CN100545264C - 一种重组人角质细胞生长因子的生产方法 - Google Patents
一种重组人角质细胞生长因子的生产方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN100545264C CN100545264C CNB2005100854968A CN200510085496A CN100545264C CN 100545264 C CN100545264 C CN 100545264C CN B2005100854968 A CNB2005100854968 A CN B2005100854968A CN 200510085496 A CN200510085496 A CN 200510085496A CN 100545264 C CN100545264 C CN 100545264C
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- kgf
- leu
- growth factor
- gst
- pro
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 title claims abstract description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 5
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims abstract description 34
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 25
- 108090000385 Fibroblast growth factor 7 Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 22
- 101001060261 Homo sapiens Fibroblast growth factor 7 Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 102000057239 human FGF7 Human genes 0.000 claims abstract description 19
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 16
- 108010013369 Enteropeptidase Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 102100029727 Enteropeptidase Human genes 0.000 claims abstract description 12
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 12
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 claims abstract description 11
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 claims abstract description 5
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims abstract description 5
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims abstract description 5
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims abstract description 5
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 claims abstract description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims abstract description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 14
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 12
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 10
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 7
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims description 7
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 claims description 6
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 claims description 6
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 claims description 6
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 claims description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 6
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 claims description 6
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 5
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 claims description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 4
- FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 6-methoxy-1,2,3,4-tetrahydroquinoline Chemical compound N1CCCC2=CC(OC)=CC=C21 FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 3
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 claims description 3
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 2
- 102100028071 Fibroblast growth factor 7 Human genes 0.000 claims 5
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims 3
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 18
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 abstract description 17
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 abstract description 6
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 abstract description 5
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 abstract description 5
- 102000003972 Fibroblast growth factor 7 Human genes 0.000 abstract description 3
- 238000005215 recombination Methods 0.000 abstract description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 49
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 16
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 4
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 102220023257 rs387907546 Human genes 0.000 description 4
- 238000005267 amalgamation Methods 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 3
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 102220369447 c.1352G>A Human genes 0.000 description 2
- 102220369445 c.668T>C Human genes 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 2
- 206010020718 hyperplasia Diseases 0.000 description 2
- 210000004347 intestinal mucosa Anatomy 0.000 description 2
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 2
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 102220023258 rs387907548 Human genes 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YASYEJJMZJALEJ-UHFFFAOYSA-N Citric acid monohydrate Chemical compound O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O YASYEJJMZJALEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000005979 Citrus limon Nutrition 0.000 description 1
- 244000131522 Citrus pyriformis Species 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 241000672609 Escherichia coli BL21 Species 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 102000001621 Mucoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010093825 Mucoproteins Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 1
- DPDMMXDBJGCCQC-UHFFFAOYSA-N [Na].[Cl] Chemical compound [Na].[Cl] DPDMMXDBJGCCQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002821 alveolar epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 210000000424 bronchial epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001156 gastric mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 210000002175 goblet cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 210000000442 hair follicle cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 231100000652 hormesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 229940045641 monobasic sodium phosphate Drugs 0.000 description 1
- 230000037311 normal skin Effects 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000003946 protein process Effects 0.000 description 1
- 238000011127 radiochemotherapy Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 230000008521 reorganization Effects 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 206010041823 squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及一种重组人角质细胞生长因子的生产方法，特别涉及一种利用基因重组技术制备人角质细胞生长因子的生物活性多肽的方法，该方法包括以下步骤：a.人工合成人角质细胞生长因子氨基酸编码区相对应的基因；b.步骤a得到的基因与适宜的表达载体上的谷胱甘肽S-转移酶蛋白基因3′端融合，该基因中间部分含凝血酶或者肠激酶识别位点；c.将含有融合蛋白编码基因的适宜的表达载体转化适宜的大肠杆菌获得基因工程菌；d.该基因工程菌经发酵后，经提取层析纯化步骤，制备出GST-KGF融合蛋白；e.再经凝血酶或者肠激酶切割后，分离纯化获得重组入角质细胞生长因子。
Description
技术领域：
本发明涉及一种生物活性多肽的制备方法，特别涉及一种利用基因重组技术制备人角质细胞生长因子的生物活性多肽的方法。
背景技术：
人角质细胞生长因子(英文名称：Human Keratinocyte Growth factor，简称：KGF或KGF1)是目前已知能促使非成纤维上皮细胞(特别是角质细胞)增殖的细胞因子。KGFmRNA的组织学分布有其特殊性：来自胚胎、新生儿和成人上皮组织的几种基质成纤维细胞系中有KGFmRNA的表达，在人肾脏、胃肠道中也有表达，而在胶质细胞、肺、脑和各种上皮细胞(包括鳞状细胞癌、支气管上皮细胞等)中未检测到KGF mRNA。KGF mRNA的这种组织学分布提示KGF在真皮中产生而不在皮下。KGF对小鼠BALB/MK细胞具有促有丝***作用，同时KGF具有影响角质细胞的分化和成熟。(Rubin et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86：802-806(1989))。同时，KGF对非角质上皮细胞也有刺激作用：在体内，KGF诱导正常皮肤附属结构(如皮质细胞和毛囊细胞)，肝脏细胞和呼吸性膜上皮细胞(如II型肺细胞)的增生和分化，刺激肠黏膜细胞(如胃腺小肠腺产黏蛋白的杯状细胞，结肠的隐窝细胞和肠道内的其它上皮细胞)的增生和生长。(WO94/23032)。
目前KGF已经用于人体血液性肿瘤放化疗引起的消化道溃疡的治疗。
目前制备KGF主要用重组表达方法，在W90/108771、WO96/11951中有描述。
现有技术工艺步骤极其繁杂，同时，KGF对大肠杆菌宿主具有极强的毒性，KGF在普通的大肠杆菌中表达效率很低，为克服以上缺陷，本专利提供了一种利用融合表达的方法制备重组KGF的制备方法。该方法大大简化了工艺，大大提高了KGF的产量，从而可大规模工业化生产KGF。
发明内容：
本发明提供一种制备人角质细胞生长因子的方法，该方法包括以下步骤：
a.人工合成人角质细胞生长因子氨基酸编码区相对应的基因；
b.步骤a得到的基因与适宜的表达载体上的谷胱甘肽S-转移酶(GlutathioneS-transferase：GST，)蛋白基因3′端融合，该基因中间部分含凝血酶或者肠激酶识别位点；
c.将含有融合蛋白编码基因的适宜的表达载体转化适宜的大肠杆菌获得基因工程菌；
d.该基因工程菌经发酵后，经提取层析纯化步骤，制备出GST-KGF融合蛋白；
e.再经凝血酶或者肠激酶切割后，分离纯化获得重组人角质细胞生长因子。
其中所述人工合成人角质细胞生长因子氨基酸编码区相对应的基因是现有技术，可以通过现有技术获得，如人工合成的方法。
步骤b.中所述谷胱甘肽S-转移酶(Glutathione S-transferase：GST)蛋白基因是现有技术，可以在市场上购买得到，其中的GST蛋白和人角质细胞生长因子之间通过肠激酶酶切识别位点-(ASP)N Lys-连接，结构为X_(ASP)N Lys_KGF1，其中(Asp)为天冬氨酸，X为GST，n为2、3或者4。
或
所述融合蛋白中GST蛋白和人角质细胞生长因子之间通过凝血酶识别位点X-P2-P3-Pro-P1.连接，连接方式为X-P2-P3-Pro-P1_KGF1，其中X为GST，P1为Arg或Lys，P2、P3为疏水性氨基酸(选自：Leu、Val、ILe、Met、Ala、Cys或Trp)，这里P2优选Leu，P3优选Val，其氨基酸序列优选为X-Leu-Val-Pro-Arg-KGF1，其中X为GST。
本发明优选的GST-KGF1融合蛋白的编码DNA序列见序列表1和3。
本发明的GST-KGF1融合蛋白的氨基酸序列见序列表2和4。
本发明的制备方法，其特征在于，其中所述发酵是将合格的重组人角质细胞生长因子基因工程菌接种到发酵罐中培养，其中加入IPTG诱导融合蛋白的表达。
本发明的制备方法，其中所述提取层析纯化步骤(1)包括离心收集菌体，破菌、离心收集破菌液上清的步骤，将收集的上清上Heparin亲和层析柱，用平衡缓冲液洗去杂蛋白，然后用含适宜浓度的NaCl洗脱GST-KGF1融合蛋白，将洗脱的GST-KGF1融合蛋白上Sepharose 6B亲和层析柱，用适当浓度的GSH洗脱融合蛋自，所得融合蛋白用高纯度的Enterkinase或Thrombin做酶切处理，将酶切的融合蛋白上SP Sepharose F.F.柱去掉GST蛋白，将得到的KGF1上Heparin亲和层析柱层析，用含适宜浓度的NaCl洗脱KGF1，得到纯度95％以上的纯KGF1。
本发明还提供用本发明的方法制备的人角质细胞生长因子的药物组合物，该组合物是以药物制剂形式存在的，优选的是冻干注射剂，单位剂量的注射剂即每支注射剂，其配方组成如下：
角质细胞生长因子 6.6mg
甘露醇 5～20mg
柠檬酸(一水) 2.1mg
柠檬钠(二水) 2.94mg
或
角质细胞生长因子 6.6mg
甘露醇 5～20mg
磷酸二氢钠 0.93mg
磷酸氢二钠 1.73mg
氯化钠 10mg
本发明是根据已经发表的人角质细胞生长因子一级结构的氨基酸编码序列(该序列可按照遗传密码的通用性、简并性和大肠杆菌对遗传密码使用的偏好性原则进行改变)，人工合成该双链DNA全序列。本发明的主要特点在于，分别将该编码基因片段克隆入适宜表达载体，(优选的如：pGEX-4T-3，可以从市场上买到)中构建形成重组质粒，然后将重组质粒转化适宜的大肠杆菌，优选的如：BL21(DE3)(可以从市场上买到)，经筛选得到的具有高表达能力的基因工程菌。该基因工程菌以GST为融合伴侣，融合表达KGF1，即形成GST-KGF1融合蛋白，所表达的融合蛋白经过适宜的步骤分离纯化后，用适宜的具有特异序列识别能力的蛋白酶如用肠激酶(Enterkinase)或凝血酶(Thrombin)将KGF1从融合蛋白上切割下来，经过高度分离纯化，得到KGF1纯品。经过N-末端氨基酸序列测定、质谱分子量测定、等电点测定、肽图分析以及生物活性检测等分析，结果表明我们所表达的人角质细胞生长因子与天然的人角质细胞生长因子各指标完全一致。
本发明使用的分子克隆方法的基本原理，以及操作步骤中所使用的原料，溶剂，工具属于现有技术领域，如DNA的合成方法，酶切位点的选择等，本发明使用的表达载体，宿主菌等都为商业化载体或菌种。
以上方法的具体操作步骤可以见本发明的实施例。
本发明的优点主要表现在：
(1)、本发明中GST-KGF1融合蛋白以可溶的形式存在(以肠激酶Enterkinase识别序列连接)，从而大大简化生产工艺和大大提高生产效率；
(2)、通过上述工艺得到的KGF1，其结构等理化特性和生物学活性与文献报道的结构完全一致，避免通常重组蛋白质药物N端前面多出一个Met甚至多个氨基酸残基，从而可降低其免疫原性；
附图说明：
图1 pGEX-4T-3质粒图谱和多克隆位点及序列
图2 pGEX-4T-3-KGF1重组质粒的构建示意图
图3 GST-E-KGF1融合蛋白(肠激酶识别序列)融合蛋白表达、肠激酶处理后纯化的人角质细胞生长因子电泳图谱
具体实施方式：
以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。
实施例1
1.表达载体的选择
选用Novagen公司的pGEX系列表达载体如pGEX-4T-3作为表达载体，pGEX-4T-3是用于高效融合表达蛋白和多肽的大肠杆菌表达载体***，目的蛋白或多肽以225个氨基酸残基的谷胱甘肽S转移酶(GST)作为融合伴侣。(见附图1)。
2.基因的设计和合成：
根据文献报道的KGF1 DNA编码序列(序列可根据遗传密码的通用性、简并性原则改变，但不改变氨基酸组成和排列)设计编码成熟入KGF1序列，同时在该序列的5-端加上BamHI识别序列GGATCC和肠激酶(Enterokinase)酶切位点编码序列或凝血酶(thrombin)酶切位点编码序列；在3端加上Xho I的识别序列CTCGAG；
3.将上述合成的具有不同酶切位点的核酸片段分别***到pGEX-4T-3的Kpn和Xho I位点由表达载体上的融合伴侣GST蛋白的编码序列与***的KGF1DNA编码序列共同形成序列2或序列4的NDA序列，该序列编码的氨基酸序列为序列1和序列3，见序列表1、2、3、4。形成重组质粒，转化大肠杆菌BL21，经筛选即得高效表达基因工程菌。有关操作方法参见《分子克隆手册》冷泉港第二版；构建图谱见附图2
4.将细菌接种到LB或其它适宜的培养基中，当工程菌长到适宜浓度时如对数中期，加入适宜浓度的IPTG(如0.1～0.5mM)，可见明显的融合蛋白表达条带；
5.将培养过夜的种子液，接种到发酵罐适宜的培养基(如LB、TB或其它适宜培养基中)中培养，细菌培养至适宜的程度时，加IPTG诱导培养一定时间(如：3-4小时)。离心收菌，将菌体悬浮在适宜的缓冲液中(如磷酸盐缓冲液、Tris-HCL缓冲液等)，超生波或高压匀浆破菌。将破碎的菌液离心，收集上清液，弃沉淀。
将收集的上清上Heparin亲和层析柱，用平衡缓冲液洗去杂蛋白，然后用含适宜浓度的NaCl洗脱GST-KGF1融合蛋白，将洗脱的GST-KGF1融合蛋白上Sepharose 6B亲和层析柱，用适当浓度的GSH洗脱融合蛋白，所得融合蛋白用高纯度的Enterkinase或Thrombin做酶切处理，将酶切的融合蛋白上SP Sepharose F.F.柱去掉GST蛋白，将得到的KGF1上Heparin亲和层析柱层析，用含适宜浓度的NaCl洗脱KGF1，得到纯度95％以上的纯KGF1。纯化后得到的KGF1电泳附图3：
实施例2
根据实施例1所得的rhKGF的理化性质测定
1、N-末端15个氨基酸序列测定
将上述两种方法得到的重组人角质细胞生长因子，进行N-末端测定，测定结果如下：
N-Ser-Tyr-Asp-Tyr-Met-Glu-Gly-Gly-Asp-Ile-Arg-Val-Arg-Arg-Leu-C
与预期结果完全一致。
2、量质谱测定
采用FAB方法测定，两种方法得到的重组人角质细胞生长因子的分子量为，16278.5，与理论预测一致。
3、生物学活性测定：
利用KGF1促进4MBr-5细胞增殖的特点进行KGF1生物活性的测定。
测得结果为：
序列表
<110>成都芝田生物工程有限公司
<120>一种重组人角质细胞生长因子的生产方法
<160>4
<210>1
<211>1101
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
atgtccccta tactaggtta ttggaaaatt aagggccttg tgcaacccac tcgacttctt 60
ttggaatatc ttgaagaaaa atatgaagag catttgtatg agcgcgatga aggtgataaa 120
tggcgaaaca aaaagtttga attgggtttg gagtttccca atcttcctta ttatattgat 180
ggtgatgtta aattaacaca gtctatggcc atcatacgtt atatagctga caagcacaac 240
atgttgggtg gttgtccaaa agagcgtgca gagatttcaa tgcttgaagg agcggttttg 300
gatattagat acggtgtttc gagaattgca tatagtaaag actttgaaac tctcaaagtt 360
gattttctta gcaagctacc tgaaatgctg aaaatgttcg aagatcgttt atgtcataaa 420
acatatttaa atggtgatca tgtaacccat cctgacttca tgttgtatga cgctcttgat 480
gttgttttat acatggaccc aatgtgcctg gatgcgttcc caaaattagt ttgttttaaa 540
aaacgtattg aagctatccc acaaattgat aagtacttga aatccagcaa gtatatagca 600
tggcctttgc agggctggca agccacgttt ggtggtggcg accatcctcc aaaatcggat 660
ctggttccgc gttcctacga ctacatggaa ggtggtgaca tccgtgttcg tcgtctgttc 720
tgccgtaccc agtggtacct gcgtatcgac aaacgtggta aagttaaagg tacccaggaa 780
atgaaaaaca actacaacat catggaaatc cgtaccgttg ctgttggtat cgttgctatc 840
aaaggtgttg aatccgaatt ctacctggct atgaacaaag aaggtaaact gtacgctaaa 900
aaagaatgca acgaagactg caacttcaaa gaactgatcc tggaaaacca ctacaacacc 960
tacgcttccg ctaaatggac ccacaacggt ggtgaaatgt tcgttgctct gaaccagaaa 1020
ggtatcccgg ttcgtggtaa aaaaaccaaa aaagaacaga aaaccgctca cttcctgccg 1080
atggctatca cctaactcgag 1101
<210>2
<211>364
<212>PRT
<213>人工序列
<400>2
Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln
5 10 15
Pro Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu
20 25 30
His Leu Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys
35 40 45
Phe Glu Leu Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp
50 55 60
Gly Asp Val Lys Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile
65 70 75
Ala Asp Lys His Asn Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala
80 85 90
Glu Ile Ser Met Leu Glu Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly
95 100 105
Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val
110 115 120
Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu Met Leu Lys Met Phe Glu Asp
125 130 135
Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn Gly Asp His Val Thr His
140 145 150
Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp Val Val Leu Tyr Met
155 160 165
Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu Val Cys Phe Lys
170 175 180
Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr Leu Lys Ser
185 190 195
Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala Thr Phe
200 205 210
Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Val Pro Arg Ser
215 220 225
Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly Asp Ile Arg Val Arg Arg Leu Phe
230 235 240
Cys Arg Thr Gln Trp Tyr Leu Arg Ile Asp Lys Arg Gly Lys Val
245 250 255
Lys Gly Thr Gln Glu Met Lys Asn Asn Tyr Asn Ile Met Glu Ile
260 265 270
Arg Thr Val Ala Val Gly Ile Val Ala Ile Lys Gly Val Glu Ser
275 280 285
Glu Phe Tyr Leu Ala Met Asn Lys Glu Gly Lys Leu Tyr Ala Lys
290 295 300
Lys Glu Cys Asn Glu Asp Cys Asn Phe Lys Glu Leu Ile Leu Glu
305 310 315
Asn His Tyr Asn Thr Tyr Ala Ser Ala Lys Trp Thr His Asn Gly
320 325 330
Gly Glu Met Phe Val Ala Leu Asn Gln Lys Gly Ile Pro Val Arg
335 340 345
Gly Lys Lys Thr Lys Lys Glu Gln Lys Thr Ala His Phe Leu Pro
350 355 360
Met Ala Ile Thr
364
<210>3
<211>1122
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
atgtccccta tactaggtta ttggaaaatt aagggccttg tgcaacccac tcgacttctt 60
ttggaatatc ttgaagaaaa atatgaagag catttgtatg agcgcgatga aggtgataaa 120
tggcgaaaca aaaagtttga attgggtttg gagtttccca atcttcctta ttatattgat 180
ggtgatgtta aattaacaca gtctatggcc atcatacgtt atatagctga caagcacaac 240
atgttgggtg gttgtccaaa agagcgtgca gagatttcaa tgcttgaagg agcggttttg 300
gatattagat acggtgtttc gagaattgca tatagtaaag actttgaaac tctcaaagtt 360
gattttctta gcaagctacc tgaaatgctg aaaatgttcg aagatcgttt atgtcataaa 420
acatatttaa atggtgatca tgtaacccat cctgacttca tgttgtatga cgctcttgat 480
gttgttttat acatggaccc aatgtgcctg gatgcgttcc caaaattagt ttgttttaaa 540
aaacgtattg aagctatccc acaaattgat aagtacttga aatccagcaa gtatatagca 600
tggcctttgc agggctggca agccacgttt ggtggtggcg accatcctcc aaaatcggat 660
ctggttccgc gtggatccga tgacgatgac aagtcctacg actacatgga aggtggtgac 720
atccgtgttc gtcgtctgtt ctgccgtacc cagtggtacc tgcgtatcga caaacgtggt 780
aaagttaaag gtacccagga aatgaaaaac aactacaaca tcatggaaat ccgtaccgtt 840
gctgttggta tcgttgctat caaaggtgtt gaatccgaat tctacctggc tatgaacaaa 900
gaaggtaaac tgtacgctaa aaaagaatgc aacgaagact gcaacttcaa agaactgatc 960
ctggaaaacc actacaacac ctacgcttcc gctaaatgga cccacaacgg tggtgaaatg 1020
ttcgttgctc tgaaccagaa aggtatcccg gttcgtggta aaaaaaccaa aaaagaacag 1080
aaaaccgctc acttcctgcc gatggctatc acctaactcg ag 1122
<210>4
<211>371
<212>PRT
<213>人工序列
<400>4
Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln
1 5 10 15
Pro Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu
20 25 30
His Leu Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys
35 40 45
Phe Glu Leu Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp
50 55 60
Gly Asp Val Lys Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile
65 70 75
Ala Asp Lys His Asn Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala
80 85 90
Glu Ile Ser Met Leu Glu Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly
95 100 105
Val Ser Arg Ile AIa Tyr Ser Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val
110 115 120
Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu Met Leu Lys Met Phe Glu Asp
125 130 135
Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn Gly Asp His Val Thr His
140 145 150
Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp Val Val Leu Tyr Met
155 160 165
Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu Val Cys Phe Lys
170 175 180
Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr Leu Lys Ser
185 190 195
Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala Thr Phe
200 205 210
Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Val Pro Arg Gly
215 220 225
Ser Asp Asp Asp Asp Lys Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly Asp
230 235 240
Ile Arg Val Arg Arg Leu Phe Cys Arg Thr Gln Trp Tyr Leu Arg
245 250 255
Ile Asp Lys Arg Gly Lys Val Lys Gly Thr Gln Glu Met Lys Asn
260 265 270
Asn Tyr Asn Ile Met Glu Ile Arg Thr Val Ala Val Gly Ile Val
275 280 285
Ala Ile Lys Gly Val Glu Ser Glu Phe Tyr Leu Ala Met Asn Lys
290 295 300
Glu Gly Lys Leu Tyr Ala Lys Lys Glu Cys Asn Glu Asp Cys Asn
305 310 315
Phe Lys Glu Leu Ile Leu Glu Asn His Tyr Asn Thr Tyr Ala Ser
320 325 330
Ala Lys Trp Thr His Asn Gly Gly Glu Met Phe Val Ala Leu Asn
335 340 345
Gln Lys Gly Ile Pro Val Arg Gly Lys Lys Thr Lys Lys Glu Gln
350 355 360
Lys Thr Ala His Phe Leu Pro Met Ala Ile Thr
365 370 371
Claims (7)
1、一种人角质细胞生长因子的制备方法，包括以下步骤：
a.人工合成人角质细胞生长因子氨基酸编码区相对应的基因；
b.步骤a得到的基因与适宜的表达载体上的GST蛋白基因3′端融合，中间含肠激酶或者凝血酶识别位点；
c.将含有融合蛋白编码基因的适宜的表达载体转化适宜的大肠杆菌获得基因工程菌；
d.该基因工程菌经发酵后，经提取层析纯化步骤，制备出GST-KGF融合蛋白；
e.再经肠激酶或者凝血酶切割后，分离纯化获得重组人角质细胞生长因子；
其中所述GST-KGF融合蛋白的氨基酸序列见序列表2和4。
2、根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，上述融合蛋白中GST蛋白和人角质细胞生长因子之间通过肠激酶酶切识别位点-Leu-Val-Pro-Arg-连接，结构为X-Leu-Val-Pro-Arg-KGF，其中X为GST蛋白，Leu为亮氨酸，Val为缬氨酸，Pro为脯氨酸，Arg为精氨酸。
3、根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，其中所述融合蛋自中GST蛋白和人角质细胞生长因子之间通过凝血酶(Thrombin)酶切识别位点X-P2-P3-Pro-P1.连接，连接方式为X-P4-P3-Pro-P1-KGF，其中X为GST蛋白，P1为Arg或Lys，P2、P3为疏水性氨基酸。
4、根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，其中所述疏水性氨基酸选自Leu、Val、ILe、Met、Ala、Cys或Trp。
5、根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，结构式X-P4-P3-Pro-P1-KGF中，P1为Arg，P2为Val、P3为Leu，其序列表达式为X-Leu-Val-Pro-Arg-KGF，其中X为GST蛋白，KGF序列为已报道的人缺失N-端23个氨基酸残基的含140个氨基酸的KGF。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，其中所述GST-KGF融合蛋白的编码DNA序列见序列表1和3。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，其中所述发酵是将合格的重组人角质细胞生长因子基因工程菌接种到发酵罐中培养，其中加入IPTG诱导融合蛋白的表达，提取层析纯化步骤包括离心收集菌体，破菌、离心收集破菌液上清的步骤，将收集的上清上Heparin亲和层析柱，用平衡缓冲液洗去杂蛋白，然后用含适宜浓度的NaCl洗脱GST-KGF融合蛋白，将洗脱的GST-KGF融合蛋白上Sepharose 6B亲和层析柱，用适当浓度的GSH洗脱融合蛋白，所得融合蛋白用高纯度的Enterkinase或Thrombin做酶切处理，将酶切的融合蛋白上SP Sepharose F.F.柱去掉GST蛋白，将得到的KGF上Heparin亲和层析柱层析，用含适宜浓度的NaCl洗脱KGF，得到纯度95％以上的KGF。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNB2005100854968A CN100545264C (zh) | 2005-07-22 | 2005-07-22 | 一种重组人角质细胞生长因子的生产方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNB2005100854968A CN100545264C (zh) | 2005-07-22 | 2005-07-22 | 一种重组人角质细胞生长因子的生产方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN1766107A CN1766107A (zh) | 2006-05-03 |
| CN100545264C true CN100545264C (zh) | 2009-09-30 |
Family
ID=36742224
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CNB2005100854968A Expired - Fee Related CN100545264C (zh) | 2005-07-22 | 2005-07-22 | 一种重组人角质细胞生长因子的生产方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN100545264C (zh) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101721683B (zh) * | 2009-11-10 | 2015-06-24 | 苏州金盟生物技术有限公司 | 人角质细胞生长因子1在制备治疗肛裂的药物中的应用 |
| CN102242124B (zh) * | 2010-05-10 | 2013-05-22 | 齐鲁制药有限公司 | 改造的角化细胞生长因子基因及其在酵母中的表达 |
| CN103952427A (zh) * | 2014-05-11 | 2014-07-30 | 浙江大学 | 人***瘤病毒6bE7蛋白表达及应用 |
| CN104059933A (zh) * | 2014-05-11 | 2014-09-24 | 浙江大学 | 人***瘤病毒11e7蛋白表达及应用 |
| CN106226511B (zh) * | 2016-07-28 | 2018-04-06 | 苏州金盟生物技术有限公司 | 一种重组人角质细胞生长因子生物学活性检测方法 |
| CN109456399A (zh) * | 2017-09-06 | 2019-03-12 | 山东益华生物科技有限公司 | 植物作为宿主在表达角质细胞生长因子中的应用 |
| KR20210138014A (ko) * | 2019-02-24 | 2021-11-18 | 온코시미스 바이오테크 프라이빗 리미티드 | 박테리아에 의한 재조합 glp-1 펩타이드의 연속 생성 방법 |
-
2005
- 2005-07-22 CN CNB2005100854968A patent/CN100545264C/zh not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| 角质细胞生长因子在大肠杆菌中的表达、纯化及生物学活性研究. 黄新强.中国优秀硕士学位论文全文数据库. 2002 |
| 角质细胞生长因子在大肠杆菌中的表达、纯化及生物学活性研究. 黄新强.中国优秀硕士学位论文全文数据库. 2002 * |
| 重组人角质细胞生长因子-2基因的克隆和表达. 王金凤等.军事医学科学院院刊，第1期. 2004 |
| 重组人角质细胞生长因子-2基因的克隆和表达. 王金凤等.军事医学科学院院刊，第1期. 2004 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1766107A (zh) | 2006-05-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN100545264C (zh) | 一种重组人角质细胞生长因子的生产方法 | |
| CN110845603B (zh) | 人胶原蛋白17型多肽、其生产方法和用途 | |
| AU648670B2 (en) | A-C-B Proinsulin, method of manufacturing and using same, and intermediates in insulin production | |
| CN100564517C (zh) | 一种蝎抗神经胶质瘤肽及其制备方法和应用 | |
| CN108912221A (zh) | 用于生产重组融合蛋白的辅助蛋白、编码基因、重组融合蛋白、重组表达载体及制备方法 | |
| CN110724187B (zh) | 一种高效表达利拉鲁肽前体的重组工程菌及其应用 | |
| CN101240033B (zh) | 一种促胰岛素分泌肽与人血清白蛋白的融合蛋白及其制备方法 | |
| CN101514229B (zh) | 人干扰素α衍生物及其聚乙二醇化修饰物 | |
| CN107353346A (zh) | 一种由猪白蛋白与猪干扰素γ组成的融合蛋白及其制备方法和一种重组猪长效干扰素γ | |
| CN101875699B (zh) | 人表皮生长因子和金属硫蛋白的融合蛋白及其制备方法和应用 | |
| CN100528899C (zh) | 含有肽载体和表皮生长因子的融合蛋白和核酸及其用途 | |
| CN101434954A (zh) | 中华蜜蜂王浆主蛋白AccMRJP7基因及其编码蛋白 | |
| CN101671390B (zh) | 人干扰素α衍生物及其聚乙二醇化修饰物的制备和用途 | |
| CN113372452B (zh) | 一种细粒棘球绦虫重组蛋白CTLA4-IgV-EgG1Y162及其应用 | |
| CN100418983C (zh) | 人胰高血糖素相关肽-2类似物 | |
| CN102391377B (zh) | 一种可诱导和激活癌靶向t细胞的融合蛋白及制备方法及用途 | |
| CN101897953B (zh) | 无创性高穿透性表皮生长因子及其应用 | |
| CN110305887A (zh) | 抗真菌肽Drosomycin、制备方法及其应用 | |
| CN101880327A (zh) | 蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽融合体及其获得方法 | |
| CN100503826C (zh) | 一种重组人血小板衍生生长因子及其编码基因与表达方法 | |
| CN100465272C (zh) | 重组东亚马氏钳蝎毒rBmKaIT1的基因工程 | |
| KR100729830B1 (ko) | 페너트라틴을 이용하여 단백질의 세포투과를 증진시키는대장균용발현벡터 | |
| CN101775404A (zh) | 一种原核表达体系高表达碱性蛋白的方法 | |
| CN1313900A (zh) | 一种新的人溶菌酶基因、其编码的多肽及制备方法 | |
| CN101481420B (zh) | 一种杂合抗菌肽ca-ma及其重组表达方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C57 | Notification of unclear or unknown address | ||
| DD01 | Delivery of document by public notice |
Addressee: Min Hui Document name: Notice of conformity |
|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: SUZHOU JINMENG BIOTECHNOLOGY CO., LTD. Effective date: 20110829 Owner name: CHENGDU JINKAI BIOTECHNOLOGY CO., LTD. |
|
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: ADDRESS; FROM: 610041 CHENGDU, SICHUAN PROVINCE TO: 215425 SUZHOU, JIANGSU PROVINCE |
|
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20110829 Address after: Shaxi town of Suzhou City, Jiangsu province 215425 Guizhuang Xiangtang High-tech Industrial Park Co-patentee after: CHENGDU JINKAI BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co.,Ltd. Patentee after: SUZHOU GENEMEN BIOTECH Co.,Ltd. Address before: 610041 doctor's Pioneer Park, Chengdu hi tech Zone, Sichuan Patentee before: CHENGDU ZHITIAN BIOENGINEERING Co.,Ltd. |
|
| CP01 | Change in the name or title of a patent holder | ||
| CP01 | Change in the name or title of a patent holder |
Address after: Shaxi town of Suzhou City, Jiangsu province 215425 Guizhuang Xiangtang High-tech Industrial Park Co-patentee after: Xinlitai (Chengdu) Biotechnology Co.,Ltd. Patentee after: Xinlitai (Suzhou) Pharmaceutical Co.,Ltd. Address before: Shaxi town of Suzhou City, Jiangsu province 215425 Guizhuang Xiangtang High-tech Industrial Park Co-patentee before: CHENGDU JINKAI BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co.,Ltd. Patentee before: SUZHOU GENEMEN BIOTECH Co.,Ltd. |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20090930 Termination date: 20210722 |