冻1小时之后，将安瓿管放入真空器中，开动真空泵进行干燥，最后封管。
本发明所述的菌种斜面活化是指打开保存的冻干管，挑取菌种后均匀涂布在斜面培养基上，于28℃培养7天。
本发明所述的摇瓶种子培养是指采用菌株生长所需要的碳源、氮源、无机盐等，经过灭菌后，挖取适量菌体斜面，转移到种子摇瓶中，在自动旋转摇瓶机上震荡培养，200rpm，28℃，培养22-26小时获得摇瓶种子。
本发明所述的发酵是指采用菌株生长所需要的碳源、氮源、无机盐、消泡剂等，经过灭菌后，按照一定的接种量比例(10-15％)，转入摇瓶种子，在自动旋转摇瓶机上震荡培养，220-240rpm，28℃，培养140-150小时，获得发酵代谢产物。
本发明所述的发酵液后处理方法指发酵液放瓶后，在室温、常压下，使用转速为4000rpm的离心机离心30分钟，弃发酵上清液，收集菌丝体，55℃烘干至重量减半，用10倍量的水悬浮菌丝体，然后加入2倍水量的石油醚，搅拌均匀并分层厚，收集水相，重复上述石油醚萃取操作一次，目的是去除极性较小的脂肪酸等物质，对内酯类物质的提取影响较小。于水相中加入2N CaOH2，调节PH到8.0，使游离脂肪酸成盐沉淀(因为游离脂肪酸钙盐为疏水性物质，在水中的溶解度很小)，待沉淀充分，离心获得上清液1和沉淀1。沉淀1使用2倍量的水震荡洗涤，3000rpm离心20分钟，并重复两次，收集上清液2，与上清液1合并。然后加入等体积量的乙酸乙酯，萃取1次后，获得酯相1和水相1，其中水相1种加入2N HCl调节PH到4.7(本发明的实验结果表明，PH4.7-6.1范围内，有利于提高银杏内酯的收率)，之后加入3倍量的乙酸乙酯分3次充分萃取，获得的酯相2与酯相1合并。挥干乙酸乙酯获得提取物的干燥物。拌样上硅胶柱，使用氯仿-甲醇进行梯度洗脱，收集各馏分，获得银杏内酯A、B、白果内酯。
本发明的优点是：
1、替代植物来源，提供银杏活性成分的新资源
本发明为首次使用微生物发酵制备银杏内酯，完全替代了植物来源的银杏树，因此更有利环保、不破坏生态平衡，并且可在发酵过程中控制其产量与质量，不受地域与季节的变化的影响，是本发明的最大优点。
2、不含银杏叶提取物中的有害物质-银杏酚和银杏酸
银杏酚(Ginkgols)和银杏酸可引起严重的过敏反应。这类反应归于urshiol类型的烷酚，被认为自然界中最强烈的接触性过敏原中的部分。用银杏叶治疗病人，已有报道数例发生循环障碍包括过敏性休克。因此1999年8月，欧共体药品审查委员会兽用药品委员会发布银杏提取物总结报告(EMEA/MRL/668/99终稿)，对其中银杏酸作了规定(低于5mg/kg)。EMEA该文件强调该标准同样用于人，该标准也被北美国家所采纳。本发明微生物发酵制备的代谢产物中没有发现银杏酸。
3、生产成本低，无污染
本发明所使用的原料成本低，生产工艺先进，适于大规模工业化生产，而且生产设备可与其他微生物产品通用。此外，本产品的生产过程中无有害物质的排放，对周围环境无污染、无公害、符合环保要求。
本发明中的菌种保藏：
保藏日期：2006年04月17日。
保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。
保藏编号：CGMCC No1677。
菌种分类命名：Fusarium oxysporum。
附图说明：
图1为生产工艺流程图
图2为发酵液后处理工艺流程图
具体实施方式：
实施例1：本发明所述用于发酵制备银杏内酯的微生物菌种GB-1-3特征。
在PDA培养基上培养二天，生长白色棉絮状菌丝，菌落边缘纤毛状；培养到第三天，基内菌丝为红色；气生菌丝为白色，生长繁茂，布满全皿。光学显微镜下观察菌丝上无厚垣孢子，分生孢子分为大小两种孢子，大孢子为镰刀形，无色，3～5隔，大小为25～48×3～4.5μm；小孢子长椭圆形，无色，1～2隔，大小为12～15×2.4～3μm。使用摇瓶种子培养基获得菌丝体，提取其染色体，使用ITS引物、以该菌体的染色体为模版，进行PCR扩增，并对其PCR产物进行回收、克隆和测序，将所获序列在Genbank中进行比对、分析。同时结合考察培养特征、菌丝形态学，确定该菌株为Fusarium tricinctum(三线镰刀菌)，属半知茵亚门(Deuteromycotina)、丝孢纲(Hyphomycetes)、瘤座孢目(Tuberculariales)、瘤座孢科(Tuberculariaceae)、镰孢菌属真菌。
本发明所述微生物发酵制备银杏内酯的生产工艺
一、培养基
1、斜面培养基：
葡萄糖10g/L，马铃薯(去皮)200g/L，琼脂15g/L，用蒸馏水配置，pH7.2-7.4，121℃ 30min。
马铃薯浸汁的制备：取200g去皮马铃薯，切成小块，置于1000ml水中煮一个小时后过滤，用冷开水将滤液补足1000ml。
2、摇瓶种子培养基
葡萄糖  20g/L，花生饼粉  3.0g/L，NH4Cl  3.0g/L，KH2PO4  3.0g/L，MgSO47H2O  3.0g/L，CaCO34.0g/L，
NaAC·3H2O  1.0g/L，常水配置，灭菌前PH6.0。
分装40ml/250ml三角瓶，121℃ 30min。
3、发酵罐培养基
葡萄糖     10g/L，花生饼粉 10g/L，黄豆饼粉    10g/L，
玉米淀粉   40g/L，NH4Cl    3g/L， KH2PO4      3g/L，
NaAC·3H2O 3g/L， CaCO3    4g/L， MgSO4·7H2O 3g/L。
常水配置，灭菌前PH6.0，分装50ml/250ml三角瓶，121℃30min。
以上组成中花生饼粉、黄豆饼粉、玉米淀粉要求新鲜不发霉且过160目筛。
二、发酵生产
1、菌种的斜面活化：打开菌种脱脂牛奶冻干管，挑取少量粉末均匀涂布在上述灭过菌的斜面上，在28℃温度下培养5-7天，待菌苔生长到白色气生菌丝体致密、布满斜面、无杂菌，冰箱4保存。
2、摇瓶种子培养：将活化好的斜面菌种挖块1*1cm2接种到每个种子培养瓶中，在28℃温度下恒温震荡培养，200rpm，22-26小时，镜检菌丝生长舒展、染色深、无杂菌即可。
3、发酵：发酵培养基配方如上，灭菌后，将培养好的种子，按照10％的转种量，转入发酵瓶中，180-240rpm，25-28℃，培养时间为140-150小时。
4、终止发酵后，将发酵液在室温、常压下，使用转速为4000rpm的离心机离心30分钟，弃发酵上清液，收集菌丝体，55℃烘干至重量减半，用10倍量的水悬浮菌丝体，然后加入2倍水量的石油醚，搅拌均匀并分层厚，收集水相，重复上述石油醚萃取操作一次，目的是去除极性较小的脂肪酸等物质，对内酯类物质的提取影响较小。于水相中加入2N CaOH2，调节PH到8.0，使游离脂肪酸成盐沉淀(因为游离脂肪酸钙盐为疏水性物质，在水中的溶解度很小)，待沉淀充分，离心获得上清液1和沉淀1。沉淀1使用2倍量的水震荡洗涤，3000rpm离心20分钟，并重复两次，收集上清液2，与上清液1合并。然后加入等体积量的乙酸乙酯，萃取1次后，获得酯相1和水相1，其中水相1种加入2N HCl调节PH到4.7(本发明的实验结果表明，PH4.7-6.1范围内，有利于提高银杏内酯的收率)，之后加入3倍量的乙酸乙酯分3次充分萃取，获得的酯相2与酯相1合并。挥干乙酸乙酯获得提取物的干燥物。拌样上硅胶柱，使用氯仿-甲醇进行梯度洗脱，收集各馏分，获得银杏内酯A、B、白果内酯。
实施例2  本发明所述微生物发酵制备银杏内酯的检测
将菌株GD3-1的发酵液离心获得菌丝体，按照实施例1所述的萃取方法处理后，将乙酸乙酯相挥发后获得的粗提物干燥样品使用甲醇溶解，配置成7.6mg/ml溶液；分别将银杏内酯A、B、C和白果内酯溶解后，配置成含有上述各种标准品浓度为0.2mg/ml的溶液。以上述标准品溶液为对照，采用外标法和内加法相结合的方法，对样品进行分析。。标准品和样品各相近峰位的保留时间和峰面积的比较见表2。从表2中可以看出样品中确实有与标准品GA、GB、GC和BB重合的色谱峰。
                  表2  样品中与标准品保留时间相近的物质的色谱数据统计
  标准品(0.2mg/ml)   GA   GB   GC   BB
  保留时间t`R(min)   16.375   18.492   8.748   7.937
  峰面积Ar   50708   45875   58342   34699
  样品(7.6mg粗提物/ml)   GA｀   GB｀   GC｀   BB｀
  保留时间tR(min)   16.668   18.15   8.542   8.005
  峰面积Ar   3426   30169   11906   66403
  样品(7.6mg粗提物/ml)+标准品(0.2mg/ml)
  保留时间tR(min)   16.59   18.775   8.757   8.173
  峰面积Ar   53995   86291   65164   96603
实施例3  本发明所述微生物发酵产物中银杏内酯成分的一级质谱鉴定
以GD 3-1为出发菌株摇瓶培养，菌丝体按照提取工艺处理后获得的乙酸乙酯提取物，以标准品(银杏内酯A、B、C和白果内酯)作对照，在相同条件下进行HPLC分析，采集与标准品保留时间接近的色谱峰，浓缩后再以标准品作对照，进行质谱分析。标准品BB、GA和GB质谱分析结果的比较及解析见表4，BB标准品与样品质谱分析结果的比较见表5，GA标准品与样品质谱分析结果的比较见表6，GB标准品与样品质谱分析结果的比较见表7。
             表4  标准品质谱分析结果的比较及解析
  图谱属性   BB   GA   GB   解析
  标准品分子量   326   408   424   M
  正离子全谱(m/z)+   426.0833.4838.7855.5   442.0463.0865.7886.8   M+NH4 +M+K+2M+NH4 +2M+Na+2M+K+
  正离子二级谱(m/z)+   440.5425.7   456.6442.5378.6   M+CH3OH+H+M+NH4 +M-CO2+H+
  负离子全谱(m/z)-   325.0370.6650.9   406.9452.8814.9   422.9458.9468.6847.0   M-1M+Cl-M+HCOO-2M-1
  负离子二级谱(m/z)-   325.0306.5250.9206.8163.3   406.8378.6351.0   423.0394.7367.0   M-1[M-H3O+][M-CO-H+]-[M-2CO-H+]-250.9-CO2206.8-CO2
                 表5  白果内酯及其样品的结果比较
  图谱属性   BB标准品   BB｀样品   解析
  负离子全谱   325.0650.9   325.0   M-12M-1
325负离子二级谱   325.8325.0306.5250.9206.8163.3   326.3325.2306.1250.9206.9163.2 M-1[M-H3O+]-[M-CO-H+]-250.9-CO2206.9-CO2
              表6  GA标准品及其样品的结果比较
  图谱属性   GA标准品   GA｀样品   解析
正离子全谱   426.0833.4839.7   425.9   M+NH4 +2M+NH4 +2M+Na+
426正离子二级谱   441.7440.5426.5425.7   441.8440.6426.4425.0 M+CH3OH+H+M+NH4 +
负离子全谱   406.9452.8811.0 452.9810.9   M-1M+HCOO-2M-1
453负离子二级谱   452.5406.8378.6351.0   453.1406.9378.6350.9   M+HCOO-M-1M-CO-H+M-2CO-H+
               表7  GB标准品及其样品的结果比较
  图谱属性   GB标准品   GB｀样品   解析
  正离子全谱   442.0865.7886.7   442.0463.4   M+NH4 +M+K+2M+NH4 +2M+K+
442.0正离子二级谱   457.7456.6442.5378.6   457.6456.6442.2378.7 M+CH3OH+H+M+NH4 +M-CO2+H+
负离子全谱   422.9468.6847.0   423.0458.9   M-1M+Cl-M+HCOO-2M-1
423.0负离子二级谱   424.0423.0394.7367.0   424.4423.0394.8366.9 M-1M-CO-H+M-2CO-H+
以上数据表明，发酵液提取样品中存在与标准品BB、GA、GB保留时间接近，准分子离子相同的物质。
实施例4本发明所述微生物发酵产物中银杏内酯B成分的高效液相/电喷雾质谱(HPLC/ESI-MS)分析鉴定
将GD3-1发酵后的菌丝体乙酸乙酯萃取物经硅胶柱层析，氯仿-甲醇梯度洗脱，发现氯仿-甲醇96∶4的流出液中含有与银杏内酯B(GB)保留时间一致的物质；截留该段馏分，得到大约50μg的样品(GB｀)，用4mL甲醇溶解，以GB标准品作对照，在相同色谱和质谱条件下进行高效液相/电喷雾质谱(HPLC/ESI-MS)分析，发现两者一致，进一步确认了银杏内酯B的存在。

Claims (5)

1、微生物发酵制备银杏内酯的微生物菌，其特征在于：采用的是三线镰刀菌，保藏号CGMCC No1677，菌种分类命名：Fusariumoxysporum。
2、一种如权利要求1所述的菌种三线镰刀菌的培育方法，其特征在于：摇瓶种子的制备：灭菌前培养基Ph6.0，挖块接种1*1cm2的生产菌株斜面菌苔，转数200rpm，温度为25-28℃，培养时间为30-36小时。
3、根据权利要求2所述的三线镰刀菌的培育方法，其特征在于：摇瓶发酵工艺为：灭菌前培养基Ph6.0，按照10-15％的接种量接种，搅拌转数200-240rpm，温度为25-28℃，培养时间为140-148小时。
4、一种利用微生物发酵制备银杏内酯的方法，其特征在于：所使用的生产菌种GB-1-3为三线镰刀菌，属半知茵亚门、丝孢纲、瘤座孢目、瘤座孢科、镰孢菌属真菌，其工艺如下：(1)培养基  种子和发酵培养基中的营养采用碳源和氮源，其中碳源可为葡萄糖、淀粉、糊精、饴糖，氮源可为蛋白胨、花生饼粉、黄豆饼粉、牛肉膏、鱼粉，此外还需要添加无机盐，NH4Cl、KH2PO4、MgSO4.7H2O、CH3COONa、CaCO3，(2)发酵工艺  使用该生产菌株，可通过摇瓶二级发酵的方法，获得其代谢产物——银杏内酯，培养方法包括：原始菌种的活化、摇瓶种子的制备、摇瓶发酵、发酵液的后处理、提取纯化制备银杏内酯。
5、根据利要求4所述的一种利用微生物发酵制备银杏内酯的方法，其特征在于：其发酵液后处理工艺如下：
菌体粗提物用10倍量的水悬浮，所得料液加入2倍量的石油醚，萃取2次，分离出醚相和水相；于水相中加入2N CaOH2，调节PH到8.0，使游离脂肪酸成盐沉淀，待沉淀充分，3000rpm离心20min获得上清液1和沉淀1；沉淀1使用2倍量的水震荡洗涤，3000rpm离心20分钟，并重复两次，得到沉淀和上清液2，收集上清液2与上清液1合并，然后加入等体积量的乙酸乙酯，萃取1次后，获得酯相1和水相1，其中水相1中加入2N HCl调节PH到4.7，之后加入3倍量的乙酸乙酯分3次充分萃取，获得的酯相2与酯相1合并；挥干乙酸乙酯获得提取物的干燥物，拌样上硅胶柱，使用氯仿-甲醇进行梯度洗脱，收集各馏分，获得银杏内酯A、B、白果内酯。
CN 200610103651 2006-07-26 2006-07-26 微生物发酵制备银杏内酯的微生物菌及制备银杏内酯方法 Pending CN1944626A (zh)

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