CN110305887A - 抗真菌肽Drosomycin、制备方法及其应用 - Google Patents

抗真菌肽Drosomycin、制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种SUMO‑Drosomycin融合蛋白及其制备方法，以及一种抗真菌肽Drosomycin的制备方法，该蛋白在大肠杆菌表达***中表达时，能够克服大部分的目标蛋白质在这个***合成容易折叠错误的问题，避免形成没有功能的蛋白质。即该蛋白能够正确折叠，具有较高的抗菌活性、且不产生耐药性，制备抗菌药物、无菌食品、化妆品中的应用前景广阔，具有较高的市场价值。

Description

抗真菌肽Drosomycin、制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种抗真菌肽Drosomycin、制备方法及其应用。
背景技术
抗生素的大量使用带来了日益突出的细菌耐药性问题，同时还可能会导致体内微生态失衡，造成不可预料的疾病隐患。而抗菌肽是天然免疫的主要成分具有耐高温、耐酸、水溶性好、抗菌谱广、抗菌机制特殊、杀菌快速且不产生耐药性的特点，近年来成为研究热点。
抗菌肽(Antibacterial peptide，AMP)又叫宿主防御肽(host defensepeptides)，普遍存在于真核和原核生物体内，参与机体的天然免疫。昆虫是世界上分布最广泛的种群，其具有极强的防御能力和适应能力，以抗菌肽为主的体液免疫是其免疫的重要组成部分。
抗真菌肽Drosomycin是黑腹果蝇体内的一类抗真菌肽，其成熟肽由44个氨基酸组成，分子质量为4.9kDa，其中8个Cys形成4对二硫键，对丝状病原真菌具有广谱抗性。但这种抗真菌肽在黑腹果蝇体内天然含量极微，通过免疫诱导果蝇生产的昆虫抗微生物肽产量很低，且提取步骤繁琐、成本高；直接合成则价格昂贵，成为限制其开发应用的瓶颈。
发明内容
基于上述问题，本发明的目的在于提供一种活性好、表达量高的抗真菌肽Drosomycin。
具体技术方案如下：
一种融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：
(1)构建得到包含有如SEQ.ID No.11所示序列的重组表达载体质粒ppSUMO-Drosomycin；
(2)向受体菌中转化所述重组表达载体质粒ppSUMO-Drosomycin，培养表达，即得。
在其中一些实施例中，所述如SEQ.ID No.11所示的融合基因，由以下方法制备得到：
(1)构建包含有氨基酸序列如SEQ.ID NO.5所示的重组质粒pET-19T-Drosomycin；以所述pET-19T-Drosomycin为模板，SEQ.ID No.9和SEQ.ID No.10为引物，扩增得产物A；
(2)以pET3c-SUMO为模板，SEQ.ID NO.7和SEQ.ID NO.8为引物，扩增得产物B；
(3)将产物A、产物B、SEQ.ID NO.7和SEQ.ID No.10混合后，PCR扩增，即得。
在其中一些实施例中，所述重组质粒pET-19T-Drosomycin的构建，包括以下步骤：
以SEQ.ID NO.2、SEQ.ID NO.3、SEQ.ID NO.4为引物，进行重叠互补PCR，扩增得产物C；
将所述产物C连接到pET-19T载体上，得pET-19T-Drosomycin。
在其中一些实施例中，上述受体菌为E.coli BL21。
本发明还提供一种融合蛋白，具体技术方案如下：
一种融合蛋白，由上述制备方法制备得到，所述融合蛋白为SUMO-Drosomycin融合蛋白，氨基酸序列如SEQ.ID NO.12所示。
本发明还提供一种含有上述表达载体质粒的工程菌，具体技术方案如下：
一种工程菌，包含有如SEQ.ID No.11所示序列的重组表达载体质粒。。
本发明还提供一种抗真菌肽Drosomycin的制备方法，包括以下步骤：SUMO蛋白酶对上述SUMO-Drosomycin融合蛋白进行酶切，分离纯化，即得。
在其中一些实施例中，所述分离纯化为：对所述酶切的产物通过Ni-NTA亲和层析柱分离后，利用截留分子量为3kDa的超滤管过柱，即得。
本发明还提供一种抗真菌肽Drosomycin，具体技术方案如下：
一种抗真菌肽Drosomycin，由上述抗真菌肽Drosomycin的制备方法制备得到，其核苷酸序列如SEQ.ID NO.13所示。
本发明还提供一种上述融合蛋白或上述抗真菌肽Drosomycin的应用，具体方案如下：
上述融合蛋白或上述抗真菌肽Drosomycin在制备抗菌药物、无菌食品、化妆品中的应用。
本发明所述抗菌肽Drosomycin融合蛋白、制备方法及应用具有以下有益效果：
本发明所述的融合蛋白的制备方法，通过发明人的大量创造性劳动，设计得到序列如SEQ.ID NO.11的DNA，通过构建得到含有如SEQ.ID No.11所示序列的重组表达载体质粒的方法，采用菌株培养的方式，制备融合蛋白，本方案对编码基因的合理设计，并构建得到重组表达载体质粒，其能够在大肠杆菌表达***中表达时，克服大部分的目标蛋白质在这个***合成容易折叠错误的问题，避免形成没有功能的蛋白质，即该蛋白能够正确折叠，具有较高的抗菌活性，且表达产量高、易于工业化生产。
本发明设计得到核苷酸序列如SEQ.ID NO.7～10所述的引物，通过PCR扩增得到含有如SEQ.ID No.11所示序列的扩增片段，并构建表达载体，表达、纯化得到的融合蛋白保证了蛋白质折叠正确，表达产量高。
本发明所述的Drosomycin的制备方法，采用了SUMO蛋白酶对上述SUMO-Drosomycin融合蛋白酶切，并分离纯化，得到抗菌肽Drosomycin，且表达产量显著高于天然提取、易于工业化生产，其对粗糙脉胞菌、尖孢镰刀菌具有明显的抗菌活性。
本发明所述的SUMO-Drosomycin融合蛋白及抗菌肽Drosomycin在制备抗菌药物、无菌食品、化妆品中的应用前景广阔，具有较高的市场价值。
附图说明
图1为重组表达载体质粒ppSUMO-Drosomycin的示意图；
图2为含有重组表达载体质粒的转化体菌株ppSUMO-Drosomycin/E.coli BL21(DE3)诱导表达的SDS-PAGE凝胶电泳检测结果；
图3为SUMO-Drosomycin融合蛋白的His标签Western Blot鉴定结果；
图4为含有重组表达载体质粒的转化体菌株ppSUMO-Drosomycin/E.coli BL21(DE3)中试发酵工艺参数变化图；
图5为融合蛋白SUMO-Drosomycin的纯化样品SDS-PAGE凝胶电泳检测结果；
图6为融合蛋白SUMO-Drosomycin酶解得到的抗菌肽Drosomycin的SDS-PAGE凝胶电泳检测结果；
图7为抗真菌肽Drosomycin平板抑菌法抑菌实验结果；
图8为抗真菌肽Drosomycin作用于粗糙脉胞菌和尖孢镰刀菌后的扫描电镜观察结果；
图9为抗真菌肽Drosomycin对哺乳动物细胞增殖的影响。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
实施例1
一、引物设计和SUMO-Drosomycin序列获得
1、Drosomycin基因SEQ.ID NO.1的获得
Drosomycin成熟肽对应的基因序列有132bp，如SEQ.ID NO.1所示，编码氨基酸44个，预测蛋白质的等电点为5.45，大小为4.9kDa。Drosomycin结构复杂，8个Cys形成4对二硫键，不适合在原核生物***中表达。因此，根据上述肽段的特点、基因及表达***的特点，首先对Drosomycin基因的密码子进行优化，优化后的Drosomycin核苷酸序列如SEQ.ID NO.5所示。根据优化过后的核苷酸序列分别设计3个互相互补的长引物drs-1、drs-2和drs-3，通过PCR直接合成Drosomycin。
首先用以下引物经重叠互补PCR获得密码子优化后的Drosomycin基因。
drs-1(SEQ.ID NO.2)：
5’-GACTGTCTGTCTGGTCGTTACAAGGGTCCGTGTGCGGTGTGGGATAACGAG-3’
drs-2(SEQ.ID NO.3)：
5’-GTGGCCGGAGGAGCGACCTTCTTCTTTGCAAACACGACGACAGGTCTCG-3’
drs-3(SEQ.ID NO.4)：
5’-GCCACTGCTCTCCAAGCCTGAAATGCTGGTGCGAAGGCTGCTAG-3’
(1)第1阶段PCR反应(Step1)反应体系如下：
说明：将上述反应体系混匀，离心，100℃水浴5min，冰浴1min，加pfu Taq酶(0.5U/μL)2μL，在PCR仪上72℃延伸10min。然后进行第2阶段PCR反应。
(2)第2阶段PCR反应(Step2)反应体系如下：
说明：将第2阶段PCR的反应体系混匀，样品处理按第1阶段PCR反应的步骤进行处理。然后进行第3阶段PCR的反应。
(3)第3阶段PCR反应(Step3)反应体系如下：
将Step3中的反应体系混匀，离心后对合成的基因完整片段进行PCR扩增。PCR反应条件为：95℃预变性5min，一个循环；94℃1min，55℃1min，72℃1min，30个循环；72℃延伸10min。得核苷酸序列如SEQ.ID NO.5所示的优化后的Drosomycin基因，并将扩增产物连接到pET-19T载体上。·
SEQ.ID NO.5
5’-GACTGTCTGTCTGGTCGTTACAAGGGTCCGTGTGCGGTGTGGGATAACGAGACCTGTCGTCGTGTTTGCAAAGAAGAAGGTCGCTCCTCCGGCCACTGCTCTCCAAGCCTGAAATGCTGGTGCGAAGGCTGCTAG-3’；
2、融合基因SUMO-Drosomycin的获得
针对保存在pET-3c-SUMO载体上的SUMO基因，设计SUMO扩增引物，通过PCR获得全长SUMO基因，其核苷酸序列如SEQ.ID NO.6所示。
SEQ.ID NO.6
5’-ATGCATCATCATCATCATCACGGCATGTCGGACTCAGAAGTCAATCAAGAAGCTAAGCCAGAGGTCAAGCCAGAAGTCAAGCCTGAGACTCACATCAATTTAAAGGTGTCCGATGGATCTTCAGAGATCTTCTTCAAGATCAAAAAGACCACTCCTTTAAGAAGGCTGATGGAAGCGTTCGCTAAAAGACAGGGTAAGGAAATGGACTCCTTAAGATTCTTGTACGACGGTATTAGAATTCAAGCTGATCAGACCCCTGAAGATTTGGACATGGAGGATAACGATATCATTGAGGCTCACAGAGAACAGATTGGTGGT-3’；
用以下引物经过重叠延伸PCR得到SUMO-Drosomycin融合基因序列，重叠延伸PCR步骤如下：
(1)扩增SUMO
上游引物SUMO-F(SEQ.ID NO.7)：
下游引物SUMO-R(SEQ.ID No.8)：
其中上述序列的斜体部分分别为NdeⅠ和BamHⅠ的酶切位点。
PCR扩增体系如下：
PCR反应程序为95℃，5min；95℃，30s；55℃，30s；72℃，30s；30个循环；72℃，10min；
(2)扩增Drosomycin
上游引物Drs-F(SEQ.ID No.9)：
下游引物Drs-R(SEQ.ID No.10)：
其中上述序列的斜体部分分别为NdeⅠ和XhoⅠ的酶切位点。
PCR反应程序为95℃，5min；95℃，30s；55℃，30s；72℃，30s；30个循环；72℃，10min；
PCR扩增体系如下：
(3)扩增SUMO+Drosomycin
上游引物SUMO-F(SEQ.ID NO.7)：
下游引物Drs-R(SEQ.ID No.10)：
PCR反应程序为95℃，5min；95℃，30s；55℃，30s；72℃，1min；30个循环；72℃，10min；
PCR扩增体系如下：
PCR产物测序结果表明，获得的融合基因序列如SEQ.ID No.11所示，由453个碱基组成，自5’端第1位到第318位为SUMO的编码序列，第319位到第453位为昆虫抗菌肽Drosomycin的编码序列；如SEQ.ID No.11所示的融合基因序列，即SUMO-Drosomycin序列，用于编码包括氨基酸序列如SEQ.ID No.12所示的融合蛋白，该序列由150个氨基酸残基组成。
SEQ.ID No.11
ATGCATCATCATCATCATCACGGCATGTCGGACTCAGAAGTCAATCAAGAAGCTAAGCCAGAGGTCAAGCCAGAAGTCAAGCCTGAGACTCACATCAATTTAAAGGTGTCCGATGGATCTTCAGAGATCTTCTTCAAGATCAAAAAGACCACTCCTTTAAGAAGGCTGATGGAAGCGTTCGCTAAAAGACAGGGTAAGGAAATGGACTCCTTAAGATTCTTGTACGACGGTATTAGAATTCAAGCTGATCAGACCCCTGAAGATTTGGACATGGAGGATAACGATATCATTGAGGCTCACAGAGAACAGATTGGTGGTGACTGTCTGTCTGGTCGTTACAAGGGTCCGTGTGCGGTGTGGGATAACGAGACCTGTCGTCGTGTTTGCAAAGAAGAAGGTCGCTCCTCCGGCCACTGCTCTCCAAGCCTGAAATGCTGGTGCGAAGGCTGCTAG
SEQ.ID No.12
MHHHHHHGMSDSEVNQEAKPEVKPEVKPETHINLKVSDGSSEIFFKIKKTTPLRRLMEAFAKRQGKEMDSLRFLYDGIRIQADQTPEDLDMEDNDIIEAHREQIGGDCLSGRYKGPCAVWDNETCRRVCKEEGRSSGHCSPSLKCWCEGC
二、重组表达载体质粒的构建，转化体菌株的获得
本实施例采用的载体是pET-28a载体，购买自TaKaRa，该载体携带T7promoter启动子，能够促进目的蛋白的可溶性表达。融合蛋白上设计有His标签，有利于后续的纯化。转化所用的大肠杆菌为BL21(DE3)，可由天根生物科技有限公司获得。
通过上述PCR引物上添加的限制性内切酶位点NdeⅠ、BamHⅠ和XhoⅠ，将上述扩增所得基因片段SEQ.ID No.11连接到pET-28a质粒中，构建得到重组表达载体质粒，命名为ppSUMO-Drosomycin，如图1所示。
将上述重组表达载体质粒使用常规方法转化进E.coli BL21(DE3)受体菌后，经过常规的PCR鉴定和测序鉴定，获得含有重组表达载体质粒的转化体菌株ppSUMO-Drosomycin/E.coli BL21(DE3)。
三.蛋白表达
将上述含有重组表达载体质粒的转化体菌株ppSUMO-Drosomycin/E.coli BL21(DE3)进行诱导表达培养，以只含有编码SUMO基因的载体pET-28a的转化菌株作为对照，IPTG浓度0.5mmol/L，起始菌液浓度OD600＝0.5，随后25℃，150rpm恒温摇床进行诱导，分别在诱导0h、2h、4h、8h和10h后取样。培养物经溶菌酶裂解、超声波破碎，12000rpm离心1min收集上清，并且取含有重组表达载体的转化菌株ppSUMO-Drosomycin/E.coli BL21(DE3)诱导表达10h的菌液超声破碎后的上清和沉淀，对上述样品制样进行SDS-PAGE鉴定，结果如图2所示。其中，1-5分别对应0h，2h，4h，8h，10h的空载菌株的经溶菌酶裂解、超声波破碎，离心取上清的测定结果；6-10分别对应诱导0h，2h，4h，8h，10h的重组菌株的经溶菌酶裂解、超声波破碎，离心取上清的测定结果；11和12分别对应诱导10h的重组菌超声破碎得到的上清和沉淀结果；M为Marker。从图中可见，在经IPTG浓度0.5mmol/L诱导2h后，含有重组表达载体质粒的转化菌株即表达SUMO-Drosomycin融合蛋白，并且到10h时所得到的表达量最高。由于SUMO-Drosomycin融合蛋白带有6×His标签，利用Western Blot可进一步检测到融合蛋白的表达，结果如图3所示：M为Marker；1-5分别是IPTG诱导0h，2h，4h，8h，10h后重组菌的鉴定结果。。
采用含有重组表达载体质粒的转化体菌株ppSUMO-Drosomycin/E.coli BL21(DE3)，进行中试发酵：使用1.8升发酵罐，根据pH值的变化，等到pH下降再上升到起始值左右时，25。C，150rpm的条件下诱导，从图中可以看出3h时pH值上升到起始值，随后加入0.5mmol/L的IPTG诱导12h，同时根据溶解氧的变化及时自动添加补料。此时用小烧杯从发酵罐出口管获取发酵液样品，取200μl菌液至1.5mL离心管，室温10000r/min离心1min，作为0h的取样，此后每隔4h按同样方法取样，4℃保存，准备SDS-PAGE电泳样品的制备，具体工艺参数控制如图4所示。Ⅰ为种子菌生长期，Ⅱ-Ⅳ为生长诱导期，其中Ⅱ通过添加补料碳源的方法维持pH值，Ⅲ通过添加NaOH的方法维持pH值，Ⅳ为最后一个阶段，使罐内的葡萄糖全部耗尽，有利于后续的纯化。
在中试发酵产物中取50g菌进行超声破碎，高速离心得到上清，对得到的上清蛋白进行镍柱亲和层析纯化。
Drosomycin与SUMO进行融合表达，在其表达的融合蛋白中存在His.Tag(组氨酸标签)-SUMO切割位点，所以，对含有抗真菌肽Drosomycin的融合蛋白上清，首先通过融合蛋白中的His.Tag(组氨酸标签)与Ni-NTA亲和层析柱的特异结合和Sephadex G-10层析脱盐处理的分离纯化，使用不同浓度的咪唑进行洗脱脱盐，获得融合蛋白SUMO-Drosomycin的纯化样品，对纯化得到的样品使用SDS-PAGE凝胶电泳分离检测SUMO-Drosomycin融合蛋白，结果如图5所示，0mM、20mM、40mM、60mM、300mM分别为10h菌超声破碎后上清，用咪唑对Ni-NTA亲和层析柱进行洗脱的结果，其中脱盐为300mM咪唑洗脱液利用PBS脱盐的结果。
由SUMO蛋白酶对上述SUMO-Drosomycin融合蛋白进行酶切，对获得的酶切产物通过Ni-NTA亲和层析柱的特异结合分离纯化得到目的蛋白Drosomycin，利用截留分子量为3kDa的超滤管过柱获取分子量约为4.9kDa的抗真菌肽Drosomycin，其氨基酸序列如下(SEQ.ID NO.13)：
DCLSGRYKGPCAVWDNETCRRVCKEEGRSSGHCSPSLKCWCEGC
对得到的抗真菌肽Drosomycin进行BCA定量检测，和用SDS-PAGE进行纯度评估，结果如表1所示。
表1发酵合成SUMO-Drosomycin融合蛋白的得率与纯度
其中，a为通过BCA蛋白定量试剂盒对蛋白进行定量；b为利用灰度扫描软件ImageJ对SDS-PAGE考马斯亮蓝进行纯度的评估。
使用SDS-PAGE凝胶电泳分离检测，结果如图6所示，SUMO为利用SUMO蛋白酶酶切后吸附在镍柱上未洗脱的SUMO和SUMO蛋白酶，Drs是SUMO蛋白酶酶切后利用PBS洗脱下来的重组蛋白Drosomycin，SUMO+Drs为该***表达的融合蛋白。
实施例2
对实施例1中获得的抗菌肽Drosomycin(Drs)，利用常规的琼脂板空穴扩散法(平板抑菌圈法)，以粗糙脉胞菌(N.crassa)和尖孢镰刀菌(F.oxysporum)作为受试菌，进行抗菌活性的试验。
平板抑菌法实验结果如图7所示，其中PBS和单独的SUMO蛋白对两种受试菌均无抑制作用，而分离得到的抗菌肽Drosomycin在3μg以上时，对两种菌均有抑制效果，在15μg时显示明显的抗菌活性。
以5μg/μL浓度的Drosomycin和control(PBS)，分别作用于粗糙脉胞菌和尖孢镰刀菌，处理10小时后，用多聚甲醛对菌丝进行固定，采用JSM-6360LV扫描电子显微镜，于1200和3700倍下观察并拍照，结果如图8所示，可见：从图中可以看出正常生长的真菌即用PBS处理的菌丝外表光滑，菌丝形态细长、均匀。而用外源表达的重组蛋白Drosomycin短肽处理后，菌丝的外表发生明显变化，营养气生菌丝分枝粗细不均，菌丝表面凹凸不平，不能像正常的菌丝一样生长并分枝发芽。
实施例3
利用CCK-8法检测实施例1所述体外重组蛋白Drosomycin对哺乳细胞293T和小鼠胚胎成纤维细胞3T3-L1的毒性，结果发现其不影响293T和3T3-L1细胞的增殖，说明抗真菌肽Drosomycin对哺乳动物细胞无毒性作用。结果如图9所示，可见：分别用0、10μg/mL、40μg/mL、160μg/mL浓度的Drosomycin处理哺乳细胞293-T和3T3-L1细胞，24h后利用CCK8试剂盒检测293-T和3T3-L1细胞增殖能力，从图中可以看到Drosomycin的浓度即使提高到160μg/mL，293-T和3T3-L1细胞的增殖能力也维持在100％左右。可见Drosomycin对哺乳细胞293-T和3T3-L1不具有毒性作用。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 抗真菌肽Drosomycin、制备方法及其应用
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 132
<212> DNA
<213> Drosophila melanogaster
<400> 1
gactgcctgt ccggaagata caagggtccc tgtgccgtct gggacaacga gacctgtcgt 60
cgtgtgtgca aggaggaggg acgctccagt ggccactgca gccccagtct gaagtgctgg 120
tgcgaaggat gc 132
<210> 2
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gactgtctgt ctggtcgtta caagggtccg tgtgcggtgt gggataacga g 51
<210> 3
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtggccggag gagcgacctt cttctttgca aacacgacga caggtctcg 49
<210> 4
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gccactgctc tccaagcctg aaatgctggt gcgaaggctg ctag 44
<210> 5
<211> 135
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gactgtctgt ctggtcgtta caagggtccg tgtgcggtgt gggataacga gacctgtcgt 60
cgtgtttgca aagaagaagg tcgctcctcc ggccactgct ctccaagcct gaaatgctgg 120
tgcgaaggct gctag 135
<210> 6
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atgcatcatc atcatcatca cggcatgtcg gactcagaag tcaatcaaga agctaagcca 60
gaggtcaagc cagaagtcaa gcctgagact cacatcaatt taaaggtgtc cgatggatct 120
tcagagatct tcttcaagat caaaaagacc actcctttaa gaaggctgat ggaagcgttc 180
gctaaaagac agggtaagga aatggactcc ttaagattct tgtacgacgg tattagaatt 240
caagctgatc agacccctga agatttggac atggaggata acgatatcat tgaggctcac 300
agagaacaga ttggtggt 318
<210> 7
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cccatatgca tcatcatcat catcatcacg gcatgtcgga 40
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
caggcagtcg gatccaccaa tctgttctct 30
<210> 9
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
acagattggt ggatccgact gcctgtcc 28
<210> 10
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ccgctcgagt tagcatcctt cgcacca 27
<210> 11
<211> 453
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
atgcatcatc atcatcatca cggcatgtcg gactcagaag tcaatcaaga agctaagcca 60
gaggtcaagc cagaagtcaa gcctgagact cacatcaatt taaaggtgtc cgatggatct 120
tcagagatct tcttcaagat caaaaagacc actcctttaa gaaggctgat ggaagcgttc 180
gctaaaagac agggtaagga aatggactcc ttaagattct tgtacgacgg tattagaatt 240
caagctgatc agacccctga agatttggac atggaggata acgatatcat tgaggctcac 300
agagaacaga ttggtggtga ctgtctgtct ggtcgttaca agggtccgtg tgcggtgtgg 360
gataacgaga cctgtcgtcg tgtttgcaaa gaagaaggtc gctcctccgg ccactgctct 420
ccaagcctga aatgctggtg cgaaggctgc tag 453
<210> 12
<211> 150
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Met His His His His His His Gly Met Ser Asp Ser Glu Val Asn Gln
1 5 10 15
Glu Ala Lys Pro Glu Val Lys Pro Glu Val Lys Pro Glu Thr His Ile
20 25 30
Asn Leu Lys Val Ser Asp Gly Ser Ser Glu Ile Phe Phe Lys Ile Lys
35 40 45
Lys Thr Thr Pro Leu Arg Arg Leu Met Glu Ala Phe Ala Lys Arg Gln
50 55 60
Gly Lys Glu Met Asp Ser Leu Arg Phe Leu Tyr Asp Gly Ile Arg Ile
65 70 75 80
Gln Ala Asp Gln Thr Pro Glu Asp Leu Asp Met Glu Asp Asn Asp Ile
85 90 95
Ile Glu Ala His Arg Glu Gln Ile Gly Gly Asp Cys Leu Ser Gly Arg
100 105 110
Tyr Lys Gly Pro Cys Ala Val Trp Asp Asn Glu Thr Cys Arg Arg Val
115 120 125
Cys Lys Glu Glu Gly Arg Ser Ser Gly His Cys Ser Pro Ser Leu Lys
130 135 140
Cys Trp Cys Glu Gly Cys
145 150

Claims (10)

1.一种融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)构建得到包含有如SEQ.ID No.11所示序列的重组表达载体质粒ppSUMO-Drosomycin；
(2)向受体菌中转化所述重组表达载体质粒ppSUMO-Drosomycin，培养表达，即得。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述如SEQ.ID No.11所示序列，由以下方法制备得到：
(1)构建包含有氨基酸序列如SEQ.ID NO.5所示的重组质粒pET-19T-Drosomycin；以所述pET-19T-Drosomycin为模板，SEQ.ID No.9和SEQ.ID No.10为引物，扩增得产物A；
(2)以pET3c-SUMO为模板，SEQ.ID NO.7和SEQ.ID NO.8为引物，扩增得产物B；
(3)将产物A、产物B、SEQ.ID NO.7和SEQ.ID No.10混合后，PCR扩增得到含有如SEQ.IDNo.11所示序列的扩增片段。
3.根据权利要求2所述的融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述重组质粒pET-19T-Drosomycin的构建，包括以下步骤：
以SEQ.ID NO.2、SEQ.ID NO.3、SEQ.ID NO.4为引物，进行重叠互补PCR，扩增得产物C；
将所述产物C连接到pET-19T载体上，得pET-19T-Drosomycin。
4.根据权利要求1-3任一项所述的融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述受体菌为E.coli BL21；和/或
所述重组表达载体质粒ppSUMO-Drosomycin上携带有T7promoter启动子。
5.一种融合蛋白，其特征在于，由如权利要求1-4任一项所述的制备方法制备得到。
6.根据权利要求5所述的一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白为SUMO-Drosomycin融合蛋白，氨基酸序列如SEQ.ID NO.12所示。
7.一种工程菌，其特征在于，包含有如SEQ.ID No.11所示序列的重组表达载体质粒。
8.一种抗真菌肽Drosomycin的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
SUMO蛋白酶对权利要求5或6所述的SUMO-Drosomycin融合蛋白进行酶切，分离纯化，即得。
9.一种抗真菌肽Drosomycin，其特征在于，由权利要求8所述的制备方法制备得到，其核苷酸序列如SEQ.ID NO.13所示。
10.权利要求5所述的融合蛋白或权利要求9所述的抗真菌肽Drosomycin在制备抗菌药物、无菌食品、化妆品中的应用。
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